CN114931670A - 活性物质及其自愈合水凝胶在修复软骨中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了活性物质及其自愈合水凝胶在修复软骨中的应用。

Description

活性物质及其自愈合水凝胶在修复软骨中的应用
技术领域
本发明提供了一种活性物质及其用途，具体地，涉及脱水淫羊藿素及负载脱水淫羊藿素颗粒的复合水凝胶在软骨修复中的应用。
背景技术
因创伤或退变引起的关节软骨缺损是最常见的骨科疾病之一，它会导致膝关节功能障碍，严重的疼痛，甚至残疾，给个体患者和社会带来沉重的经济负担。但由于软骨无神经无血管的特性，体内关节软骨的自身修复能力极其有限，一旦发生损伤或者病变，难以自行修复；因此关节软骨的再生修复仍然是一个巨大的挑战。
传统的治疗方法包括微骨折术、自体软骨移植和基质诱导的自体软骨细胞移植术等，然而，在临床应用中获得解剖功能正常的天然透明软骨仍然是一个巨大的挑战。目前临床应用较多的、效果肯定的软骨退变与缺损治疗方法是自体软骨细胞移植，但软骨细胞来源有限，体外扩增时极易反分化而丧失表型。基于种子细胞、生物材料及生物因子的组织工程的发展为软骨损伤修复提供了新选择，被认为是是修复软骨有前途的方法。
在软骨再生领域，骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells, BM-MSCs)、脐带间充质干细胞、软骨干细胞等间充质干细胞因具有自我更新能力和体外成软骨潜能，且安全性好，是软骨再生的理想的种子细胞。澳大利亚默多克大学的临床前试验显示在大型动物模型中供者的成体干细胞治疗明显保护了膝关节骨性关节炎的软骨损伤，没有任何副作用。证明异体成体干细胞治疗膝关节骨性关节炎的有效性和安全性。
水凝胶由于其优越的功能(如柔韧性佳的机械性能和良好的生物相容性)在软骨再生中有独特优势。自愈合水凝胶，由于其亲水性，低毒性，可注射和快速的自修复能力，被证明是非常有前途的软骨组织工程生物材料，特别在软骨原位修复方面。
纵观软骨修复的研究，虽取得不少成果，但是迄今为止仍难以获得高质量的透明软骨及长时间的维持其表型。与接受透明质酸治疗的对照组相比，接受干细胞治疗三个月后的骨性关节炎羊的关节软骨明显增厚，软骨磨损减少，软骨生物力学强度更大，但是长期效果并不理想。许多生长因子例如转化生长因子(TGF)-β和胰岛素样生长因子(IGF)被用来促进干细胞成软骨分化和维护软骨表型。然而，由于生长因子成本高、降解快、活性易丧失，其广泛应用受到严重限制。因此，具有干细胞成软骨诱导能力的天然生物活性小分子化合物在软骨再生中具有很大的市场及应用前景。
发明内容
本发明旨在发现天然生物活性小分子化合物脱水淫羊藿素可以促进干细胞成软骨分化和维护软骨表型；我们设计了一种新型的软骨再生系统，该系统包括可注射水凝胶、细胞或干细胞、脱水淫羊藿素、负载脱水淫羊藿素的介孔二氧化硅颗粒，将这几种元素1种或几种结合，以实现高效而持久的原位软骨再生。
本发明提供了一种活性物质的用途，其特征在于：
一种活性物质的用途，其特征在于：
上述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞；
基于本发明的研究表明，上述活性物质的优选组成方案为：A-G组分的单独使用，或A-E 任一组分与F组分的合用，或A-E任一组分与G组分的合用，或F组分与G组分的合用，或A-E任一组分、F组分与G组分的合用；
上述用途为包含如下中的至少一种：
用途A.用于制备促进干细胞成软骨分化的药物、生物材料、内植物；
用途B.用于制备促进软骨基质合成的药物、生物材料、内植物；
用途C.用于制备修复软骨的药物、生物材料、内植物；
用途D.用于制备关节炎治疗的药物、生物材料、内植物。
本发明提供的一种活性物质的用途，其特征在于：
上述用途还包括：用于制备促进col2a1，acan和sox9的mRNA表达的药物。
上述药物中，活性物质的用量优选不大于3μM。
本发明还提供了一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
将活性物质与凝胶成胶制剂复合形成复合水凝胶；
其中，上述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞。
基于本发明的研究表明，采用上述活性物质制备水凝胶的优选组成方案为：A-G组分的单独使用，或A-E任一组分与F组分的合用，或A-E任一组分与G组分的合用，或F组分与G组分的合用，或A-E任一组分、F组分与G组分的合用。
在本发明中的一个优选实施例中采用的凝胶成胶制剂主要选自壳聚糖(GCS)、海藻酸醛 (OSA)等；
但是，基于实际应用上的需要，上述凝胶成胶制剂也可采用传统方法中能够用于水凝胶制备的任何添加材料，一般来说基于下述成胶原理实现：基于壳聚糖衍生物中的氨基与海藻酸醛中的醛基发生席夫碱反应，其他如：含有氨基的壳聚糖或其衍生物，此处衍生物指含有壳聚糖架体的物质，如：醇化衍生物，类似于乙二醇壳聚糖等物质，海藻酸醛还可以为不同氧化度的海藻酸钠，即海藻酸醛；
本发明提供的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于，在本发明中当选用优选材料进行符合时，其具体的复合方法如下所示：
S1.在超声处理下，将活性物质分散在包含有壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中；
S2.将包含有海藻酸醛的缓冲溶液迅速分散在S1的反应溶液中。
上述活性物质与壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液的用量比例优选为10-100μl/1ml；
上述壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中壳聚糖或其衍生物的质量百分比优选为1-10wt％。
上述包含有海藻酸醛的缓冲溶液中海藻酸醛的质量百分比优选为5-15wt％。
此外，本发明还提供了一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
将活性物质封装于介孔二氧化硅颗粒中后，与凝胶成胶制剂复合形成复合水凝胶；
其中，上述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞。
基于本发明的研究表明，采用上述活性物质制备水凝胶的优选组成方案为：A-G组分的单独使用，或A-E任一组分与F组分的合用，或A-E任一组分与G组分的合用，或F组分与G组分的合用，或A-E任一组分、F组分与G组分的合用。
在本发明中的一个优选实施例中采用的二氧化硅颗粒为介孔二氧化硅粒子(mSiO2Ps)；
