CN112807489A - 一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架及其制备方法与应用，涉及医用材料技术领域。本发明方法采用双注射方式，通过并行注射预凝胶溶液和粘度调节剂，得到凝胶化的梯度可注射脱细胞支架。该脱细胞支架可以搭载MSCs植入体内，在生理pH值下发生水解，在损伤部位缓慢释放药物，实现促进负载的MSCs向软骨细胞的分化，对损伤的软骨组织进行修复；其具有的梯度性，能够更好的模拟软骨组织原有的生物学特点，起到更好的修复效果。本发明脱细胞支架和技术，原料便宜，来源广泛，临床推广后可以显著减少患者病痛，减少手术次数，提高治疗效果，具有显著的社会和经济效益。

Description

一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架及其制备方法与应用。
背景技术
膝关节是人体中结构最复杂的关节之一，起着全面且复杂的稳定作用。近几年来，国民健身运动逐渐得到普及和发展，加之我国逐渐进入老龄化社会，使得膝关节疾患呈现直线上升的趋势，尤其是软骨损伤一直是临床医学上常见的问题。
软骨损伤在临床上的表现主要以关节疼痛、积液和功能障碍为主。而软骨损伤主要在反复慢性损伤和退变中比较常见，一旦延误最佳治疗时机，将很容易导致创伤性关节炎，进一步影响患者的活动功能。膝关节软骨主要由覆盖于膝关节表面的透明软骨组成，一些创伤或关节内部等相关疾病都可以引发膝关节软骨损伤，但由于其主要靠关节液营养，软骨无血液供应以及无神经分布的特点，膝关节软骨损伤后自身修复能力还有很大不足，自身修复所得到的也多为纤维软骨而非透明软骨。
因此，对于膝关节软骨损伤的临床治疗变得十分重要。然而面对众多的膝关节软骨损伤患者，在治疗膝关节软骨损伤的过程中，需要根据患者的膝关节软骨损伤部位选择适宜的治疗方法。
目前针对软骨损伤的治疗方法主要分为两类，药物治疗和手术治疗。虽然已经有多种治疗方法用于临床，但是均具有一定的局限性和缺点。晚期患者通常需要进行人工关节置换术，有可能会导致术后的并发症和复发症，而且人工关节的使用寿命也应当纳入考虑当中，翻修手术有着较高的难度和风险，可能对患者造成二次伤害。因此对早期软骨退化的延缓及修复目前研究的重点及难点。
软骨损伤的传统药物疗法主要使用透明质酸钠和地塞米松进行关节间注射，由于药物所具有的抗炎作用和润滑作用，这种方法可以有效的缓解疼痛，提高患者的关节活动能力。但由于药物缺乏特异性，不易在损伤部位处吸收，并且未被吸收的药物会随着滑膜液代谢脱离作用部位，或者因为相关酶的存在发生降解，所以导致作用时间较短。而且无法对受损的软骨组织进行修复。近年来，越来越多的学者开始关注组织工程疗法。
组织工程疗法的原理是将细胞从生物体内分离出之后在体外进行培养扩增，再将其与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物支架按一定比例混合后，使细胞黏附在生物支架上，植入体内损伤的组织或器官，随着生物支架的降解，植入的细胞在体内不断增殖并最终形成相应的组织或器官，实现组织的再生。
目前进行软骨修复主要使用间充质干细胞。间充质干细胞具有多向分化的能力，在一定的培养环境下可以实现向软骨细胞，成骨细胞，脂肪细胞或成肌细胞的分化。不同组织来源的干细胞具有不同的分化特性，其中滑膜间充质干细胞具有最强的向软骨细胞分化的潜力，而且间充质干细胞可以稳定软骨细胞的特异性表型以防止其发生去分化。同时与软骨细胞相比，间充质干细胞的来源较多因此更适用于通过组织工程进行软骨修复。
使用生物支架搭载干细胞植入又对生物支架的组成提出了一定要求，天然生物支架的强度较弱而且降解速度较快，人工合成的支架又有生物相容性差，有可能引起免疫反应等缺点。生物支架的主要作用是模拟组织细胞在体内的生长并对其进行固定，为细胞分化增殖，以及软骨的形成提供一个良好的微环境，尽管合成材料可以通过改性赋予其与细胞微环境类似的机械性能和生物化学性质，但是这些材料仍然不能模仿原组织中细胞与细胞外基质的多种相互作用。
最新的研究结果显示，近些年来，脱细胞化细胞外基质(decellularuzedextracellular matrix，dECM)作为一种生物材料逐渐被用于组织工程中。因为dECM在最大限度上保留有原组织的化学与结构组成，故其拥有与原组织类似的生化环境和机械强度，同时dECM与细胞相亲性良好，可以促进细胞增殖，并且为细胞分化提供适当的诱因。细胞外基质的脱细胞化可以通过物理法，化学法或生物法实现，主要目的是为了在最大限度保留细胞外基质各种组分的前提下除去其所含有的DNA，使得在植入体内后可以避免体内免疫反应的发生。将已进行脱细胞化的细胞外基质进一步使用胃蛋白酶进行消化之后，可以得到溶解的dECM，这种均质的溶液可以在注射入体内之后在生理温度和pH下自发进行凝胶，从而实现对损伤部位的原位治疗。
