CN111514377A - 用于促进细胞和组织生长的固体基质 - Google Patents

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尼尔·阿尔特舒勒
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Cartiheal 2009 Ltd
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Abstract

本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质的特征在于至少75％的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定。本发明还提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质的特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值。本发明还提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质的特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜所测量的实质表面粗糙度(Ra)。本发明还提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于珊瑚的固体基质的方法及其应用。

Description

用于促进细胞和组织生长的固体基质
本申请是申请日为2014年2月10日、申请号为201480021035.1、发明名称为“用于促进细胞和组织生长的固体基质”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求均在2013年2月13日提交的美国临时申请序列号61/763,981、美国临时申请序列号61/763,985、美国临时申请序列号61/764,467和美国临时申请序列号61/764,496的权益，以及要求均在2013年3月6日提交的美国临时申请序列号61/773,219和美国临时申请序列号61/773,228的权益，所有这些都在此以其整体通过引用并入本文。
发明背景
组织生长、再生和修复对于恢复组织的功能和重构组织的形态经常是必要的，例如，由于暴露于创伤、瘤形成、异常组织生长、老化以及其它的结果。
合成材料多年来也已经成功用作用于促进离体组织组装和修复和类似地用于恢复和重构不同组织(例如用于骨)的基质。另一种可能性是自体组织移植，尽管自体组织的供应受到限制且组织采集可能疼痛，具有感染、出血、外表致残(cosmetic disability)、神经损伤和功能丧失的风险。此外，显著发病率与自体移植物采集位点有关。这些问题可通过使用由促进干细胞(例如间充质干细胞(MSC))的粘附、迁移、增殖和分化的合成的或天然的生物材料制成的固体基质对组织工程改造来克服。
寻求治疗的许多疾病和病症将受益于以位点特异性的方式促进细胞和组织生长、促进受损或患病位点内的生长和引入新组织的能力。
在骨和软骨应用中，直接的微环境和三维(3D)组织是一般分化和尤其是软骨形成和成骨性分化中的重要因素。
一些骨组织工程改造支架由天然聚合物(例如胶原蛋白、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖)组成。由于其亲水性相互作用、低毒性和低的慢性炎性反应，天然材料提供特别的细胞相互作用、细胞接种方便性的优点。然而，这些支架通常是机械不稳定的且不易造成具有用于移植的特定预定形状的组织结构的产生。为获得机械强度，需要化学改性，这可能导致毒性。
关节的关节软骨表面的缺损和退化引起疼痛和僵硬。保护关节的软骨的损伤可能由作为创伤、运动或重复应力的结果的物理损伤(例如，由于十字韧带受伤引起的骨软骨骨折、继发损伤)或由疾病(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、无菌性坏死、剥脱性骨软骨炎)引起。
骨关节炎(OA)由关节(最特别是臀部和膝关节)的总体磨损和撕裂引起。骨关节炎在老年人中常见，但事实上到40岁时，大多数个体在其荷重关节中有一些骨关节炎性变化。骨关节炎发病率增加的另一种新趋势是肥胖症的增加。CDC估计30％的美国成人(或六千万人)是肥胖的。肥胖成人比正常体重的成人发生膝OA的可能性大4倍。类风湿性关节炎是导致软骨破坏的炎性病症。其被认为至少部分地是其中患者对该疾病具有遗传倾向性的一种自身免疫性疾病。
损伤关节的整形外科预防和修复在治疗患者的费用和时间花费方面对医疗职业来说都是沉重的负担。这部分地是因为软骨不具有自我修复的能力。再生长透明软骨从而修复软骨缺损的尝试仍然未取得成功。在致力于预防关节的严重退行性变化的尝试中，为了修复缺损并预防关节损伤，整形外科是可行的。外科技术的使用通常要求健康组织的移除和捐赠以替换受损的或患病的组织。采用来自自体移植物、同种异体移植物或异种移植物的供体组织的技术完全不能令人满意，因为自体移植物对受试者添加了额外的创伤，而同种异体移植物和异种移植物受限于对宿主受试者的免疫反应性和感染剂的可能转移。利用除了人或动物组织以外的材料用于软骨再生的外科尝试也未获得成功。
更广泛地，还缺乏用于细胞和组织生长、延伸和建模中的其它应用的适当的固体基质。
至今仍然缺乏修复此类组织的组织功能和促进重构其形态的理想材料。
发明简述
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化固体基质。在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，其包括：建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，和选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明提供了促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质包含优化的海洋生物骨骼衍生物，且特征在于至少75％的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定，且所述固体基质已经暴露于某些分离后纯化和/或加工程序。
在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于至少80％的比流体吸收能力值，且在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于至少85％的比流体吸收能力值，且在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于至少90％的比流体吸收能力值，且在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于至少95％的比流体吸收能力值，且在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于至少97％的比流体吸收能力值。在一些实施方案中，根据本发明且经由本发明的方法获得的固体基质的特征在于75％-100％的比流体吸收能力值。
在一些实施方案中，术语“比流体吸收能力值”在本文也称为“SFUC”或“SWC”，所有这些都应当理解为是可互换的。
在一些实施方案中，本发明的比流体吸收能力值使用自动装置测定。在一些方面，且如下文例举且进一步描述，可以同时或相继评价各种样品的比流体吸收能力值的评价，作为适于商业化生产的自动按比例放大过程的部分。在一些方面，这种装置可以进一步提供个体选择和具有所需特征的样品的转运。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，或用于获得其的方法，所述固体基质包含生物骨骼衍生物，且特征在于，当与流体接触时，具有小于60度的接触角值。
如技术人员将理解，接触角可以如本文所述和例举，使用标准方法和设备(例如，经由测角术)来测定。在一些实施方案中，这种方法可以使用如描述于P.A.Thomson,W.B.Brinckerhoff,M.O.Robbins,:K.L.Mittal(编辑),Contact Angle Wettability andAdhesion,VSP,Utrecht,1993,pp.139–158；E.L.Decker,S.Garof,Langmuir 13(1997)6321；和M.G.Orkoula等人:Colloids and Surfaces A:Physicochem.Eng.Aspects 157(1999)333–340；Hiemenz,P.C.；Rajagopalan,R.Principles of Colloid and SurfaceChemistry,1997,第3版,Marcel Dekker,Inc；Applied Colloid and Surface ChemistryChapter 2:Surface Tension and wetting,by Richard Pashley,Marilyn Karaman,2004,John Wiley and sons的方法，其所有都以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，或用于获得其的方法，所述固体基质的特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜所测量的实质表面粗糙度(Ra)。
在一些实施方案中，珊瑚或珊瑚衍生物是霰石、方解石、其混合物或它们的其它多晶型体。
在一些实施方案中，珊瑚或珊瑚衍生物的结构组成通过X-射线衍射(XRD)或费格尔溶液阳性染色来测定。
在一些实施方案中，所述固体基质分离自滨珊瑚属(Porites species)、角孔珊瑚属(Goniopora)、千孔珊瑚属(Millepora species)或鹿角珊瑚属(Acropora species)。
在一些实施方案中，所述固体基质分离自藤壶或软体动物。在一些实施方案中，所述固体基质由真珠质构成。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的一种或多种固体基质的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒将包含一系列特征在于至少75％的比流体吸收能力值和/或由本发明的方法产生的固体基质，其中所述试剂盒中的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料具有75％至99％的比流体吸收能力值，并且在一些实施方案中，所述试剂盒含有一系列特征在于80％至99％的比流体吸收能力值的固体基质，并且在一些实施方案中，所述试剂盒含有一系列特征在于85％至99％的比流体吸收能力值的固体基质，并且在一些实施方案中，所述试剂盒含有一系列特征在于90％至99％的比流体吸收能力值的固体基质，并且在一些实施方案中，所述试剂盒含有一系列特征在于95％至99％或在其它实施方案中95％至100％的比流体吸收能力值的固体基质。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
·建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；和
·选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，根据该方面，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触0.1–15分钟以促进所述流体自发流体吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述自发流体吸收值的步骤。
在一些实施方案中，根据该方面，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以促进所述流体最大吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。
在一些实施方案中，根据该方面，比流体吸收能力值是所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化的函数。
在一些实施方案中，根据该方面，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化是由于所述流体吸收入所述固体材料的间隙内，或者在一些实施方案中，由于所述流体吸收入所述固体材料的孔内，或者在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化是由于所述流体吸收入所述固体材料的间隙内且由于所述流体吸收入所述固体材料的孔内，其在一些实施方案中，在单个珊瑚晶体内或者在一些实施方案中，在单个珊瑚晶体之间。
在一些实施方案中，根据该方面，比流体吸收能力值是将流体应用于所述基于珊瑚的固体材料的流体体积变化的函数。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质包含生物骨骼衍生物，且特征在于，当与流体接触时，具有小于60度的接触角值。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于生物骨骼衍生物的固体材料；
·使所述基于生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且建立所述生物骨骼衍生物的接触角；和
·选择特征在于接触角小于60度的基于生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，便于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于生物骨骼衍生物的固体基质的本发明方法可以包括以下步骤，由此使基于生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且建立所述生物骨骼衍生物的接触角，或者建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值(所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定)可以在紧接近于目标样品且在一些实施方案中来自相当区域(例如，在生长环中的珊瑚生长的区域方面)的样品上进行，其中设想所述选择在一些实施方案中基于接近区域的表现，和其对于选择期望的标准的实现，如本文所述。
在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料基本上由碳酸钙组成。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
·在所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上建立实质粗糙表面的存在，所述实质粗糙表面通过扫描电子显微镜或原子力显微镜来确定；和·选择特征在于确定所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上存在实质粗糙表面的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·在所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上建立实质粗糙表面的存在，所述实质粗糙表面通过扫描电子显微镜或原子力显微镜来确定；和
·选择特征在于确定所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上存在实质粗糙表面的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于生物骨骼衍生物的固体基质的方法，其包括对于这种本文所述的方法的步骤的组合。
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括使所述固体基质与细胞或组织接触的步骤。
在一些实施方案中，根据该方面，所述接触促进所述细胞或所述组织内的细胞的粘附、增殖或分化或其组合。
在一些实施方案中，流体是含蛋白、含盐或含碳水化合物的溶液，或者在一些实施方案中，流体是生物流体，并且在一些实施方案中，当所述固体基质与受试者的细胞或组织接触时，所述生物流体相对于所述受试者的细胞或组织是自体或异体的。在一些实施方案中，流体是水。
在一些实施方案中，所述固体基质促进由创伤或疾病损伤的组织中的细胞或组织生长。
在一些实施方案中，本发明提供了根据本文所述的任何方面的方法产生的固体基质。
在一些实施方案中，本发明提供了用于将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
a)建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料组的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立所述组中的各样品的自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；
b)选择特征在于一定比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
c)使(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与两亲材料、极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触；
d)测定(c)中获得的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料中如(a)中的比流体吸收能力；和
e)选择(d)中获得的具有新建立的增加的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
本发明还提供了用于将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
a)建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料组的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立所述组中的各样品的自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；
b)选择特征在于一定比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
c)使(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料进行冷等离子体处理、电晕处理或其组合；
d)测定(c)中获得的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料中如(a)中的比流体吸收能力；和
