CN108778248A - 与生理响应性微针递送系统有关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了微针设备，包括所述微针设备的药盒及使用所述微针设备的方法。具体地，公开了一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；和至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置。

Description

与生理响应性微针递送系统有关的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月19日提交的美国临时申请第62/297,346号的权益，其据此通过引用整体并入本文。
背景技术
糖尿病，作为最具挑战性的慢性疾病之一，目前影响了全球超过3.87亿人，预计到2030年这一数字将增加到约5亿(J.E.Shaw等Diabetes Research and Clinical Practice2010,87,4；B.Belgium,IDF Diabetes Atlas，第6版，International DiabetesFederation 2013)。提供终身的外源性胰岛素对于1型糖尿病的治疗至关重要(Matriano等Diabetes Care 2013,36增刊1,S67；R.A.Hayward,Jama 1997,278,1663；D.R.Owens,B.Zinman,G.B.Bolli,The Lancet 2001,358,739；R.A.Hayward,Jama 1997,278,1663；D.R.Owens等The Lancet 2001,358,739)。然而，2014年全世界估计有490万例糖尿病相关死亡。传统胰岛素注射的一个主要制约因素在于血糖控制不足，导致糖尿病并发症，如失明、截肢和肾衰竭。相反，用胰岛素过度治疗会导致低血糖，这可能导致行为和认知障碍、癫痫发作、脑损伤或死亡(Mo等Chemical Society Reviews 2014,43,3595；C.Ricordi等Nature Reviews Immunology 2004,4,259；G.Steil,Advanced Drug DeliveryReviews2004,56,125；Z.Gu等Chemical Society Reviews 2011,40,3638)。
已经深入研究了胰岛素生成细胞的移植以治疗1型糖尿病(S.Schneider等Transplantation 2008,86,1762)。然而，由于宿主对移植细胞的识别、对供体细胞的依赖以及对广泛免疫抑制疗法的需求，直接细胞移植在糖尿病护理中的作用有限(S.Merani等British Journal of Surgery 2008,95,1449；R.Nishimura等TransplantationProceedings2011,43,3239；A.R.Pepper等Nature Biotechnology 2015,33,518)。替代技术是将胰腺β-细胞封装在半渗透性容器中，使其与免疫系统分离并保护其免受免疫系统损害，同时仍然允许营养物和氧气扩散和运输到封装细胞中(H.Zimmermann等CurrentDiabetes Reports 2007,7,314；E.Pedraza等Proceedings of the National Academy ofSciences2012,109,4245；C.C.Lin等Proceedings of the National Academy ofSciences 2011,108,6380)。然而，植入或取出细胞囊通常需要外科手术。更重要的是，细胞囊的生物相容性常常受损，导致持续性炎症、异物巨细胞的形成、纤维化、对周围组织的损害以及植入物无法控制葡萄糖(O.Veiseh,R.Langer,Nature 2015,524,39；Z.Gu,A.A.Aimetti,Q.Wang,T.T.Dang,Y.Zhang,O.Veiseh,H.Cheng,R.S.Langer,D.G.Anderson等ACS Nano 2013,7,4194；W.Tai等Biomacromolecules2014,15,3495)。本领域需要的是用于向有需要的受试者递送组合物的设备和方法，其中所述设备和方法不需要手术。
附图简述
图1A和1B显示了基于整合有胰腺β细胞和葡萄糖信号放大器(glucose signalamplifier/GSA)的微针阵列贴片的葡萄糖响应系统(GRS)示意图。图1A显示了无GSA的葡萄糖响应系统，在血糖量正常和高血糖状态下，微针贴片的胰岛素释放都不显著。微针贴片由交联透明质酸(灰色)构成。图1B显示了有GSA的葡萄糖响应系统，高血糖状态触发显著提升的胰岛素释放。微针贴片由包埋组装的(从上至下)α-直链淀粉层和GSA层的交联透明质酸构成。
图2A-F显示了对葡萄糖信号放大器(GSA)的表征。图2A显示了在400mg/dL葡萄糖溶液中温育前，在37℃下分别温育20分钟、2小时和6小时后酶封装的GSA的TEM图像。比例尺为200nm。图2B(上)显示了在400mg/dL葡萄糖溶液中温育前和在37℃下温育2小时后FITC-GA负载的GSA溶液的荧光2.5D图像。图2B(下)显示了沿所示白色虚线的荧光强度分布(a.u.表示“任意单位”)。图2C显示了在400mg/dL葡萄糖溶液中温育前和温育6小时后GSA的尺寸分布。图2D显示了在含有氧浓度分子探针的不同葡萄糖水平的溶液中温育的GSA的磷光寿命曲线。图2E显示了在400mg/dL葡萄糖溶液中负载有全剂量或半剂量的GOx的GSA的磷光寿命曲线。图2F显示了在330nm下GSA在37℃不同葡萄糖浓度的溶液中的紫外吸收强度。误差线表示标准误差(s.d.)(n＝3)。
图3A-I显示了对GSA的体外葡萄糖响应研究及对微针贴片和L-S GRS的表征。图3A显示了37℃下在不同葡萄糖浓度的溶液中GSA的体外积累酶释放曲线。对于在400mg/dL葡萄糖溶液中的GSA而言，与在100mg/dL或0mg/dL葡萄糖浓度的溶液中的那些相比，*P<0.05。图3B显示由释放的酶催化α-淀粉酶水解生成葡萄糖。对于在400mg/dL葡萄糖溶液中的GSA而言，与在100mg/dL或0mg/dL葡萄糖溶液中的那些相比，*P<0.05。图3C显示了因不同葡萄糖溶液流过微流体设备(100mg/dL和400mg/dL)刺激的L-S GRS的分泌速率曲线。(n＝3)。图3D显示了胰岛素(绿色)和细胞核(蓝色)染色的胰腺β-细胞囊的免疫荧光图像。比例尺为500μm。图3E(a-c)显示了封装后第1天至第3天胰腺β-细胞的荧光图像。细胞经钙-淀粉酶(活的，绿色)和乙锭均二聚物(死的，红色)染色。比例尺为500μm。(右下角)细胞囊在封装后第1天至第3天随时间变化的胰岛素分泌指数。误差线表示标准偏差。(n＝3)。图3F显示了使用微流体设备，从L-S GRS刺激的胰岛素分泌的示意图。不同葡萄糖浓度的KRB流过微流体通道并从出口收集胰腺β-细胞囊分泌的胰岛素。图3G显示了负载GSA的微针贴片的图片。比例尺为1cm。图3H显示了微针贴片的SEM图像。比例尺为500μm。图3I显示了L-S GRS的荧光显微镜图像：微针贴片负载有若丹明标记的GSA并且经钙-淀粉酶染色的胰腺β-细胞囊位于微针贴片背面。比例尺为500μm。
图4A-F显示了用于1型糖尿病治疗的L-S GRS的体内研究。图4A显示经皮用微针贴片处理小鼠背部皮肤。比例尺为1mm(上)；用黑色虚线内的区域表示经处理皮肤的H&E染色横截面(下)。皮肤肌肉和脂肪组织区域分别标记为M和F。比例尺为200μm。图4B显示了用于STZ诱导的1型糖尿病小鼠治疗的微针贴片的体内研究。小鼠经受经皮施用各种微针样品：无GRS的空微针(w/o GRS)、仅整合L-GRS的微针(L-GRS)、仅整合S-GRS的微针(S-GRS)、整合L-S-GRS的微针(L-S GRS)、整合L-S-GRS但S-GRS中无GOx的微针(L-S GRS(w/o GOx))及整合L-S-GRS但S-GRS中无α-直链淀粉的微针(L-S GRS(w/o AM))。与对照组相比，施用整合L-S GRS的微针*P<0.05。图4C显示了用额外微针(L-S GRS)处理的糖尿病小鼠在施用6小时后血糖水平(BGL)的变化。与无额外施用相比，额外施用微针*P<0.05。黑色箭头表示施用点。图4D显示了健康小鼠在施用微针(MN L-S GRS或空微针(MN w/o GRS))后血糖水平的变化。误差线表示标准偏差。(n＝5)。图4E显示了与健康对照小鼠相比，施用具有L-S GRS的微针2小时后针对糖尿病小鼠的耐量试验。施用时间点用黑色箭头指出。图4F显示基于120分钟内曲线下面积(AUC)计算响应率，基线设为0分钟时的血糖读数。误差线表示标准偏差。(n＝5)。与健康小鼠相比，对于施用MN L-S GRS进行处理的糖尿病小鼠而言*P<0.05。
图5显示了缺氧敏感性透明质酸(HS-HA)的葡萄糖响应机制。
图6显示了(从左至右)分别在4℃下用PBS缓冲液，在37℃下用PBS缓冲液和在37℃下用含对照水平的葡萄糖浓度(100mg/dL)的PBS缓冲液温育6小时后GSA的TEM图像和DLS测量结果。
图7显示了GA与AA之间在不同的酶重量比率下归一化的葡萄糖产率。误差线表示标准偏差。(n＝3)。
图8显示了在含3mg/mL AA和6mg/mL GA的10mg/mLα-直链淀粉溶液中α-直链淀粉向葡萄糖的转化率。误差线表示标准偏差。(n＝3)。
图9A-B显示了天然状态的(a)AA和(b)GA以及在37℃下在含400mg/dL葡萄糖的溶液中温育6小时的GSA释放的(a)AA和(b)GA的CD图谱。
图10显示了在2D组织培养板上培养的细胞和封装在3D囊中的细胞在封装30小时后由葡萄糖刺激的胰岛素分泌量。将400mg/dL葡萄糖KRB中的胰岛素分泌量归一化为100mg/dL葡萄糖KRB中的胰岛素分泌量。误差线表示标准偏差。(n＝3)。
图11显示了负载GSA的交联微针的机械特性。(n＝5)。