Kartogenin(KGN)是近些年来发现的一种对软骨修复能力有着巨大促进作用的小分子。从机理方面分析，KGN主要起作用是通过激活smad4/smad5通路，进而促进间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化，促进软骨组织的生成，而且KGN可以促进软骨细胞细胞外基质的分泌。但是KGN本身并不能溶于水，直接进行注射的话效果较弱，因此找到合适的载体负载KGN以实现其在修复过程中的缓慢释放具有极为重要的意义。
软骨组织本身具有层状结构，针对这一特点，研究人员也开发出了双相支架材料用于一体化修复骨软骨的损伤，但是这种支架并不能模拟软骨组织本身的多层结构。多层支架的发现使得对软骨损伤的修复效率进一步提高，但是其仍然具有不可避免的在不同层之间会出现分界线，有可能由于固定性差而出现脱落等特点。
综上所述，制备一种具有良好的机械强度和缓释性能，同时能够更好的模拟软骨组织原有的生物学特点的支架材料，对搭载干细胞植入体内修复受损软骨组织具有重要临床意义。
发明内容
本发明研究生物医用材料学、细胞生物学、关节外科学等交叉学科。针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的首要目的在于提供一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架。
本发明的再一目的在于提供上述用于软骨修复的可注射脱细胞支架的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，包括如下步骤：
1)将脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒混合，用磷酸盐缓冲液稀释成预凝胶溶液；
2)将壳聚糖溶解于水中，得到粘度调节剂；
3)采用双注射方式，并行注射预凝胶溶液和粘度调节剂，得到凝胶化的梯度可注射脱细胞支架。
步骤1)中所述的脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒的配比优选为1000～10：1。
步骤1)中所述的磷酸缓冲液的用量，优选按脱细胞化细胞外基质在体系中的浓度为按8～12mg/mL计算；更优选按10mg/mL计算。
步骤1)中所述的磷酸盐缓冲液，优选浓度0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。
步骤1)中所述的脱细胞化细胞外基质，是由软骨组织采用脱细胞技术制备得到；具体的制备方法如下：
a.软骨组织切成0.5～1mm，优选为0.7mm厚的片，冻干磨成粗粉；将粗粉依次置于0.1％～5％(w/v)，优选为1％(w/v)的乳化剂溶液中搅拌24～72h，优选为48h，置于DNA酶/RNA酶混合溶液中搅拌8～24h，优选为12h，再次置于0.1％～5％(w/v)，优选为1％(w/v)的乳化剂溶液中搅拌24～72h，，优选为48h；去离子水中浸泡除去残余化学物质，冻干磨成细粉；
b.将细粉置于10～20mg/mL，优选为15mg/mL的胃蛋白酶溶液中消化处理24～72h；调节体系的酸碱度至中性，获得所述的脱细胞化细胞外基质。步骤a中所述的乳化剂，优选为十二烷基磺酸钠(SDS)或Triton X-10中的至少一种。
步骤a中所述的乳化剂溶液，优选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液(PBS)中的至少一种配制。
步骤b中所述的胃蛋白酶溶液，优选用0.01mol/L的HCl溶液配制。
步骤b中所述的胃蛋白酶溶液的用量，优选按胃蛋白酶与细粉的质量比为1：2～100计算；更优选按质量比为1：10计算。
步骤b中所述的调节体系的酸碱度所用的调节剂，优选为0.1mol/L NaOH溶液和10×PBS缓冲液。
步骤1)中所述的负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒的介孔二氧化硅优选采用改进型Stober法制备得到；所述的负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒的具体的制备方法如下：
