CN114042188A - 一种促进腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用，通过对纳米级生物玻璃颗粒表面进行氨基修饰，利用酰胺化反应枝接kartogenin小分子，并混合于由甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮及氯化钠合成的可注射温敏水凝胶，制备成该复合水凝胶。该复合水凝胶能够有效解决陈旧性肩袖损伤面临的骨质丢失和软骨缺失两大难题，且在室温下成粘稠液态，35℃以上环境中30s成胶，即将其注射至体内后能够短时间内成胶，原位释放药物并诱导细胞分化。可注射温敏体系的应用使得其操作十分便捷，又可达到原位成胶释放药物的目的。本发明可为临床上修复陈旧性肩袖损伤提供新的思路，同时促进腱骨界面的骨再生和软骨再生。

Description

一种促进腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及外科手术用材料技术领域，具体涉及一种促进腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
肩袖又叫旋转袖，是包绕在肱骨头周围的一组肌腱复合体，肱骨头的前方为肩胛下肌腱，上方为冈上肌腱，后方为冈下肌腱和小圆肌腱，附着于肱骨大结节和肱骨解剖颈的边缘，其内面与关节囊紧密相连，外面为三角肌下滑囊，这些肌腱的运动导致肩关节旋内，旋外和上举活动，但更重要的是，这些肌腱将肱骨头稳定于肩胛盂上，对维持肩关节的稳定和肩关节活动起着极其重要的作用。
肩袖的功能是上臂外展过程中使肱骨头向关节盂方向拉近，维持肱骨头与关节盂的正常支点关节。肩袖损伤将减弱甚至丧失这一功能，严重影响上肢外展功能。陈旧性肩袖损伤由于大结节骨质长期没有机械刺激，存在骨质丢失问题，同时由于腱骨界面的疤痕愈合，造成修复术后再撕裂率颇高。患者的年龄，肩袖退变、萎缩、脂质浸润程度，肩袖撕裂程度都被认为是修补后再撕裂的重要危险因素。
肩袖修复手术的成功与否很大程度上取决于骨道和肌腱之间腱-骨界面的生物愈合，而早期腱-骨界面的连接是最薄弱的环节。牢固的腱-骨界面愈合是韧带重建、肩袖修复术后发挥其生理功能的先决条件，但腱-骨界面愈合困难，如何促进腱-骨界面愈合逐渐成为了近年来国内外学者关注的热点。目前已有的生物因子或细胞注射疗法，由于因子或细胞在关节内扩散造成局部有效成分丢失，逃逸的因子或细胞还可导致异位骨化等不良反应。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种促进腱骨愈合的复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将BGs(生物活性玻璃)加入乙醇溶液中；超声分散后，向溶液中滴入APTES，搅拌、洗涤并进行真空干燥得到NH2-BGs(氨基琥珀酸甘油酯)；
步骤二，将步骤一制备的NH2-BGs加入活化的KGN(kartogenin)溶液中搅拌，在室温下反应40-56h后，清洗，制备得KGN@BGS；
步骤三，在室温下将NaCl溶液加入MC(甲基纤维素)溶液中搅拌成混合溶液；加入含KGN@BGS的水中；然后在混合液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌均匀；随后，加入PVA(聚乙烯醇)溶液，搅拌均匀，得到可促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶。
进一步地，步骤一中的BGs通过以下方法制备：将十六烷基三甲基溴化铵溶解在含有ddH2O和乙醇的混合溶液中，加热到30-46℃，连续搅拌直到完全溶解；依次加入氨水、TEOS(正硅酸乙酯)、TEP(磷酸三乙酯)，搅拌；加入硝酸钙搅拌2-3h，离心后从玻璃溶胶中分离出白色沉淀物；最后，在烘箱中烘干，然后在马弗炉中烧结，得到了BGs产品。
进一步地，在制备BGs产品的过程中，十六烷基三甲基溴化铵和硝酸钙的质量比为1:(1.5～2)。
进一步地，在马弗炉中烧结的温度为550℃，时间为6小时。
进一步地，步骤一中的乙醇溶液的浓度为98％-99％，溶剂为ddH2O。