e)选择(d)中获得的具有新建立的增加的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，比流体吸收能力值增加至少5％。在一些实施方案中，所选择的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于75％至95％的比流体吸收能力值。在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少15％。在一些实施方案中，所选择的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于45％至70％的比流体吸收能力值。在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少35％。在一些实施方案中，所选择的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于1％至40％的比流体吸收能力值。在一些实施方案中，所述固体基质基本上由珊瑚或基于珊瑚的衍生物组成。在一些实施方案中，所述固体基质基本上由霰石、方解石、羟基磷灰石或其组合组成。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在建立(d)中的所述比流体吸收能力值之前将基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料完全或部分转化或涂覆为羟基磷灰石的步骤，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料是霰石。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在建立(d)中的所述比流体吸收能力值之后将基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料完全或部分转化为羟基磷灰石的步骤，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料主要是碳酸钙。在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料可以用作骨填料或骨替代材料。在一些实施方案中，两亲材料、极性溶剂、阳离子材料或阴离子材料是吐温、普朗尼克、乙醇、亚甲基蓝、透明质酸、硫酸软骨素或其组合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在与所述两亲材料、极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触之后将次级清洗方法应用于(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的步骤。在一些实施方案中，所述次级清洗方法包括应用热、超声、正压、负压或其组合。在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料进一步包括骨填料、骨水泥、生物玻璃或骨替代材料。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触0.1–15分钟或在一些实施方案中1-2秒至20分钟或在一些实施方案中0.5–40分钟以允许所述流体自发流体吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述自发液体吸收值的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触12直至24小时或在一些实施方案中2直至15小时或在一些实施方案中1直至24小时或在一些实施方案中6直至24小时或在一些实施方案中18直至24小时以允许所述流体自发流体吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述自发液体吸收值的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以提供所述流体最大吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。在一些实施方案中，比流体吸收能力值是所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化的函数。在一些实施方案中，比流体吸收能力值是将流体应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的流体体积变化的函数。在一些实施方案中，流体是含蛋白、含盐或含碳水化合物的溶液。在一些实施方案中，当所述固体基质与受试者的细胞或组织接触时，所述生物流体相对于所述受试者的细胞或组织是自体的。在一些实施方案中，所述流体是水。在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料分离自滨珊瑚属(Poritesspecies)、角孔珊瑚属(Goniopora)、千孔珊瑚属(Millepora species)或鹿角珊瑚属(Acropora species)。在一些实施方案中，所述固体基质分离自藤壶或软体动物，或骨或象牙或象牙质。在一些实施方案中，所述固体基质由真珠质组成。
在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料近似圆柱、圆锥、tac、销、螺钉、矩形棒、板、盘、角椎体、颗粒、粉末、珊瑚沙、球、骨、骨节、肋、椎骨或立方体的形式。在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料近似容纳所需组织生长或修复的位点的形状。在一些实施方案中，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料包含沿着所述基于珊瑚的固体材料的笛卡尔坐标轴的一个或多个凹陷(hollow)。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
·建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；或建立接触角值；和
·选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，
·在所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上建立实质粗糙表面的存在，所述实质粗糙表面通过扫描电子显微镜、x-射线衍射或原子力显微镜来确定；和
·选择特征在于确定所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上存在实质粗糙表面的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
·建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；或建立接触角值；
·选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；和
·通过使用x-射线衍射或费格尔染色阳性染色建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的晶体组成或结构。
本发明提及的所有出版物、专利和专利申请以其整体通过引用并入本文，如同具体和单独地指出各单个出版物或专利通过引用并入一样。在本说明书和并入的参考文献冲突的情况下，将以本说明书为准。当本文中给出数值范围时，该范围包括端点。而且，应理解，除非另有说明或由上下文和本领域技术人员的知识证明，表示为范围的值可以假定为该指定范围内的任何具体的值或亚范围，任选地在本发明的不同实施方案中包括或不包括其中任一个或两个端点，到所述范围下限单位的十分之一，除非上下文明确指示为其它情况。当提到本身具有为整数的单位的值用到百分比时，任何所得分数可以取整到最接近的整数。
附图说明
图1提供了一系列植入物的照片，评价了所述植入物吸收生物流体(在该情况下，人全血)的能力。图1A-1C显示小珊瑚固体基质样品内3种吸收模式，分别为合理地如通过表面颜色变化观察所测定的完全吸收、中等吸收和最小吸收。图1D-1F显示由其分离较小植入物的珊瑚固体基质的较大块。
图2呈现用于鉴定用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的实施筛选方案的流程图。
图3表明随着时间的植入之前的生物流体吸收和位点愈合之间的相关性。4周后，宏观评估用特征在于植入前植入物内大量水和血液吸收或其最小吸收的植入物处理的植入位点。在具有大量流体吸收的样品中，与软骨外观一致的组织基本覆盖植入物，而特征在于最小/减少流体吸收的样品呈现更多植入物植入上的纤维覆盖(分别地，图3A相比于3D)。特征在于最小/减少流体吸收的各植入物[图3B和3C]相比于特征在于大量流体吸收的植入物[图3E和3F]的X射线和显微CT分析表明，特征在于大量流体吸收的植入物似乎正确整合入植入位点，而没有显著的不良反应，具有优异的骨整合、骨传导和骨转导，而特征在于最小/减少流体吸收的植入物似乎诱导机械完整性的骨再吸收、裂解和疏松，这可能是由于增强的破骨细胞活性。
图4提供了针对当暴露于流体时其接触角评估的实施植入物的照片。图4A和4B显示从较大块切出对其接触角表征进行评价的样品的区域，且图4C和4D提供了对于所示区域获得的接触角值。图4A和4B中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图4C和4D中的某些区域提供60至90度(图4C)和超过90度(图4D)的接触角。
图5是针对当暴露于流体时其接触角评估的实施植入物的照片。图5A显示从较大块切出的区域，对其评价其接触角表征。图5B和5C中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图5B和5C中的某些区域提供60至90度和超过90度的接触角(分别地，蓝色区域相比于红色区域)。
图6类似地提供了针对当暴露于流体时其接触角评估的实施植入物的照片。图6A显示从较大块切出的区域，对其评价其接触角表征。图6B中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图6B中的某些区域提供60至90度和超过90度的接触角(分别地，蓝色区域相比于红色区域)。
图7表明显示比较表面润湿特征的ESEM分析的结果。图7A中评价的样品显示零液滴角度值，没有液滴形成，表明高亲水结构。图7B描绘应用流体之后，当应用水时未能“湿润”的样品。图7C显示，在再干燥之后，水滴在表面上是显而易见的，与不良表面润湿的表型一致。图7D呈现不同样品的结果，其结果与小于60度的接触角一致，且图7E呈现不同样品的结果，其结果与高于60度的接触角一致。
图8表明在具有最小生物流体吸收的样品中在各种放大率下特征在于最小生物液体吸收的分离基质与特征在于实质生物液体吸收的基质的如通过ESEM测定的微观结构的比较，表明与实质吸收样品相比更光滑的外表面(图8A-8C相比于8D-8F)。
图9表明在具有最小生物流体吸收的样品中在各种放大率下特征在于最小生物液体吸收的分离基质与特征在于实质生物液体吸收的基质的如通过AFM测定的微观结构的比较，表明与实质吸收样品相比更光滑的外表面(图9A-9C相比于9D-9F)。
图10绘制将吐温80应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图11绘制将吐温80和超声处理应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图12绘制将普朗尼克(有或无吐温80)应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图13绘制将无水乙醇应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图14绘制将亚甲基蓝应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图15绘制将透明质酸应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图16绘制将硫酸软骨素应用于这种样品之前和之后作为评价的珊瑚样品的函数的SFUC值。
图17绘制来自相继暴露于纯化化学品(次氯酸盐和过氧化氢，随后无水乙醇提取)的两个样品(第一评估(n＝13)和第二评估(n＝15)珊瑚)的植入物的SWC值。*P<0.05；**P<0.01。
图18和19类似地绘制暴露于纯化步骤和乙醇提取步骤之后的植入物的平均SWC值。
图20A和20B在侧视图和顶视图中示意性描绘本发明的实施自动化装置。
图21A-21C呈现具有低比流体吸收能力值(图21A和图21B)相比于高比流体吸收能力值(图21C)的珊瑚基质的细胞粘附的扫描电子显微照片。
图22A-B用图形描绘具有低相比于高比流体吸收能力值的样品中如通过
Figure BDA0002435238150000131
测定法所测定的HEPM细胞增殖和活力值。
图23A-F描绘如文献中报道的传统费格尔染色(图23A-23B)，和在进一步乙醇纯化步骤之前(图23C，23D)和之后(图23E，23F)通过本发明的实施方法分离和处理的珊瑚样品中的血液吸收相比于费格尔染色。
发明详述
本发明尤其提供用于选择和获得用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的固体基质的方法和由此获得的材料。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质包含珊瑚，且特征在于至少75％的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质包含生物骨骼衍生物，且特征在于，当与流体接触时，具有小于60度的接触角值。
在一些实施方案中，本发明提供了用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质，所述固体基质包含海洋生物骨骼衍生物且特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜所测量实质表面粗糙度(Ra)。
本发明的固体基质将包含基于海洋生物骨骼衍生物的材料。
在一些实施方案中，术语“基于海洋生物骨骼衍生物的材料”是指源自海洋生物和源自生物的骨架组分，诸如如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入的生物的外骨骼的固体片或研磨材料。
在一些实施方案中，术语“基于海洋生物骨骼衍生物的材料”是指如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入的基于珊瑚的材料。
主要由CaCO3组成的珊瑚已经显示具有支持快速细胞浸润(cellularinvasion)、粘附和增殖的优点。珊瑚已经显示是用于有利于间质干细胞的粘附、增殖和分化和最终引入软骨和/或骨组织的有效基质。珊瑚也已经显示充当用于促进许多其它细胞类型的粘附和增殖的优异基质，其充当细胞和组织生长的优异支持物。
术语“珊瑚”和“碳酸钙”和“霰石”和“方解石”在本发明中可互换使用，除非具体相反说明。
在一些实施方案中，术语“基于海洋生物骨骼衍生物的材料”是指如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入的珊瑚或珊瑚衍生物。在一些实施方案中，术语“基于海洋生物骨骼衍生物的材料”是指如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入的源自藤壶或软体动物的骨骼材料，且在一些实施方案中，预期如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入的真珠质的包含物。
在一些实施方案中，术语“基于海洋生物骨骼衍生物的材料”是指珊瑚或珊瑚衍生物，其分离自天然海洋生物，且随后如本文所述加工，以便适合于植入人或兽医受试者，所述基于海洋生物骨骼衍生物的材料已经具体进行如本文所述的进一步加工，包括先前的清洗和纯化步骤，以便将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的分离的基于海洋生物骨骼衍生物的材料转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的材料。
在一些实施方案中，这样的优化具体包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与两亲材料、极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触。
在一些实施方案中，所述固体基质含有源自珊瑚且悬浮于生物相容性基质的研磨颗粒。在一些实施方案中，所述生物相容性基质是水凝胶。
在一些实施方案中，如本文所使用提及“植入物”或“塞子”或“固体基质”是指如本文关于固体基质描述且被认为包括在本发明的所述方面中的任何实施方案或组合实施方案。例如，如本文所使用提及“固体基质”应当理解为指如本文所述适用于所示目的或含有所示属性等的固体基质的任何实施方案。
在一个实施方案中，“固体基质”是指用于细胞和/或组织修复和/或恢复功能的成型平台，其中所述成形平台提供这种修复和/或恢复功能的位点。在一个实施方案中，所述固体基质是临时平台。在一个实施方案中，“临时平台”是指本发明的珊瑚的自然降解，其在这种修复过程中随着时间发生，其中所述珊瑚的自然完全或部分降解可以导致固体基质形状随着时间的变化和/或固体基质尺寸随着时间的变化。
应当理解的是，不同种的珊瑚在其平均孔径和孔体积方面有变化，并且本发明考虑使用任何这种珊瑚作为用于制备如本文所述的固体基质的起始材料，其中所述固体基质的特征在于其特征在于至少75％的比流体吸收能力值，其如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入。
如本文所使用，术语“孔隙体积”是指本发明的多孔支架内的体积或开放空间。孔隙体积通过本领域已知的任何方法测定。孔隙率可通过标准方法来计算，其中一个实例在下文进一步提供，参见例如Karageorgiou V,Kaplan D.(2005)"Porosity of 3Dbiomaterial scaffolds and osteogenesis"Biomaterials.；26(27):5474-91，其以其整体通过引用并入本文。
应当理解的是，术语“珊瑚”是指这样的起始材料，从其可以分离霰石、碳酸钙、方解石或羟基磷灰石等，且如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入。
在一个实施方案中，本发明的固体基质、方法和/或试剂盒利用珊瑚的使用，所述珊瑚如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者且进一步加工以优化用于植入。在一个实施方案中，所述珊瑚包括任何种，尤其包括滨珊瑚、鹿角珊瑚、角孔珊瑚、千孔珊瑚或其组合。在另一个实施方案中，本发明的固体基质、方法和/或试剂盒利用真珠质、软体动物壳或骨块的使用。
在一个实施方案中，所述珊瑚来自滨珊瑚属。在一个实施方案中，所述珊瑚是滨珊瑚(Porites lutea)。在一个实施方案中，所述珊瑚来自鹿角珊瑚属。在一个实施方案中，所述珊瑚是巨枝鹿角珊瑚(Acropora grandis)，在一个实施方案中，其是非常常见的、生长迅速的且易于在培养中生长。因此，在一个实施方案中，鹿角珊瑚样品可以在珊瑚礁的掩蔽区域中容易地收集，且通过使用培养的珊瑚材料可以避免从珊瑚礁收集。