在本发明中的一个优选实施例中采用的凝胶成胶制剂主要选自壳聚糖(GCS)、海藻酸醛 (OSA)等；
但是，基于实际应用上的需要，上述介孔二氧化硅颗粒可被任何可作为医疗用途的有机或无极材料颗粒所替代，即、其能起到封装指定药物目即可；
上述凝胶成胶制剂也可采用传统方法中能够用于水凝胶制备的任何添加材料，一般来说基于下述成胶原理实现：基于壳聚糖衍生物中的氨基与海藻酸醛中的醛基发生席夫碱反应，其他如：含有氨基的壳聚糖或其衍生物，此处衍生物指含有壳聚糖架体的物质，如：醇化衍生物，类似于乙二醇壳聚糖等物质，海藻酸醛还可以为不同氧化度的海藻酸钠，即海藻酸醛；
进一步地，本发明提供的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于，在本发明中当选用优选材料进行复合时，其具体的复合方法如下所示：
S1.在超声处理下，将封装有活性物质的介孔二氧化硅颗粒分散在包含有壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中；
S2.将包含有海藻酸醛的缓冲溶液迅速分散在S1的反应溶液中。
上述封装有活性物质的介孔二氧化硅颗粒与壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液的用量比例优选为10-100μl/1ml；
上述壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中壳聚糖或其衍生物的质量百分比优选为1-10wt％。
上述包含有海藻酸醛的缓冲溶液中海藻酸醛的质量百分比优选为5-15wt％。
本发明提供的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：上述活性物质封装于介孔二氧化硅颗粒的具体方法为：在超声处理下，将活性物质分散在缓冲溶液中后，在剧烈搅拌下将介孔二氧化硅颗粒分散在活性物质溶液中，连续搅拌过夜后，将反应溶液蒸发至干；
上述活性物质与介孔二氧化硅颗粒的质量比为1：20-100。
本发明提供的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：上述可注射的复合水凝胶的用途包含如下用途中的至少一种：
用途A.作为一种3D活细胞支架、生物材料、内植物；
用途B.作为一种诱导干细胞增殖的药物、生物材料、内植物；
用途C.作为促进干细胞成软骨分化的药物、生物材料、内植物；
用途D.用于制备修复软骨的药物、生物材料、内植物；
用途E.用于关节炎治疗药物、生物材料、内植物。
本发明提供的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：上述脱水淫羊藿素可以为其他待缓释的药物替换。
本发明的作用和效果:
在本发明的研究中表明天然小分子化合物AHI为一种具有促进干细胞成软骨分化的生物活性因子。
在本发明中，还设计了一种新的持续缓释AHI系统，通过整合氧化海藻酸钠，乙二醇壳聚糖，干细胞和AHI-mSiO2 Ps，实现“一步法”软骨原位再生。这种新型支架通过在水凝胶和 mSiO2 Ps的混合基质中持续释放AHI，显著促进了软骨再生。因此，该水凝胶有望成为未来组织和器官再生的新型功能支架。
附图说明
图1.体外检测脱水淫羊藿素对干细胞成软骨分化的影响，其中，(A)体外AHI对兔干细胞增殖的影响。将干细胞与各种浓度的AHI(0.1μM-125μM)一起培养72h。通过CCK8实验测定细胞增殖。(B)阿尔新蓝染色的定量分析。(C)通过阿尔辛蓝染色的细胞化学分析检测不同组蛋白多糖的含量。
图2.体外检测脱水淫羊藿素对干细胞成软骨分化的影响，其中，(A)基于Q-PCR的对照组和实验组的。软骨特异性基因col2a1，acan和sox9的mRNA表达。(B)通过HYP分析定量不同组中胶原蛋白的产生,通过GAG测定法定量不同组中软骨基质的产生(n＝3，*p ＜0.05，**p＜0.01)。
图3.可注射GOAS-干细胞复合水凝胶的制备和软骨再生应用示意图。
图4.照片展示了AHI负载的mSiO2和GCS的水悬浮液与OSA溶液在PBS(pH 7.4)中溶解，60s后，水凝胶前体液凝固形成水凝胶。
图5.GOA水凝胶，载有AHI的mSiO2NPs和GOAS复合水凝胶的药物释放曲线。
图6.冷冻干燥后的GOAS复合水凝胶的SEM图像。其中，A)为从横截面观察结果，C)为测量截面观察结果。比例尺：1毫米。B)和D)是A)和C)的局部放大图。比例尺： 500nm。
图7.冻干3天后，冷冻干燥的GCS-OSA水凝胶的SEM图像。
图8.封装在不同水凝胶中的干细胞活/死细胞实验的共聚焦图像。(比例尺＝200μm)
图9.封装在实验组和对照组水凝胶中的干细胞的活力测定。
图10.在3D培养中用AHI处理的干细胞的成软骨能力。其中，(A)基于Q-PCR的软骨特异性基因col2a1，sox9和acan的mRNA表达。(B)通过蛋白质印迹法检测软骨特异性基因COL2A1的蛋白质表达。
图11.体外分析包裹干细胞3D培养系统中HYP和GAG的含量，其中，(A)通过HYP 分析定量不同水凝胶中胶原蛋白的产生。(B)通过GAG测定法定量不同水凝胶中软骨基质的产生(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图12.体内修复软骨的肉眼观察，组织学评分和生物力学测试。其中，A在手术后第4、 8和12周收获的标本的宏观照片。不同组中修复的软骨的生物力学特性：B折合模量和C硬度。(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，比例尺＝5mm)。
图13.复合水凝胶促进了体内软骨的再生，其中，(A)在第4、8和12周对再生的软骨进行H&E染色(N：天然软骨；R：再生的软骨；箭头指示天然软骨和再生软骨的边界。(B) 在第4和12周时，再生软骨的组织学评分。(*p<0.05，**p<0.01)。
图14.体内再生软骨的组织学评估。其中，(A)在第4、8和12周时对再生软骨进行甲苯胺蓝染色。(N：天然软骨；R：修复的软骨；箭头指示天然软骨和再生软骨的边界)。(B) 在第4、8和12周时对II型胶原进行免疫组织化学染色(n＝5，比例尺＝200μm)。
图15.整个研究的示意图。
具体实施方式
实施例1.脱水淫羊藿素调控软骨干细胞成软骨分化
1.实验方法
1.1兔软骨干细胞的分离和培养