A.将80～120g水，20～30g乙醇，0.1～2mL浓氨水和0.5～2g十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，反应30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应8～24h；反应产物洗涤，利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，得到介孔二氧化硅；
B.将0.5～5g步骤A得到的介孔二氧化硅分散在50～500g乙醇中，加入0.1～1g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应8～24h，反应产物洗涤，得到表面氨基改性的介孔二氧化硅；
C.将1mg的Kartogenin溶解于10mL DMSO中，得到溶液I，将1mg的表面氨基改性的介孔二氧化硅溶解于10mL DMSO中，得到溶液II；将溶液I和溶液II按体积比1～10：1～10混合；加入二环己基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(DDC/NHS)，在35℃下反应8～24h，离心，洗涤，冻干，获得负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒。
所述的步骤A的具体操作优选为：将100g水，23.4g乙醇，0.18mL浓氨水和0.8g十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，反应30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应8～24h；反应产物洗涤，利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，得到介孔二氧化硅干粉。
所述的步骤B的具体操作优选为：将1g步骤A得到的介孔二氧化硅干粉分散在100g乙醇中，加入0.25g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应8～24h，反应产物洗涤，得到表面氨基改性的介孔二氧化硅。
步骤2)中所述的壳聚糖的粘度优选为200mPa·s以上，更优选为200～600mPa·s，最优选为400mPa·s。
步骤2)中所述的壳聚糖的浓度优选为0.1％～2％(w/v)，更优选为1％(w/v)。
步骤3)中所述的并行注射中，凝胶溶液和粘度调节剂的用量按体积比1～5:1配比；更优选为按体积比2:1配比。
步骤3)中所述的并行注射中，针头间距优选为0.4～0.6cm，更优选为0.5cm。
步骤3)中所述的并行注射中，凝胶溶液的注射速度为1～3mL/min，优选为2mL/min，粘度调节剂的注射速度为3～5mL/min，优选为4mL/min。
一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架，通过上述方法制备得到。
上述用于软骨修复的可注射脱细胞支架联合间充质干细胞在制备软骨修复装置中的应用。具体操作如下：
1)将脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒混合，接种间充质干细胞，混合均匀，用磷酸盐缓冲液稀释成预凝胶溶液；
2)将壳聚糖溶解于水中，得到粘度调节剂；
3)采用双注射方式，并行注射预凝胶溶液和粘度调节剂，得到凝胶化的梯度可注射脱细胞支架。
步骤1)中所述的间充质干细胞的接种量优选为1×105～2×105细胞/mL混合液。
一种软骨修复装置，所述的软骨修复装置包括并联的两只针筒；两支针筒分别装有上述预凝胶溶液和粘度调节剂。
所述的预凝胶溶液和粘度调节剂的体积比优选为1～5:1；更优选为2:1。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本发明创建了全新的基于脱细胞基质的软骨损伤修复材料，通过采用模拟原组织结构的的脱细胞基质制备的可注射原位凝胶生物支架，具备可注射、可在生理环境下自凝胶、梯度性质等特征，解决了修复不规则软骨损伤的难题。
本发明方法通过优化脱细胞基质的制备方法，与传统的制备方法相比，进一步使用胃蛋白酶进行消化，制得可进行注射的脱细胞基质，调控化学组分，制备降解性、凝胶速度及力学性能更优的水凝胶，实现在生理条件下原位凝胶；通过在凝胶过程中加入浓度调节剂和交联剂，使得形成的凝胶具有梯度性质，可以进一步模拟软骨原有的层状结构，实现不规则软骨损伤的修复，提高软骨修复效率。