在另一个实施方案中，所述珊瑚来自千孔珊瑚属。在一个实施方案中，所述珊瑚是两叉千孔珊瑚(Millepora dichotoma)。在一个实施方案中，所述珊瑚的孔径为150μm，且可以克隆和培养，使得千孔珊瑚属可用作本发明的固体基质、方法和/或试剂盒的骨架。
在一个实施方案中，所述珊瑚来自角孔珊瑚属。在一些实施方案中，所述珊瑚是Goniopora albiconus、Goniopora burgosi、Goniopora cellulosa、锡兰角孔珊瑚(Goniopora ceylon)、Goniopora ciliatus、圆柱角孔珊瑚(Goniopora columna)、Goniopora djiboutiensis、Goniopora eclipsensis、Goniopora fruticosa、细角孔珊瑚(Goniopora gracilis)、Goniopora klunzingeri、兜水母目角孔珊瑚(Gonioporalobata)、Goniopora mauritiensis、Goniopora minor、Goniopora norfolkensis、Goniopora palmensis、Goniopora pandoraensis、Goniopora parvistella、Gonioporapearsoni、Goniopora pendulus、Goniopora planulata、多形角孔珊瑚(Gonioporapolyformis)、Goniopora reptans、Goniopora savignyi、Goniopora somaliensis、Goniopora stokes、斯氏角孔珊瑚(Goniopora stutchburyi)、苏丹角孔珊瑚(Gonioporasultani)、柔嫩角孔珊瑚(Goniopora tenella)、Goniopora tenuidens或翠绿色角孔珊瑚(Goniopora viridis)。
在另一个实施方案中，所述珊瑚来自以下种中的任何一种或多种：海孔角蜂巢珊瑚(Favites halicora)；网状菊花珊瑚(Goniastrea retiformis)；棘星珊瑚(Acanthastrea echinata)；Acanthastrea hemprichi；Acanthastrea ishigakiensis；粗糙鹿角珊瑚(Acropora aspera)；简单轴孔珊瑚(Acropora austera)；珊瑚虫属“browndigitate”；荆棘鹿角珊瑚(Acropora carduus)；谷鹿角珊瑚(Acropora cerealis)；鹿角珊瑚(Acropora chesterfieldensis；方格鹿角珊瑚(Acropora clathrata)；Acroporacophodactyla；珊瑚虫属“danai-like”；两叉轴孔珊瑚(Acropora divaricata)；童氏轴孔珊瑚(Acropora donei)；棘鹿角珊瑚(Acropora echinata)；蓝花盘珊瑚(Acroporaefflorescens)；芽枝鹿角珊瑚(Acropora gemmifera)；鹿角珊瑚(Acropora globiceps)；颗粒鹿角珊瑚(Acropora granulosa)；Acropora cf hemprichi；Acropora kosurini；Acropora cf loisettae；Acropora longicyathus；罗立轴孔珊瑚(Acropora loripes)；粗短轴孔珊瑚(Acropora cf lutkeni)；Acropora paniculata；Acropora proximalis；Acropora rudis；石松鹿角珊瑚(Acropora selago)；单独鹿角珊瑚(Acroporasolitaryensis)；Acropora cf spicifera as per Veron；Acropora cf spicifera asper Wallace；柔枝轴孔珊瑚(Acropora tenuis)；华伦轴孔珊瑚(Acroporavalenciennesi)；巨锥轴孔珊瑚(Acropora vaughani)；穗枝轴孔珊瑚(Acroporavermiculata)；疣星孔珊瑚(Astreopora gracilis)；多星孔珊瑚(Astreoporamyriophthalma)；蓝德尔星孔珊瑚(Astreopora randalli)；Astreopora suggesta；澳纹珊瑚(Australomussa rowleyensis)；柱形筛珊瑚(Coscinaraea collumna)；壳状筛孔珊瑚(Coscinaraea crassa)；刺蕺珊瑚(Cynarina lacrymalis)；紫侧孔珊瑚(Distichoporaviolacea)；棘刺叶珊瑚(Echinophyllia echinata)；梳状珊瑚科(Echinophyllia cfechinoporoides)；宝石刺孔珊瑚(Echinopora gemmacea)；粗糙棘叶珊瑚(Echinoporahirsutissima)；榔头珊瑚(Euphyllia ancora)；花瓶珊瑚(Euphyllia divisa)；Euphylliayaeyamensis；圆形角菊珊瑚(Favia rotundata)；Favia truncatus；Favitesacuticollis；五边角蜂巢珊瑚(Favities pentagona)；颗粒石芝珊瑚(Fungiagranulosa)；Fungia klunzingeri；Fungia mollucensis；Galaxea acrhelia；艾氏菊花珊瑚(Goniastrea edwardsi)；Goniastea minuta；Hydnophora pilosa；环柔纹珊瑚(Leptoseris explanata)；壳状柔纹珊瑚(Leptoseris incrustans)；类菌柔纹珊瑚(Leptoseris mycetoseroides)；凹凸柔纹珊瑚(Leptoseris scabra)；叶形柔纹珊瑚(Leptoseris yabei)；波状石叶珊瑚(Lithophyllon undulatum)；赫氏叶状珊瑚(Lobophyllia hemprichii)；粗裸肋珊瑚(Merulina scabricula)；两叉千孔珊瑚(Millepora dichotoma)；Millepora exaesa；纠结千孔珊瑚(Millipora intricata)；Millepora murrayensis；板叶千孔珊瑚(Millipora platyphylla)；简短园菊珊瑚(Monastrea curta)；Monastrea colemani；曲纹表孔珊瑚(Montipora caliculata)；疣表孔珊瑚(Montipora capitata)；浅窝蔷薇珊瑚(Montipora foveolata)；Montiporameandrina；结节蔷薇珊瑚(Montipora tuberculosa)；Montipora cf vietnamensis；Oulophyllia laevis；Oxypora crassispinosa；撕裂尖孔珊瑚(Oxypora lacera)；Pavonabipartita；脉结牡丹珊瑚(Pavona venosa)；莴苣梳状珊瑚(Pectinia alcicornis)；牡丹梳珊瑚(Pectinia paeonea)；尖边扁脑珊瑚(Platygyra acuta)；小脑纹珊瑚(Platygyrapini)；扁脑珊瑚“green”；维氏脑纹珊瑚(Platygyra verweyi)；Podabacia cflanakensis；疣滨珊瑚(Porites annae)；指表孔珊瑚(Porites cylindrica)；Poritesevermanni；Porites monticulosa；指形表孔珊瑚(Psammocora digitata)；Psammocoraexplanulata；血红沙珊瑚(Psammocora haimeana)；浅薄沙珊瑚(Psammocorasuperficialis)；锯齿屣珊瑚(Sandalolitha dentata)；浅杯排孔珊瑚(Seriatoporacaliendrum)；甲胄柱群珊瑚(Stylocoeniella armata)；罩柱群珊瑚(Stylocoeniellaguentheri)；柱星珊瑚(Stylaster sp.)；笙珊瑚(Tubipora musica)；小星陀螺珊瑚(Turbinaria stellulata)；或本领域已知的任何珊瑚或其组合。
在另一个实施方案中，海洋动物的衍生物-诸如珊瑚、海绵动物、软体动物壳和其它相关生物可以用于本发明的固体基质、方法和/或试剂盒中，可以是石珊瑚目、蓝珊瑚目的苍珊瑚科(Helioporida)、匍匐珊瑚目的笙珊瑚属、多孔螅目的千孔珊瑚科或本领域已知的其它珊瑚。在一些实施方案中，用于本发明的基质、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括造礁石珊瑚，在一些实施方案中包括角孔珊瑚属和其它。在一些实施方案中，用于本发明的基质、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括汽孔珊瑚(Alveoppora)。在一些实施方案中，用于本发明的基质、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括竹珊瑚，在一些实施方案中，包括来自竹珊瑚科(Isididae)、掌状珊瑚属(generaKeratoisis)、Isidella和其它。
在本发明的一个实施方案中，术语“珊瑚”是指从单片珊瑚切下来的珊瑚，且如下文所述进一步加工以适合用于植入人或兽医受试者，且仍进一步加工以优化用于植入。
在一些实施方案中，所述固体基质是任何所需形状。
在一个实施方案中，珊瑚可以机器加工成各种构型，且相当复杂的形状，如圆柱形结构和螺纹结构可以由适当的机器或其它加工如化学加工来形成。在另一个实施方案中，珊瑚可以成形以形成固体块、棒或颗粒形式。在一个实施方案中，珊瑚材料以这样的方式成形，以便符合所需组织结构的形状或填充潜在植入位点中的间隙和轮廓缺损。在一个实施方案中，以使其接触相邻定位的组织结构的最大表面积的方向植入珊瑚。
在一些实施方案中，所述固体基质近似圆柱、圆锥、tac、销、螺钉、矩形棒、板、盘、角椎体、颗粒、粉末、珊瑚沙、球、骨、骨节、肋、椎骨或立方体的形式。在一些实施方案中，所述固体基质近似容纳所需组织生长或修复的位点的形状。
在一些实施方案中，所述固体基质包含沿着所述固体基质的笛卡尔坐标轴的一个或多个凹陷。
在一个实施方案中，珊瑚固体基质的尺寸可以是可用于本发明目的的任何尺寸，如本领域技术人员将根据目的所知。例如且在一个实施方案中，所述固体基质可以是与意欲替代的结构基本上相同的尺寸，而在另一个实施方案中，固体基质或其部分可以是缺损、裂缝或断裂的尺寸，使得其可以被置于其中，以增强/替换离散位置中的组织形成/功能。在一个实施方案中，用于本发明的固体基质中的珊瑚包含适用于细胞接种和/或脉管系统发展的平均空隙直径、平均孔径或其组合。
本发明的方法和材料，在一些实施方案中，依靠用于使用的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的分离或制备。在一些实施方案中，这种分离和制备可以尤其包括，选择所需样品，包括从较大珊瑚样品中的生长环的所需区域选择许多样品，和/或在一些实施方案中，首先加工这种样品，和/或在一些实施方案中，预筛选这种样品用于其吸收如本文所述的流体，和/或在一些实施方案中，进一步加工这种样品，如本文所述。根据该方面，这种分离和制备在所述建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值之前实现，如本文所述，在一些实施方案中，如至少75％的所述比流体吸收能力值或当与流体接触时小于60度的接触角值或如本文所述的表面粗糙度或费格尔染色阳性所表征选择基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料之前实现。
在一个实施方案中，将珊瑚在其使用之前洗涤、漂白、冷冻、干燥、暴露于电力、磁力或超声波或微波或电磁辐射或高压或其组合。根据该方面，且在一些实施方案中，将珊瑚暴露于进一步加工，如下文所述。
在一些实施方案中，所述固体基质是适合于预期目的的尺寸，如本领域技术人员将理解。
例如，且在一些实施方案中，用于骨软骨治疗或修复的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且在一些实施方案中，本发明和/或用于所述试剂盒和方法的固体基质可以具有约5-15mm的直径和约5-25mm的高度。在一些实施方案中，所述固体基质具有约1-35mm的直径，且约1-45mm或约5-40mm的高度，和约5-60mm或约5-15mm的高度，和约5-45mm、5-30mm、15-60mm或更高的高度。
例如，且在一些实施方案中，本发明和/或用于所述试剂盒和方法的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且在一些实施方案中，本发明和/或用于所述试剂盒和方法的固体基质可以具有纳米或微米尺度的直径。在一些实施方案中，用于骨软骨治疗或修复的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且具有约1-100nm的直径，或在一些实施方案中，具有约50–1000nm的直径，或在一些实施方案中，具有约10–2000nm的直径，或在一些实施方案中，具有约100–4000nm的直径。在一些实施方案中，用于骨软骨治疗或修复的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且具有约1-100μm的直径，或在一些实施方案中，具有约50–1000μm的直径，或在一些实施方案中，具有约10–2000μm的直径，或在一些实施方案中，具有约100–4000μm的直径。
例如，且在一些实施方案中，本发明和/或用于所述试剂盒和方法的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且在一些实施方案中，本发明和/或用于所述试剂盒和方法的固体基质可以具有毫米或厘米尺度的直径。在一些实施方案中，用于骨软骨治疗或修复的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且具有约1-100mm的直径，或在一些实施方案中，具有约50–1000mm的直径，或在一些实施方案中，具有约10–2000mm的直径，或在一些实施方案中，具有约100–4000mm的直径。在一些实施方案中，用于骨软骨治疗或修复的固体基质可以利用形状为圆柱形或椭圆形的基质，且具有约1-100cm的直径，或在一些实施方案中，具有约50–1000cm的直径，或在一些实施方案中，具有约10–2000cm的直径，或在一些实施方案中，具有约100–4000cm的直径。
技术人应当理解，可以选择基质的尺寸，以便适合于具体应用，例如，当用作用于骨修复的支架材料时，则所述尺寸可以近似于受试者中的长骨的维度。因此，本发明不应由固体基质的尺寸限制。
本发明的固体基质的相内的空隙的平均直径可以通过任何方式测定，包括数字图像分析。
在一些实施方案中，根据本发明使用的珊瑚可以如PCT国际申请公开号WO 2009/066283、PCT国际申请公开号WO 2010/058400、PCT国际申请公开号WO 2010/146574和PCT国际申请公开号WO 2010/146574(其各自以其整体通过引用并入本文)所述制备。
在一些实施方案中，珊瑚通过已知方法且如本文所述分离自天然来源。在一些实施方案中，小心地从较大珊瑚样品内的一个或多个生长环的区域分离珊瑚切片，所述区域已经显示具有适当的比流体吸收能力值、适当的接触角值和/或表面粗糙度，如本文所述，且在一些实施方案中，然后暴露于如下文所述的进一步加工。
本发明的方法促进获得本发明的固体基质，其特征在于如对于特定应用所需的比流体吸收能力值，例如，至少75％，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定。
如本文描述且例举，例如，如实施例3和4中所述，比流体吸收能力值可以通过以下测定：评价给定样品的生物流体的自发吸收相比于总吸收能力，且达到所述比流体吸收能力水平，由此如果该值超过75％，则这种固体基质将用于促进细胞和组织生长和/或恢复功能的应用中。
在一些实施方案中，用于选择固体基质的方法包括分离基于珊瑚的固体材料的样品，和建立所述材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定，和选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值的材料。
在一些实施方案中，所述生物流体是血液，且在一些实施方案中，所述生物流体是水。在一些实施方案中，所述生物流体是亲水性的。
在一些实施方案中，当所述固体基质与受试者的这种细胞或组织接触时，所述生物流体相对于所述受试者的细胞或组织是自体的。
应当理解的是，所述生物流体可以是生物相容且其引入对于所述应用在固体基质中是适当的任何流体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述材料与流体接触2–15分钟以促进所述流体自发流体吸收入所述基于珊瑚的固体材料以达到所述自发流体吸收值的步骤。在一些实施方案中，所述方法可以允许所述材料与流体接触0.5–15分钟、或在一些实施方案中0.5-5分钟、或在一些实施方案中10—60分钟、或在一些实施方案中60至90分钟、或在一些实施方案中其它时间间隔，以促进自发流体吸收。技术人员将了解，可以根据所评价的样品基质的维度和几何形状延长或缩短应用流体以测定自发吸收的时间量。在一些实施方案中，当评价较大样品时，所述方法进一步包括使所述材料与流体接触2–24小时以促进所述流体自发流体吸收入所述基于珊瑚的固体材料以达到所述自发流体吸收值的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压或在一些实施方案中机械压力应用于所述基于珊瑚的固体材料以促进所述流体最大吸收入所述基于珊瑚的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。在一些实施方案中，正压的应用经由将真空或在一些实施方案中将机械压力应用于流体中浸渍的基质，促进流体进入其内。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括使所述基于珊瑚的固体材料与流体接触且将正压应用于所述基于珊瑚的固体材料以促进所述流体最大吸收入所述基于珊瑚的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。根据该方面，且在一些实施方案中，注意确保压力的应用不以任何方式损害固体基质的结构完整性。
在一些实施方案中，正压的应用经由任何手动方式，例如，经由使用任何施涂器、注射器等、重力压力和其它，如技术人员所理解。在一些实施方案中，正压的应用经由强制渗透、离心等。在一些实施方案中，预期所述方法和其它的组合。