进一步地，上述活化的KGN溶液通过以下方法制备：将KGN溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后加入PBS中，并向PBS溶液中分别加入EDC(1-乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混合搅拌活化KGN的羧基。
进一步地，添加的EDC和NHS的物质的量比为10～13:7。
本发明的第二方面是提供采用上述制备方法制备的复合水凝胶。
进一步地，该复合水凝胶中KGN的浓度为300-340μg/mL，BGs的浓度为 05-2.5mg/mL，甲基纤维素的浓度为0.008-0.015g/mL，氯化钠的浓度为0.008-0.012g/mL，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.008-0.015g/mL，聚乙烯醇的浓度为0.008-0.012g/mL。
进一步地，该复合水凝胶中KGN的浓度为320μg/mL，BGs的浓度为2mg/mL，甲基纤维素的浓度为0.013g/mL，氯化钠的浓度为0.01g/mL，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.013g/mL，聚乙烯醇的浓度为0.01g/mL。
进一步地，该复合水凝胶在35℃以上环境中20-35s成胶。
本发明的第三方面是提供上述复合水凝胶在制备修复陈旧性肩袖损伤产品中应用，该产品为注射剂型。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的复合水凝胶采用Kartogenin小分子和生物玻璃颗粒本身具有促进细胞增殖的作用，同时Kartogenin能够促进干细胞成软骨分化，生物玻璃能促进干细胞成骨分化，二者的有机结合能够有效解决陈旧性肩袖损伤面临的骨质丢失和软骨缺失两大难题，且该水凝胶在室温下成粘稠液态，35℃以上环境中 30s成胶，即将其注射至体内后能够短时间内成胶，原位释放药物并诱导细胞分化。可注射温敏体系的应用使得其操作十分便捷，又可达到原位成胶释放药物的目的。本发明可为临床上修复陈旧性肩袖损伤提供新的思路，同时促进腱骨界面的骨再生和软骨再生。
附图说明
图1是采用振荡扫描实验验证复合水凝胶的成胶温度；其中，图A表示了水凝胶在温度升高或降低是产生的液态向固态转化的相变，图B-D分别表示了在温度上升时水凝胶的流体力学特性变化，包括储存模量、损失模量和阻尼系数，图F表示了阻尼系数为1时温度为35℃，说明水凝胶的相变温度为35℃；
图2显示了KGN和BGs的浓度选择，相同密度的肌腱干细胞与不同浓度的药物共培养1天和3天后通过CCK-8检测增殖活性，图A为KGN的浓度与细胞增殖的关系，图B为BGs的浓度与细胞增殖情况；
图3显示了复合水凝胶具备双向诱导特性(成骨和成软骨)，其中，图A-D 分别表示了空白对照组、水凝胶组、KGN/水凝胶组和KGN@BGS/水凝胶组中诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化的茜素红染色结果；图E表示半定量测定的吸光度值；图F-I分别表示了空白对照组、水凝胶组、KGN/水凝胶组和KGN@BGS/ 水凝胶组中诱导肌腱干细胞向成软骨细胞分化的阿尔辛蓝染色结果；图J表示诱导肌腱干细胞向成软骨细胞的伯尔尼评分结果；
图4显示了成骨诱导(图A)和成软骨诱导(图B)14天后I型胶原和Runx2 蛋白表达水平；
图5显示了慢性RCT模型中大结节骨质的丢失情况；
图6显示了肱骨头冈上肌复合体的生物力学检测结果；其中，图A-C分别显示了各个组在修补1个月、2个月、3个月时的腱骨界面横截面积、最大失效负荷和失效压强；
图7显示了各个组在修补1个月、2个月、3个月时骨隧道愈合情况，含BG 水凝胶的注射对骨隧道愈合最佳。
图8显示了番红固绿染色结果以观察腱骨界面的软骨再生情况；其中，图A 显示了健康肩袖的番红固绿染色结果，图B显示了修补1个月、2个月、3个月后的腱骨界面的软骨再生情况。
具体实施方式
本发明提供了一种促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶，其制备方法包括如下步骤：
1.NH2-BGs的合成