在体外粘附试验中使用了纤连蛋白来分离关节软骨干细胞(articularcartilage stem cells, 干细胞)。超净台中，无菌条件下分离兔(12周龄)膝关节和髋关节的软骨，然后将软骨切成小薄片，切成2mm3-3mm3大小的碎片。随后，将软骨碎片在0.25％胰蛋白酶中消化10分钟，添加含有10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养液，以停止胰蛋白酶消化。用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗3遍，然后在II型胶原酶(0.02％，wt/vol；溶于无血清DMEM/F12培养液)中消化5个小时，每间隔半小时摇晃培养皿一次，加快细胞消化进度。将分离的细胞接种到涂有纤连蛋白(10μg/ml)的六孔板中，加入含10％胎牛血清， 50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液。20分钟后，除去培养液，粘附的细胞即为干细胞。在胰蛋白酶中消化干细胞，并接种到10cm培养皿中。将干细胞置于37°、 5％CO2的培养箱中培养，每2-3d换液一次。
1.2细胞毒性测定
使用标准方法进行细胞毒性测定。简而言之，当干细胞融合到到80-90％时，用0.25％胰蛋白酶中消化，离心，将细胞以1×104细胞/孔的密度接种到96孔板中。12小时后，将含有不同浓度药物的新鲜培养基加入每个孔中。将细胞在静态条件下于37℃，5％CO2的培养箱中孵育72小时。之后吸除培养基，每个孔加入10μl CCK8，避光在37℃下孵育2小时。使用酶标仪在450nm的波长和650nm的参考波长下，测量各个孔的吸光光度值。
1.3成软骨诱导
取第三代干细胞，以2×105个细胞接种，1000rpm离心5min，在成软骨诱导液中培养，置于37°、5％CO2的培养箱中，每3天换液一次，培养3周。
1.4阿尔辛蓝染色和分析
用PBS洗涤，在室温下固定在4％聚甲醛中10分钟。然后将固定的细胞在室温下浸入溶于3％乙酸(pH 2.5)的1％阿尔辛蓝染色液中。30分钟后，用双蒸水(ddH2O)洗涤细胞，洗涤3次。然后用高清扫描仪对细胞板进行扫描，并保存，用Image J软件对染色的细胞进行定量分析。
1.5 GAG和HYP定量
糖胺聚糖(GAG)和羟脯氨酸(HYP)含量的检测是根据报道的方法进行的。将培养液提供给干细胞和包裹干细胞的水凝胶。在不同的时间点，收集细胞和包裹干细胞的水凝胶用于基因分析和生化分析(ds-DNA，GAG和HYP含量)。使用Varioskan Flash多功能酶标仪和分光光度计检测DNA，GAG和HYP的含量。将干细胞和包裹干细胞的水凝胶在预先制备的木瓜蛋白酶溶液中于60℃过夜消化24小时，测量ds-DNA和GAG含量。将上面消化的20μL 样品与200μL Hoechst 33258工作溶液(2μg/ml)于37℃避光反应1h。以激发波长360nm 和发射波长460nm来测量荧光强度，将读数与小牛胸腺DNA的标准曲线进行比较。通过二甲基亚甲基蓝(DMMB)测定法测定总硫酸化GAG含量。简而言之，将上面消化的20μL样品与200μLDMMB试剂混合，并在室温下反应30分钟，并在酶标仪上于525nm处测量吸光度。根据从鲨鱼获得的6-硫酸软骨素获得的标准曲线计算GAG的含量。通过定量HYP含量确定胶原蛋白含量。将相同消化液的等分试样在120℃的6M HCl中进一步水解2h，然后使用分光光度法(波长560nm)测量水解后溶液中羟脯氨酸的含量。通过进样L-羟脯氨酸标准品进行检测，根据结果绘制标准曲线。相对于L-羟脯氨酸的标准曲线确定检测样本中羟脯氨酸含量。GAG和HYP均通过ds-DNA含量标准化。
1.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
1.6.1细胞总RNA的抽提
(1)PBS洗涤细胞3遍，加入适量Trizol，用移液器充分吹打后转入EP管中，直接抽提总RNA或放入-80℃冰箱中；
(2)按照每1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例，往EP管中加入氯仿，将EP管盖紧，剧烈震荡15秒，室温静置5min；
(3)4℃，12000rpm，离心15min，离心后，EP管中的溶液分为三层：下层红色苯酚-氯仿中含有DNA，中间层含有蛋白质，上层透明水溶液中溶解有RNA；
(4)将上层水相溶液转移至新的EP管中，注意勿吸到中间界面，每个EP管加入0.5ml 异丙醇，盖紧EP管，上下颠倒充分混匀；
(5)冰上静置10min，4℃，12000rpm，离心10min，EP管底部的白色沉淀即为RNA；
(6)弃去上清液，每个EP管加入1ml 75％酒精(DEPC水配制)，轻轻将吹打悬浮沉淀；
(7)4℃，7500g，离心5min；
(8)弃去上清液，每个EP管加入1ml 75％酒精(DEPC水配制)，轻轻将吹打悬浮沉淀；
(9)4℃，7500g，离心5min；
(10)弃去上清液，4℃，7500g，离心2min，轻轻将剩余的上清液吸除；
(11)将RNA样品放在通风厨中干燥5-8min；
(12)加入20μl DEPC水溶解RNA样品，用Nanodrop 2000检测RNA浓度和纯度。RNA样本-80℃保存，或直接进行反转录实验。
1.6.2反转录PCR
将抽提的RNA进行反转录，反映体系如下：
反应组分 20μl反应体系(μl)
RNA(1μg) X
DEPC水 12.5-X
5xRevertAid Buffer 4
dNTP(10mM) 2
Oligo dT 1
RevertAid 0.5
反映体系充分混匀后，短暂离心，放入PCR仪中，PCR程序为：42℃，1h；70℃，10min；4℃，+∞。反应结束后的样品放入-20℃冰箱保存。
1.6.3实时荧光定量PCR
(1)将上述反转录产物稀释10倍，按照下表配制实时荧光定量PCR反应体系：
Figure RE-GDA0003753377210000091
引物序列如下：
Col2a1 AAGAGCGGTGACTACTGGATAG【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
TGCTGTCTCCATAGCTGAAGT【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
Aggrecan AGGTCGTGGTGAAAGGTGTTG【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
GTAGGTTCTCACGCCAGGGA【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
Sox9 GGTGCTCAAGGGCTACGACT【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
GGGTGGTCTTTCTTGTGCTG【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