在一些实施方案中，可以进行预筛选步骤。例如，且在某些实施方案中，取所需厚度的珊瑚切片，其例如可以垂直于珊瑚样品生长环。可以评价切片的生物流体的快速吸收，如，例如，着色蛋白质流体如血液的吸收。在一些实施方案中，可以使用来自任何来源(诸如，例如，来自家畜或其它来源)的血液。
可以进一步评价提供快速吸收为所述预筛选程序的部分的样品的比流体吸收能力值。
例如，且在一些实施方案中，较小样品或特定支架可以分离自由其取珊瑚切片用于预筛选的块，通过预筛选确定以提供生物流体的快速吸收的区域。
在一些实施方案中，将支架和/或较小样品干燥，然后进行进一步加工。这种进一步加工，例如，可以确保去除会使得植入物不适合用于植入人或兽医受试者的物质。在一些实施方案中，这种加工产生根据任何监管机构指导(诸如，例如，ASTM F 1185–03:StandardSpecification for Composition of Hydroxylapatite for Surgical Implants，或ASTMF 1581–08:Standard Specification for Composition of Anorganic Bone forSurgical Implants)适合于植入的产品。
在一些实施方案中，这种进一步加工包括氧化支架和/或较小样品中的有机残余物，和随后消除所使用的氧化剂。在一些方面，这种氧化剂可以包括次氯酸钠、过氧化氢(其溶液)或使用两者，其在一些实施方案中，随后为应用极性溶剂。
在一些实施方案中，可以在建立比流体吸收能力值之后进行这种进一步加工步骤，且在一些实施方案中，可以在建立样品的比流体吸收能力值之前进行这种进一步加工步骤。
根据该方面，且在一些实施方案中，可以将这种支架或较小样品充分干燥，然后评价其自发流体吸收值，例如，如下面实施例1中所述。例如，可以将干燥样品浸入水中，且评价自发流体吸收值，随后评价总流体吸收值。根据该方面，且在一个实施方案中，选择产生至少75％的比流体吸收能力值的样品用于进一步加工。在一个实施方案中，选择产生至少60-95％的比流体吸收能力值的样品用于更进一步加工。
在一些方面，这种更进一步加工包括改善或进一步优化给定支架和/或样品的比流体吸收能力值的方法，包括如本文所述的优化其的方法。在一些实施方案中，这种进一步加工可以包括使支架和/或样品经受极性溶剂暴露，如本文所述。
在一些实施方案中，本发明还提供了用于将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
a)建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料组的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立所述组中的各样品的自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；
b)选择特征在于一定比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
c)使(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料进行冷等离子体处理、电晕处理或其组合；
d)测定(c)中获得的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料中如(a)中的比流体吸收能力；和
e)选择(d)中获得的具有新建立的增加的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，进一步加工具体考虑冷等离子体处理、电晕处理或其组合。在一些实施方案中，进一步加工可以包括通过已知方法例如经由水热反应表面转化成羟基磷灰石。
在一些实施方案中，本发明的用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质包含特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的生物骨骼衍生物。
实施例5表明，特征在于小于60度的接触角值的固体基质与具有至少75％的比流体吸收能力值的样品是相当的，因此，这种样品也被认为是本发明的包含部分。
用于测定接触角的方法是众所周知的，并且可以使用任何适当的方法。这种方法的一个实施方案在本文中关于实施例5提供且如上所述。
在一些实施方案中，珊瑚或珊瑚衍生物的结构组成通过X-射线衍射(XRD)或费格尔溶液阳性染色来测定。
在一些实施方案中，术语“费格尔溶液阳性染色”或“费格尔染色阳性”是指与本领域已知且如本文所述的标准费格尔染色模式(黑色)一致的染色模式，表明霰石晶体结构。
类似地，在本发明的一些实施方案中，提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于生物骨骼衍生物的固体材料；
·使所述基于生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且建立所述生物骨骼衍生物的接触角；和
·选择特征在于小于60度的接触角的基于生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明的基于珊瑚的固体基质可以通过已知方法部分或完全转化为羟基磷灰石。
根据该方面，可以将特征在于至少75％的比流体吸收能力值的固体基质，其比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定，转化为羟基磷灰石，且所示活性存在于经转化的基质中。
在另一个实施方案中，可以将特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的固体基质转化为羟基磷灰石，且所示活性存在于经转化的基质中。
在另一个方面，将固体基质转化为羟基磷灰石，且然后评价其中至少75％的比流体吸收能力值的存在，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定，且本申请具体选择和涵盖这种满足所述标准的基质。
在另一个方面，将固体基质转化为羟基磷灰石，且然后在其接触角和所述角度是否小于60度的方面对其进行评价，且本申请具体选择和涵盖这种满足所述标准的基质。
根据该方面，且在一个实施方案中，如本文所定义的固体基质，诸如，例如，如本文所述的珊瑚样品或真珠质或其它通过以下来评价：选择用于如本文所述方法中的小干燥样品，可以验证其来自较大块的分离区域，以便提供关于可以分离且然后使用额外样品的块中的区域特征的信息。
在一些方面，将样品在真空下干燥和/或加热或加压或蒸汽处理。
在一些实施方案中，对于关于比流体吸收能力值的方面，这种值是所述基于珊瑚的固体材料的重量变化的函数。
根据该方面且在一些实施方案中，记录各样品的干重，且将如本文所述的流体添加至测定容器中。
根据该方面且在一些实施方案中，将至少1:1比率的mm尺寸的样品与以ml添加的体积的流体应用于容器。在一些实施方案中，与样品尺寸相比，应用的流体量是过量的。
根据该方面且在一些实施方案中，一旦评价初始流体吸收，根据该方面且在一些实施方案中，然后使固体基质样品与流体接触，且评价固体基质样品的重量。在其它实施方案中，通过阿基米德原理通过梯度离心评价比重。
根据该方面且在一些实施方案中，基于样品的重量变化，评价自发流体吸收且建立自发流体吸收值。
根据该方面且在一些实施方案中，比流体吸收能力值是将流体应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的流体体积变化的函数。根据该方面，基于应用于样品的体积的完全吸收，评价自发流体吸收且建立自发流体吸收值。
根据该方面且在一些实施方案中，所述方法然后进一步包括使显著增加量的流体与样品接触，且向其应用压力以促进最大流体吸收至样品的总流体吸收能力。
根据该方面且在一些实施方案中，如上所示，这种压力可以是正压或负压，且应用时间持续足够长的时间，以确保应用的流体最大吸收入海洋生物骨骼衍生物样品。
根据该方面且在一些实施方案中，这种时间可以包括0.5–60分钟的时间间隔，或者在一些实施方案中，当评价较大样品时，这种时间可以包括2-24小时的时间间隔以达到所述自发液体吸收值。应当理解，本文所述的时间间隔适用于如本文所述的关于其的任何实施方案。技术人员将了解，可以根据所评价的样品基质的维度和几何形状延长或缩短应用流体以测定完全能力流体吸收的时间量。
根据这些方面，因此评价总流体吸收能力，然后测定比流体吸收能力值。
在一些实施方案中，本发明具体预期具有超过75％的截止值的比流体吸收能力值的固体基质，应当注意对于样品优化为用于促进细胞或组织生长的固体基质。应当理解的是，本发明预期用于促进减少明显假阳性(即，不作为最适合于所示应用的固体基质)的存在的合理值的所示截止值。
在一些实施方案中，本发明具体预期当与流体接触时具有小于60度的接触角值的固体基质，应当注意对于样品优化为用于促进细胞或组织生长的固体基质。应当理解的是，本发明预期用于促进减少明显假阳性(即，不作为最适合于所示应用的固体基质)的存在的合理值的所示截止值。
应当指出的是，先前已经显示用于促进组织生长的珊瑚基质诸如软骨和骨的有效性。令人惊讶地，现已发现，尽管许多分离的基于珊瑚的基质可用于这种修复，但当针对其增强的生物流体的自发吸收具体选择基质时，发现一致的和优越的功能。令人惊讶地，据发现，不仅基于珊瑚的材料可以是用于促进细胞和组织生长和/或恢复功能的有效材料，而且用于其中的珊瑚的所选样品的自发流体吸收特征在这方面提供甚至更大的活性。
不被理论所束缚，且代表本发明的基质、方法和应用的非限制性实施方案，特征在于至少75％的所需比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择以下样品，其血管形成增强，或在一些实施方案中，其对淋巴的接近增强，或在一些实施方案中，其吸收能力预示对胞外基质相关材料的亲和力，或在一些实施方案中，其吸收能力预示对细胞吸引的亲和力，包括从近端血管外渗。
在其它实施方案中，本发明的基质、方法和应用，特征在于至少75％的所需比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值或具有所述表面粗糙度的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择特别可用于抗癌应用中的样品。
在其它实施方案中，本发明的基质、方法和应用，特征在于至少75％的所需比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值或具有所述表面粗糙度的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择特别可用于促进骨整合、骨传导、骨转导、软骨形成或软骨再生的样品。
在其它实施方案中，本发明的基质、方法和应用，特征在于至少75％的所需比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值或具有所述表面粗糙度的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择特别可用于促进用于细胞、组织或器官生长的离体三维支持和结构的样品。在一些实施方案中，这种细胞、组织或器官生长可以包括用于心脏、肌肉、肝脏、皮肤、肾脏、血管和神经元生长和发育的细胞、组织或器官生长。
在其它实施方案中，本发明的基质、方法和应用，特征在于至少75％的所需比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择或特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值或具有所述表面粗糙度的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择以下样品，所述样品特别可用于促进用于其应用的离体或体外干细胞生长、增殖和/或分化，包括对于由其产生的细胞、组织或器官生长的三维支持和结构提供其，例如，对于心脏、肌肉、肝脏、皮肤、肾脏、血管和神经元生长和发育中的应用。
应当理解的是，任何这些机制和其它机制可以是说明增强的细胞或组织生长或修复功能的现象的原因，并且特征在于至少75％的比流体吸收能力值的用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的应用相关的任何这种机制被理解为是本发明的部分。
在一些实施方案中，由此加工且发现特征在于至少75％的比流体吸收能力值的样品，或者特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择，则可用于分离由其取样品的区段的接近定位的区域，所述样品然后可以可靠地使用，且被认为根据本发明的方法进行优化。在一些实施方案中，关于基于珊瑚的样品，这种区域可以包括由其衍生样品的珊瑚内的整个年生长环区域。
在一些实施方案中，由此加工且发现特征在于至少75％的比流体吸收能力值的样品，或者特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择，然后可以充分干燥且用于植入受试者或用作用于随后植入的细胞、组织或器官生长的离体基质。
在一些实施方案中，且如本文实施例9中所例举，本发明的基质、方法和应用，由此基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的特征在于所需比流体吸收能力值、接触角值或表面粗糙度，促进对这种基质的改善细胞粘附和活力。根据该方面，且在一些实施方案中，细胞粘附和细胞活力测定表明，被认为针对流体吸收优化的样品促进随着时间更大的全细胞粘附和活力。
在一些实施方案中，当样品在体内用于随后应用中时，在一些方面，在植入其之前，样品首先与来自宿主的自体生物流体或材料接触，验证了观察到的如本文所述的增强的流体吸收表型。
本发明的固体基质可以在一些实施方案中可代替或同时特征在于实质表面粗糙度(Ra)，如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜、用于阳性染色的X射线衍射或费格尔溶液分析或技术人员所理解的用于建立其的其它已知测定。
如本文所述和例举，例如，如实施例6中所述，分离的珊瑚的某些部分提供与收获自较大珊瑚片的另一区域的样品不同的表型。这种表型可以反映于样品的吸收能力、表面结构粗糙度或两者，其中所述差异导致产生特征在于促进细胞和组织生长和/或恢复功能的样品。
在一些实施方案中，用于选择固体基质的方法包括分离基于珊瑚的固体材料的样品，且在所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上建立实质粗糙表面的存在，所述实质粗糙表面通过扫描电子显微镜或原子力显微镜、X射线衍射或费格尔溶液阳性染色测定，且选择特征在于确定所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上存在实质粗糙表面或经由费格尔溶液染色的阳性染色(黑色)的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，本发明的基于珊瑚的固体基质可以通过已知方法部分或完全转化为羟基磷灰石。
在另一个方面，将固体基质转化为羟基磷灰石，且然后针对如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜或XRD分析所测量的实质表面粗糙度(Ra)的存在对其进行评价，且本申请具体选择和涵盖这种满足所述标准的基质。
不被理论所束缚，且代表本发明的基质、方法和应用的非限制性实施方案，特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可以选择以下样品，其血管形成增强，或在一些实施方案中，其对淋巴的接近增强，或在一些实施方案中，其吸收能力预示对胞外基质相关材料的亲和力，或在一些实施方案中，其吸收能力预示对细胞吸引的亲和力，包括从近端血管外渗。
在一些实施方案中，特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可用于促进抗癌活性。在一些实施方案中，特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可用于促进骨整合、骨传导、骨转导、软骨形成或软骨再生或其组合。在一些实施方案中，特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的具体选择可用于促进用于细胞、组织或器官生长的离体三维结构支持，其在一些实施方案中，特别适合于心脏、肌肉、肝脏、皮肤、肾脏、血管或神经元中的应用。
应当理解的是，任何这些机制和其它机制可以是说明增强的细胞或组织生长或修复功能的现象的原因，并且特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的应用相关的任何这种机制被理解为是本发明的部分。
在一些实施方案中，由此加工且发现特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的样品，则可用于分离由其取样品的区段的接近定位的区域，所述样品然后可以可靠地使用，且被认为根据本发明的方法进行优化。在一些实施方案中，关于基于珊瑚的样品，这种区域可以包括由其衍生样品的珊瑚内的整个年生长环区域。
在一些实施方案中，由此加工且发现特征在于如通过用于确定如本文所述的这些特征的方法所测量的所需比流体吸收能力值或所需表面粗糙度(Ra)的样品，则可用于植入受试者或用作用于随后植入的细胞或组织生长的离体基质。
在一些实施方案中，本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质可以加工/制备以形成骨填料或骨替代材料。
在一些实施方案中，本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质可用于整形外科应用，包括用作整形外科螺钉、假体和其它，如技术人员所理解。在一些实施方案中，本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质可用于需要填充材料(诸如间隙填料)的应用。
在一些实施方案中，这种填料可以包括活动玻璃，如技术人员所知。其它商业产品可以与本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质组合。在一些实施方案中，以下美国专利中所述的骨填充材料可以与本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质组合：5,939,039；6,325,987；6,383,519；6,521,246；6,969,501；和6,991,803，其中所有都以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质可用于利用增强结构(例如作为其它的增强螺钉、移植物)的应用中。在一些实施方案中，本发明的方法和材料可用于固定适合于这种应用的螺钉、假体和其它结构。
在一些实施方案中，本发明的方法和材料可用于伤口愈合。在一些实施方案中，本发明的材料包括基于固体海洋生物骨骼衍生物的固体基质，根据如本文所述的其任何实施方案，尤其包括，毫米或厘米尺度的基质，或在一些实施方案中，预期使用粉末或颗粒状的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质。