图12显示了经处理的STZ诱导型糖尿病小鼠的血糖水平，在施用MN w/o GRS、MNL-GRS、MN S-GRS、MN L-S-GRS、MN L-S GRS(w/o GOx)和MN L-S GRS(w/o AM)后的前两个小时连续监测血糖水平。黑色箭头指示施用点。误差线表示标准偏差。(n＝5)。与健康小鼠相比，对于施用MN L-S GRS进行处理的糖尿病小鼠而言，*P<0.05。
图13显示了与MIN6细胞一起温育24小时后GSA的细胞毒性研究。误差线表示标准偏差。(n＝6)。
图14A-B显示了施用PBS(a)或微针贴片(b)，处理2天后周围组织经H&E染色的皮肤横截面。那些皮肤样品距微针注射部位的距离为5mm。比例尺为200μm。
图15A-B显示了在(a)25℃和(b)37℃下使用具有砂纸覆盖平行板(25mm)的TAInstruments AR-2000压力控制流变仪测量的含98％细胞生长完全培养基的交联m-HA水凝胶的流变特性。实验在0.5Pa几何结构，具有2mm间隙的线性粘弹性方案中进行。测量至少进行三次以确保±10％以内的再现性。
发明内容
本文公开了一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；和信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自所述受者的生理信号的元件。
本文还公开了一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测生理信号的装置，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的药剂的体积或量可以基于所述生理信号而改变。
本文还公开了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：a)向所述受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：i)多根微针，其各自具有底端和尖端；ii)基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；iii)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；和iv)信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自所述受者的生理信号的元件；b)将所述微针插入所述生物屏障内；以及c)通过所述微针将所述药剂递送到所述生物屏障内，其中递送的药剂的量或体积由从所述信号放大器系统接收的信号确定。
本文还公开了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：a)向所述受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：i)多根微针，其各自具有底端和尖端；ii)基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；iii)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测生理信号的装置，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的药剂的体积或量可以基于所述生理信号而改变；以及b)将所述微针插入所述生物屏障内；以及c)通过所述微针将所述药剂递送到所述生物屏障内，其中递送的药剂的量或体积基于所述生理信号。
本文公开了一种用于递送治疗剂、预防剂或诊断剂穿过生物屏障的具有多个部件的药盒，其包括：a)微针贴片，其包括多根各自具有底端和尖端的微针，和基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；b)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；和c)信号放大器系统，其中要运输的药剂的体积或量基于从所述信号放大器系统接收的信号而改变。
本文还公开了一种用于递送治疗剂、预防剂或诊断剂穿过生物屏障的具有多个部件的药盒，其包括：a)微针贴片，其包括多根各自具有底端和尖端的微针，和基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；b)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自所述受者的生理信号的装置。
具体实施方式
定义
本申请全篇使用的术语对于本领域普通技术人员应解释为具有普通和典型含义。然而，申请人希望为以下术语给出如下文所定义的特定定义。
如说明书和权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个提及物。例如，术语“一种细胞”包括多种细胞，包括其混合物。
正如本领域普通技术人员所理解，术语“约”和“大约”定义为“接近”。在一个非限制性实施方案中，所述术语定义为在10％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语定义为在5％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语定义为在1％以内。
蛋白质的“活性”，包括与“生物活性”相关的那些，包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、受激酶磷酸化、受蛋白酶裂解和/或与其它蛋白质的嗜同性或嗜异性结合。
“生物相容性”通常是指物质及其任何代谢产物或降解产物通常对受者无毒并且不会对受试者产生任何显著有害影响。
“组合物”旨在包括活性剂与另一惰性化合物或组合物(例如可检测剂或标签)或活性化合物或组合物(例如佐剂)的组合。
如本文中所用，术语“包含/包括”旨在意指所述组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。“基本上由……组成”当用于定义组合物和方法时，应意指排除对所述组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由......组成”应意指排除除微量元素以外的其它成分和用于施用本发明组合物的基本方法步骤。由这些承接术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
“对照”是出于比较目的在实验中使用的替代受试者或样品。对照可为“阳性”或“阴性”。
“有效量”是足以实现有益或预期结果的量。有效量可以分一次或多次施用、应用或剂量来施用。
如本文中所用，术语“高糖条件”是指葡萄糖浓度高于或等于200mg/dL的环境。例如，“高血糖水平”是指血流中的葡萄糖水平高于或等于200mg/dL。在一些实施方案中，高糖条件为200–400mg/dL。在其它实施方案中，高糖条件为300–400mg/dL。
如本文中所用，术语“低糖条件”是指葡萄糖浓度为0至200mg/dL的环境。例如，“低血糖水平”是指血流中的葡萄糖水平低于200mg/dL。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换用于指包含两个或更多个氨基酸，通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接的天然或合成分子。
术语“载体”或“药学上可接受的载体”意指可用于制备药物组合物或治疗组合物，通常安全无毒的载体或赋形剂，并且包括对于兽医和/或人类药物或治疗使用可接受的载体。如本文中所用，术语“载体”或“药学上可接受的载体”涵盖即可包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文中所用，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知用于药物制剂中并且如下面进一步描述的其它物质。
如本文中所用，术语“聚合物”是指天然或合成的，其结构可由重复小单元即单体表示的分子量相对较高的有机化合物(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)。合成聚合物通常通过单体的加成或缩聚聚合形成。如本文中所用，术语“共聚物”是指由两个或更多个不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。举例而言而不限制，共聚物可以是交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还应考虑到，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段区段本身可以包含共聚物。
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。在表示此类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。类似地，用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成了另一个实施方案。还应理解，每个范围的端点相对于另一个端点很重要，并且独立于另一个端点。还应理解，本文公开了许多值，并且每个值除该值本身外，也在本文中公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指组合物(例如结合于葡萄糖结合结构的葡萄糖改性胰岛素)将会在广义的时间周期内引发研究人员、兽医、医师或其它临床医生正在寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学响应的量。在一些实施方案中，预期响应是控制I型糖尿病。在一些情况下，在向受试者施用多个剂量的组合物后，在几天、几周或几年的时期内实现预期生物或医学响应。