本发明脱细胞支架可以搭载搭载MSCs后植入体内对损伤的软骨组织进行修复。脱细胞基质表面具有负电荷，可以进一步与负载有KGN的微球进行共混，加强MSCs向软骨细胞分化的能力，随着支架材料在生理pH值下发生水解，在损伤部位缓慢释放药物，实现促进负载的间充质干细胞向软骨细胞的分化，从而提高修复效果。
本发明脱细胞支架具有良好的力学性能，动摩擦系数小于0.005，压缩模量和弹性模量达到0.5～25Kpa。
本发明所述软骨再生支架材料和技术，原料便宜，来源广泛，临床推广后可以显著减少患者病痛，减少手术次数，有显著的社会和经济效益。
附图说明
图1是本发明所述可注射脱细胞支架制备工艺流程图。
图2是实施例1制备的细胞支架示意图；其中，图A为模具，图B为所制得的梯度凝胶。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及附图来进一步说明本发明技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。其中，下述实施例中涉及的部分材料：
Kartogenin(KGN)：购自Sigma-Aldrich，产品型号为SML0370。
间充质干细胞：购自赛业生物科技有限公司，产品型号为RBXMX-01001。
1％(w/v)乳化剂的缓冲液溶液：其配制方法为：将SDS按1％(w/v)的浓度溶解于浓度为0.01mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液得到。
DNA酶和RNA酶的混合溶液：其配制方法为：将DNase和RNase分别以2.5％和4％的浓度溶解于浓度为0.01mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液中。
壳聚糖：购自Innochem，产品型号为A41618，粘度为400mPa·s。
软骨组织：猪膝关节采购于肉类加工厂，购回后自行剥离软骨组织。
实施例1
步骤1：软骨组织切成0.5mm厚的片，在-80℃冷冻并磨成粗粉。粉末置于1％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌24h。随后，样品置于DNA酶和RNA酶的混合溶液中搅拌8h。再重新置于1％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌72h，随后在大量去离子水中浸泡过夜除去残余化学物质。在-80℃下冷冻并继续进行冻干，随后磨成细粉，加入到15mg/mL的胃蛋白酶/0.01mol/LHCl溶液中。胃蛋白酶与细粉的质量比为1：10。所得悬浮液在室温下搅拌48h使进行完全消化。所得粘性溶液使用0.1mol/L NaOH溶液和10×PBS在冰水浴中调至中性，得到可注射dECM；
步骤2：介孔二氧化硅的合成采用加入制孔剂十六烷基三甲基溴化铵的改进型Stober法制备，即将100g水，23.4g乙醇，0.8mL浓氨水和0.8g十六烷基三甲基溴化铵加入到烧瓶中，搅拌混匀30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应24h。产物使用乙醇反复洗涤后，再加入到索氏提取器中利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，即得到介孔二氧化硅颗粒干粉。将得到的1g介孔二氧化硅分散在100g乙醇中，加入0.25g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应24h，产物使用乙醇，蒸馏水洗涤，即可得到表面氨基改性的药物载体颗粒；
步骤3：取1mg的KGN溶解于10mL DMSO中，与步骤2所得载体颗粒的、浓度为1％的DMSO分散液按1：1比例混合，加入0.1mg DDC/NHS(DDC与NHS的摩尔比为1：2)催化氨基和羧基的缩合，35℃反应24h，离心分离，使用蒸馏水洗涤，冻干，即可得到介孔二氧化硅-KGN微球；
步骤4：将步骤1得到的脱细胞化细胞外基质与步骤3得到的介孔二氧化硅-KGN微球以100：1的质量比混合，然后使用0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的PBS按dECM浓度为10mg/mL稀释成预凝胶溶液，作为组分A；
步骤5：配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；组分A和组分B按体积比2:1采用双通道加料进行注射，针头间距为0.5cm；凝胶溶液的注射速度为2mL/min，粘度调节剂的注射速度为4mL/min，结果如图2所示；