在一些实施方案中，这种伤口愈合可以包括烧伤、坏死组织、糖尿病性溃疡、手术伤口和任何伤口的愈合，如技术人员所理解。
在一些实施方案中，本发明的方法和材料可用于缺血性坏死、囊肿或骨肿瘤治疗中的应用中，例如，在其手术切除之后。
在一些实施方案中，本发明的方法和材料可用于颅面骨手术的应用和骨骼重构应用中。
在其它实施方案中，基质可以是几种海洋来源材料的混合物或骨和珊瑚颗粒或软骨和珊瑚颗粒的混合物。在一些实施方案中，固体基质可以是由如本文所述的海洋生物骨骼衍生物的多种样品组成的复合材料。
在本发明的一个实施方案中，固体基质可以是单独的分离的海洋生物骨骼衍生物材料，或在一些实施方案中，基质可以进一步包含额外材料。
在一些实施方案中，这种额外材料可以包括聚合物。
在一些实施方案中，术语“聚合物”是指与至少一部分固体基质材料结合的聚合物材料层的存在。在一些实施方案中，这种聚合物层是用于固体基质材料的涂层。
在一些实施方案中，这种涂层可以覆盖整个固体基质，和在一些实施方案中，这种涂层可以渗入固体基质的孔隙和/或气孔和/或空腔内。在一些实施方案中，这种涂层可以选择性地应用至固体基质的特定区域，使得它在固体基质上产生单独的相，和在一些实施方案中，可以应用这种聚合物以使得厚的聚合物层或相与一部分固体基质结合，从而产生与本文描述的固体基质结合的单独的聚合物相。
在一些实施方案中，所述聚合物涂层为如本文所述的固体基质提供了增加的特征，例如，对于固体基质增加的拉伸强度，增加的柔韧性，降低的脆性，和其它属性，和在一些实施方案中，所述聚合物涂层导致更大的细胞吸引和粘附到本文所述的固体基质上，这随之又特别导致修复量、质量和时机方面的增强修复。在一些实施方案中，所述聚合物涂层增强细胞增殖和/或分化成所需成熟组织，这随之又特别导致修复量、质量和时机方面的增强修复。
在本发明的一个实施方案中，聚合物涂层是渗透性的。在一个实施方案中，所述渗透性聚合物涂层包括特殊的多孔膜。在一个实施方案中，术语“渗透性的”是指具有气孔和开口。在一个实施方案中，本发明渗透性的聚合物涂层具有允许营养物质、治疗化合物、细胞群体、螯合剂或其组合进入的气孔和开口。在一个实施方案中，本发明渗透性的聚合物涂层具有允许营养物质、治疗化合物、细胞群体、螯合剂或其组合离开/释放的气孔和开口。
在一个实施方案中，本发明聚合物涂层是非连续的。在一个实施方案中，本发明的珊瑚的一个区域或多个子区域不含聚合物涂层，从而允许珊瑚和环境之间的直接接触。
在一些实施方案中，所述固体基质在其中结合生物相容的聚合物，其经由任何物理或化学结合与霰石或方解石组分结合。在一些实施方案中，所述聚合物是水凝胶的部分，其并入本发明的固体基质中。在一些实施方案中，这种含水凝胶的固体基质随后可以冻干或干燥，且随后可以重组。
在本发明的固体基质的一些实施方案中，聚合物可应用于固体基质，从而形成单独相，或在一些实施方案中，聚合物可以作为层应用于固体基质上，或在一些实施方案中，固体基质可以包含作为内部或外部相关层的聚合物与其结合的包含相同或不同的聚合物材料的单独相。
这种包含聚合物的固体基质可特别适于软骨修复、再生或其形成的增强。在一些实施方案中，根据该方面，例如，在治疗骨软骨缺损中，所述基于珊瑚的固体基质为适于并入受影响的骨内的尺寸，且进一步包括含聚合物的相，当插入受影响的缺损位点内时，该相邻近受影响的软骨。在另一个方面和代表本发明的一个实施方案，所述固体基质包含聚合物，其渗入固体基质的孔隙和气孔内，所述固体基质插入软骨修复位点内且所述聚合物促进软骨生长、再生或缺损位点的愈合。
这种包含聚合物的固体基质可特别适于骨修复、再生或其形成的增强。在一些实施方案中，根据该方面，例如，在治疗骨水肿、骨破损或破碎、骨疾病或骨缺损中，所述基于珊瑚的固体基质为适于并入受影响的骨内的尺寸，且进一步包含聚合物，其渗入固体基质孔隙和气孔内，所述固体基质插入骨内且所述聚合物促进骨生长、再生或缺损位点的愈合。
在一个实施方案中，本发明的聚合物涂层包含天然聚合物，其包括胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、丝(silk)、透明质酸、透明质酸钠、交联透明质酸、壳聚糖、交联壳聚糖、藻酸盐、藻酸钙、交联藻酸钙及其任何组合。
在一个实施方案中，所述聚合物包含合成改性的天然聚合物，且可以包括纤维素衍生物，例如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝化纤维素。适当的纤维素衍生物的实例包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐。
在本发明的一个实施方案中，聚合物包含合成的可生物降解聚合物。在本发明的一个实施方案中，合成的可生物降解聚合物包括α-羟酸，包括聚乳酸、聚乙醇酸、其对应异构体、其共聚物、聚原酸酯(polyorthoesters)及其组合。
在一个实施方案中，本发明聚合物包括聚(氰基丙烯酸酯)、聚(烷基-氰基丙烯酸酯)、聚(缩酮)、聚(己内酯)、聚(缩醛)、聚(α-羟基-酯)、聚(α-羟基-酯)、聚(羟基-链烷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(亚氨基-碳酸酯)、聚(酯)、聚(醚)、聚(碳酸酯)、聚(酰胺)、聚(硅氧烷)、聚(硅烷)、聚(硫醚)、聚(酰亚胺)、聚(脲)、聚(酰胺-烯胺)、聚(有机酸)、聚(电解质)、聚(对-二氧环己酮)、聚(烯烃)、泊洛沙姆、无机或有机金属聚合物、弹性体、或其任何衍生物、或由其组合获得的共聚物。
在一个实施方案中，本发明聚合物包括聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。在另一个实施方案中，所述聚合物包括聚(D,L-丙交酯)(PLA)。在另一个实施方案中，所述聚合物包括聚(D,L-乙交酯)(PGA)。在一个实施方案中，所述聚合物包括糖胺聚糖。
在一个实施方案中，所述聚合物包括合成的可降解聚合物，其可包括但不限于聚羟酸，例如聚(丙交酯)、聚(乙交酯)及其共聚物；聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚(羟丁酸)；聚(羟戊酸)；聚[丙交酯-共-(ε-己内酯)]；聚[乙交酯-共(ε-己内酯)]；聚(碳酸酯)、聚(伪氨基酸)；聚(氨基酸)；聚(羟基链烷酸酯)；聚(酐)；聚(原酸酯)；及其混合物和共聚物。
在本发明的一个实施方案中，聚合物包括蛋白，诸如玉米蛋白、改性玉米蛋白、酪蛋白、明胶、麸质、血清白蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、α-胎蛋白、球蛋白、巨球蛋白、粘连蛋白(cohesin)、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨保护素(osteoprotegerin)或本领域技术人员理解的其它蛋白。在另一个实施方案中，聚合物可以包括环糖(cyclicsugar)、环糊精、环糊精的合成衍生物、糖脂、糖胺聚糖、低聚糖、聚糖诸如藻酸盐、角叉菜胶(χ、λ、μ、κ)、壳聚糖、纤维素、硫酸软骨素、凝胶多糖(curdlan)、葡聚糖、爱生兰(elsinan)、红藻胶(furcellran)、半乳糖甘露聚糖、结冷胶(gellan)、糖原、阿拉伯胶、半纤维素、菊粉、刺梧桐树胶、果聚糖、果胶、支链淀粉(pullulan)、茁霉多糖、金属卟啉(prophyran)、硬葡聚糖、淀粉、黄蓍胶、威兰胶(welan)、黄原胶、木聚糖、木糖葡萄糖、透明质酸、甲壳质或聚(3-羟基链烷酸)，诸如聚(β-羟丁酸)、聚(3-羟辛酸)或聚(3-羟脂肪酸)，或其任何组合。
在一个实施方案中，所述聚合物包括可生物蚀解聚合物，诸如聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(酐)和聚(原酸酯)，其由于聚合物的光滑表面的侵蚀而具有暴露于外表面的羧基，其也可使用。在一个实施方案中，所述聚合物包含不稳定键，诸如聚酐和聚酯。
在一个实施方案中，聚合物可以包含其化学衍生物(化学基团例如烷基、亚烷基的取代、增加和去除；羟基化；氧化及本领域技术人员常规进行的其它修饰)、例如单独的蛋白质或碳水化合物或者与合成聚合物组合的混合物。
在本发明的一个实施方案中，聚合物是可生物降解的。在一个实施方案中，术语“可生物降解”或其语法形式是指本发明材料，其在其所存在的受试者生物环境中降解。在一个实施方案中，所述可生物降解的材料经历降解，在降解期间释放酸性产物，或在另一个实施方案中释放碱性产物。在一个实施方案中，生物降解包括材料例如经由消化通过生化过程降解成其组分亚基。在一个实施方案中，生物降解可以包括例如本发明聚合物骨架中键的裂解(无论是共价键或其它键)。在另一个实施方案中，生物降解可以包括侧链内键或例如将侧链连接至聚合物骨架的键(无论是共价键或其它键)的裂解。
在一个实施方案中，本发明珊瑚通过利用交联剂与聚合物涂层共价结合。在一个实施方案中，短语“交联剂”是指促进2个原子之间共价键形成的试剂。在一个实施方案中，所述交联剂是零长度交联剂。
在一个实施方案中，所述交联剂是(1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N-磺基羟基琥珀酰胺(磺基NHS)、5-碘嘧啶、N-烷氧羰基二氢喹啉、吡咯喹啉醌、京尼平(genipin)或其组合。
在一个实施方案中，所述交联剂是同型双功能交联剂，诸如例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯或二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、同型双功能亚氨酯(例如己二亚氨酸二甲酯或庚二亚氨酸二甲酯)、巯基反应性交联剂(例如1,4-二-[3’-(2’-二硫吡啶)丙酰氨基]丁烷)、二氟苯衍生物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、醛(例如甲醛、戊二醛)、二-环氧化物(例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚)、酰肼(例如己二酸二酰肼)、二-重氮衍生物(例如o-联甲苯胺)、二-烷基卤或其组合。
在一个实施方案中，所述交联剂是异双功能交联剂，诸如例如，胺反应性和巯基反应性交联剂(例如N-琥珀酰亚胺3-(2-二硫吡啶)丙酸酯、羰基反应性和巯基反应性交联剂(例如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)，或其组合。
在一些实施方案中，所述交联剂是三功能交联剂，诸如例如，4-叠氮-2-硝基苯基生物胞素-4-硝基苯基酯、磺基琥珀酰亚胺基-2-[6-生物素酰胺]-2-(对-叠氮苯甲酰胺基)己烷酰胺基]乙基-1,3’-二硫丙酸(磺基-SBED)，或其组合。
在另一个实施方案中，所述交联剂是酶。在本发明的一个实施方案中，所述交联剂包括转谷氨酰胺酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、聚合酶、连接酶或其组合。
在给定应用中，为活性而使用的交联剂浓度的选择将随所选体积、试剂和聚合物而变化，如本领域技术人员所知的。
在一个实施方案中，本发明珊瑚和本发明聚合物涂层的结合包括物理和/或机械结合。例如，在一个实施方案中，物理和/或机械结合可包括采用任何手段的吸收、风干、使用交联剂、应用热、应用真空、应用冻干方法、冷冻、应用机械力或其任何组合，来促进本发明描述的珊瑚和聚合物涂层之间的物理结合。
在一些实施方案中，聚合物的选择或聚合物应用于如本文所述的固体基质可以如此选择，用于增加流体吸收的增加能力。类似地，可以处理固体基质的表面以同样增加其内的流体吸收。在一些实施方案中，这种表面处理可以包括将血浆应用于固体基质。
对于本领域技术人员而言是显而易见的是：聚合物应用于本发明的固体基质及其组分的物理和/或化学性质可以影响本发明方法及其试剂盒在诱导或增强软骨和/或骨修复中的用途。
在一个实施方案中，如应用于本发明的固体基质的聚合物的厚度为2.0μm到0.1μm。在一个实施方案中，聚合物涂层的厚度为约1.0μm。在一个实施方案中，本发明的聚合物涂层的厚度为10μm到50μm。在一个实施方案中，如应用于本发明的固体基质的聚合物涂层的厚度为约10-25、或约15-30、或约25-50μm。在一个实施方案中，应用于本发明的固体基质的聚合物涂层的厚度为约0.0001-0.1μm。在一个实施方案中，应用于本发明的固体基质的聚合物涂层的厚度为约20-200μm。在一个实施方案中，应用于本发明的固体基质的聚合物涂层的厚度为约100-1500μm。
在一些实施方案中，所述如应用于本发明的固体基质的聚合物是薄涂层，其与本发明的固体基质结合且具有以上指出的厚度。
在一些实施方案中，所述如应用于本发明的固体基质的聚合物涂覆于整个本发明的固体基质，使得，在一些实施方案中，本发明的固体基质内的气孔和孔隙填充有本发明描述的聚合物，且这种如应用的聚合物层的厚度可以为约60-900μm。
在一些实施方案中，所述如应用于本发明的固体基质的聚合物涂覆于固体基质的末端或一部分上，从而在本发明的固体基质上形成额外的聚合物相。根据该方面且在一些实施方案中，所述如应用的聚合物层的厚度为约0.01-10mm。
在一些实施方案中，包含聚合物添加剂的多个固体基质植入期望的植入位点中，其中植入期望位点的应用于第一固体基质的聚合物厚度可相比于应用于第二固体基质的聚合物厚度发生变化。此类厚度的变化可反映本发明描述的范围。
在一个实施方案中，如应用于本发明的固体基质的聚合物的厚度影响本发明的固体基质的物理特性。例如，聚合物应用的厚度可以影响本发明的固体基质的弹性、拉伸强度、粘附性或保持力，或其任何组合。在一个实施方案中，聚合物应用增加本发明的固体基质的弹性。在一个实施方案中，聚合物应用增加本发明的固体基质的拉伸强度。在一个实施方案中，聚合物应用的粘附性与间充质干细胞、血管、期望的修复位点处组织，包括软骨修复、软骨组织、或骨组织、或其组合的粘附有关。在一个实施方案中，聚合物应用降低本发明的固体基质的粘附性。在一个实施方案中，聚合物应用增加本发明的固体基质的粘附性。本领域技术人员将理解，聚合物应用可以增加对于一个物体的粘附性而降低对于另一个物体的粘附性。例如，在一个实施方案中，所述聚合物应用增加对间充质干细胞的粘附性而降低感染剂的粘附性。在一个实施方案中，聚合物应用的保持力与细胞群体的保持有关。在一个实施方案中，保持在聚合物涂层内的细胞群体是间充质干细胞群体、软骨细胞群体、成骨细胞群体等。在一个实施方案中，聚合物应用的保持力与效应物化合物的保持有关。
在一个实施方案中，聚合物应用的厚度影响应用于本发明的固体基质上的细胞的增殖和/或分化，或影响与本发明的基质的细胞或组织生长/恢复功能相关的细胞的活化或迁移，或其组合。
在本发明的固体基质内，生物相容的聚合物(诸如透明质酸)的并入可经由任何方法实现，包括，在一些实施方案中，压力驱动的应用，例如，经由真空、离心力或机械压力的应用。在一些实施方案中，重力足以允许透明质酸适当且相对均匀地渗透到植入物的所需深度。根据该方面，在一个实施方案中，例如使用固绿/番红O染色，植入物的肉眼观察表明透明质酸通过基质的均匀分布并且到达随应用时间和条件变化的所需深度。
在一个实施方案中，本发明的固体基质可以进一步包含效应物化合物，其在一些实施方案中，可以与本发明的固体基质直接结合，或在一些实施方案中，可以与聚合物结合，且与其结合应用。
在一个实施方案中，这种效应物化合物可包括银离子、铜离子或其它金属或其组合。在另一个实施方案中，可通过应用电荷便于该化合物的释放。
在另一个实施方案中，第一植入物可以用金属诸如银涂覆，且第二植入物可以用第二金属诸如金涂覆。电场的应用或由电池驱动可引起电荷流至植入材料之间，且由于银离子的放电而导致区域的杀菌。这种实施方式可以，例如，可用于治疗骨髓炎。
在一个实施方案中，所述效应物化合物包含本发明试剂盒的组分，其用于并入如本文所述的本发明的固体基质中。
在本发明的一个实施方案中，所述效应物化合物包括细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、生长因子、螯合剂、细胞群体、治疗化合物或抗生素、或其任何组合。
在本发明一个实施方案中，短语“治疗化合物”是指肽、蛋白或核酸，或其组合。在另一个实施方案中，所述治疗化合物是抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗寄生虫化合物。在另一个实施方案中，所述治疗化合物具有细胞毒性或抗癌活性。在另一个实施方案中，所述治疗化合物是酶、受体、通道蛋白、激素、细胞因子或生长因子。在另一个实施方案中，所述治疗化合物是免疫刺激性的。在另一个实施方案中，所述治疗化合物抑制炎性或免疫反应。在一个实施方案中，所述治疗化合物包括促血管生成因子。
在一个实施方案中，所述效应物化合物包括抗寄生虫剂、抗组胺剂、免疫调节剂、抗凝血剂、表面活性剂、抗体、β肾上腺素能受体抑制剂、钙通道阻断剂、ace抑制剂、生长因子、激素、DNA、siRNA或载体，或其任何组合。
在一个实施方案中，短语“效应物化合物”是指当应用于本发明的固体基质、试剂盒和/或方法时，具有用于治疗、预防、阻止、抑制、延迟或降低感染、疾病、紊乱或病症的发生率的特定目的或应用的任何试剂或化合物。在一个实施方案中，本发明效应物化合物将产生仅使该化合物成像的能力的预期效果。在一些实施方案中，所述效应物化合物可用于使该化合物存在的位点成像，然而，这种能力对使用该化合物的目的或选择而言是次要的。
在本发明的一个实施方案中，当在本文中提及时，术语“效应物化合物”应理解为也包括“药物”和“试剂”，且代表希望其并入本发明的固体基质和/或试剂盒内或需要其用途的分子。在一个实施方案中，所述试剂直接并入本发明的固体基质和/或试剂盒中。在另一个实施方案中，所述试剂通过与本发明聚合物涂层、珊瑚或珊瑚颗粒和/或本发明试剂盒的物理相互作用或与其结合而并入本发明的固体基质和/或试剂盒中。
在一个实施方案中，“效应物化合物”是治疗性化合物。
在一个实施方案中，短语“治疗化合物”是指当提供给需要的受试者时，提供有益效果的分子。在一些情况下，所述分子的治疗性在于它起到代替受试者中这种分子的缺失或存在减少的作用。在一个实施方案中，所述分子是编码不存在蛋白的表达的核酸，诸如在内源无效突变体的情况下被异种蛋白的表达补偿。在其它实施方案中，内源蛋白发生突变并产生非功能蛋白，这通过异源功能蛋白的表达补偿。在其它实施方案中，异源蛋白的表达是对低的内源水平的附加，导致给定蛋白的累积增强表达。在其它实施方案中，所述分子刺激提供用于细胞或宿主功能的关键成分的表达或分泌或其它的信号传导级联。
在另一个实施方案中，所述治疗化合物可以是天然或非天然的胰岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、激酶、磷酸酶、转糖基酶、胰蛋白酶元、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶、激素、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、三酰甘油脂肪酶、磷脂酶A2、弹性蛋白酶、淀粉酶、凝血因子、UDP葡糖醛酸基转移酶、鸟氨酸氨甲酸基转移酶、细胞色素p450酶、腺苷脱氨酶、血清胸腺因子、胸腺体液因子、促胸腺生成素、生长激素、生长调节素、共刺激因子、抗体、集落刺激因子、促红细胞生成因子、表皮生长因子、肝促红细胞生成因子(肝细胞生成素)、肝细胞生长因子、白介素、干扰素、负性生长因子(negative growth factor)、成纤维细胞生长因子、α家族转化生长因子、β家族转化生长因子、胃泌素、分泌素、缩胆囊肽、生长激素抑制素、血清素、P物质、转录因子或其组合。