通过溶胶-凝胶法对生物活性玻璃进行调制。简单地说，将5.6g十六烷基三甲基溴化铵溶解在含有25mL ddH2O和80mL乙醇的混合溶液中，加热到40℃，连续搅拌直到完全溶解。依次加入氨水9.4mL、TEOS(正硅酸乙酯)15.23mL、 TEP(磷酸三乙酯)1.58mL，搅拌30min。加入9.62g硝酸钙搅拌3h，离心后从玻璃溶胶中分离出白色沉淀物。最后，在烘箱中烘干24h，然后在马弗炉中(550℃， 6h)烧结，得到了BGs产品。将制备的6g生物活性玻璃加入含有3ml双蒸水 (ddH2O)和200ml乙醇的混合液中。超声分散30min后，向溶液中滴入6mLAPTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)。在65℃下搅拌6h后，用ddH2O和乙醇洗涤体系。产品在60℃的真空干燥炉中干燥过夜，即可得到NH2-BGs。
2.将NH2-BGs与KGN接枝，形成KGN@BGS
共32mgKGN溶于3mlDMSO中，然后加入29mLPBS中，并向PBS溶液中分别加入0.13mmolEDC和0.07mmolNHS，混合溶液搅拌5h，活化KGN的羧基。将制备好的200mgNH2-BGs加入上述活化的KGN溶液中搅拌。在室温下共价反应48h后，用大量的ddH2O清洗支架，去除吸附在支架表面的副产物。
3.温敏水凝胶的制备及体系合成
在70℃下，将260mgMC加入12.2mLddH2O中，连续搅拌至均匀分散。MC 溶液在冰箱中放置48小时制备。在室温下将200mgNaCl溶解于2ml的ddH2O 中，加入MC溶液中搅拌成混合溶液；加入含46.4mg KGN@BGS的2mL H2O；然后在混合液中加入260mgPVP，搅拌均匀。随后，加入4ml 5％PVA溶液，搅拌均匀，得到可促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶。
验证实施例
本实施例对实施例1提供的复合水凝胶进行性能和功能探究，具体的实验方法和结果如下：
(1)振荡扫描实验探究成胶的温度
利用先进的流变仪(TA仪器，AR 2000型)，采用锥板几何结构，完成了水凝胶的振荡扫描实验，其中锥角1°，直径75mm。该装置配备了一个温度单元 (帕尔蒂尔板)，它可以有效地将温度(±0.05℃)控制在本工作所考虑的温度范围内。在温度上升过程中测量动态粘弹性函数，包括剪切储能模量(G‘)和损耗模量(G’‘)随时间和温度的变化。为了确定溶胶-凝胶点，将角频率(ω)设置在1-10rad/s之间，升温速率为1℃/min，从10℃监测到50℃，应变幅度(℃) 为0.03。将装有0.5ml水凝胶的1.5mlEP管置于35℃水浴锅中，30s后即刻完成相变。
由图1可知，损失模量和储存模量交点为35℃，证明其在35℃以上即成胶，体温环境下亦是，即将其注射至体内后能够短时间内成胶，原位释放药物并诱导细胞分化。
(2)通过对干细胞的增殖影响探索合适的药物浓度
细胞增殖试验采用第2代或第3代肌腱干细胞(TDSCs)。在孔板中种植相同密度的细胞，加入不同浓度的KGN或BGs，在1天和3天两个时间点通过CCK-8细胞增殖活性试剂盒检测细胞增殖情况，对比不同浓度药物对细胞增殖的影响，探索最佳浓度(图2)。
由图2可知，320μg/mL的KGN和2mg/mL的BG有利于细胞增殖。
(3)通过对干细胞的诱导证明复合水凝胶的双向诱导特性(成骨和成软骨)
细胞诱导采用第2代或第3代肌腱干细胞(TDSCs)。融合后，将培养基换成分化培养基(DM)，放置水凝胶(1ml)，形成共培养体系。以1ml PBS作为对照。
成骨源性DM含有10％胎牛血清、50μg/mL维生素C和4mMβ-甘油磷酸酯的MEM。培养基每72小时更换一次。第14天用Western blotting检测I型胶原和Runx2蛋白表达水平(图3)。诱导14d后，用4％(v/w)多聚甲醛固定细胞，茜素红染色，光镜(X7，奥林巴斯，日本)进行观察(图3A-D)。半定量：细胞用60％异丙醇染色，提取的色素在510nm(TECAN)处测定吸光度(图3E)。
软骨源性DM含1％胰岛素转铁蛋白硒溶液(ITS-G)、1mM丙酮酸钠、 50μg/mL抗坏血酸、40μg/mL L-脯氨酸、100nM地塞米松、10ng/mL转化生长因子-β3。连续7天每天更换培养基。进一步的三维颗粒系统实验用于软骨诱导能力的验证。将1×106细胞用1ml软骨细胞培养液悬浮于15ml离心管中，250g 离心5min。培养两天后，细胞形成颗粒，将颗粒移至平板共培养体系中。分化 21d后冰冻切片，阿尔辛蓝染色(图3F-I)。采用伯尔尼评分系统评价颗粒(图 3J)。