GAPDH TCACCATCTTCCAGGAGCGA【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
CACAATGCCGAAGTGGTCGT【引物序列(5’–3’)，Rabbit】
(2)将配制好反应体系加入到384孔板中，2000rpm，离心5min，封膜。将384孔板放入 ABI Real-time PCR仪中，反应程序如下：
Figure RE-GDA0003753377210000092
(3))计算方法：GAPDH作为内参。数据分析按照2-ΔΔCt方法进行，文章图中显示的数值均为实验组相对于对照组的表达量改变的倍数。
1.7免疫印迹(Western Blot)
1.71细胞总蛋白的提取
(1)弃去细胞培养的上清，用预冷的PBS洗涤3遍；
(2)加入适量的RIPA裂解液(含1％PMSF)，冰上裂解30min；
(3)用细胞刮将细胞从孔板底部刮下，充分裂解后，将裂解液和细胞的混悬液转移至EP管中；
(4)4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清液至新的EP管中，上清液即为总蛋白。
1.7.2蛋白浓度测定(BCA法)
(1)采用BCA蛋白定量试剂盒，按照A液：B液＝50:1的比例配制工作液，混合均匀，96孔板每个孔加入200μl工作液；
(2)分别取10μl RIPA裂解液和10μl蛋白样品加入到上述96孔板中，37℃孵育30min；
(3)取不同浓度的标准品，进样，检测在562nm处吸光度值，根据吸光度值绘制标准曲线；
(4)用酶标仪检测96孔板的每个孔在562nm处吸光度值，根据BCA标准曲线计算蛋白样品的浓度。
1.7.3SDS-PAGE电泳
(1)蛋白样品制备：将相应体积的4×loading buffer加入到总蛋白中，充分混匀后，然后金属浴99℃加热10min，使蛋白变性二硫键打开，随即将蛋白置于冰上；
(2)制备分离胶：按照下表中的体系进行配制分离胶(10％凝胶)
试剂：ddH2O4 ml；1.5M Tris-HCl(pH 8.8)2ml；40％丙烯酰胺混合液2ml；10％APS
80μl；TEMED8μl；
将液体混匀后，将配制好的液体加入到预先准备好的胶板中间，随即加入2ml无水乙醇压胶，等待大约15min，分离胶凝固，将无水乙醇倒出，用ddH2O洗涤2遍后，用滤纸将水吸干；
(3)制备浓缩胶：按照下表中的体系进行配制浓缩胶(5％凝胶)
试剂：ddH2O2.5 ml；1.5M Tris-HCl(pH 6.8)1ml；40％丙烯酰胺混合液0.5ml；10％ APS40μl；TEMED4μl；
按照上述体系配制好后，将液体注入分离胶上层，立即插入梳子，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子，配胶完成；
(4)电泳：将蛋白样品取出，4℃融化，将1×runningbuffer加入电泳槽中，在第一个孔和最后一个孔中分别加入5μl蛋白marker，其他孔分别加入20μg蛋白样品，80V恒压电泳跑30min，至溴酚兰进入分离胶，改为100V恒压电泳跑60min，直至溴酚兰跑到分离胶底端，电泳结束；
(5)转膜：取下SDS-PAGE凝胶，裁剪NC膜，将NC膜、凝胶、纤维垫、滤纸在转膜液中浸泡，用转膜夹以三明治(从下到上依次是纤维垫、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、纤维垫) 的方式夹牢，整个过程在转膜液中完成，赶走内部的气泡，将转膜夹放入盛有转膜液的转膜槽中，放入冰盒，冰浴环境中，300mA恒流转膜1.5h；
(6)封闭：取出转有蛋白的NC膜，标记好方向，将NC膜浸入封闭液(5％BSA，用 TBST配制)中，摇床上室温孵育1h，以封闭非特异性蛋白结合位点；
(7)孵育一抗：按照说明书上建议的配制比例配制一抗，按照蛋白分子量剪开NC膜，将剪开的NC膜分别浸入相应的一抗中，4℃孵育过夜；
(8)洗膜：吸去一抗并回收，用TBST洗膜3次，每次10min；
(9)孵育二抗：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，摇床上室温孵育1h；
(10)洗膜：吸去二抗并回收，用TBST洗膜3次，每次10min；
(11)显色和扫描：配制显色液(A液：B液＝1:1)，将混合好的显色液加到NC膜上，用Tanon成像仪显像，并拍照保存。
1.8统计分析
所有实验至少经过3次重复，数据以平均值±标准差(mean±standarddeviation)表示。两组间差异分析用双尾student’s t检验(two-tailed student’s t-test)。One-wayANOVA用于对多组数据进行统计分析。p<0.05认为具有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.实验结果
脱水淫羊藿素(AHI)可以在体外显著促进干细胞的成软骨分化。
将药物用于实验，安全是最为重要的，因此要进行必要的安全测试，排除可能对细胞造成的毒性，选择适当的浓度进行后续实验。为了进一步验证AHI的有效安全浓度，用一系列浓度的AHI处理干细胞，通过CCK-8试剂盒检测干细胞的增殖。与0μM相比，当AHI的浓度等于或小于3μM时，AHI对干细胞的增殖没有影响，但是AHI浓度大于3显著抑制干细胞的增殖,而且在3-125μM浓度范围内,随着药物浓度的升高,细胞毒性越来越大(图1A)。这些结果表明，在不影响干细胞增殖的情况下，可以使用的最高浓度为3μMAHI。
为了进一步研究AHI对干细胞成软骨分化的潜力，通过Q-PCR检测了软骨特异性基因 col2a1，acan和sox9的mRNA表达，通过Western blot检测了软骨特异性基因COL2A1的蛋白表达水平。此外，干细胞软骨分化21天后，用阿尔新蓝染色检测蛋白聚糖的积累，并通过Image J软件定量染色强度。如图1B,C所示，与DMSO组相比，AHI处理组显示出更高的染色强度。有趣的是，随着AHI浓度在一定范围内(1μM-3μM)的增加，染色强度逐渐增强； AHI浓度为4μM(>3μM)时，与3μM浓度AHI处理组比较，染色强度减弱。这些结果充分证明，3μM的AHI浓度是促进干细胞成软骨分化的最佳浓度。
与未进行AHI处理的干细胞相比，经AHI处理的干细胞中软骨特异性基因col2a1，acan 和sox9的mRNA表达水平显著增加(图2A)。随着AHI浓度在一定范围内(1μM-3μM) 的增加，；AHI浓度为4μM(>3μM)时，与3μM浓度AHI处理组比较，软骨特异性基因col2a1，acan和sox9的mRNA表达水平降低(图2A)。通过检测细胞中羟脯氨酸(HYP)和糖胺多糖(GAG)含量，结果与，用AHI处理的干细胞比未进行AHI处理的干细胞具有更大的成软骨分化能力(图2B)。