在本发明的任何实施方案中，本发明的珊瑚固体基质及其在方法中的使用还可以包括其它化合物，或和其它化合物一起植入，所述化合物诸如例如为抗氧化剂、生长因子、细胞因子、抗生素、抗炎剂、免疫抑制剂、防腐剂、止痛药、其它治疗剂和赋形剂。在一个实施方案中，除HMG-CoA还原酶抑制剂之外，可以施用的生长因子的实例包括但不限于，表皮生长因子(EGF)、转化生长因于-α(TGF-α)、转化生长因于-β(TGF-β)、人内皮细胞生长因子(ECGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、软骨源形态发生蛋白(CDMP)、富含血小板的血浆(PRP)、血小板源性生长因子(PDGF)或其任何组合。抗生素的实例包括抗微生物剂和抗菌剂。
在一个实施方案中，用于本发明的固体基质和/或试剂盒和/或本发明方法中的效应物化合物尤其可以包括抗体或抗体片段、肽、寡核苷酸、生物靶标的配体、免疫缀合物、化学模拟官能团、糖脂、标记试剂、酶、金属离子螯合剂、酶辅助因子、细胞毒性化合物、杀菌化合物、抑菌化合物、杀真菌化合物、抑真菌化合物、化学治疗剂、生长因子、激素、细胞因子、毒素、前药、抗代谢物、微管抑制剂、放射性材料或靶向部分，或其任何组合。
在一个实施方案中，本发明的固体基质和/或试剂盒和/或本发明方法包括或利用了寡核苷酸、核酸或载体。在一些实施方案中，术语“寡核苷酸”可与术语“核酸”互换使用，且可以指可包括但不限于，原核序列、真核mRNA、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA，以及甚至合成DNA序列的分子。该术语也指包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列。
在一个实施方案中，本发明的固体基质和/或试剂盒和/或本发明使用方法可以包括核酸，或在另一个实施方案中，本发明的固体基质和/或试剂盒和/或本发明使用方法可以包括递送作为特定载体的一部分的核酸。在一个实施方案中，编码目的序列的多核苷酸片段可以结合到适于转导/转化哺乳动物细胞和适于引导转导细胞内重组产物的表达的可商购的表达载体系统中。应理解，这种可商购的载体系统可经由常用重组技术容易地改性，从而替换、复制或突变存在的启动子或增强子序列和/或引入任何其它的多核苷酸序列，诸如例如，编码其它选择标记物的序列或编码报告多肽的序列。
在一个实施方案中，用于本发明的固体基质和/或试剂盒和/或本发明方法中的效应物化合物尤其可以包括细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、生长因子、螯合剂、细胞群体、治疗化合物、抗炎化合物、促血管生成化合物或抗生素，或其任何组合。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒和/或基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质包含已知的骨诱导材料、骨水泥、骨玻璃或骨填料或其组合。
在一些实施方案中，骨水泥可以包括任何已知的水泥，包括β-磷酸三钙、磷酸一钙一水合物(MCPM)(Ca(H2PO4)2H2O)及其混合物，包括水镁石水泥。在一些实施方案中，水泥可以包括无定形磷酸钙(ACP)、磷酸二钙二水合物(DCPD)、无水磷酸二钙(DCPA)、α-磷酸三钙(α-TCP)、磷酸二钙(DCP)、磷酸四钙(TTCP)、磷酸二氢钙一水合物(MCPM)、碳酸钙(CC)和其它及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒和/或基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质包含已知，且在一些实施方案中，可商购的骨诱导材料，包括，例如，生物活性玻璃、骨水泥组分，诸如β-TCP、聚(-甲基丙烯酸甲酯)。
在一些实施方案中，本发明的固体基质可以用细胞、细胞群体或组织接种。
在一些实施方案中，细胞或组织包含干细胞或祖细胞或其组合。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的基质、使用方法或试剂盒使用的细胞或组织进行工程改造从而表达所需产物。
在一个实施方案中，短语“细胞群体”是指转染细胞群体、转导细胞群体、转化细胞群体或从受试者分离的细胞群体，或其组合。在一些实施方案中，转染、转导或转化细胞可以接种在固体基质上，或在一些实施方案中，可以并入用于其的聚合物应用，或其组合中。
在一个实施方案中，本发明细胞群体包括间充质干细胞。在一个实施方案中，所述间充质干细胞是转化的。
在一个实施方案中，细胞群体包含有利于期望植入本发明的固体基质的组织的修复的细胞。
在一些实施方案中，细胞有利于和/或促进软骨和/或骨形成和/或修复。这种细胞可包括成软骨细胞或软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前体细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合。在另一个实施方案中，前体细胞可以指软骨细胞和其它细胞的组合；骨细胞和其它细胞的组合；滑膜细胞和其它细胞的组合；骨髓细胞和其它细胞的组合；间充质细胞和其它细胞的组合；基质细胞和其它细胞的组合；干细胞和其它细胞的组合；胚胎干细胞和其它细胞的组合；从成人组织分离的前体细胞和其它细胞的组合；外周血液祖细胞和其它细胞的组合；从成人组织分离的干细胞和其它细胞的组合；遗传转化细胞和其它细胞的组合。用于本发明方法的前体细胞由受体哺乳动物(即自体的)或同源哺乳动物的器官组织制备。在另一个实施方案中，可以使用同种异体的和异种的前体细胞。
在一个实施方案中，本发明的固体基质并入干细胞或祖细胞或前体细胞。这种细胞可从哺乳动物供体(例如，患者自身细胞)、来自供体的细胞培养物或已建立的培养细胞系中直接获得。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、猴、猿或人。相同种和/或相同免疫特性的细胞可通过活检从患者或近亲中获得。使用标准细胞培养技术和条件，然后使细胞在培养基中生长直到汇合以及需要时使用。可以培养所述细胞直到获得用于特定应用的足够数量的细胞。
在一个实施方案中，本发明的固体基质并入可以参与组织修复例如软骨和/或骨形成或修复的任何细胞。在一些实施方案中，这种细胞代表自体移植物，因为细胞是离外培养以将该细胞接种在本发明的固体基质上，且这种接种的固体基质植入受试者体内。
在一些实施方案中，这种细胞可代表同种异体移植物或异种移植物，其可并入本发明的固体基质中并植入修复位点内。
在一个实施方案中，本发明珊瑚包括来自培养足以将细胞接种在珊瑚中的一段时间的珊瑚体外培养物的细胞群体。在一个实施方案中，所述细胞群体是间充质干细胞群体；软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前体细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合。在一个实施方案中，将体外接种的间充质干细胞；软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前体细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合转化。在一个实施方案中，所述细胞群体包括有益于软骨修复的细胞群体。在一个实施方案中，所述培养物包含螯合剂。在本发明的一个实施方案中，培养物中的螯合剂包括钙螯合剂。
在一些实施方案中，所述固体基质可以进一步充当骨替代物或骨空隙填料。在一些实施方案中，所述固体基质可以进一步并入骨替代物或骨空隙填料。在一些实施方案中，这种含骨材料可以包含自体或异体骨。在一些实施方案中，这种含骨材料可以包含动物骨。
如本文所例举，将所述血液、水和其它亲水性流体应用于珊瑚样品，且评价珊瑚样品内流体的吸收。
图1描绘如所述进行的代表性吸收研究的结果，其显示根据评价的样品分别流体的吸收模式(实质吸收和部分、最小或无吸收)。这种吸收模式的可变性令人惊讶地提供选择在植入后具有优化的细胞和组织生长和/或恢复功能的功效的固体基质的方式。
如本文所提供的实施例2表明与具有最小生物流体吸收的珊瑚固体基质相比，植入的珊瑚固体基质内生物流体的实质吸收和随后在植入位点的愈合之间以令人惊讶的优异方式的相关性。
还例举了实施例3中提供的开发建立以选择这种用于促进细胞或组织生长的优化的基于珊瑚的固体基质的筛选方案。
实施例5提供了当与流体接触时具有小于60度的接触角值的基于生物骨骼衍生物的固体基质的表征的支持，其作为与如上文所述的比流体吸收能力值提供的方式相当的选择方式。
本发明提供了可用于细胞和组织生长和/或恢复功能的优化选择的基于珊瑚的固体基质的意料之外的应用，且本文例举用于软骨和骨修复和形成增强的具体应用。
具体而言，本发明提供了以下意料之外的应用：当固体基质的特征在于至少75％的比流体吸收能力值(所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定)且将这种基质插入骨修复位点时，骨再生、(任选地和骨整合、骨传导和骨转导)修复和形成增强是最佳的。
具体而言，本发明提供了以下意料之外的应用：当固体基质的特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值且将这种基质插入骨修复位点时，骨再生、修复和形成增强是最佳的。
在其它实施方案中，本发明提供了当固体基质的特征在于至少75％的比流体吸收能力值(所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定)且将这种基质插入软骨缺损位点时在较大软骨形成方面意料之外的优势。
在其它实施方案中，本发明提供了当固体基质的特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值且将这种基质插入软骨缺损位点时在较大软骨形成方面意料之外的优势。
本发明在一些实施方案中还提供了可用于细胞和组织生长和/或恢复功能的优化选择的基于珊瑚的固体基质的意料之外的应用，且本文例举用于软骨和骨修复和形成增强的具体应用。
具体而言，本发明提供了以下意料之外的应用：当固体基质的特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜或XRD分析所测量的实质表面粗糙度(Ra)且将这种基质插入骨修复位点时，骨再生、修复和形成增强任选地和骨整合、骨传导和骨转导是最佳的。
在其它实施方案中，本发明提供了当固体基质的特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜或XRD分析所测量的实质表面粗糙度(Ra)且将这种基质插入软骨缺损位点时在较大软骨形成方面意料之外的优势。
在一些实施方案中，本发明的固体基质可以应用于患有需要修复的骨缺损的受试者，其中到达骨缺损导致在覆盖软骨中产生缺损，且本发明的固体基质允许受影响的骨或骨和软骨组织的愈合。
在其它实施方案中，这种固体基质可以施用于患有需要修复的软骨缺损的受试者，其中用于刺激软骨修复的固体基质的最佳插入需要将所述支架锚定在底层骨(underlying bone)中，例如，通过在底层骨中产生最小的孔隙用于固体基质插入，且一旦插入，所述固体基质促进覆盖软骨和底层骨两者的修复。
在其它实施方案中，这种固体基质可以施用于患有骨软骨缺损的受试者，其中骨和软骨组织都需要作为疾病发病机理的部分的修复。在一些实施方案中，根据该方面的固体基质尤其适用于这种应用。
技术人员应当理解，具体而言涉及骨治疗的应用可以包括使用并入如本文所述的任何额外元件的固体基质，所述额外元件包括，例如，骨异种移植物，骨自体移植物，骨替代物，已知的骨空隙填料，治疗性化合物等。
在一些实施方案中，本发明的固体基质可以与其它已知和/或可用的材料结合使用，所述材料用于刺激/增强细胞和/或组织生长和/或恢复功能，例如，通过促进骨和/或软骨修复。
在一些实施方案中，本发明的固体基质可用于固定另外的固体基质，例如用于整个关节修复或韧带修复，或其它结缔组织修复。
在一些实施方案中，例如，本发明的固体基质可用作针，与其它支架结合用于骨修复或再生等。应理解本发明的固体基质(单独或与其它适当材料组合)在治疗、修复或刺激细胞或组织生长或恢复功能中的任何用途将被认为是本发明的一部分。
应理解本发明的固体基质可以是适应于根据本发明方法的应用的任何适当的形状或尺寸。例如和在一些实施方案中，为了将本发明的固体基质应用于受试者的长骨内，固体基质尺寸可调节为接近于支架植入的位点的尺寸，且根据需要，缩放数量级可为毫米到厘米。类似地，本发明的固体基质的形状可以为本发明的固体基质可加工或处理成的任何形状，且可以具有适于实现所需应用于细胞和/或组织生长和恢复功能的任何构型。
在一个实施方案中，将所述珊瑚成形为待生长的组织的形式。例如，所述珊瑚可以成形为软骨组织片，诸如膝盖或肘部半月板的；椎骨，脊柱应用，头骨、盘、关节；骨、胸腔、髋、骨盆、耳、鼻、韧带、支气管和椎间盘的关节面。
本发明提供了，在一些实施方案中，用于修复受试者中与身体创伤相关的软骨和/或骨组织缺损或与疾病或病症相关的软骨和/或骨组织缺损的珊瑚固体基质。
在一个实施方案中，珊瑚固体基质在用于软骨和/或骨修复的方法中之前成形。在一个实施方案中，珊瑚固体基质与软骨和/或骨修复的方法同时成形，例如，当可以最好地观察到修复位点时，可以在手术期间成形珊瑚固体基质，因此优化使用的珊瑚固体基质的形状。
在一些实施方案中，将多个珊瑚固体基质插入以最大限度占据缺损位点，使得每个珊瑚固体基质可以以不同的角度和/或形状和/或深度和/或孔隙率插入，以容纳正确插入期望的植入位点内的期望区域。应当理解的是，角度或定位的提及可以关于具体植入位点中插入的一个或多个珊瑚固体基质。
在一个实施方案中，短语“软骨修复”是指使软骨缺损恢复为更健康的状态。在一个实施方案中，恢复软骨导致软骨组织再生。在一个实施方案中，恢复软骨导致完全或部分厚度的关节软骨缺损的再生。在一个实施方案中，恢复软骨导致软骨修复位点处软骨组织的完全或部分再生。在一个实施方案中，软骨修复可导致缺失或缺损骨组织的恢复/修复，其中软骨缺损的修复需要除去软骨修复位点处的骨组织。在一个实施方案中，恢复软骨导致骨软骨缺损的再生。在一个实施方案中，软骨修复包括恢复关节(例如膝、肘、髋、肩关节)、耳、鼻或气管(wind pipe)的软骨缺损。
在一些实施方案中，“软骨修复”是指治疗、预防或改善或消除骨关节炎和软骨退行性变化的症状，或改善或消除骨关节炎和软骨退行性变化的发病机制。
在一个实施方案中，短语“骨修复”是指将骨缺损恢复到更健康的状态。在一个实施方案中，恢复骨导致骨组织再生。在一个实施方案中，恢复骨导致骨组织内的任何骨折或孔隙的填充。在一个实施方案中，恢复骨导致骨修复位点处骨组织的完全或部分再生。在一个实施方案中，骨修复导致缺失或缺损的骨组织的恢复/修复。在一个实施方案中，骨修复包括根据需要恢复任何骨的骨缺损，治疗骨水肿，和其它骨病。
在一些实施方案中，短语“骨修复”是指治疗患有骨质疏松症、佩吉特病、纤维性结构不良、骨水肿或骨营养不良的受试者。在另一个实施方案中，所述受试者患有骨和/或软骨虚弱。在另一个实施方案中，所述受试者患有其它骨重塑疾病，包括骨软化症、软骨病、类风湿性关节炎、软骨发育不全、骨软骨炎(osteochodrytis)、甲状旁腺机能亢进、成骨不全(eogenesisimperfec)、先天性低磷酸酯酶症、纤维瘤病变、多发性骨髓瘤、异常骨转换、溶骨性骨疾病、牙周病，或其组合。在一个实施方案中，骨重塑疾病包括特征在于有机基质紊乱的骨疾病、骨矿化、骨重塑、内分泌、营养及调节骨骼和无机物体内平衡的其它因子，或其组合。这种疾病可以是遗传性或获得性的，且在一个实施方案中，这种疾病是全身性的并影响整个骨骼系统。
在一些实施方案中，短语“软骨修复”是指治疗、预防或改善或消除骨软骨缺损、骨囊肿、肿瘤、缺血性坏死和其它相关的疾病或病症的症状，或改善或消除骨软骨缺损、骨囊肿、肿瘤、缺血性坏死和其它相关的疾病或病症的发病机制。
本发明的固体基质、试剂盒和方法也可在骨和/或软骨缺损是由骨重塑疾病以外的因素所引起的病症中用于增强骨和/或软骨形成。这种骨缺损包括骨折、骨创伤、与创伤骨手术后、关节修复手术后、骨整形手术后、骨化疗、牙科手术后和骨放疗有关的病症。骨折包括所有种类的微观和宏观骨折。在一个实施方案中，骨折的一些实例包括撕脱骨折、粉碎性骨折、横骨折、斜形骨折、扭转骨折、节段性骨折、移位骨折、嵌入骨折、绿枝性骨折、隆起骨折、疲劳骨折、关节内骨折(骨骺骨折)、闭合性骨折(单纯骨折)、开放性骨折(有创骨折)和潜隐骨折。在一个实施方案中，使用本发明方法治疗的骨折是非连接骨折。
在一个实施方案中，本发明方法用于软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病的诱导或增强修复。在一个实施方案中，所述软骨缺损由创伤、撕裂、运动损伤、全厚度关节软骨缺损、关节缺损或重复应力损伤(例如骨软骨骨折、由于十字韧带损伤引起的继发损伤)而引起。在一个实施方案中，所述软骨紊乱包括软骨疾病。在一个实施方案中，本发明方法诱导或增强骨关节炎、类风湿性关节炎、无菌性坏死、剥脱性骨软骨炎、关节软骨损伤、髌骨软化症、软骨肉瘤、头和颈软骨肉瘤、肋软骨炎、内生软骨瘤、拇趾僵硬、髋臼盂唇撕裂、剥脱性骨软骨炎、半月板撕裂、复发性多软骨炎、犬关节炎、第四鳃弓缺损或皱缩耳的软骨修复。在一个实施方案中，本发明方法诱导或增强退行性软骨疾病中的软骨修复，所述疾病包括至少部分地以机体结缔组织的退化或新陈代谢紊乱为特征的疾病，不仅包括关节或相关结构(包括肌肉、粘液囊(滑膜)、腱、韧带和纤维组织)，而且包括生长板、半月板系统和椎间盘。
在一个实施方案中，本发明的固体基质、试剂盒和方法也可用于增强长骨骨折修复；在节段性缺损中生成骨；提供用于骨折的骨移植替代物；促进肿瘤重构或脊柱融合；提供例如在髋、椎骨或腕的骨质疏松症中虚弱骨或疏松骨的局部治疗(通过注射)，或其组合。在另一个实施方案中，本发明的固体基质、试剂盒和方法也可用于加快骨折的长骨修复；治疗长骨骨折的延迟连接或不连接或者脊柱融合的假关节；诱导髋或膝的无血管形成性坏死中新骨的形成，或其组合的方法中。
在一个实施方案中，本发明方法通过检验软骨和/或骨组织修复位点来评价，其中评估是通过组织学、组织化学、触诊、活检、内诊镜检查、关节镜检查或包含X射线照片、计算机化X射线密度测定法、计算机化荧光密度测定法、CT、MRI或本领域已知的其它方法的成像技术，或其任何组合进行。
在一个实施方案中，本发明的方法包括诱导和增强软骨和/或骨修复，其中将本发明的固体基质植入软骨和/或骨修复的位点内影响和改善软骨和/或骨修复。
在一个实施方案中，本发明的方法诱导或增强软骨和/或骨修复，其中所述固体基质将细胞群体吸引至固体基质，由此影响或改善软骨和/或骨修复。
本领域临床医生将认识到，需要将珊瑚固体基质植入软骨和/或骨修复位点内的本发明方法可能需要准备软骨和/或骨修复位点。这些准备可以发生在植入珊瑚固体基质之前或和植入同时发生。例如，首先可以通过邻近软骨和/或骨修复位点的软骨和/或骨组织和/或其它组织钻孔，来产生尺寸适合于用于本发明方法的珊瑚固体基质的通道。然后将珊瑚固体基质植入该位点内，这样珊瑚固体基质的区域穿过钻孔的软骨和/或骨组织。或者，所述珊瑚固体基质可以粘附至能够穿透软骨和/或骨或其它组织或其组合的工具上。在这种情况下，当所述工具穿过软骨和/或骨组织时，粘附的珊瑚固体基质也同时植入。