术语“受试者”或“受者”本文定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，受试者为人。
如本文中所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”及其语法变型包括部分或完全延迟、减轻、缓和或降低病症或病状的一种或多种伴随症状的强度和/或减轻、缓和或阻止病症或病状的一种或多种原因。根据本发明的治疗可以防止性、预防性、缓解性(pallatively)或补救性应用。
在一些情况下，术语“治疗”及其语法变型包括与治疗受试者之前相比或与普通群体或研究群体中此类症状的发病率相比，控制血糖水平和降低I型糖尿病症状的严重程度。
术语“I型糖尿病”是指因自身免疫性破坏胰岛素生成细胞和降低身体生成胰岛素的能力而引起的糖尿病形式。
详述
本文公开了一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：
多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；
基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；和
至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置。
药剂递送系统可以，例如包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的药剂的体积或量可以基于所述生理信号而改变。反馈元件可包括“通断”开关，使得在检测到信号时，药剂递送系统可以向受者递送药剂，但在未检测到信号时，不递送药剂。相反，信号的检测可以具有相反作用，其中药剂递送系统默认为向受者递送药剂，除非检测到信号，致使药剂递送系统不释放药剂向受者递送。以实例说明，反馈元件可以检测受者体内病原体(药剂)的存在，并且在检测到药剂时，反馈元件可以允许抗体从贮器中释放。
在另一个实例中，反馈元件可以检测生理信号如pH或温度的变化。反馈元件可含“截止值”，使得pH或温度变化达到一定量，或达到一定数值时(例如pH低于6.5或例如温度高于99.1)，反馈元件允许药剂释放变化或释放且随后施用给受者的药剂量变化。
反馈元件也可以基于检测到的信号量来调节释放的药剂量或体积，使得检测到的更大量的信号可以导致更大量的药剂释放，或相反地，检测到的更大量的信号可以导致更少量的药剂释放。
任选地，所述设备可包括信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自受者的生理信号的元件。信号放大器系统通过增加信号而起作用，这样增加了药剂递送系统检测到的信号。这可以在需要检测生理信号的极小变化的情况下或在药剂递送系统不够灵敏而无法在未扩大信号时检测变化时进行。信号放大器系统的实例可见于实施例1。
信号放大器系统可以整合到微针内。例如，信号放大器系统可以处于微针的尖端，作为微针外部的涂层，或在微针尖端内部。
一方面，检测到的生理信号可以是受者体内存在的任何物质。例如，生理信号可以是生物物质或药物。所述物质可以天然存在于受者体内，或者可以是非内源性或外源物质。另一方面，受试者的生理反应可包括生理环境因素，包括pH和温度。生理信号的实例包括但不限于葡萄糖、胆固醇、胆红素、肌酸、代谢酶、血红蛋白、肝素、凝血因子、尿酸、癌胚抗原或其它肿瘤抗原、生殖激素、氧、pH、温度、酒精、烟草代谢物和非法药物。
贮器中要递送给受者的药剂可以是治疗剂、预防剂或诊断剂。例如，所述药剂可选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。例如，可以配制许多不同的药物用本微针设备和方法递送。如本文中所用，术语“药物”或“药物制剂”广泛地用于指任何预防剂、治疗剂或诊断剂，或可能适于引入到生物组织的其它物质，包括药物赋形剂和用于纹身、美容等的物质。所述药物可以是具有生物活性的物质。所述药物制剂可包括各种形式，例如脂质溶液、凝胶、固体颗粒(例如微粒、纳米颗粒)或其组合。所述药物可包含小分子、大的(即，大)分子或其组合。在代表性而不是非限制性的实施方案中，所述药物可选自氨基酸、疫苗、抗病毒剂、基因递送载体、白细胞介素抑制剂、免疫调节剂、神经营养因子、神经保护剂、抗肿瘤剂、化学治疗剂、多糖、抗凝血剂、抗生素、镇痛剂、麻醉剂、抗组胺药、抗炎药和病毒。所述药物可选自合适的蛋白质、肽及其片段，其可以是天然存在的、合成的或重组生成的。在一个实施方案中，所述药物制剂包括胰岛素。
所述药物制剂还可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括本领域已知的pH调节剂、粘度调节剂、稀释剂等。具体地，所述药剂可为胰岛素。
本文公开的设备可包括要释放的药剂本身，或用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的药剂的装置。用于产生药剂的装置的一个实例为细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞，或者可以是来自任何其它来源的能够产生用于向受者施用的药剂的细胞。例如，所述细胞可为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
所述药剂，或用于产生药剂的装置可以设置在例如半渗透的贮器中。这样可以允许与受者进行流体交换，使得反馈元件可以与受者流体连通，从而检测受者生理信号的变化。例如，贮器可包括细胞，其中所述细胞对来自受者的生理信号的变化敏感。如以上关于反馈元件所述，受者的此类生理变化可以刺激细胞释放药剂，或停止释放药剂。在一个实例中，贮器可包括藻酸盐微凝胶。
在一个实例中，信号放大器系统包括葡萄糖信号放大器(本文也称为“GSA”)。信号放大器系统可包括自组装聚合纳米囊泡。以具体实例而言，葡萄糖信号放大器可包括葡糖氧化酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
就微针本身而论，其可由各种材料构造，包括金属、陶瓷、半导体、有机物、聚合物和复合材料。优选的构造材料包括医药级不锈钢、金、钛、镍、铁、锡、铬、铜、钯、铂，这些或其它金属的合金、硅、二氧化硅和聚合物。代表性的生物可降解聚合物包括羟酸例如乳酸和乙醇酸的聚合物聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯，以及与PEG的共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)。代表性的非生物可降解聚合物包括聚碳酸酯、聚酯和聚丙烯酰胺。
微针应具有在被插入生物屏障内时，在保持在原位长达许多天时和在取出时保持完好的机械强度。在微针由生物可降解聚合物形成的实施方案中，微针必须保持完好至少足够长时间以便微针达到其预期目的(例如，其用于递送药物的导管功能)。微针应可用标准方法例如环氧乙烷或γ辐射灭菌。
微针可具有直轴或锥形轴。在一个优选实施方案中，微针的直径在微针底端处最大并且在底部远端逐渐减小到一个点。微针也可以制造成具有包括笔直(非锥形)部分和锥形部分的轴。针也可能根本没有锥形端，即它们可能仅仅是具有钝形或扁平尖端的圆柱。具有基本上均匀的直径但不逐渐减小到一个点的空心微针在本文中称为“微管”。如本文中所用，除非另有说明，否则术语“微针”包括微管和锥形针。
微针可以与基板垂直或呈一个角度定向。优选地，微针与基板垂直定向，使得可以提供基板每单位面积较大的微针密度。微针阵列可包括混合的微针定向、高度或其它参数。
微针可以形成为具有在垂直方向上具有圆形横截面的轴，或者横截面可为非圆形。例如，微针的横截面可以是多边形(例如，星形、矩形、三角形)、椭圆形或另一形状。横截面尺寸可介于约1μm和1000μm之间，使得底部可为约200-600μm，并且尖端可介于1和20μm之间。在一个实施方案中，微针底部可为大约400μm，而尖端可为大约5μm。
微针的长度通常介于约10μm和1mm之间，优选地介于400μm和1mm之间。例如，微针长度可为大约800μm。对于特定应用而言，考虑到插入和未插入部分两者进行长度选择。微针阵列可包括例如具有不同长度、外径、内径、横截面形状和微针间距的混合微针。
贮器可连接到微针尖端，使得贮器中储存或产生的药剂可以从贮器流出通过微针尖端，流入目标组织内。贮器将要提供合适的、无渗漏的药剂储存，或在要递送之前产生药剂的装置。
单个微针设备的贮器可包括多个相互分离和/或与阵列中的一部分微针分离的隔室。例如可以提供所述设备用于通过不同的针递送不同的药剂，或以不同速率或在不同时间递送相同或不同药剂。或者，不同隔室的内容物可以相互组合，例如通过刺穿或以其它方式移除隔室间的屏障，以便使物质混合。
微针和基板通过本领域技术人员已知的方法制造。实例包括微加工工艺，通过在硅、金属、聚合物和其它材料中产生小的机械结构。例如可以使用下述组合制造空心微针的三维阵列：干蚀刻工艺；在经光刻限定的聚合物中产生微模和选择性侧壁电镀；或使用环氧树脂模具转移法的直接微模塑技术。这些方法例如在1998年6月10提交的美国序列号09/095,221；1999年5月21日提交的美国序列号09/316,229；Henry等，“MicromachinedNeedles for the Transdermal Delivery of Drugs,”Micro Electro MechanicalSystems,Heidelberg,Germany，第494–98页(1998年1月26–29日)中有描述。
本文还公开了治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
i)多根微针，其各自具有底端和尖端；
ii)基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
iii)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；以及；