实施例2.缓释脱水淫羊藿素的复合自愈性水凝胶的制备和表征
1.实验方法
1.1mSiO2 Ps的制备
通过溶胶-凝胶法合成了mSiO2 Ps。用典型的合成方法，将0.54g十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)在超声处理下使CTAB均匀分散在包含乙醇(60ml)，去离子水(120ml)和浓氨溶液(3.0mL，28wt％)的混合溶液中。在1小时内将正硅酸乙酯(TEOS)(0.85g，2.21mmol) 滴加到水溶液中。将反应混合物在25℃下以180rpm/min搅拌8小时。离心收集辛，用水分别洗涤3次。在40℃下干燥12小时，并在550℃下在空气中煅烧6小时后，制备成mSiO2 Ps。
1.2AHI封装的mSiO2 Ps的制备
在超声处理下，将400mgAHI药物分散在PBS溶液(pH＝7.4，4.0ml)中。然后，在剧烈搅拌下将上述mSiO2 NP分散在AHI溶液中。连续搅拌过夜后，将反应溶液蒸发至干。收集产品以备后用。
1.3复合水凝胶的制备
根据[C.G.Gomez,M.Rinaudo,M.A.Villar,Oxidation of sodium alginate andcharacterization ofthe oxidized derivatives,Carbohydr.Polym.67(3)(2007)296-304.]报道的方法制备氧化海藻酸钠(OSA，50％氧化度)。在复合水凝胶的合成过程中，首先在超声处理下将 350μl AHI包裹的mSiO2 Ps分散在GCS PBS溶液(6ml，3wt％)中。然后，将OSAPBS 溶液(1.08ml，10wt％)迅速分散在上述反应溶液中。在35℃涡旋60s后不久，将反应混合物立即转化为与AHI封装的mSiO2 Ps复合的GCS-OSA水凝胶(命名为GOAS复合水凝胶)。
在相同的合成条件下，未将AHI封装的mSiO2 Ps添加到GCS PBS溶液中以形成GCS-OSA水凝胶(命名为GO水凝胶)。将没有封装的AHI的纯mSiO2 Ps添加到GCS PBS 溶液中以形成GCS-OSA-mSiO2水凝胶(命名为GOS复合水凝胶)。
在上述合成过程中的方案为最优选方案，但是，根据实际使用的需要，基于需求中所需要的不同水凝胶性状上的差异，在制备过程中，上述壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中壳聚糖或其衍生物的质量百分比优选自1-10wt％的范围内。
上述海藻酸醛的缓冲溶液中海藻酸醛的质量百分比优选自5-15wt％的范围内。
壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液与海藻酸醛的缓冲溶液的质量比例选自1：0.01-100的范围内。
1.4干细胞共培养复合水凝胶的制备
GCS用完全DMEM/F121：1培养基(83.9μl，3wt％)溶解，同时AHI封装的mSiO2 Ps 分散在其中，OSA用完全DMEM/F121：1培养基(15.1μl，10wt％)溶解，两种液体和干细胞(1μl，2×109/ml)快速混合以形成水凝胶前体液。在室温下60秒钟后，制备成干细胞共培养的复合水凝胶。
1.5体外释放的检测
使用紫外分光光度计进行体外AHI释放行为的研究。简而言之，将样品浸入0.5mlPBS 中并在100rpm转速摇动的培养箱中。为了检测AHI从GOS，AHI-NPs和GOAS释放的动力学，在离心后收集PBS的总体积，并在每次采样时用相同体积的PBS代替。通过标准筛将样品快速过滤，然后吸出10μl上清液，并通过高效液相色谱在367nm下进行测量。将AHI溶液的吸光度曲线绘制成AHI浓度的线性函数，将其作为校准曲线。最后，根据检测结果与标准曲线进行比，确定AHI百分释放量，累计AHI百分释放量。体外AHI累积释放研究以3 个重复样本进行，平均值显示在本研究中。
1.6扫描电镜
将水凝胶样品冷冻干燥，用液氮淬冷样品，用手术刀片将样品切成小块，用导电胶将样品固定在样品台上，然后喷金2min。采用扫描电子显微镜观察水凝胶样品的外貌和显微结构，并拍照保存。
1.7透射电镜
先将纳一定质量的米颗粒样品冷冻干燥，用高能超声波使样品均匀分散于无水乙醇，将分散均匀的样品滴于铜网微栅，进行干燥，随后将附有样品的铜网置于透射电子显微镜下，然后采用透射电子显微镜观察颗粒样品的微观结构，并拍照保存。
1.8统计分析
所有实验至少经过3次重复，数据以平均值±标准差(mean±standarddeviation)表示。两组间差异分析用双尾student’s t检验(two-tailed student’s t-test)。One-wayANOVA用于对多组数据进行统计分析。p<0.05认为具有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.实验结果
2.1复合水凝胶的制备与体外释放分析
本发明设计了一种新型的软骨再生系统，该系统将可注射水凝胶、干细胞和AHI负载的介孔二氧化硅颗粒(mSiO2 Ps)相结合，以实现高效而持久的原位软骨再生(图5)。mSiO2 Ps通过利用其高孔隙率充当AHI的储存库和载体，用来调节AHI的缓慢释放。将乙二醇壳聚糖(GCS)分散并溶解在PBS(pH 7.4)中，形成均匀的悬浮液，再将氧化的海藻酸钠(OSA) 添加到悬浮液中，通过短暂的自愈过程，形成GCS-OSA水凝胶(命名为GO水凝胶)。将GCS和AHI分散并溶解在PBS(pH 7.4)中，形成均匀的悬浮液，再将OSA添加到悬浮液中，通过短暂的自愈过程，形成GCS-OSA-AHI水凝胶(命名为GOA水凝胶)。将mSiO2 Ps 和GC分散并溶解在PBS(pH 7.4)中，形成均匀的悬浮液，再将OSA添加到悬浮液中，通过短时的自愈过程得到GCS-OSA-mSiO2 Ps复合水凝胶(命名为GOS水凝胶)。将AHI-mSiO2 Ps和GC分散并溶解在PBS(pH 7.4)中，形成均匀的悬浮液，再将OSA添加到悬浮液中，通过短时的自愈过程得到GCS-OSA-AHI-mSiO2 Ps复合水凝胶(命名为GOAS水凝胶)，尤其是，当将OSA和干细胞一起加入悬浮液中时，获得了GCS-OSA-AHI-mSiO2 Ps-干细胞复合水凝胶(命名为GOAS-干细胞水凝胶)。将GOAS-干细胞复合水凝胶前体液注射到软骨缺损中，在室温下通过反应原位形成GOAS-干细胞复合水凝胶，而在整个制造过程中无需外部刺激，例如化学交联剂，UV(图3)。