或者，配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；将组分A和组分B按照体积比2:1分别装在并联的两只针筒里，并采用无菌包装。
实施例2
步骤1：软骨组织切成0.7mm厚的片，在-80℃冷冻并磨成粗粉。粉末置于1.5％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌24h。随后，样品置于DNA酶和RNA酶的混合溶液中搅拌8h。再重新置于1％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌48h，随后在大量去离子水中浸泡过夜除去残余化学物质。最后，所得的dECM在-80℃下冷冻并继续进行冻干，随后磨成细粉，加入到15mg/mL的胃蛋白酶/0.01mol/L HCl溶液中。胃蛋白酶与基质的质量比为1：2。所得悬浮液在室温下搅拌48h使进行完全消化。粘性溶液使用0.1mol/L NaOH溶液和10×PBS在冰水浴中调至中性，得到可注射dECM；
步骤2：介孔二氧化硅的合成采用加入制孔剂十六烷基三甲基溴化铵的改进型Stober法制备，即将100g水，20g乙醇，1mL浓氨水和1.5g十六烷基三甲基溴化铵加入到烧瓶中，搅拌混匀30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应8h。产物使用乙醇反复洗涤后，再加入到索氏提取器中利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，即得到介孔二氧化硅颗粒干粉.将得到的1g介孔二氧化硅分散在100g乙醇中，加入0.25g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应24h，产物使用乙醇，蒸馏水洗涤，即可得到表面氨基改性的药物载体颗粒；
步骤3：取1mg的KGN溶解于10mL DMSO中，与上述载体颗粒的DMSO分散液混合，该分散液浓度为0.1％，加入DDC/NHS催化氨基和羧基的缩合，35℃反应8h，离心分离，使用蒸馏水洗涤，冻干，即可得到介孔二氧化硅-KGN微球；
步骤4：将步骤1得到的脱细胞化细胞外基质与步骤3得到的介孔二氧化硅-KGN微球以100：1的质量比混合，然后使用0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的PBS按dECM浓度为10mg/mL稀释成预凝胶溶液，作为组分A；
步骤5：配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；组分A和组分B按体积比1:1采用双通道加料进行注射，针头间距为0.5cm；凝胶溶液的注射速度为2mL/min，粘度调节剂的注射速度为4mL/min；
或者，配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；将组分A和组分B按照体积比2:1分别装在并联的两只针筒里，并采用无菌包装。
实施例3
步骤1：软骨组织切成0.7mm厚的片，在-80℃冷冻并磨成粗粉。粉末置于3％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌24h。随后，样品置于DNA酶和RNA酶的混合溶液中搅拌12h。再重新置于3％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌48h，随后在大量去离子水中浸泡过夜除去残余化学物质。最后，所得的dECM在-80℃下冷冻并继续进行冻干，随后磨成细粉，加入到15mg/mL的胃蛋白酶/0.01mol/L HCl溶液中。胃蛋白酶与基质的质量比为1：50。所得悬浮液在室温下搅拌48h使进行完全消化。粘性溶液使用0.1mol/L NaOH溶液和10×PBS在冰水浴中调至中性，得到可注射dECM；
步骤2：介孔二氧化硅的合成采用加入制孔剂十六烷基三甲基溴化铵的改进型Stober法制备，即将100g水，20g乙醇，1mL浓氨水和1.5g十六烷基三甲基溴化铵加入到烧瓶中，搅拌混匀30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应16h。产物使用乙醇反复洗涤后，再加入到索氏提取器中利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，即得到介孔二氧化硅颗粒干粉.将得到的5g介孔二氧化硅分散在100g乙醇中，加入1g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应24h，产物使用乙醇，蒸馏水洗涤，即可得到表面氨基改性的药物载体颗粒；