b)将所述微针插入所述生物屏障内；以及
c)通过所述微针将所述药剂递送到所述生物屏障内，其中递送的药剂的量或体积由从所述信号放大器系统接收的信号确定。
如以上所讨论的，药剂递送系统可以例如包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的药剂的体积或量可以基于所述生理信号而改变。反馈元件基本上可包括“通断”开关，使得在检测到信号时，药剂递送系统可以向受者递送药剂。相反，信号的检测可以具有相反作用，从而使药剂递送系统不释放药剂向受者递送。以实例说明，反馈元件可以检测受者体内病原体的存在，并且在检测到分析物时，反馈元件可以允许抗体从贮器中释放。
如以上所讨论的，所述设备可包括信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自所述受者的生理信号的元件。信号放大器系统通过增加信号而起作用，这样增加了药剂递送系统检测到的信号。这可以在需要检测生理信号的极小变化的情况下或在药剂递送系统不够灵敏无法在未扩大信号时检测变化时进行。信号放大器系统的实例可见于实施例1。
本文还公开了药盒。所述药盒可包括用于和本文公开的方法一起使用的部件。例如，所述药盒可包括形成本文公开的设备所需要的部件。公开了一种用于递送治疗剂、预防剂或诊断剂穿过生物屏障的具有多个部件的药盒，其包括：a)微针贴片，其包括多根各自具有底端和尖端的微针，和基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；b)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置。所述药剂递送系统还可包括反馈元件。还公开的作为药盒部件的可以是本文讨论的信号放大器系统。所述药盒还可包括书面使用说明书。
实施例
实施例1：微针贴片平台
本文公开了一种无痛微针(MN)贴片平台，无需植入用于调节胰岛素从胰腺β-细胞的分泌，以进行血糖水平(BGL)的葡萄糖响应性调控。如图1所示，这种策略整合了活的(基于细胞的)和合成的葡萄糖响应系统(L-S GRS)，通过微针以微创方式允许位于外部的β-细胞囊感测葡萄糖信号并分泌胰岛素。初始设计整合了细胞囊与交联透明质酸(HA)制成的微针贴片(图1a)。预计在高血糖状态下，葡萄糖可以扩散通过微针并与封装在藻酸盐微凝胶内的β-细胞相互作用以便促进胰岛素分泌。然而，由于葡萄糖扩散有限，贴片并未对高血糖状态有效响应并且检测到胰岛素分泌增加不显著。为有效触发细胞响应，此处报道的微针基质特别地含有合成“葡萄糖信号放大器”(GSA)(图1b)。这种创新GSA以截留三种酶即葡糖氧化酶(GOx)、α-淀粉酶(AM)和葡糖淀粉酶(GA)的自组装聚合纳米囊泡为特征。GOx在氧的存在下将葡萄糖转化为葡萄糖酸。淀粉酶将α-直链淀粉水解为二糖和三糖，其进一步被GA转化为葡萄糖(N.Gurung等Process Biochemistry 2003,38,1599；L.Kandra,Journal ofMolecular Structure:THEOCHEM 2003,666-667,487)。
一旦经受血糖水平升高，由缺氧敏感性物质组成的GSA就响应于GOx的快速葡萄糖氧化和氧消耗迅速解离释放封装的酶(J.Yu等Proceedings of the National Academy ofSciences 2015,112,8260；O.Veiseh等Nature 2015,524,39)：
释放的酶随后水解包埋在微针基质内的α-直链淀粉(S.Peat等Nature 1953,172,158；J.F.Robyt,D.French,Archives of Biochemistry and Biophysics 1967,122,8；W.J.Whelan等Nature 1952,170,748)，产生局部葡萄糖集中位点。“放大的”葡萄糖有效地扩散到位于外部的β-细胞囊内，促进胰岛素分泌并扩散到血管和淋巴毛细管网内(A.J.Harvey等Pharmaceutical Research 2010,28,107)。使用链脲菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠作为动物模型，证明由约107个β-细胞组成的GRS对高血糖状态迅速响应，降低血糖水平并保持在降低的水平下长达10小时。这种具有生理信号放大器模态的细胞-合成混合葡萄糖响应设备呈现了植入胰腺β-细胞的有用替代方案用于严密调控血糖水平。
通过溶剂透析法制备GSA用于封装三种酶(J.E.Chung等Nature Nanotechnology2014,9,907；H.Yu等Nature Communications 2014,5)。简单地说，胺官能化2-硝基咪唑(NI)基团经由酰胺键与HA共价缀合。经疏水性NI基团官能化的缺氧敏感性HA(HS-HA)容易在含Gox、α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的水溶液中自组装成GSA(图5)。在缺氧条件下，疏水性NI基团经由与NADPH受硝基还原酶催化的单电子反应还原为亲水性2-氨基咪唑(Y.Seki等Journal of biochemistry 1970,67,389)。具有氨基的还原产物可溶于水，这利于GSA的分解(J.Yu等Proceedings of the National Academy of Sciences 2015,112,8260；R.J.Hickey等Journal of the American Chemical Society 2011,133,1517)。透射电子显微镜(TEM)图像(图2a)显示，GSA具有球形形状和单分散尺寸。通过动态光散射(DLS)测量的GSA平均流体动力学尺寸为340nm(图2c)，这与TEM图像一致。由于HA的残留羧基，GSA的ζ电位测定为-45.7±2.4mV。具有经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的GA和AM的GSA的荧光图像进一步证实成功共同封装所述酶(图2b)。基于所有酶的GSA的负载容量测定为7.4±0.5重量％而负载效率为16.1±1.0重量％。GSA在4℃下温育时稳定并且在两周内未检测到明显的浊度变化。
为评估体外GSA的葡萄糖响应能力，在具有不同葡萄糖浓度的1×PBS缓冲液中检查囊泡，葡萄糖浓度包括典型高血糖水平(400mg/dL)、正常血糖水平(100mg/dL)和对照水平(0mg/dL)。高血糖水平与其它两个对照组相比，在GSA中产生相对低氧环境，这通过氧敏磷光分子探针检验(图2d)。GSA内部的含氧量随时间逐渐降低并且在20分钟内达到平衡。通过改变负载到囊泡内的GOx量来进一步调节耗氧动力学，其显示出半剂量的GOx明显延迟缺氧效应(图2e)。随着含氧量降低，NI基团被添加到溶液中的NADPH有效还原。相应地，紫外-可见光谱中NI在330nm下的特征峰快速下降，证实了这种生物还原反应(图2f)。由于HS-HA上生成水溶性侧基，GSA开始解离并且随后释放封装的酶。如TEM图像所示，400mg/dL葡萄糖溶液中的GSA从20分钟到6小时经历逐渐形态变化(图2a)，这与DLS所示平均流体动力学尺寸的显著下降(图2c)一致。相比之下，未用葡萄糖或用100mg/dL葡萄糖温育的GSA展示出稳定的流体动力学尺寸并且无显著形态变化(图6)。此外，通过荧光显微镜可视化封装的FITC标记酶从解离囊泡中释放。荧光信号强度显著下降并于2小时后呈现均匀分布，表明酶从解离的GSA中逃逸并均匀分散在溶液中(图2b)。
接下来检查响应于葡萄糖水平变化的酶释放动力学。在正常葡萄糖水平(100mg/dL)和对照水平(0mg/dL)下温育24小时内未检测到有大量酶从GSA中释放(图3a)。形成鲜明对比，在高血糖环境(400mg/dL)下前2小时就从GSA实现酶快速释放。这归因于NI基团更快还原，这是葡萄糖氧化后由缺氧条件诱导的。
之后，进一步研究从GSA释放的酶催化α-直链淀粉转化为葡萄糖。通过分析其对α-直链淀粉的酶促水解能力(用葡萄糖产率表示)将AA与GA的封装比率预先优化为1:2(图7)。依次利用AA和GA糖化10mg/mLα-直链淀粉溶液时，葡萄糖产量容易地增加至816±26mg/dL，产生81.6％的α-直链淀粉转化率(图8)。圆二色(CD)光谱证实从GSA释放的酶GA和AA保持其二级构象结构(图9)。同时，在不同葡萄糖浓度的α-直链淀粉溶液中温育GSA时，用400mg/dL葡萄糖温育时与用100mg/dL葡萄糖温育相比实现了明显更快的葡萄糖生成(图3b)。表明与GSA解体相关的酶的逐渐释放激活了α-直链淀粉的酶促水解。总的来说，一旦“感测”到葡萄糖水平升高，GSA就可以激活释放酶，促进α-直链淀粉向葡萄糖转化以放大葡萄糖信号用于下游作用。
进一步研究微针贴片用于递送来自胰腺β-细胞囊的胰岛素的用途。为产生L-SGRS的“活的”葡萄糖响应元件，按2×106个细胞/mL的包装密度将小鼠胰岛β-细胞系封装在具有RGD(C.C.Lin等Proceedings of the National Academy of Sciences 2011,108,6380.)和IV型胶原蛋白(L.M.Weber等Biomaterials 2007,28,3004.)的藻酸盐微凝胶中，以提供良性环境与仿生细胞-ECM粘附相互作用。用荧光显微镜可视化成功封装，细胞集中且分泌的胰岛素均匀分布在囊周围(图3d)。所得囊尺寸为735±27μm。第1天后至第3天进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)分析和死活测定以验证封装的β-细胞保持其活力和功能性(图3e)C.C.Lin等Proceedings of the National Academy of Sciences 2011,108,6380.)。结果表明与用2D组织培养板上培养的细胞的胰岛素分泌指数相比，封装的β-细胞可以存活相对较长时间并且保持正常的葡萄糖响应性胰岛素分泌能力(图10)。