在一些实施方案中，在珊瑚固体基质植入修复位点或几种珊瑚固体基质植入修复位点之后，将所述珊瑚固体基质进行加工以优化并入和优化软骨和/或骨修复。在一些实施方案中，这种加工可以包括切割、磨光或以其它方式使一个或多个珊瑚固体基质的表面光滑，用于优化修复。
在一些实施方案中，如本文所定义的固体基质的特征在于至少75％的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定。
在一些实施方案中，如本文所定义的固体基质的特征在于当与流体接触时具有小于60度的接触角值。
在一些实施方案中，如本文所定义的固体基质的特征在于当通过扫描电子显微镜评价时诸如图8D-8F中明显的结构。在一些实施方案中，如本文所定义的固体基质的特征在于当通过原子力显微镜评价时诸如图9D-9F中明显的结构。
在一些实施方案中，当固体基质通过包括以下的方法制备：
·分离基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
·建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；和
·选择特征在于至少75％的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，
或者在一些实施方案中，当固体基质通过包括以下的方法制备：
·分离或制备基于生物骨骼衍生物的固体材料；
·使所述基于生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且建立所述生物骨骼衍生物的接触角；和
·选择特征在于小于60度的接触角的基于生物骨骼衍生物的固体材料；或者在一些实施方案中，这种基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于如通过扫描电子显微镜或原子力显微镜所测量的实质表面粗糙度(Ra)。
在一些实施方案中，本发明提供了用于将次优化的海洋生物骨骼衍生物转化为提供细胞或组织生长或恢复功能的海洋生物骨骼衍生物。在一些实施方案中，本发明提供了用于优化提供增强的细胞或组织生长或恢复功能的海洋生物骨骼衍生物的方法。在一些实施方案中，根据该方面，这种海洋生物骨骼衍生物的初始分离和加工以便呈现与植入哺乳动物组织内相容的形式，例如，在人或兽医应用中，可以减少比流体吸收能力值，且本发明的优化方法便于改善这种值。
根据该方面，且在一些实施方案中，用于根据本发明使用的海洋生物骨骼衍生物的这种分离和加工包括暴露于次氯酸钠和过氧化氢的溶液。根据该方面，标准惯例是用次氯酸钠处理珊瑚/霰石样品，作为第一清洗/加工方案的部分[参见例如，美国专利号US5433751]。
尽管各组已经提出在人受试者的治疗应用中使用基于珊瑚的材料，迄今为止没有任何迹象表明不是给定物种的所有珊瑚样品都提供治疗效果。
令人惊讶地，现已发现，珊瑚的物理特征存在可变性，其影响其治疗应用，而且，某些标准加工步骤负面影响基于珊瑚的材料的治疗潜力。
甚至更令人惊讶的是本文的发现：可以通过应用某些方法步骤，例如，将乙醇选择性应用于样品作为本发明的基于珊瑚的材料的加工步骤的部分，可以恢复和/或改善治疗活性。
在一些实施方案中，本发明提供了用于将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
a)建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料组的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立所述组中的各样品的自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；
b)选择特征在于一定比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
c)使(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与两亲材料、极性溶剂、非极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触；
d)测定(c)中获得的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料中如(a)中的比流体吸收能力；和
e)选择(d)中获得的具有新建立的增加的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少3％。在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少5％。在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少4.5％。在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少3％-15％。
根据该方面，且在一些实施方案中，这种基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于75％至95％的比流体吸收能力值。
在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少10-15％。根据该方面，且在一些实施方案中，这种基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于45％至70％的比流体吸收能力值。
在一些实施方案中，增加的比流体吸收能力值增加至少20-35％。根据该方面，且在一些实施方案中，这种基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于1％至40％的比流体吸收能力值。
在一些实施方案中，两亲材料是洗涤剂或表面活性剂。在一些实施方案中，两亲材料是吐温或由例如聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链侧接例如聚氧丙烯的两个亲水链组成的非离子共聚物。
在一些实施方案中，所述极性溶剂是醇，诸如乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇等。
在一些实施方案中，非极性溶剂是甲苯、己烷、二甲苯和其它。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使基质与(c)中列出的材料接触之后或之前将次级清洗方法应用于(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的步骤。
在一些实施方案中，所述次级清洗方法包括应用压力、加热、超声、乙醇、有机溶剂、盐缓冲液诸如磷酸盐缓冲液、蒸汽处理或其组合。
在一些实施方案中，次级清洗方法包括用有机溶剂处理。在一些实施方案中，次级清洗方法包括酶促处理，诸如，但不限于，使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或软骨素酶ABC。在一些实施方案中，所述次级清洗方法包括超声、加热、冷冻干燥、高压应用、在高压下浸渍等。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料；
·在所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上建立实质粗糙表面的存在，所述实质粗糙表面通过扫描电子显微镜或原子力显微镜来确定；和·选择特征在于确定所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料上存在实质粗糙表面的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料。
在一些实施方案中，根据该方面，所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以促进所述流体最大吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了根据本文所述的任何方面的方法产生的固体基质。
对于本领域技术人员而言将是显而易见的是：在不离开本发明精神和范围的情况下，本发明的固体基质、试剂盒、过程和方法可以进行各种修改和变化。
在一个实施方案中，本发明提供组合制剂。在一个实施方案中，术语“组合制剂”特别定义为“部件试剂盒”，是指上述定义的组合伴体可单独使用或以不同组合使用，即，同时、共同、单独或相继。
实施例
实施例1
本发明的基于珊瑚的固体基质的物理特性可变性
材料和方法
金刚石盘锯用于移取外部珊瑚层，和所需尺寸的代表性较小部分从珊瑚块切割的大部分。
从珊瑚内的各区域收获平均孔径为100-150μm的来自水螅珊瑚类滨珊瑚(Poriteslutea)的珊瑚。目视评估珊瑚的外观、密度和孔隙率。然后任选将珊瑚浸渍于5％次氯酸钠中，用于去除外部有机组织。简言之，首先将珊瑚暴露于5％次氯酸钠溶液30分钟，在温度范围RT在50℃，和使用范围为0.2-0.00001巴的真空压力的亚大气压压力下，3次交换。然后将珊瑚切片在RT-50℃的温度和使用范围为0.2-0.00001巴的真空压力的亚大气压压力下暴露于10％过氧化氢溶液15分钟。然后将清洗的切片在RT-50℃的温度范围和使用范围为0.3-0.00001巴的真空压力的亚大气压压力下用蒸馏水洗涤30分钟，3次交换。
将珊瑚通过以至少22.5kGy的强度暴露于γ辐射而任选灭菌，然后可以在包装材料中无菌储存，且具体而言，照射较小样品，而不照射评价的较大块。
然后将各切片置于塑料培养皿中，且将2ml流体应用于各培养皿。记录关于流体吸收的观察结果。使用的流体包括动物血液、血浆、水和各种有色溶液。
结果
为了确定从各区域移除的样品是否提供其物理特征不同的材料，且这种可变性是否为其提供替代质量，将列出的血液和其它流体应用于珊瑚样品且评价珊瑚样品内的流体吸收。
图1描绘如所述进行的代表性吸收研究的结果。从珊瑚块的不同区域分离珊瑚样品，且评价应用于其的血液的吸收的模式和强度。令人惊讶地，在吸收概况方面似乎没有均匀性，且其不是“全或无”现象。
图1A例如显示整个结构的合理实质吸收，而图1C显示整个结构的不良吸收至无吸收，且图1B提供该结构内的临时现象，因为一些区域基本上吸收流体且一些区域吸收最少流体至不吸收流体。图1D-1F显示穿过由其切割和制备珊瑚塞子的珊瑚片的横截面切片，其同样提供宏观结构内的不同吸收模式。
在其在与图1C中的样品相当的平行样品内的吸收方面评价其它流体。为了充当染料，制备和应用盐溶液、和蛋白溶液、碳水化合物溶液、离子溶液，且结果基本上反映了所应用血液的结果，因为在图1C的样品中发生不良吸收至无吸收。向其应用的自来水提供基本上相同的结果，导致图1C的珊瑚样品内的不良吸收至无吸收。
图1D-1F分别提供由其取图1A-1C的样品的较大珊瑚块的图像。如图1D中可见，由其取1A的样品的区域显示应用的流体(在该情况下，血液)的良好吸收，而由其取图1C的样品的区域(即，图1F的块)显示最小吸收，且图1E中显示的由其取图1B的样品的区域显示中等吸收，因为一些区域显示良好吸收，而其它区域显示最小吸收。
如本文所表明，评价的样品尺寸不是限制性的，且实际上可以因此评价各种尺寸和厚度的样品。此外，表面张力的差异是明显的(比较图1C与图1A)。
实施例2
建立用于基于珊瑚的固体基质的筛选方案
基于实施例1中的发现，可以建立筛选方案以选择用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于珊瑚的固体基质。图2提供预期的筛选方案过程的流程图。将珊瑚样品鉴定、分离和机械加工成所需尺寸和形状，或多块评价。然后将样品清洗和任选灭菌，然后干燥。为此目的，可以将所评价的珊瑚样品在真空下干燥和/或加热。
然后可以记录各样品的干重。
将如本文所述的流体以近似1:1比率添加至各测定容器中，或者将略多，即等于或大于以mm计的样品尺寸相比于以ml计的流体体积添加至容器。
然后可以称重样品，且测定自发流体吸收值。
在进一步操作样品之前，可以任选干燥样品。
使显著增加量的流体与样品接触，且应用真空一定时间段，以确保所应用的流体最大吸收入珊瑚样品。
评价总流体吸收能力，且通过自发流体吸收值除以总流体吸收能力而测定比流体吸收能力值。
如果该值超过75％的截止值，则将记录样品作为用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质的适用性。当样品在体内用于随后应用中时，在一些方面，在植入其之前，首先将样品与来自宿主的自体生物流体或材料接触。如果该值小于所示截止值，则所述样品不用作用于促进细胞或组织生长或恢复功能的固体基质。
实施例3-
根据本发明的基于珊瑚的固体基质的某些物理特性的改善的固体基质引入
为了评价实施例1的塞子的血液吸收的表型可变性的结果，使用标准生产方法制备珊瑚塞子，所述标准生产方法包括三次次氯酸盐洗涤、过氧化氢处理和多次双蒸水洗涤。如实施例2中所述测定其自发流体吸收和总流体吸收值，其中水是这种情况下评价的样品流体。还检查表现出大于75％的自发流体吸收值的样品植入物的自发血液吸收能力。
植入物被分级为红色、白色和中间状态，其中中间状态是指为红色的区域和保持白色的区域。将植入物置于各山羊膝盖，使得各山羊接受特征在于大于75％的自发流体吸收值的植入物和特征在于小于50％的自发流体吸收值的植入物。随访动物4周，然后处死。
肉眼和组织学评价早期软骨形成。使用X射线、显微CT和组织学评价骨整合和早期骨形成或再吸收。
图3表明随着时间的植入之前的生物流体吸收和位点愈合之间的相关性。将特征在于植入物内大量水和血液吸收或其最小吸收的植入物植入缺陷位点，且在植入后4周肉眼评价。在具有显著流体吸收的样品中，与透明软骨外观一致的组织基本覆盖植入物，而特征在于最小/减少流体吸收的样品呈现更多覆盖在植入物植入上的纤维囊(分别地，图3A相比于3D)。特征在于最小/减少流体吸收的各植入物[图3B和3C]相比于特征在于大量流体吸收的植入物[图3E和3F]的X射线和显微CT分析表明，特征在于大量流体吸收的植入物似乎正确整合入植入位点，而没有显著的不良反应。特征在于最小/减少流体吸收的植入物似乎诱导植入物的骨再吸收、裂解和疏松。
实施例4
预筛选用于植入的基于珊瑚的固体基质
对于促进细胞或组织生长或修复功能中的应用，评价固体基质吸收流体(诸如，例如，水)的能力。然后将提供至少75％的比流体吸收能力值的基质植入期望的组织位点。例如，且代表一个实施方案，这种固体基质可以植入软骨和邻近骨内，用于骨软骨缺损或疾病中的修复或再生的应用。
固体基质可以根据如本文所述的任何实施方案制备，如本领域技术人员将理解。
预期所述基质用于兽医学应用，以及用于人类受试者治疗中。在适当时间间隔，标准方法用于评价基质的良好并入和受影响组织的愈合，例如，可以进行X射线、CT或MRI成像以验证所述植入物的位置。
可在任何适当的位置植入，例如，对于膝关节修复，可在股骨内髁(MFC)、股骨侧髁(LFC)、髌骨(Patela)、滑车沟(TG)和胫骨内植入。
在涉及促进细胞或组织生长或修复功能的应用中，应当注意的是，在其促进在所述位点的细胞或组织生长或修复功能、促进植入位点的愈合、促进回复组织功能或其组合的能力的方面，特征在于至少75％的比流体吸收能力值的固体基质将显著优于特征在于小于40％的比流体吸收能力值的固体基质。
实施例5
本发明的基于珊瑚的固体基质的物理特性可变性
天然表面由于其可变的材料组成、表面粗糙度和孔隙率是异质的，因此表现出可变的疏水性/粘附特征。考虑表面的地形和化学结构，接触角测量可以表征粗糙表面的润湿性。
接触角测量用测角术进行。接触角是固体表面上宏观测量的平衡接触角。其不同于原子级平滑、化学均匀表面上测量的Young接触角。
将所述区域分成三个类别且将它们的相对表面积近似为总表面积的百分数：
特征在于0至60度接触角的区域在提供的图中作为白色区域出现。特征在于60至90度的接触角的区域在提供的图中以蓝色标记，且特征在于90度和更高的接触角的区域在提供的图中以红色标记。
用精确的微剂量注射器将1ul-10ul体积的水滴沉积在清洗和干燥的珊瑚样品上。用具有0.1度的精度的Rame-Hart测角仪(Model 500)(Bormashenko,2012)测量接触角。评价液滴的两侧的测量值，且取平均值。采用的测试介质是生理盐水。
评价被称为R43、R34和R44的三个3x3mm珊瑚样品。在评估接触角之前，评价来自每块的样品的比流体吸收能力值，且结果呈现于表1中。
Figure BDA0002435238150000561
Figure BDA0002435238150000571
图4提供了针对其接触角评估的珊瑚样品R43样本的照片。图4A和4B显示从较大块切出的区域，对其评价其接触角表征。图4A和4B中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图4C和4D中的某些区域提供60至90度(图4C)和超过90度(图4D)的接触角。
图5提供了针对其接触角评估的珊瑚样品R34样本的照片。图5A显示从较大块切出的区域，对其评价其接触角表征。图5B和5中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图5B和4C中的某些区域提供60至90度和超过90度的接触角(分别地，蓝色区域相比于红色区域)。图6类似地提供了针对其接触角评估的珊瑚样品R44样本的照片。图6A显示从较大块切出的区域，对其评价其接触角表征。图6B中评价的块的大多数区域提供主要小于60度的接触角。图6B中的某些区域提供60至90度和超过90度的接触角(分别地，蓝色区域相比于红色区域)。
接触角测量值平行于对于各珊瑚样品获得的比流体吸收能力值。因此，用于促进细胞或组织生长或该功能的恢复功能的改善的固体基质可以通过测定接触角或比流体吸收能力值进行表征。
此外，环境扫描电子显微镜(ESEM)研究证实了本文呈现的接触角研究的结果。
表2呈现通过ESEM评估的珊瑚样品的比流体吸收能力值。
Figure BDA0002435238150000581
图7呈现在表2中描述的样品上进行的ESEM分析的结果。从R27-7块评价的样品提供零液滴角度值，且没有看到液滴形成(图7A)。图7B-7C呈现样品R30-40的结果。应用流体之后取图7B，且应当指出，当应用水时，该样品未能“湿润”。图7C显示，在再干燥之后，水滴在表面上是显而易见的，与不良表面润湿的表型一致。
图7D-7E呈现样品R43-1的结果，其中结果与对于样品R30-40看到的那些一致。
总之，这些结果确证对于各珊瑚样品获得的接触角数据以及比流体吸收能力值。具有对于各珊瑚样品获得的大于75％的比流体吸收能力值的样品没有表现出表面上的液滴形成，与“良好润湿”的表型一致(图7A)，而具有较低流体吸收能力值的样品在干燥期间表现出液滴形成。
实施例6
本发明的改善的基于珊瑚的固体基质的物理特征
珊瑚样品如上文实施例1所述进行加工。样品然后根据标准方法进行环境扫描电子显微镜和原子力显微镜。
图8A-C表明具有最小比流体吸收能力值的固体基质的表面结构与具有显著比流体吸收能力值的基质的表面结构的比较(比较图8A-C和8D-F)。具有较低比流体吸收能力值的基质与具有较高比流体吸收能力值的基质相比表现出更光滑的外表面结构，而容易看到后者样品的晶体结构。
此外，原子力显微镜表明具有较低比流体吸收能力值的基质的特征在于更光滑的外表面(图9A-9C)。形成鲜明对比，特征在于较高比流体吸收能力值的基质表现出更粗糙的表面(图9D-9F)。