整个胶凝过程在37℃的条件下通过简单涡旋60s即可轻松完成，对环境条件和设备没有特殊要求(图4)。为了实现AHI的缓释，通过纳米铸造方法将AHI分子加载到mSiO2Ps中，方法是将mSiO2 Ps浸渍在AHI的PBS溶液中，然后蒸发溶剂。为了验证可注射GOAS复合水凝胶的缓释效果，检测了复合水凝胶的体外药物释放行为。释放曲线结果显示，GOA水凝胶和AHI-mSiO2 Ps在两周开始时突然释放，然后逐渐缓慢释放AHI，累积释放分别为 91.0±4.33％，87.52±2.97％(图5)。由于位于载体表面附近区域的AHI的快速扩散，在头两周内突然释放。然而，GOAS复合水凝胶在长达10周的时间内显示出持续，缓慢的药物释放过程，累积释放率为85.58±2.37％。值得一提的是，持续释放的行为不仅归因于mSiO2 Ps的许多径向排列的介孔通道，而且还得益于有机水凝胶的三维(3D)网络结构。这样独特的持续释放使得复合水凝胶可以用于体内应用。
2.2水凝胶的扫描电镜分析
将AHI-mSiO2 Ps与OSA和GCS混合后，将得到的GOAS复合水凝胶冷冻干燥以进行结构分析。图6是GOAS复合水凝胶横断面和测断面的扫描电镜图，用以观察水凝胶的微观形貌。从6A,C中可以看出，水凝胶中存在许多孔状结构，这是水凝胶在成胶过程中大分子链之间发生动态交联形成的三维网状结构，网状多孔结构有利于生物体内营养物质的运输和交换，同时非常有利于小分子化合物的控制释放行为。此外，图6B,D分别是图6A,C的放大图，从图6B,D中可以看出，在水凝胶的孔道的表面，分布着颗粒，这是在水凝胶形成过程中混入的载AHI颗粒。图7是GCS-OSA水凝胶的扫描电镜图，从图中可以看出，该水凝胶中也存在许多孔状结构。与GOAS复合水凝胶相比，水凝胶孔道中没有颗粒。扫描电镜观察结果表明，干燥后的GOAS复合水凝胶具有开放的微孔结构，AHI-mSiO2 Ps在水凝胶横截面上均匀分布，AHI-mSiO2 Ps在水凝胶中的均匀分布有利于通过调控颗粒介孔通道和水凝胶的三维网状结构来实现持续缓慢释放AHI。
故而，本实施例设计的水凝胶是一种新型的可注射的复合水凝胶，该水凝胶通过整合基于壳聚糖的水凝胶和载有AHI的mSiO2 Ps，用作软骨再生的持续释放系统。由于有机水凝胶三维孔道和无机mSiO2 Ps的介孔通道的协同调控，保证了复合水凝胶对AHI的持续缓释。
实施例3.缓释脱水淫羊藿素复合自愈性水凝胶的体外实验
1.实验方法
1.1活/死细胞染色
(1)体外制备水凝胶，分为GOS组和GOAS组，将水凝胶浸入完全培养基，培养3天；
(2)吸除培养基，PBS洗3次；
(3)按照试剂盒说明书配制染色工作液，将水凝胶浸入染色工作液，37℃避光孵育30 min；
(4)将水凝胶浸入PBS浸泡3次，每次10min；
(5)在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照保存。
1.2细胞毒性实验
(1)体外制备水凝胶，分为GOS组和GOAS组，将水凝胶浸入完全培养基，培养3天；
(2)吸除培养基，PBS洗3次；
(3)按照说明书配制CCK-8工作液，将水凝胶浸入CCK-8工作液，避光在37℃下孵育2小时；
(4)使用酶标仪在450nm的波长和650nm的参考波长下，测量各个孔的吸光光度值。
1.3 GAG和HYP定量，步骤同前。
1.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，步骤同前。
1.5免疫印迹(Western Blot)，步骤同前。
1.6统计分析
所有实验至少经过3次重复，数据以平均值±标准差(mean±standarddeviation)表示。两组间差异分析用双尾student’s t检验(two-tailed student’s t-test)。One-wayANOVA用于对多组数据进行统计分析。p<0.05认为具有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.实验结果
2.1复合水凝胶对干细胞活力的影响
生物材料在组织工程中的应用，必须以不影响细胞的存活为前提。首先，检测进行活/死实验以检测新系统对干细胞生存能力的影响。水凝胶中几乎所有包裹的干细胞都被染成绿色，两组间没有明显差异，复合水凝胶GOS和GOAS都不影响干细胞的生存，两组之间没有明显差异(图8)。通过CCK-8实验对三组细胞的增殖进行了评估，如图9所示，各组呈现增长的趋势，三组之间没有明显差异。与对照组(培养皿中的细胞)相比，GOS组和GOAS组对干细胞的增殖无显著影响。这些结果表明复合水凝胶不影响细胞的活力和增殖。
2.2体外3D复合水凝胶对干细胞成软骨分化的潜能
为了测试新型缓释系统的成软骨潜能，首先建立体外3D培养系统，体外检测复合水凝胶对干细胞成软骨的影响。将干细胞和AHI-mSiO2 Ps包裹在水凝胶中以建立体外3D培养系统。体外培养7、14和21天，收集样本，通过Q-PCR检测软骨特异性基因例如acan，col2a1和sox9的的mRNA水平，通过western blot检测软骨特异性基因COL2A1的蛋白表达水平。与GOS-干细胞组相比，在共培养7、14和21天后，GOAS-干细胞组中观察到了软骨特异性基因例如acan，col2a1和sox9的更高的(图10A)。可见，在培养过程中，GOAS水凝胶产生更多II型胶原和蛋白聚糖。Sox9是参与软骨细胞分化的转录因子，GOAS水凝胶sox的 mRNA水平更高一些。与软骨特异性基因的mRNA表达一致，GOAS-干细胞组的COL2A1 蛋白水平较高(图10B)。通过Q-PCR和westernblot的结果看，与GOS水凝胶相比，GOAS 水凝胶体外更能促进，可见AHI起到了促进干细胞成软骨分化的作用。
通过体外分析包裹干细胞3D培养系统中HYP和GAG的含量，来评价干细胞在复合水凝胶中的成软骨潜力。根据HYP和GAG含量的检测，与GOS-干细胞组相比，GOAS-干细胞组HYP和GAG的含量更高，说明GOAS-干细胞有更高的软骨形成能力(图11A,B)。复合水凝胶不影响细胞的活力和增殖，能够实现AHI的持续释放，能显著促进干细胞成软骨分化，上述特征和优良的性能鼓励我们进行进一步的体内研究。
在本实施例中，构建了复合水凝胶体系，该体系由GCS、OSA、AHI-mSiO2 Ps、干细胞组成。干细胞在这个培养系统中被水凝胶包裹，保持正常的圆形形态，如图15所示。如图 11所示，各组细胞数量均呈上升趋势，结果表明，水凝胶对细胞增殖没有影响，这说明该水凝胶体系适合作为干细胞的基底材料。