同时，使用微模塑法制造微针贴片。所得微针设备在10-mm2贴片上具有400根锥形针，且每根针底部的边长为400μm，尖端的边长为5μm，且高度为800μm(图3g、图3h)。使用交替沉积将针设计成具有由GSA、α-直链淀粉和交联透明质酸基质组成的三层结构。微针的机械强度测定为0.18N/针，这足以穿透皮肤而不断裂(图11)(S.P.Sullivan等NatureMedicine 2010,16,915)。荧光图描绘了微针贴片与胰腺β-细胞囊的代表性整合(图3i)。GSA均匀分布在微针的尖端区域并且细胞内嵌囊位于微针贴片背面。
通过微流体检查L-S GRS的GSIS(图3f)。一边连续输注分别具有高血糖水平(400mg/dL)和正常血糖水平(100mg/dL)的Krebs-Ringer缓冲液(KRB)，一边在开口微流体通道中温育贴片上的针。高葡萄糖水平输注时的GSIS与低葡萄糖输注相比展示出增加3倍(图3c)。这归因于高血糖流，其快速促进GSA解离；α-直链淀粉的后续水解产生放大的足够葡萄糖水平信号，以触发胰岛素从β-细胞囊分泌。
为研究葡萄糖响应微针设备的体内功效，使STZ诱导的1型糖尿病小鼠经受经皮施用各种微针样品：无GRS的空微针(w/o GRS)、仅整合L-GRS的微针(L-GRS)、仅整合S-GRS的微针(S-GRS)、整合L-S-GRS的微针(L-S GRS)、整合L-S-GRS但S-GRS中无GOx的微针(L-SGRS(w/o GOx))及整合L-S-GRS但S-GRS中无α-直链淀粉的微针(L-S GRS(w/o AM))。每张微针贴片以5N/张贴片用自制涂布器施用以确保均匀穿透并经局部皮肤粘合剂固定在皮肤上。切除的皮肤组织清楚显示出可见的针插入部位(图4a，上)并且苏木精和伊红(H&E)染色的横截面图像表明微针可以穿透至表皮大约200μm的深度(图4a，下)，这允许GSA实时暴露于间液(S.P.Sullivan等Nature Medicine 2010,16,915)。
随时间推移监测每组中经处理小鼠的血糖水平。如图4b所示，经整合L-S GRS的微针贴片处理的小鼠的血糖水平在2小时内迅速下降到接近200mg/dL并且保持在显著降低的水平下6小时，无高血糖或低血糖状态的峰值。相比之下，无完全S-GRS(L-GRS组)或仅缺乏应答元件-GOx(L-S GRS(w/o GOx)组)或放大元件AM(L-S GRS(w/o AM)组)，血糖水平仅在前一小时降低，这可以用留在水凝胶中的残留量的胰岛素的扩散来解释。之后，β-细胞的胰岛素分泌保持在基础水平并且小鼠的血糖水平恢复到高血糖状态。在β-细胞囊不存在时，经仅整合S-GRS的微针(S-GRS)处理的组或空微针(w/o GRS)组未如预期的那样展示出血糖水平显著下降。S-GRS组的血糖水平暂时升高可归因于诱导的α-淀粉酶水解和宿主葡萄糖清除(图12)。
为评估微针贴片是否可以调节血糖水平，而不引起潜在低血糖风险，使一组STZ诱导小鼠经受微针贴片置换施用。在第一次施用6小时后的第二次微针贴片处理在高血糖触发因子不存在时未分泌过量胰岛素，这样可以避免低血糖风险。而且，附加微针贴片与对照相比，能够响应于血糖水平升高而延长处理效果(图4c)。对于用整合L-S GRS的微针贴片和作为对照的空微针处理的健康小鼠的研究证明，所述设备并未引起低血糖(图4d)。L-S GRS不显著的胰岛素释放仍然将小鼠的血糖水平保持在正常范围内。葡萄糖耐量试验证明了对糖尿病小鼠的葡萄糖严密调控能力(J.Yu等Proceedings of the National Academy ofSciences 2015,112,8260；D.H.-C.Chou等Proceedings of the National Academy ofSciences 2015,112,2401)。L-S GRS施用2小时后，腹膜内(i.p.)注射葡萄糖对糖尿病小鼠进行处理。糖尿病小鼠的血糖水平显示增加100mg/dL并且在60分钟内迅速下降到初始血糖水平(图4e)。计算0至120分钟间的曲线下面积以指示微针维持葡萄糖稳态。葡萄糖激发2小时后，在微针组与对照组间观察到显著差异(图4f)。
为评估负载GSA的微针贴片的生物相容性，通过MTT测定来评价溶解的微针对β-细胞的细胞毒性(图13)。微针和相应的溶解产物以研究的浓度未显示出细胞活力显著降低。用微针贴片处理的皮肤在移除微针后的8小时内迅速复原并且注射部位H&E染色的皮肤切片未呈现出明显炎症(图14)(W.Yuan等Drug Design,Development and Therapy 2013,945)。
目前，生物相容性和安全性问题明显妨碍了胰岛细胞移植的临床应用(O.Veiseh等Nature Reviews Drug Discovery 2014,14,45；S.Mitragotri等ACS Nano 2015,9,6644；K.M.Bratlie等Advanced Healthcare Materials 2012,1,267)。不利用传统施用方法和依赖于侵入性操作，开发了基于微针贴片的策略以控制由内部高血糖状态触发的从位于外部的胰腺β-细胞的胰岛素分泌。重要的是，在这种情况的“葡萄糖水平”下，为了有效传输信号和充分刺激胰岛素从β-细胞分泌，首次并入合成放大器以快速放大生理信号。体内连续处理的结果证实了微针贴片长期严密调节葡萄糖的效力。这种方法规避了胰腺细胞疗法与免疫反应和长期功效相关的挑战性问题。这个有效施用期限可通过优化细胞密度和活力以及用于运输葡萄糖和胰岛素的基质材料的物理化学性质而进一步延长。在一个实例中，为了易于施用，可以每1、2、3、4、5、6、7天或更多天向患者递送用猪胰岛或干细胞分化的人胰腺细胞新鲜制备的贴片。公开了合成放大器，用于在原始生物信号不足以触发响应性时增强生理信号响应性药物递送系统的功效。
实施例1中所用的方法
材料
除非另有说明，否则所有化学药品购自Sigma-Aldrich。透明质酸钠(HA，分子量300kDa)购自Freda Biochem Co.,Ltd.(Shandong,China)，定制合成肽(CGRGDS,MW594.31)购自Celtek Bioscience,LLC.(Franklin,TN)，抗胰岛素抗体(ab181547)和山羊抗兔IgG H&L(FITC)(ab6717)购自Abcam，skin affix手术粘合剂购自Medline Industries,Inc.。
缺氧敏感性透明质酸(HS-HA)的合成和表征
通过形成酰胺，使6-(2-硝基咪唑)己胺化学缀合来合成缺氧敏感性透明质酸(HS-HA)。首先，合成6-(2-硝基咪唑)己胺以与HA的羧酸基团反应。简言之，将NI(0.15g，1.3mmol)溶于DMF中，向其中添加K2CO3(0.28g，2.0mmol)。然后向溶液中滴加6-(Boc-氨基)己基溴(0.39g，1.4mmol)并在80℃下搅拌4小时。通过过滤从反应混合物中分离出固体杂质并用甲醇洗涤。通过蒸发从残留溶剂中获得固体产物，使其悬浮在去离子(DI)水中，然后用乙酸乙酯萃取。收集有机层并用硫酸钠浓缩。将产物再溶解在于冰上的甲醇中。向溶液添加5mL于甲醇中的1.25M HCl并在室温(RT)下搅拌24小时。之后，使用旋转蒸发仪去除溶剂以获得胺官能化NI。其次，使6-(2-硝基咪唑)己胺在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下与HA缀合。简单地说，将0.24g的HA(分子量：约300kDa)溶于水中，向其中添加EDC(0.56g，3.4mmol)和NHS(0.39g，3.4mmol)并在室温下搅拌15分钟。稍后向混合物中添加于DMF中的6-(2-硝基咪唑)己胺(0.18g，0.85mmol)并使其在室温下反应24小时。用去离子水和甲醇的1:1混合物彻底进行透析24小时并用去离子水进行透析48小时。然后，冻干获得HS-HA并通过1H NMR(Varian Gemini 2300)表征。通过紫外-可见光吸光度测定接枝度为20％。
6-(2-硝基咪唑)己胺：1H NMR(DMSO-d6,300MHz,δppm):1.30-1.78(m,8H,NH2CH2(CH2)4),2.73(s,2H,NH2CH2),4.38(s,2H,NCH2),7.19(s,1H),7.87(s,1H)。
HS-HA：1H NMR(D2O,300MHz,δppm):1.88-2.40(m,8H,NH2CH2(CH2)4),2.87-3.19(m,4H,NH2CH2,NCH2),7.19(s,1H),7.48(s,1H)。
甲基丙烯酸化透明质酸(m-HA)的制备和表征
透明质酸(HA)通过与甲基丙烯酸酐(MA)反应而被双键改性。将2克透明质酸溶于100mL蒸馏(DI)水中，于冷室内过夜，接着滴加1.6mL甲基丙烯酸酐(MA)。通过添加5N NaOH将反应溶液保持在pH 8-9之间并且在4℃下连续搅拌24小时。随后，使m-HA在丙酮中沉淀，用乙醇洗涤3次，然后溶于蒸馏水中。用蒸馏水透析48小时后，冻干获得纯化m-HA，产率为87.5％，并且通过1H NMR(Varian Gemini 2300)表征。进行标准反卷积算法以分离密集峰后，通过比较5.74和6.17ppm(甲基丙烯酸质子)的质子峰下面积与1.99ppm(HA的N-乙酰葡糖胺)的峰下面积比例，计算改性度(DM)为约15％。
m-HA：1H NMR(D2O,300MHz,δppm)：1.85-1.96(m,3H,CH2＝C(CH3)CO),1.99(s,3H,NHCOCH3),5.74(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO),6.17(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO)。