由图3可知，复合水凝胶具有优异的成骨诱导和成软骨诱导效果。图4的Westernblotting结果也证实了这一点。
(4)体内实验
选用4月龄雄性新西兰白兔130只，其中120只用于慢性RCT修复，另10 只用于确认慢性RCT模型的建立成功。新西兰白兔用戊巴比妥钠(30mg/kg) 麻醉后，将125只兔的冈上肌腱从肱骨大结节处分离出来，并用缝合环标记，其余5条不做离断处理，然后闭合切口，等待8周，直到慢性RCT模型制作完成。处死5只接受或不接受肩袖手术的新西兰白兔。采用微型CT对大结节的骨丢失进行评估。由图5可知慢性RCT组大结节处骨质丢失明显。120只新西兰白兔随机分为4组：1)单纯修复，不注射水凝胶组；2)肩袖修复后注射无生化线索水凝胶；3)肩袖修复后注射只含KGN水凝胶；4)肩袖修复后注射含KGN@BGs 水凝胶。用手钻双骨隧道(Φ＝2mm)进行足印准备和肌腱固定后，分别在骨隧道和腱骨界面内注入3种不同的水凝胶(200μL)。对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。修复术后1，2，3个月，每组各处死10只，取肱骨-冈上肌复合体，其中5只用于骨组织学检查和腱骨界面纤维软骨再生，另5只用于生物力学检测强度。
由图6可知，KGN@BGS/水凝胶组在3月后抗撕裂能力最强，骨隧道愈合最佳(图7)，且KGN的载入对于软骨再生效果显著(图8)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种促进腱骨愈合的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将BGs加入乙醇溶液中；超声分散后，向溶液中滴入APTES，搅拌、洗涤并进行真空干燥得到NH2-BGs；
步骤二，将步骤一制备的NH2-BGs加入活化的KGN溶液中搅拌，在室温下反应40-56h后，清洗，制备得KGN@BGS；
步骤三，在室温下将NaCl溶液加入MC溶液中搅拌成混合溶液；加入含KGN@BGS的水中；然后在混合液中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀；随后，加入PVA溶液，搅拌均匀，得到可促进陈旧性肩袖损伤的腱骨愈合的复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中的BGs通过以下方法制备：将十六烷基三甲基溴化铵溶解在含有ddH2O和乙醇的混合溶液中，加热到30-46℃，连续搅拌直到完全溶解；依次加入氨水、TEOS、TEP，搅拌；加入硝酸钙搅拌2-3h，离心后从玻璃溶胶中分离出白色沉淀物；最后，在烘箱中烘干，然后在马弗炉中烧结，得到了BGs产品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在制备所述BGs产品的过程中，十六烷基三甲基溴化铵和硝酸钙的质量比为1:(1.5～2)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在马弗炉中烧结的温度为550℃，时间为6小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中的乙醇溶液的浓度为98％-99％，溶剂为ddH2O。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述上述活化的KGN溶液通过以下方法制备：将KGN溶于二甲基亚砜中，然后加入PBS中，并向PBS溶液中分别加入EDC和NHS，混合搅拌活化KGN的羧基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，添加的EDC和NHS的物质的量比为10～13:7。
8.一种如权利要求1-7任一项所述制备方法制备的复合水凝胶。
9.根据权利要求8所述的复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶在35℃以上环境中20-35s成胶。
10.如权利要求8或9所述的复合水凝胶在制备修复陈旧性肩袖损伤产品中应用，其特征在于，所述产品为注射剂型。
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