理想的软骨再生生物材料应为体内软骨特异性基质沉积提供合适的微环境，还应该能够粘附和整合周围的原生组织，促进细胞迁移、增殖、分化和新组织的形成。在本研究中，本实施例设计了一种由GCS、OSA、AHI-mSiO2 Ps和干细胞组成的可注射GOAS-干细胞水凝胶。通过mSiO2 Ps无机颗粒介孔通道和有机水凝胶的三维网格多孔通道的协同调控，实现缓慢释放AHI。此外，复合水凝胶的多孔结构促进细胞和新生组织之间的相互作用，允许足够的营养物质交换制备。Q-PCR分析数据显示，在GOAS-干细胞水凝胶组，col2a1、acan、sox9 等软骨相关标志物表达水平明显高于GOS-干细胞水凝胶组。western blot的结果以及HYP和 GAG含量结果也都表明，GOS-干细胞水凝胶更有利于促进干细胞成软骨分化。
故而，本实施例设计的GOAS-干细胞水凝胶在体外表现出显著促进干细胞成软骨分化的效果。
实施例4.缓释脱水淫羊藿素的复合自愈性水凝胶在软骨缺损修复中的应用
1.实验方法
1.1动物软骨缺损模型的建立及修复手术
所有动物操作程序均已获得上海交通大学医学院附属新华医院机构动物护理和使用委员会的批准。我们使用的所有动物均购自上海市松江区松联实验动物场。将成年雄性新西兰白兔(2.3-2.8kg)用于体内研究。将兔随机分为三组：未治疗组，GOS-干细胞组和GOAS-干细胞组。全身麻醉后，将兔子仰卧。进行髌骨内侧切口以使膝关节脱位并暴露关节表面。使用角膜环钻在股骨滑车的中心钻圆柱状软骨缺损(直径4毫米，深度1.5毫米)。将OSA，GCS， ACSC和空心颗粒的混合物注入软骨缺损部位，并在室温下等待1分钟GOA-干细胞组的水凝胶形成。将OSA，GCS，ACSC和AHI-NPs的混合物注入软骨缺损部位，1分钟后，GOAS-干细胞组的水凝胶形成。未治疗组的软骨缺损未得到治疗。最后，膝关节复位，用缝合线缝合切口，缝合膝关节皮肤。给兔子肌肉注射青霉素以防止感染。允许兔子在单个笼子中自由移动。在第4、8、12周后，处死兔子以进行进一步研究。
1.2纳米压痕评估
根据报道的方法，通过纳米压痕技术对修复的组织进行生物力学分析。取新西兰大白兔的膝关节，分离出样品，并通过TriboIndenter对样品进行生物力学测试，其曲率半径为400 毫米的对角线球形金刚石探针。梯形加载函数应用于每个压痕部位，分别具有加载(10s)，保持(2s)和卸载(10s)。将压痕力控制到最大压痕深度为500nm。
1.3修复效果宏观评价
使用国际软骨修复协会(ICRS)组织学评分评估软骨修复情况，评分由三名不同的研究人员进行。国际软骨修复协会组织学评分标准：
评分项特点 分值
1.表面光滑/连续 3
不连续/不规则 0
2.基质透明软骨 3
混合：透明软骨/纤维软骨 2
纤维软骨 1
纤维组织 0
3.细胞分布圆柱状 3
混合：圆柱状-成簇排列 2
成簇排列 1
单个细胞/不规则 0
4.细胞活力大部分成活 3
部分成活 1
<10％成活 0
5.软骨下骨正常 3
增强的重塑 2
骨坏死/肉芽组织 1
与底部分离或骨折 0
6.软骨钙化正常 3
不正常或钙化 0
1.4标本处理
(1)处死大白兔，取下膝关节，去除软组织；
(2)用PBS将膝关节表面冲洗干净；
(3)固定：将标本浸入4％多聚甲醛中进行固定，12h以上，不超过24h；
(4)冲洗：流水冲洗膝关节标本，冲洗12h以上，彻底去除标本中残留的多聚甲醛；
(5)脱钙：将标本放入12.5％EDTA中进行脱钙，室温摇床上进行，每2天换一次脱钙液。当针头无明显阻力穿过标本时，证明脱钙完成，按照需要和要求进行修剪标本；
(6)冲洗：流水冲洗标本，冲洗12h以上，彻底去除标本中残留的脱钙液；
(7)脱水：按照以下顺序进行梯度脱水：将标本置于80％乙醇脱水1h；将标本置于95％乙醇I脱水1h；将标本置于95％乙醇II脱水1h；将标本置于100％乙醇I脱水1h；将标本置于100％乙醇II脱水1h；将标本置于100％乙醇III脱水1h；
(8)二甲苯透明：按照以下顺序进行标本透明：二甲苯I15min；二甲苯II 15min，在标本透明过程中，观察透明程度，标本完全透明后及时将标本取出,终止透明；
(9)浸蜡：按照以下顺序将标本浸入60℃的石蜡中：石蜡I15min；石蜡II 45min；石蜡III 90min；石蜡IV过夜；
(10)包埋：采用石蜡包埋法将标本进行包埋，修整蜡块，进行分组标记；
(11)切片：做5-7μm连续切片，转移到42℃水浴锅中进行展片，用载玻片捞片，37℃烤片过夜。
1.5统计分析
所有实验至少经过3次重复，数据以平均值±标准差(mean±standarddeviation)表示。两组间差异分析用双尾student’s t检验(two-tailed student’s t-test)。One-wayANOVA用于对多组数据进行统计分析。p<0.05认为具有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.实验结果
2.1复合水凝胶促进了体内软骨的再生
为了进行体内评估复合水凝胶软骨修复情况，使用新西兰白兔建立软骨缺损模型。使用环钻在股骨髁间的中心钻孔，控制软骨缺损直径4毫米，深度1.5毫米。将动物分为未处理组，GOS-干细胞组和GOAS-干细胞组3组，然后将水凝胶的预制前体液注入软骨缺损部位，并在60秒内原位形成复合水凝胶。在术后4周，8周和16周，收集整个膝关节进行大体观察和组织学分析(图12-14)。4周后，如图12A所示，在未处理组中，缺损区域仍然是空的。在GOS-干细胞组，软骨缺损区域中的新生组织极少，而且新生组织为易碎多病变组织。与未处理组和GOS-干细胞相比，在GOAS-干细胞组中可以清楚地看到部分再生组织，但是仍然可以清楚地看到软骨缺损区域。8周后，对照组缺损处仅填充少量纤维组织，几乎未形成软骨，软骨缺损清晰可见。在GOS-干细胞组仍可观察到明显的软骨缺损，缺损处可以观察到一些纤维组织和软骨样组织。与未处理组和GOS-干细胞相比，GOAS-干细胞组再生的组织几乎完全填满了缺损(图12A,图13A)。GOAS-干细胞的平均国际软骨修复协会组织学评分 (ICRS)评分高于GOS-干细胞的评分，是未处理组的1.9倍(图13B)。12周后，未处理组可明显观察到大的软骨缺损区域，而GOS-干细胞组可见部分再生组织填充缺损，仅在中央部位可见软骨缺损。有趣的是，GOAS-干细胞组显示出光滑和白色透明的外观，周围组织整合良好(图12A,图13A)。此外，GOAS-干细胞组ICRS评分是GOS-干细胞组评分的1.2倍(P <0.05)，是未处理组高1.6倍(P<0.01))(图13B)。
植入后12周，进一步检测修复软骨的生物力学特性。如图12B所示，与GOS-干细胞组和未处理组相比，GOAS-干细胞组具有明显更高的折合模量。此外，GOAS-干细胞组的平均硬度值为403KPa，接近正常软骨的硬度，是GOS-干细胞组的平均硬度高近2倍，是未处理组的平均硬度高3.7倍(图12C)。为了模拟完整软骨的功能，复合水凝胶修复的软骨应具有足够的机械强度来承受外部压力。生物力学测试表明，GOAS-干细胞组修复软骨的力学性能与正常软骨相当。以上结果表明，可注射的GOAS-干细胞复合水凝胶具有出色的功能性软骨再生性能。