在37℃下使用具有砂纸覆盖平行板(25mm)的TA Instruments AR-2000压力控制流变仪进行m-HA水凝胶的流变实验。用N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA 2％，重量％)和光敏引发剂(Irgacure 2959；0.05％，重量％)经由紫外照射(波长：365nm，强度：9W/cm2)1分钟，使2重量％于杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)中的m-HA水凝胶通过原位光聚合交联。实验在0.5Pa几何结构，具有2mm间隙的线性粘弹性方案中进行。测量至少进行三次以确保±10％以内的再现性。
GSA的制备和表征：通过在水溶液中自组装制备GSA。简单地说，将20mg两性HS-HA溶于水/甲醇中(2:1体积/体积)，接着添加1mg来自黑曲霉(aspergillus niger)的GOx(200U/mg，160kDa/7nm)、3mg来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的α-淀粉酶(500-1,500U/mg，51kDa/2.43nm)和6mg来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶(≥300U/mL，75kDa/3.35nm)。在4℃下搅拌混合物2小时。然后，用去离子水透析1天去除甲醇。在pH 7.4下用离心过滤器(分子质量截止值100kDa，Millipore)进一步过滤所得GSA悬浮液以通过14,000×g离心10分钟去除未负载的酶。将最终GSA悬浮液储存在4℃下用于进一步研究。对于荧光GSA，在GSA制备期间向酶溶液中添加0.01重量％的若丹明B。通过BCA(二辛可宁酸)蛋白测定法测量未封装酶的量并使用无酶囊泡作为基本校正，测定酶封装囊泡的负载容量(LC)和封装效率(EE)。LC和EE按LC＝(A–B)/C，EE＝(A–B)/A进行计算，其中A是期望封装酶量，B是收集溶液中酶的游离量，并且C是囊泡总重量。在Zetasizer(Nano ZS；Malvern)上测量ζ电位和粒度分布。用JEOL 2000FX TEM仪器获得GSA的TEM图像。
耗氧率测定
使用MitoXpress(Cayman Chemical)，根据生产商的方案测定耗氧率(OCR)。简单地说，将200μL具有0、100或400mg/dL葡萄糖，含10μL的MitoXpress探针的5mg/mL GSA溶液置于96孔板中，并在酶标仪上，在37℃下在380/650nm的激发/发射波长下对该板进行测量。每5分钟重复测量每个样品孔，取30μs和70μs延迟时间及30μs选通时间下的两个强度读数。将每个样品孔获得的TR-F强度信号转化为磷光寿命(μs)τ值，如下：τ＝(70-30)/ln(F1/F2)，其中F1和F2是70μs和30μs延迟时间下的TR-F强度信号。所得递增的寿命τ反映了每个样品中的氧浓度。
GSA的体外葡萄糖响应研究
为评价GSA的葡萄糖响应能力，将GSA在500μL含100μM NADPH和5μg/mL细胞色素c还原酶的PBS缓冲液(NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na2HPO4，10mM；KH2PO4，2mM；pH 7.4)中温育。先用乙醇洗涤α-直链淀粉，再添加到PBS溶液(10mg/mL)中。添加不同量的45％葡萄糖溶液(Corning)以达到不同葡萄糖浓度(0mg/dL、100mg/dL和400mg/dL)的最终溶液。通过质量流量计的调控在37℃下于氧浓度为21％的容器中温育混合物。以预定时间间隔，通过14,000×g离心(分子质量截止值10kDa，Millipore)10分钟，从GSA悬浮液中分离释放的酶。使用Coomassie Plus蛋白质测定检查GSA内封装的残留酶和从GSA分离的释放酶的浓度。在Infinite 200PRO多模式酶标仪(Tecan Group Ltd.)上检测A595，并用酶溶液的标准曲线校准酶含量。在pH 7.4下用离心过滤器(分子质量截止值10kDa，Millipore)，通过14,000×g离心10分钟进一步分离葡萄糖。通过葡萄糖(GO)测定法测定葡萄糖浓度。简单地说，恰当稀释样品，然后在37℃下添加测定试剂30分钟。间隔30-60秒向每管添加2.0mL的12N H2SO4，终止反应。在540nm下针对试剂空白测量吸光度。由标准曲线计算葡萄糖浓度。为绘制GSA溶液的紫外-可见光吸收，在设定时间测量A 330nm下的强度。用圆二色谱仪(Aviv)分析天然的和从GSA(1μM)释放的AA和GA的远紫外圆二色光谱。
负载GSA的微针的制造
使用10个来自Blueacre Technology Ltd.的统一硅酮模具进行微针制造。每个模具特征在于，通过激光烧蚀加工的微针锥形腔的20×20阵列。针腔底部的边长为400μm，高度为800μm且尖端的边长为5μm。等离子清洗模具后，使50μL GSA溶液沉积到模具表面上，然后真空(600mmHg)处理5分钟以使GSA溶液流入微针腔内并达到所需粘度。之后，将模具转移到Hettich Universal 32R离心机上，以2000rpm离心20分钟以将GSA压实到尖端区。GSA层完全干燥后，向模具送入第二层0.5mL 10mg/mLα-直链淀粉溶液并使用相同工艺制造模具。然后向模具表面吸取300μL混有MBA(2重量％)和光敏引发剂(0.5重量％)的m-HA溶液(4重量％)，接着进行真空处理和离心的组合。重复所述工艺3-4次，直至m-HA层干燥并且在真空条件下从模具腔内未产生明显气泡。为了支持微针贴片，在2cm×2cm模具底板周围贴一条4cm×10cm银色胶带，并向制备的微型模具贮器中添加3mL HA(5重量％)溶液，并在25℃下干燥(在真空干燥器中过夜)。完全干燥后，在30s紫外照射下(波长为365nm)使微针贴片通过原位聚合交联。将所得产品小心地与模具分离并定制以适合自制涂布器。最终微针可储存在4℃密封的6孔细胞培养板中一周。
机械强度试验
通过将针压在MTS 30G拉力试验机上的不锈钢板上，用应力-应变仪测量微针的机械强度。初始量规在微针尖端和不锈钢板间设为2.00mm，10.00N为细胞负载容量。上部不锈钢板朝微针移动的速度设为0.1mm·s-1。当针开始弯曲时记录微针的失效力。
细胞培养
小鼠胰岛瘤细胞系6(MIN6)细胞由旧金山加利福尼亚大学Michael McManus博士友情提供。所用培养基为DMEM高葡萄糖培养基，在37℃和5％CO2下每500mL培养基含胎牛血清(15％)、青霉素/链霉素(1％)和2.5uL胰岛巯基乙醇(Biorad)。每3天更换一次培养基并且使细胞传代，融合率为60％。使用MIN6细胞系的第32-38代。
胰腺β-细胞的封装
以12 000rpm离心2重量％藻酸盐水溶液以去除所有杂质。将藻酸盐(120mg)溶液与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(50mg/30mg)于pH5.0的乙酸缓冲液中混合30分钟以活化藻酸盐上的羰基，接着与附加1,6-二氨基己烷(60mg)再混合4小时。使混合物于2-丙醇(IPA)中沉淀以去除未反应的二胺。使藻酸盐-胺衍生物与具有游离硫醇Cys残基的CGRGDS肽序列在4℃下于碳酸氢钠溶液(50mM；pH＝8.5)中反应4小时(肽与藻酸盐的重量比为0.02:1)。通过用去离子水广泛透析5天(分子质量截止值3 500Da，Millipore)来纯化肽修饰的藻酸盐，通过0.22-μm过滤器灭菌并冻干。使MIN6细胞胰蛋白酶化并按(2×106个细胞/mL)悬浮在补充有1％IV型胶原蛋白的2％藻酸盐-RGD培养基中。用附带的钝形尖端，即22号金属针将混合物转移到1mL注射器中。将注射器置于配备有注射泵的电喷雾系统中。电喷雾系统的阳极与针连接，而阴极与含有50mL的20mMBaCl2的金属接收容器连接。在高压(8kV)下以0.155mL/分钟的流速喷射溶液，距接收容器的工作距离为5cm。挤出液滴(50-65uL)后，使内相在BaCl2(200mM)灭菌溶液中胶化5分钟。然后用NaCl灭菌溶液(150mM)冲洗收集的囊三次，之后转移到12孔培养板中的DMEM培养基中。对于每个实验组而言，收集到约100个均匀数量的囊并进一步引入块状水凝胶中以容许处理间的比较。用N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA 2％，重量％)和光敏引发剂(Irgacure2959；0.05％，重量％)经由紫外照射(波长：365nm)1分钟，通过m-HA在DMEM(2％，重量％，DMEM)中的光聚合，使HA水凝胶交联(图15)。
胰腺β-细胞囊的表征
为了分析细胞集群的形态特征，在Olympus IX70多参数显微镜下观察胰腺β-细胞囊。将胰腺β-细胞囊的平均直径调整为椭圆形并通过使用ImageJ软件的颗粒分析方法调节图像来进行分析。
用LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒(Invitrogen)使定性细胞活力可视化。在含4μM钙-淀粉酶和8μM乙锭均二聚物-1的PBS(NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na2HPO4，10mM；KH2PO4，2mM；pH 7.4)中温育细胞囊1小时。然后在PBS中冲洗囊以去除过量染色液并用2％多聚甲醛固定15分钟。将囊置于载玻片上并经由配备有数码相机和兼容LAS-AF软件的LeicaDM5500B荧光显微镜成像。通过对活细胞(绿色)(激发波长494nm；发射波长517nm)和死细胞(红色)(激发波长528nm；发射波长617nm)计数对活力进行量化。
葡萄糖响应系统(GRS)的表征
使用SEM表征微针贴片的形态。使用双面粘性碳片将微针连同其底部一起附于SEM样品架上。使用EmTech Turbo EM溅射涂布器为样品涂上7nm厚的金-钯层。在北卡罗来纳州立大学分析仪器设施的FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)上进行成像。经钙-淀粉酶染色的胰腺β-细胞囊置于负载有若丹明标记的GSA的微针贴片的背面。用Olympus IX70多参数荧光显微镜从L-S GRS的侧视图获取荧光图像。