步骤3：取1mg的KGN溶解于10mL DMSO中，与上述载体颗粒的DMSO分散液混合，该分散液浓度为5％，加入DDC/NHS催化氨基和羧基的缩合，35℃反应8h，离心分离，使用蒸馏水洗涤，冻干，即可得到介孔二氧化硅-KGN；
步骤4：将步骤1得到的脱细胞化细胞外基质与步骤3得到的介孔二氧化硅-KGN微球以100：1的质量比混合，然后使用0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的PBS按dECM浓度为10mg/mL稀释成预凝胶溶液，作为组分A；。
步骤5：配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；组分A和组分B按体积比3:1采用双通道加料进行注射，针头间距为0.5cm；凝胶溶液的注射速度为2mL/min，粘度调节剂的注射速度为4mL/min；
或者，配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；将组分A和组分B按照体积比2:1分别装在并联的两只针筒里，并采用无菌包装。
实施例4
步骤1：软骨组织切成1mm厚的片，在-80℃冷冻并磨成粗粉。粉末置于1％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌72h。随后，样品置于DNA酶和RNA酶的混合溶液中搅拌24h。再重新置于1％乳化剂的缓冲液溶液中搅拌72h，随后在大量去离子水中浸泡过夜除去残余化学物质。最后，所得的dECM在-80℃下冷冻并继续进行冻干，随后磨成细粉，加入到15mg/mL的胃蛋白酶/0.01mol/L HCl溶液中。胃蛋白酶与基质的质量比为1：20。所得悬浮液在室温下搅拌48h使进行完全消化。粘性溶液使用0.1mol/L NaOH溶液和10×PBS在冰水浴中调至中性，得到可注射dECM；
步骤2：介孔二氧化硅的合成采用加入制孔剂十六烷基三甲基溴化铵的改进型Stober法制备，即将80g水，25g乙醇，2mL浓氨水和1g十六烷基三甲基溴化铵加入到烧瓶中，搅拌混匀30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应24h。产物使用乙醇反复洗涤后，再加入到索氏提取器中利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，即得到介孔二氧化硅颗粒干粉。将得到的1g介孔二氧化硅分散在100g乙醇中，加入0.25g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应24h，产物使用乙醇，蒸馏水洗涤，即可得到表面氨基改性的药物载体颗粒；
步骤3：取1mg的KGN溶解于10mL DMSO中，与上述载体颗粒的DMSO分散液混合，该分散液浓度为8％，加入DDC/NHS催化氨基和羧基的缩合，35℃反应16h，离心分离，使用蒸馏水洗涤，冻干，即可得到介孔二氧化硅-KGN；
步骤4：将步骤1得到的脱细胞化细胞外基质与步骤3得到的介孔二氧化硅-KGN微球以100：1的质量比混合，然后使用0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的PBS按dECM浓度为10mg/mL稀释成预凝胶溶液，作为组分A；。
步骤5：配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；组分A和组分B按体积比3:1采用双通道加料进行注射，针头间距为0.5cm；凝胶溶液的注射速度为2mL/min，粘度调节剂的注射速度为4mL/min；
或者，配制1％的壳聚糖溶液，作为组分B；将组分A和组分B按照体积比2:1分别装在并联的两只针筒里，并采用无菌包装。
实施例5
参照实施例1的方法制备负载有间充质干细胞的生物支架：与实施例1的区别仅在于：步骤4的操作为：将得到的介孔二氧化硅-KGN微球以1％的固含量分散于步骤1所得可注射dECM中，然后按1×105细胞/mL接种间充质干细胞，混合均匀，再使用0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的PBS按dECM浓度为10mg/mL稀释成预凝胶溶液，作为组分A。
实施例6材料理化表征和安全性评价
1)化学性能检测
a)脱细胞基质的羟脯氨酸含量按羟脯氨酸测定法测定，为(8.41±0.36)μg·mg-1