2.2体内修复软骨的组织学评估
为了进一步评估复合水凝胶修复软骨的质量，对新生软骨进行了甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组织化学染色。在第4周时，未处理组的缺损部位几乎是空的，仅有极少量纤维组织，没有透明软骨样细胞外基质形成。GOS-干细胞组在缺损处可以看到少量新生组织生成，但是几乎看不到透明软骨样细胞外基质。与未处理组和GOS-干细胞组相比，GOAS-干细胞组在缺损处观察到更多的再生组织，而且可以看到有少量透明软骨样细胞外基质形成(图14)。在第8周时，未处理组的缺损中仅充满了少量纤维组织，没有透明软骨样细胞外基质形成。 GOAS-干细胞组在缺损处观察到更多的再生组织，而且可以看到有少量透明软骨样细胞外基质形成。GOAS-干细胞组再生的组织几乎完全填满了缺损，同时可以看到大量的透明软骨样细胞外基质形成(图14)。在第12周，观察到更多的纤维组织填充了未处理组的缺损区域。 GOS-干细胞组再生组织依然未充满软骨缺损区域，可以看到大量的透明的软骨样组织，并伴有裂痕。值得注意的是，GOAS-干细胞组在新组织和天然软骨之间无缝连接，甲苯胺蓝和胶原II染色显示透明软骨样组织的数量最多，新组织几乎完全充满了软骨缺损区，与周围天然软骨齐平(图14)。这些结果表明，可注射复合水凝胶通过提供干细胞并释放软骨诱导天然小分子AHI，可以显著促进软骨的再生，是用于软骨细胞外基质合成和软骨再生很有应用前景的系统。
如图15所示，本实施例提供了一种新的可注射的复合水凝胶通过在水凝胶和mSiO2 Ps 的混合基质中释放一种新的促进干细胞软骨分化的生物活性天然小分子AHI，显著增强软骨再生。构建功能性复合水凝胶的这种方法也可作为优化缺陷部位局部微环境并诱导干细胞参与组织和器官再生的策略。
由于软骨无神经无血管的特性，软骨缺乏自愈能力，因此软骨修复在临床和临床前研究中都面临着一定的挑战。在本实施例中，设计了软骨再生系统GOAS-干细胞复合水凝胶，通过在水凝胶和mSiO2 Ps的混合基质中持续释放AHI(一种促进干细胞软骨形成的新型生物活性小分子)促进软骨修复。从实验结果来看，与未处理组和GOS-干细胞组相比，具有缓慢释放AHI功能的GOAS-干细胞复合水凝胶系统的修复效果更好。此外，从组织学评价来看， GOS-干细胞水凝胶修复软骨的评分最高，术后12周，再生软骨填充满整个软骨缺损区，再生软骨的力学参数更接近正常软骨。缓释的AHI增加了干细胞蛋白多糖沉积和II型胶原含量，增加了再生软骨的质量。组织学评估和生物力学测试表明，复合水凝胶在诱导干细胞增殖，体外分化以及促进体内细胞外基质产生和软骨再生方面表现出优异的性能。以上实验结果充分标明，GOAS-干细胞复合水凝胶是一种很有应用前景的生物材料，在未来组织和器官的再生中具有巨大的潜力。

Claims (10)

1.一种活性物质的用途，其特征在于：
所述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞；
所述用途为包含如下中的至少一种：
用途A.用于制备促进干细胞成软骨分化的药物、生物材料、内植物；
用途B.用于制备促进软骨基质合成的药物、生物材料、内植物；
用途C.用于制备修复软骨的药物、生物材料、内植物；
用途D.用于制备关节炎治疗的药物、生物材料、内植物。
2.如权利要求1所述的一种活性物质的用途，其特征在于：
所述用途还包括：用于制备促进软骨基质合成col2a1，acan和sox9的表达的药物。
3.如权利要求1所述的一种活性物质的用途，其特征在于：
所述药物中，活性物质的用量不大于3μM。
4.一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
将活性物质与凝胶成胶制剂复合形成复合水凝胶；
其中，所述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞。
5.如权利要求4所述的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
所述凝胶成胶制剂包含壳聚糖或其衍生物、海藻酸醛；
所述复合水凝胶的具体的复合方法如下所示：
S1.在超声处理下，将活性物质分散在包含有壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中；
S2.将包含有海藻酸醛的缓冲溶液迅速分散在S1的反应溶液中。
6.一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
将活性物质封装于介孔二氧化硅颗粒中后，与凝胶成胶制剂复合形成复合水凝胶；
其中，所述活性物质选自如下组分中的至少一种：
A.脱水淫羊藿素；
B.脱水淫羊藿素的盐；
C.脱水淫羊藿素的前体物质；
D.脱水淫羊藿素的同分异构体；
E.脱水淫羊藿素的立体异构体；
F.细胞及干细胞；
G.经脱水淫羊藿素处理的细胞及干细胞。
7.如权利要求6所述的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
所述凝胶成胶制剂包含壳聚糖或其衍生物、海藻酸醛；
所述复合水凝胶的具体的复合方法如下所示：
S1.在超声处理下，将封装有活性物质的介孔二氧化硅颗粒分散在包含有壳聚糖或其衍生物的缓冲溶液中；
S2.将包含有海藻酸醛的缓冲溶液迅速分散在S1的反应溶液中。
8.如权利要求7所述的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
所述活性物质封装于介孔二氧化硅颗粒中的具体方法为：在超声处理下，将活性物质分散在缓冲溶液中后，在剧烈搅拌下将介孔二氧化硅颗粒分散在活性物质溶液中，连续搅拌过夜后，将反应溶液蒸发至干；
所述活性物质与介孔二氧化硅颗粒的质量比为1：20-100。
9.如权利要求3-8任一所述的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：
所述可注射的复合水凝胶的用途包含如下用途中的至少一种：
用途A.作为一种3D活细胞支架、生物材料、内植物；
用途B.作为一种诱导干细胞增殖的药物、生物材料、内植物；
用途C.作为促进干细胞成软骨分化的药物、生物材料、内植物；
用途D.用于制备修复软骨的药物、生物材料、内植物；
用途E.用于关节炎治疗药物、生物材料、内植物。
10.如权利要求4-8任一所述的一种可注射的复合水凝胶，其特征在于：所述脱水淫羊藿素可以为其他待缓释的药物替换。
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