葡萄糖刺激胰岛素分泌
通过静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定法测试封装细胞的功能评估。实验前2-3天，每张96孔板(Corning Costar)接种2×105个MIN6细胞。与2D细胞培养类似，在葡萄糖处理前1天在96孔板中培养相同量的于3D囊中的细胞(10个/孔)。预先制备补充有0.1％BSA的Kerbs–Ringer(KRB)缓冲液(128mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mMMgSO4、2.5mM CaCl2、10mM HEPES，0.1％(w/v))。在37℃、5％CO2下于KRB缓冲液BSA中温育细胞2小时，然后在相同条件下用100mg/dL或400mg/dL葡萄糖温育45分钟。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Alpco.)量化细胞分泌的胰岛素的量。将含400mg/dL葡萄糖的KRB中胰岛素分泌的量归一化为含100mg/dL葡萄糖的KRB中分泌的胰岛素并表示为胰岛素分泌指数。
免疫荧光成像
封装6小时后，在4℃下于4％多聚甲醛中固定细胞，然后包埋在OCT化合物(SakuraFinetek)中并且在干冰上于异戊烷浴中快速冷冻。制作冷冻细胞囊切片(5-μm厚)，固定在显微镜载玻片上并储存在-80℃下。为了对具有免疫荧光的胰岛素染色，洗涤载玻片两次，使用0.1％Triton X100溶液渗透30分钟，随后使用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1小时。封闭后，在4℃下施加1/200稀释的兔胰岛素一级单克隆抗体(abcam 181547)过夜，接着洗涤并用1/400稀释的二级抗体山羊抗兔IgG(Alexa488)(abcam 150077)(绿色)温育。洗涤载玻片三次，施加细胞透性染料DAPI对细胞核染色并盖上盖玻片。使用OlympusIX70多参数荧光显微镜为样品成像并使用ImageJ软件处理。
GRS的体外葡萄糖响应研究
使用微流体设备进行胰岛素从微针的释放，作为对血液循环系统的芯片实验室仿真。为了动态评价葡萄糖响应能力，将微针贴片置于微流体通道的开放中心，同时释放介质流过针尖(pH 7.4KRB，具有不同葡萄糖浓度)。在两个单独的注射泵(Harvard ApparatusPHD 2000,Holliston,MA)上将输注和抽取速率设为50μL/分钟。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Alpco.)量化胰岛素释放速率。在Infinite 200PRO多模式酶标仪(Tecan Group Ltd.,Switzerland)上在450nm下测量胰岛素含量，并用胰岛素标准曲线校准。
使用STZ诱导型糖尿病小鼠进行体内研究
对STZ诱导型成年糖尿病小鼠(雄性C57B6，Jackson Lab,U.S.A.)评价微针贴片用于糖尿病治疗的体内功效。动物研究方案经北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会批准。使用Clarity GL2Plus血糖仪(ClarityDiagnostics,Boca Raton,Florida)从小鼠尾静脉血样(约3μL)测量血浆当量葡萄糖。施用之前监测其血糖水平两天，施用前所有小鼠禁食过夜。每组选择5只小鼠用微针进行皮下处理，微针含无GRS的空微针(w/o GRS)、仅整合L-GRS的微针(L-GRS)、仅整合S-GRS的微针(S-GRS)、整合L-S-GRS的微针(L-S GRS)、整合L-S-GRS但S-GRS中无GOx的微针(L-S GRS(w/oGOx))及整合L-S-GRS但S-GRS中无α-直链淀粉的微针(L-S GRS(w/o AM))。以5N/张贴片用自制涂布器将微针贴片施加到背部皮肤上，持续10分钟。使用skin affix手术粘合剂将贴片固定在皮肤上以持续释放。将12mm×12mm×5mm定制PDMS模具盖在贴片上。PDMS模具内部，胰腺β-细胞囊包埋在由DMEM制成的用于营养供给的交联m-HA水凝胶中。对于MN(S-GRS)、MN(w/o GRS)组，无细胞并入设备内。然后连续监测每个组施用小鼠的血糖水平(5、15、30和60分钟时，之后每小时一次)。进行葡萄糖耐量试验以确认微针施用2小时后微针的体内葡萄糖响应性。简单地说，使小鼠禁食过夜并施用L-S GRS。当小鼠葡萄糖水平于施用2小时后达到最低时，经腹腔注射给予小鼠1.5g葡萄糖/kg(45％无菌葡萄糖溶液，corningcellgro)。对健康小鼠进行葡萄糖耐量试验作为对照。从尾静脉吸取血液，并于葡萄糖施用后0、10、20、30、40、60、90和120分钟使用血糖仪测量葡萄糖水平。类似地，为评估低血糖风险，为两组健康小鼠施用MN(L-S GRS)或MN(w/o GRS)，但不经受葡萄糖激发。
生物相容性研究
使用比色甲基噻唑基四唑(MTT)测定法进行细胞增殖分析。按每孔5,000个细胞的密度将MIN6细胞接种到96孔板中并且在100μL的DMEM中培养。然后将板于5％CO2中在37℃下温育12小时以达到70-80％融合，之后添加连续稀释的微针溶解液。温育24小时后，用KRB溶液洗涤细胞并与100μL无FBS的新鲜DMEM和新鲜制备的20μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑嗅溶液(MTT溶液，5mg/mL)一起温育。再将板温育4小时。之后，小心地去除培养基，接着再添加150μL二甲亚砜(DMSO)。在10分钟内使用酶标仪(Infinite M200Pro,Tecan,Morrisville,NC,USA)读取590nm下板的吸光度，参考波长为620nm。
为评价在小鼠模型中微针贴片的生物相容性。在施用后第2天，通过CO2窒息使小鼠安乐死并切除周围组织。施用PBS的小鼠用作阴性对照。将组织在10％福尔马林(formalin)中固定，然后石蜡包埋，切成50-μm切片，并使用H&E染色用于组织学分析。
统计分析
数据呈现为平均值±SD。使用学生t检验或ANOVA检验进行统计分析。当P≤0.05时，实验组和对照组之间的差异被视为具有统计学意义。
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Claims (82)

1.一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：
多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；
基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；和
信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自所述受者的所述生理信号的元件。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述信号放大器系统整合到所述微针内。
3.如权利要求1或2所述的设备，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的所述药剂的体积或量能够基于所述生理信号而改变。
4.如权利要求3所述的设备，其中来自所述受者的所述生理信号在没有从所述信号放大器系统放大时，不足以被所述反馈元件检测到。
5.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的药剂的所述装置包括细胞。
6.如权利要求5所述的设备，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
7.如权利要求5或6所述的设备，其中所述细胞能够产生药剂，或基于来自所述信号放大器系统的放大信号改变产生的药剂的量。
8.如权利要求1-7中任一项所述的设备，其中所述贮器是半渗透的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的设备，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的设备，其中所述贮器包括治疗剂、预防剂或诊断剂。
11.如权利要求10所述的设备，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
12.如权利要求11所述的设备，其中所述药剂为胰岛素。
13.如权利要求1-12中任一项所述的设备，其中所述生理信号是所述受试者体内的生物物质。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述受试者的生理反应包括生理环境因素，包括pH、温度、血糖水平和其它生物标志。
15.如权利要求10所述的设备，其中所述生物物质为葡萄糖。
16.如权利要求1所述的设备，其中所述信号放大器系统包括自组装聚合纳米囊泡。
17.如权利要求16所述的设备，其中所述葡萄糖信号放大器包括葡糖氧化酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
18.如权利要求1-17中任一项所述的设备，其中所述信号放大器系统处于所述微针的尖端。
19.一种用于运输物质穿过受试者的生物屏障的设备，其包括：
多根微针，其各自具有底端和尖端，在所述底端和所述尖端处或在所述底端与所述尖端之间设置有至少一条通路；
基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测生理信号的装置，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的所述药剂的体积或量能够基于所述生理信号而改变。