b)葡萄糖醛含量按照YY/T 0606.9-2007附录A测定，为(1.38±0.15)μg·mg-1；c)pH值按GB9724测试，为7.39±0.06；2)物理性能检测a)压缩强度按GB/T1964检测，为(41.371±5.738)kPa
b)气孔率按GB/T1966检测，为94.587％±0.830％。
3)生物安全性评价
a)遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验按GB/T16886.3检验；
b)与血液相互作用试验按GB/T16886.4检验；
c)体外细胞毒性试验按GB/T16886.5检验；
d)植入后局部反应试验按GB/T16886.6检验；
e)降解产物的定性与定量试验按GB/T16886.9和GB/T16886.13检验；
f)刺激与致敏试验按GB/T16886.10检验；
g)全身急性、亚急性、亚慢性和慢性毒性试验按GB/T16886.11检验；
h)降解产物的毒代动力学试验按GB/T16886.16检验；
i)热原反应试验按YY/T 1500-2016检验；
j)无菌试验按GB/T 19973.2检验；
k)细菌内毒素试验按YY/T 1295-2015检验。
(2)材料的有效性评价：
1)体外有效性评价
a)细胞增殖：取材料或材料浸提液，接种(接种量为1×105细胞/mL)骨髓间充质干细胞(原代分离培养细胞)，接种后不同时间点以CCK-8试剂盒测定细胞数量，以PBS处理组为空白对照，未处理组为阴性对照，绘制细胞增殖曲线，并用SPSS软件统计分析实验结果。
b)细胞分化：qRT-PCR实验：将材料等份放入6孔板，每块材料上接种1×105个骨髓间充质干细胞，在37℃下培养30min得到包覆有软骨细胞和MSCs的dECM水凝胶。所得产物用流式细胞仪测定MSCs的CD44、CD71、CD34和CD45表达，使用qRT-PCR检测成软骨标记物Sox9、CoxⅡ和CoxⅠ的表达。
2)体内(动物)实验有效性研究(组织学、影像学、生物力学)
关节损伤动物模型通过在新西兰大白兔(SPF级，购自北京大学医学部动物实验中心)的膝关节软骨处钻孔制备。进行动物实验前将大白兔进行称重，并且配制3％的戊巴比妥钠溶液，按照l mL/kg的药量在实验动物的耳缘静脉处进行静脉注射。5分钟后如实验动物仍有挣扎反应，则再次进行注射。麻醉完成后将实验动物固定于手术台上，仰卧位。对手术部位进行剃毛，之后使用酒精进行消毒。
在手术部位选择实验动物的膝关节处进行，在兔膝关节做正中长约3cm的切口，分离皮下筋膜，部分切开股内侧肌，切开膝关节内侧支持带，将兔髌骨翻向外侧，暴露膝关节软骨面。随后在兔膝关节的滑车正中，以手摇钻做一直径为3mm的圆形骨软骨缺损，缺损深度为4.5mm。生理盐水冲洗缺损处及膝关节。逐层缝合肌肉肌腱层、皮下筋膜层及皮肤层，并使用无菌辅料包裹伤口。术后以生理盐水配制青霉素溶液，对实验动物进行肌肉注射，用量为40万单位/次。术后持续观察动物的生理状态，如有出现感染、伤口开裂等异常情况及时进行处理。
制备均质的生物支架：参照实施例1的制备方法，区别仅在于步骤5的操作为：将组分A采用单通道加料进行注射制备凝胶，注射速度为2mL/min。所得凝胶不具备梯度性质。
将所得关节损伤动物模型分为实验组和对照组。向实验组和对照组的软骨损伤处分别注射实施例5制备的生物支架以及上述均质的生物支架。等待自凝胶完成后继续培养一段时间，并且持续对实验动物的生理状态及日常活动进行观察，各组实验动物饲养条件相同，并且均可在笼内自由活动。
分别在植入后第六周，第十二周和第十八周通过医用磁共振成像设备MRI对实验动物膝软骨缺损修复情况，修复组织与宿主组织的结合进行观测。以10mL注射器抽取满管空气后对要取材的动物进行耳缘静脉穿刺，并将气体注入耳缘静脉中以造成空气栓塞杀死实验动物。随后对实验动物模型膝关节处水凝胶及周围的组织进行分离。观察股骨的修复情况，使用微纳米综合力学测试系统分别对软骨缺损区域以及正常软骨区域的正向垂直载荷量、剪切模量、弹性模量、摩擦系数、修复组织边界状态进行分析，以检测修复组织的生物力学特性。再将去下的股骨髁放入福尔马林溶液中保存，切片后进行番红O染色，苏木精/伊红和甲苯胺蓝染色，使用荧光倒置显微镜观察结果，采用国际软骨修复协会ICRS组织学评分系统评价修复情况。
本发明显示出符合设计目的和要求的理化性能和生物相容性，其体外细胞存活率大于对照的80％，体内研究未见周围组织坏死、明显炎症反应、感染，3个月内有效促进软骨再生，维持到第6个月，软骨没有蜕变。软骨缺损填充达到95％以上，修复组织均为透明软骨组织，动摩擦系数小于0.005，压缩模量和弹性模量达到0.5～25Kpa；修复组织与宿主组织及软骨下骨无缝连接，实现了新生软骨与软骨下骨的结合。