20.如权利要求19所述的设备，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的药剂的所述装置包括细胞。
21.如权利要求20所述的设备，其中所述细胞为人细胞。
22.如权利要求19-21中任一项所述的设备，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
23.如权利要求19-22中任一项所述的设备，其中所述贮器是半渗透的。
24.如权利要求19-23中任一项所述的设备，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
25.如权利要求19-24中任一项所述的设备，其中所述细胞能够产生治疗剂、预防剂或诊断剂。
26.如权利要求25所述的设备，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
27.如权利要求26所述的设备，其中所述药剂为胰岛素。
28.如权利要求19-27中任一项所述的设备，其中所述生理信号是所述受试者体内的生物物质。
29.如权利要求28所述的设备，其中所述受试者的生理反应包括生理环境因素，包括pH、温度、血糖水平和其它生物标志。
30.如权利要求29所述的设备，其中所述生物物质为葡萄糖。
31.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
i)多根微针，其各自具有底端和尖端；
ii)基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
iii)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自受者的生理信号的装置；和
iv)信号放大器系统，其中所述信号放大器系统包括能够放大来自所述受者的所述生理信号的元件；
b)将所述微针插入所述生物屏障内；以及
c)通过所述微针将所述药剂递送到所述生物屏障内，其中递送的药剂的量或体积由从所述信号放大器系统接收的信号确定。
32.如权利要求31所述的方法，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的物质的所述装置包括细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述贮器由能够用于递送细胞产物的材料基质构成。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述细胞能够响应于来自所述信号放大器系统的信号产生药剂。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述贮器包括治疗剂、预防剂或诊断剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述药剂为胰岛素。
40.如权利要求31所述的方法，其中所述信号放大器系统放大信号，从而基于所述受试者体内存在的所述信号的强度来改变要运输的药剂的体积或量。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述生理信号是所述受试者体内的生物物质。
42.如权利要求31-41中任一项所述的方法，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的所述药剂的体积或量能够基于所述生理信号而改变。
43.如权利要求42所述的方法，其中来自所述受者的所述生理信号在没有从所述信号放大器系统放大时，不足以被所述反馈元件检测到。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述受试者的生理反应包括生理环境因素，包括pH、温度、血糖水平和其它生物标志。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述信号为葡萄糖。
46.如权利要求31-45中任一项所述的方法，其中所述信号放大器系统包括自组装聚合纳米囊泡。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述葡萄糖信号放大器包括葡糖氧化酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
48.如权利要求31-47中任一项所述的方法，其中所述信号放大器系统处于所述微针的尖端。
49.如权利要求31-48中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有糖尿病。
50.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
i)多根微针，其各自具有底端和尖端；
ii)基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
iii)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测生理信号的装置，其中所述药剂递送系统包括反馈元件，使得要运输穿过所述生物屏障的所述药剂的体积或量能够基于所述生理信号而改变；以及
b)将所述微针插入所述生物屏障内；以及
c)通过所述微针将所述药剂递送到所述生物屏障内，其中递送的药剂的量或体积基于所述生理信号。
51.如权利要求50所述的方法，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的物质的所述装置包括细胞。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述贮器由能够用于递送细胞产物的材料基质构成。
54.如权利要求50所述的方法，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述贮器包括治疗剂、预防剂或诊断剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述药剂为胰岛素。
58.如权利要求50-57中任一项所述的方法，其中所述受试者的生理反应包括生理环境因素，包括pH、温度、血糖水平和其它生物标志。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述信号为葡萄糖。
60.如权利要求50-59中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有糖尿病。
61.一种用于递送治疗剂、预防剂或诊断剂穿过生物屏障的具有多个部件的药盒，其包括：
a)微针贴片，其包括多根各自具有底端和尖端的微针，和基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
b)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自所述受者的生理信号的装置；和
c)信号放大器系统，其中要运输的药剂的体积或量基于从所述信号放大器系统接收的信号而改变。
62.如权利要求61所述的药盒，其中所述贮器由用于递送细胞产物的材料基质构成。
63.如权利要求61或62所述的药盒，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的药剂的所述装置包括细胞。
64.如权利要求63所述的药盒，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
65.如权利要求63或64所述的药盒，其中所述细胞能够响应于来自所述信号放大器系统的信号产生药剂。
66.如权利要求61-65中任一项所述的药盒，其中所述贮器是半渗透的。
67.如权利要求66所述的药盒，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
68.如权利要求60所述的药盒，其中所述贮器包括治疗剂、预防剂或诊断剂。
69.如权利要求68所述的药盒，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
70.如权利要求69所述的药盒，其中所述药剂为胰岛素。
71.如权利要求69所述的药盒，其中所述信号放大器系统包括自组装聚合纳米囊泡。
72.如权利要求71所述的药盒，其中所述葡萄糖信号放大器包括葡糖氧化酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
73.如权利要求60-72中任一项所述的药盒，其中所述信号放大器系统处于所述微针的尖端。
74.一种用于递送治疗剂、预防剂或诊断剂穿过生物屏障的具有多个部件的药盒，其包括：
a)微针贴片，其包括多根各自具有底端和尖端的微针，和基板，所述微针的底端附接或整合到所述基板上；
b)至少一个与所述微针阵列的底端连接的贮器，其中所述贮器包括药剂递送系统，其中所述药剂递送系统包括要运输穿过所述生物屏障的药剂，或用于产生要运输穿过所述生物屏障的药剂的装置，和用于检测来自所述受者的生理信号的装置。
75.如权利要求74所述的药盒，其中所述贮器由用于递送细胞产物的材料基质构成。
76.如权利要求74或75所述的药盒，其中用于产生要运输穿过所述生物屏障贮器的药剂的所述装置包括细胞。
77.如权利要求74所述的药盒，其中所述细胞为胰腺β细胞或干细胞分化的人胰腺细胞。
78.如权利要求74-77中任一项所述的药盒，其中所述贮器是半渗透的。
79.如权利要求74所述的药盒，其中所述贮器包括藻酸盐微凝胶。
80.如权利要求74所述的药盒，其中所述贮器包括治疗剂、预防剂或诊断剂。
81.如权利要求80所述的药盒，其中所述药剂选自肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性无机分子及其组合。
82.如权利要求81所述的药盒，其中所述药剂为胰岛素。
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