上述参照具体实施方式对该一种可注射脱细胞支架及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒混合，用磷酸盐缓冲液稀释成预凝胶溶液；
2)将壳聚糖溶解于水中，得到粘度调节剂；
3)采用双注射方式，并行注射预凝胶溶液和粘度调节剂，得到凝胶化的梯度可注射脱细胞支架。
2.根据权利要求1所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒的配比为1000～10：1；
步骤1)中所述的磷酸盐缓冲液的用量，按脱细胞化细胞外基质在体系中的浓度为8～12mg/mL计算；
步骤1)中所述的磷酸盐缓冲液是浓度0.01mol/L、pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：
步骤2)中所述的壳聚糖的粘度为200mPa·s以上；
步骤2)中所述的壳聚糖的浓度为0.1％～2％w/v；
步骤3)中所述的并行注射中，凝胶溶液和粘度调节剂的用量按体积比1～5:1配比。
4.根据权利要求1所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：
步骤3)中所述的并行注射中，针头间距为0.4～0.6cm；
步骤3)中所述的并行注射中，凝胶溶液的注射速度为1～3mL/min，粘度调节剂的注射速度为3～5mL/min。
5.根据权利要求1所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的脱细胞化细胞外基质具体的制备方法如下：
a.软骨组织切成0.5～1mm，冻干磨成粗粉；将粗粉依次置于0.1％～5％w/v的乳化剂溶液中搅拌24～72h，置于DNA酶/RNA酶混合溶液中搅拌8～24h，再次置于0.1％～5％w/v的乳化剂溶液中搅拌24～72h；去离子水中浸泡除去残余化学物质，冻干磨成细粉；
b.将细粉置于10～20mg/mL的胃蛋白酶溶液中消化处理24～72h；调节体系的酸碱度至中性，获得所述的脱细胞化细胞外基质。
6.据权利要求1所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒的具体的制备方法如下：
A.将80～120g水，20～30g乙醇，0.1～2mL浓氨水和0.5～2g十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，反应30min，再加入5mL正硅酸乙酯，35℃下反应8～24h；反应产物洗涤，利用丙酮抽提72h，水洗后冻干，得到介孔二氧化硅；
B.将0.5～5g步骤A得到的介孔二氧化硅分散在50～500g乙醇中，加入0.1～1g氨基丙基三乙氧基硅烷，在70℃下反应8～24h，反应产物洗涤，得到表面氨基改性的介孔二氧化硅；
C.将1mg的Kartogenin溶解于10mL二甲基亚砜中，得到溶液I，将1mg的表面氨基改性的介孔二氧化硅溶解于10mL二甲基亚砜中，得到溶液II；将溶液I和溶液II按体积比1～10：1～10混合；加入二环己基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，在35℃下反应8～24h，离心，洗涤，冻干，获得负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒。
7.一种用于软骨修复的可注射脱细胞支架，通过权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的用于软骨修复的可注射脱细胞支架联合间充质干细胞在制备软骨修复装置中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：具体操作如下：
1)将脱细胞化细胞外基质、负载Kartogenin的介孔二氧化硅孔纳米颗粒混合，接种间充质干细胞，混合均匀，用磷酸盐缓冲液稀释成预凝胶溶液；
2)将壳聚糖溶解于水中，得到粘度调节剂；
3)采用双注射方式，并行注射预凝胶溶液和粘度调节剂，得到凝胶化的梯度可注射脱细胞支架。
10.一种软骨修复装置，其特征在于：
所述的软骨修复装置包括并联的两只针筒；两支针筒分别装有权利要求1～6中任一项所述的预凝胶溶液和粘度调节剂；
所述的预凝胶溶液和粘度调节剂的体积比为1～5:1。
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