总之，这些结果确证了以下事实：表面结构表征与对于各珊瑚样品获得的比流体吸收能力值相关。具有对于各珊瑚样品获得的大于75％的比流体吸收能力值的样品表现出更粗糙的表面，而具有较低比流体吸收能力值的样品表现出更光滑的表面。
实施例7
开发用于将基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的次优组转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法
材料和方法
如实施例1中所述分离水螅珊瑚类滨珊瑚(Porites lutea)的珊瑚样品，且制备塞子。
然后称重塞子，测定每个样品的干重。将塞子暴露于2ml双蒸水5分钟，然后称重，提供自发吸收值。然后将塞子在真空下暴露于过量双蒸水30分钟，然后称重，以测定每个塞子的总流体吸收值。然后通过自发流体吸收值除以获得的总流体吸收值而测定比流体吸收能力值。
将各切片任选置于塑料培养皿，且将2ml流体诸如血液应用于各皿，且在样品中保持了流体吸收的各自表型，其产生特定的比流体吸收能力值。
然后将显示产生不良吸收且具有小于40％的比流体吸收能力值的样品、显示产生41％至74％的中等总体比流体吸收能力值的样品和显示产生75％至99％的比流体吸收能力值的样品与测试材料接触。在一些方面，测试条件包括应用5ml 0.5％吐温80。
在一些方面，测试条件包括超声处理15分钟；应用无水乙醇；应用5ml普兰尼克，有或无先前应用吐温80。在一些方面，测试条件包括应用5ml亚甲基蓝/0.03％乙酸或3M于DDW中的0.05％透明质酸溶液。
这种处理之后，然后将样品再次与如上所述的流体(诸如水)接触，且再次评价每个样品的比流体吸收能力值。同样宏观验证流体吸收入塞子内，诸如血液的吸收。
类似地评估提供大于50％的比流体吸收能力值的样品，且与具有小于50％的值的那些进行比较。
结果
实施例2表明，特征在于至少75％的比流体吸收能力值的固体基质提供细胞或组织生长或恢复功能，且在海洋生物骨骼衍生物的给定分离块中，在可以由其分离且表现出期望的比流体吸收能力值的塞子数量方面存在可变性。因此，有兴趣确定是否可以增加特征在于小于40％或41％至74％或75％至99％的比流体吸收能力值的样品，其改善每种基质提供细胞或组织生长或恢复功能的能力。
为了确定是否有可能分离特征在于分别各比流体吸收能力值的所示范围的这种骨骼衍生物的样品和处理样品以由此改善比流体吸收能力值以便比先前获得的值更大，采取许多样品的操作。
吐温80是衍生自聚乙氧基化脱水山梨醇和油酸的非离子表面活性剂和乳化剂。因此评价吐温80的改变测试的珊瑚样品的比流体吸收能力值的能力。图10提供了评价的许多样品的结果。在基本上每个评价的样品中，吐温处理增加比流体吸收能力(SFUC)值。显著增强一些表现出较低SFUC值的样品。样品31-10、35-5和其它样品，表现出小于约30％的初始SFUC值，且在吐温80处理之后显示SFUC显著增加至高达超过60％、甚至超过80％的值。当血液应用于样品时，发生快速吸收，与先前的不良吸收形成鲜明对比(图10)。由于用两亲化合物处理插头提供评估的所有样品中的增加的SFUC，有兴趣确定其它操作是否会改善该现象。
为此，然后将已经应用吐温80的样品同样进行超声处理。图11表明这种方法的结果。如图中可见，在大部分样品中，用吐温80处理和超声处理获得的SFUC改善了随后的SFUC值。样品37-30、37-14和其它样品表现出SFUC增加至超过初始值的两倍。在许多样品中，吐温80和超声处理导致大于85％的SFUC值。
为了确定其它两亲化合物是否会提供在增加SFUC值的方面与用吐温看到的结果相同的结果，根据上文所述的方法，将普朗尼克(由侧接两个聚氧丙烯亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烯))的中央疏水链组成的非离子型三嵌段共聚物)应用于样品，来替代吐温。如图12中可见，用普朗尼克处理增加了基本上每种测试样品的SFUC(比较图12中的浅灰色柱与较深灰色柱)。在大多数情况下，将普朗尼克和吐温80两者应用于样品进一步增加获得的SFUC值。
为了确定极性溶剂是否会提供在增加SFUC值的方面与用吐温看到的结果相同的结果，将无水乙醇应用于样品。图13表明，如用吐温和普朗尼克所见，当应用乙醇时，大量评估的样品显示SFUC的增加，尽管在该情况下，当评估具有大于70％的初始SFUC的样品时，所述增加不那么显著。
为了确定阳离子化合物是否会提供在增加SFUC值的方面与用吐温看到的结果相同的结果，将样品暴露于亚甲蓝，类似于上述方法部分中对于吐温80所述。如图14中可见，实际上将亚甲蓝应用于样品有点平行于用乙醇观察到的现象，因为用具有小于30％的SFUC值的样品发现较大的增加。
为了确定阴离子化合物是否会提供在增加SFUC值的方面与用吐温看到的结果相同的结果，将样品暴露于透明质酸，类似于上述方法部分中对于吐温80所述。如图15中可见，实际上将透明质酸应用于样品增加了评估的大多数样品的SFUC值，然而，这种增加相对于吐温80评价的增加更加温和。
类似地，如图16中可见，当使用硫酸软骨素时，每个样品中的SFUC增加是明显的。
为了延伸上文报道的结果，将来自3个不同的珊瑚板坯(coralslabs)(R-76、R-77、R-78)的表现出至少75％的比流体吸收能力值的一系列植入物(n＝42)进行纯化方法，如下：在至少0.03巴的应用负压下将样品以1:20(塞子体积:NaOCl)的比率浸入5％NaOCl(W/W)溶液30分钟，其后倾析液体且将样品暴露于至少0.03巴的应用负压额外30分钟。然后浸渍样品且在至少0.03巴的应用负压下将样品以1:20(塞子体积:H2O2)的比率浸入10％(W/W)H2O2溶液15分钟，其后倾析液体且将样品暴露于至少0.03巴的应用负压额外30分钟。将样品在水中重复洗涤，随后以1:20(塞子体积:H2O)的比率浸入无菌水中，然后暴露于至少0.03巴的应用负压额外30分钟。洗涤步骤重复至少三次。然后将样品在0.03巴的真空压力下干燥至少4至6小时。然后验证代表性样品的比流体吸收能力值。
然后在至少0.03巴的真空条件下将样品以1:10(塞子体积:乙醇)的比率浸入无水乙醇中，随后倾析溶液，且如先前段落中所述在无菌水中洗涤。然后验证代表性样品的比流体吸收能力值(SWC)，结果提供于图17中，显示所示样品的平均SWC值。如从该图中明显的是，当基本清洗方案随后为用极性溶剂(在该情况下，乙醇)的提取步骤时，SWC值以统计学显著的方式改善。
图18-19显示在基本分离/加工步骤之后应用的乙醇提取步骤之前和之后对于样品获得的平均SWC值。如从评价的无数样品明显的是，意料之外地，当提取步骤使用极性溶剂(诸如乙醇)进行时，在基本分离/加工步骤之后增加比流体吸收能力值。
实施例8
用于分离和制备优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的自动化方法和装置
如实施例1中所述分离水螅珊瑚类滨珊瑚(Porites lutea)的珊瑚样品，且制备植入物。将植入物20-10置于容纳盒20-20，且将盖20-70置于装置上。经由真空20-30应用负压持续规定的时间段，直至植入物完全干燥，然后停止应用。然后将该装置单独称重各植入物以建立干重。开始自动化循环，其有利于填充，且在方法期间维持期望的流体水平。所述盒20-20经由流体内的盒操作器20-40单个升高和降低至第一流体水平以实现自发流体吸收，且植入物操纵器20-60单个定向/移动单个植入物用于重量测定，以测定自发流体吸收值，随后任选使各植入物通过干燥/印迹站。将单个植入物均称重，且返回至其在盒中的位置。所述盒20-20然后再次经由过量流体内的盒操作器20-40单个升高和降低至第二显著更高的流体水平，以促进植入物的充分浸渍，且经由真空20-30再次应用负压持续定义的时间段，确保每个植入物内的最大流体吸收。植入物操纵器20-60再次单个定向/移动单个植入物，用于第二重量测定，其提供总流体吸收值。该装置的数据处理单元确定且提供比流体吸收值的输出，任选地具体鉴定基于所示标准选择哪些样品。
应当理解的是，将构建盒的维度以容纳不同大小的植入物。同样可以成比例构建该装置以容纳较大或较小数目的盒，并且材料将适用于待评价其在规定植入物内的吸收的各种流体。并入传感器和适当的继电器，例如，在故障的情况下提供报警系统，且该装置可以进一步包含数据处理单元，以便从获得的测定的自发和总流体吸收值计算比流体吸收能力值。也可以包括统计分析作为任选与本发明的要求保护的装置提供的数据处理包的部分。
实施例9
优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的改善的细胞粘附和可变性材料和方法
使人胚胎腭间充质(HEPM)细胞生长在适当的生长培养基中。
每个珊瑚的优化(具有大于75％的比流体吸收能力值)和未优化的珊瑚(具有小于60％的比流体吸收能力值)的植入物通过以下分别用1.65x104和0.8x104个细胞/10μl的密度用HEPM细胞接种：将细胞与支架在37℃孵育15分钟，随后添加更多培养基，且进一步孵育最多7天。每2天更换生长培养基。
将含有细胞的支架固定于4％甲醛中，经由乙醇梯度溶液和HMDS梯度溶液洗涤且干燥，然后通过SEM评价。
固定后，在接种后第1、3和7天通过SEM观察细胞粘附和形态。
根据制造商的方案，用
Figure BDA0002435238150000631
代谢测定评价细胞活力。在接种后第1和7天取样品。使用Fluoreskan ascent，微孔板荧光阅读器(Labotal)在544nm和590nm处(分别地，激发和发射)评估荧光，数据一式三份。
将新鲜的200l含有
Figure BDA0002435238150000632
的培养基(分别地，1:10)添加至每个支架且再孵育18小时(总共24小时)。
结果
在评估的所有样品中，早在接种后1天发现细胞粘附，其中，优化的(opt)，即具有大于75％的比流体吸收能力值，和未优化的(nonopt)，即具有小于60％的比流体吸收能力值，如通过SEM分析所评估。
具有26％的比流体吸收能力值的未优化的样品显示，细胞粘附至珊瑚，其中可见细胞延伸(荚(pods))最近位于珊瑚表面(图21A)。尽管细胞延伸使得与珊瑚基质接触，大部分细胞体似乎不容易使得接触。图21B呈现了图21A中的“方框”区域的高倍放大，其显示末端细胞延伸与珊瑚的接触，但细胞不变平或在其整个细胞体上与珊瑚完全接触。
形成鲜明对比，具有95％的比流体吸收能力值的优化的样品显示，细胞充分粘附至珊瑚，包括散布在珊瑚上的完整细胞体(图21C)。
接种在未优化和优化的珊瑚样品上的HEPM细胞通过
Figure BDA0002435238150000633
测定来评价，其定量各种人和动物细胞系的增殖。在接种后1天，将值针对在单独的聚苯乙烯孔上接种的细胞培养物获得的值进行均一化。100％被确定为在第1天聚苯乙烯上的细胞活力值(图22A)。图22B代表接种后7天各种珊瑚上的HEPM细胞活力。在每个珊瑚中，7天的值除以1天的值，使得显示细胞活力的增加倍数。如所容易理解，与未优化的样品相比，优化的样品产生显著增加的细胞活力值。HEPM细胞活力在第7天比第1天增加平均42倍，而低SWC珊瑚R29和对照组中的增加分别为仅13倍和7倍。
总之，细胞粘附和细胞活力测定表明，被认为针对流体吸收优化的样品促进随着时间更大的全细胞粘附和活力。
实施例10
晶体形式与分离和制备植入物以产生优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的关联性
材料和方法
根据对于实施例1所述的方法分离和制备珊瑚样品。根据如描述于以下的方案染色样品：[Chemical staining methods used in the identification of carbonateminerals,Tamer AYAN,Mineral Research and Exploration Institute of Turkeyhttp://www.mta.gov.tr/v2.0/eng/dergi_pdf/65/11.pdf].简而言之，根据标准方法制备费格尔溶液。然后用费格尔溶液染色珊瑚样品，且用其染色先前评价其比流体吸收能力值的样品。在该情况下，评价如实施例9中所评价的2个样品，具有95％的比流体吸收能力值的样品R91，和具有42％的比流体吸收能力值的样品R48。
结果
珊瑚主要由碳酸钙(～98％)组成。碳酸钙可以呈不同的晶体形式，诸如霰石和方解石。珊瑚虫可以分泌形成复合外骨骼的其基底外层下方的霰石骨骼，其代表按时间顺序排列的分层档案。在一些区域，霰石结构溶解，且通常在较晚阶段，通过称为成岩作用的过程，形成方解石或微晶灰岩。
已经显示，与现代珊瑚相比，在古珊瑚(中新世)中发现更多的方解石沉淀物。图23-A显示用费格尔溶液染色的中新世珊瑚，其中黑色区域代表霰石晶体结构。图23-B显示通过费格尔染色法染色的珊瑚，其中样品中不存在霰石，因为没有观察到黑色[Bothfigures are taken from Diagenesis of growth bands in fossil scleractiniancorals:identification and modes of preservation,Reuter et al.Facies(2005),51:146-159，所述参考文献以其整体过引用并入本文]。
费格尔溶液将霰石染色为黑色。当宏观观察珊瑚样品时，在给定样品中不存在霰石的情况下，样品将显示白色或灰色。
因此，有兴趣确定晶体结构是否与比流体吸收能力值相关和本文的优化过程是否在费格尔染色方案的方面受影响。为此，评价珊瑚样品R91和R48的比流体吸收能力值，包括首先宏观评估山羊血液的吸收，且进行进一步加工，包括如实施例7中所述的乙醇提取步骤。
图23呈现在乙醇进一步纯化步骤之前和之后从R91和R48取的基本相同的样品的分析结果。尽管费格尔染色的总模式近似于各个相应样品中的血液的吸收的总模式(比较图23C与图23D和图23E与图23F)，染色模式是不同的。此外，如所更容易地观察到，当比较乙醇处理之前和之后的R48的样品时，观察到增加的血液吸收和费格尔阳性染色，表明当进行所述进一步加工步骤时样品的更大优化。
总之，似乎针对霰石相比于非霰石富集的样品更容易地与较高的比流体吸收能力值、自发血液吸收和使用费格尔溶液的黑色染色相关，其可以通过特定进一步加工步骤进一步改善，如本文所述。
本领域技术人员应理解在不离开附加权利要求所给出的本发明精神和范围的前提下，可进行形式和细节上的各种改变。本领域技术人员将认识到或能够仅采用常规实验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等价物。这种等价物应包括在权利要求的范围内。
在一些实施方案中，术语“包含”或其语法形式是指包含本发明的指定组分，也包含其它活性剂，以及制药工业已知的药学可接受的载体、赋形剂、润滑剂、稳定剂等。
在本发明的一个实施方案中，“约”是指满足具体需要的手段的量，例如，所述尺寸可主要是但不完全是指定的尺寸，但它满足软骨和/或骨修复位点处软骨和/或骨修复的具体需要。在一个实施方案中，“约”是指邻近或接近，但并非正好。存在小的误差幅度。该误差幅度不会超过正或负相同整数值。例如，约0.1微米将表示不低于0但不高于0.2。在一些实施方案中，就基准值而言的术语“约”包括高于或低于指定值的不超过5％、不超过10％或不超过20％的偏离。在一个实施方案中，术语“约”是指与所指定值的1-10％的差异，或在另一个实施方案中，指5-15％的差异，或在另一个实施方案中，指最多10％的差异，或在另一个实施方案中，指最多25％的差异，除非上下文指出差异将不会产生超过100％的值。
权利要求项中，例如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”是指一个或多于一个，除非有相反说明或从上下文来看显然相反。组内成员之间包括“或”或者“和/或”的权利要求书和说明书被认为满足一个、超过一个或所有组内成员存在于、用于或与另外与给定产品或方法相关，除非有相反说明或从上下文来看显然相反。本发明包括只有一个组内成员存在于、用于或另外与给定产品或方法相关的实施方案。本发明也包括其中超过一个或所有组内成员存在于、用于或另外与给定产品或方法相关的实施方案。而且，应理解，在各种实施方案中，本发明提供所有的变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列的权利要求中的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等被引入从属于相同基础权利要求的另一个权利要求中，除非另有陈述或除非这对本领域技术人员而言将出现矛盾或不一致。当要素以列表形式存在时，例如，马库什组合形式等，应理解也公开了所述要素的各亚组，且任何要素可从该组中去除。应理解，通常，当本发明或本发明方面被指包含特定要素、特征等时，本发明或本发明方面的某些实施方案由或基本上由这种要素、特征组成。为简化起见，这些实施方案没有在每种情况下具体列出这些术语。为方便起见，某些权利要求以从属权利要求的形式存在，但申请人保留将任何从属权利要求重新撰写成独立形式来包括该权利要求引用的独立权利要求或任何其它权利要求的要素或限定的权利，且这种重新撰写将被认为在各方面与从属权利要求相同，无论在重新撰写成独立形式之前该权利要求为什么形式(修改或未修改)。

Claims (24)

1.用于选择优化用于促进细胞或组织生长或恢复功能的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
·分离或制备基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料由珊瑚或基于珊瑚的衍生物组成；建立所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；或建立接触角值；和
·选择当与流体接触0.1–60分钟，允许所述流体自发流体吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述自发流体吸收值时特征在于至少75％的比流体吸收能力值或特征在于具有小于60度的接触角值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，所述流体是含蛋白、含盐或含碳水化合物的溶液，或作为水、血液或血浆的生物流体。
2.权利要求1的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料包含源自珊瑚且悬浮于生物相容性基质的研磨颗粒或进一步包含骨填料或骨替代材料。
3.权利要求2的方法，其中所述生物相容性基质是水凝胶。
4.权利要求1的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料可以用作骨填料或骨替代材料。
5.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以促进所述流体最大吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述比流体吸收能力值是所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化的函数，或其中所述比流体吸收能力值是将流体应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的流体体积变化的函数。
7.权利要求1的方法，其中当所述固体基质与受试者的细胞或组织接触时，所述生物流体相对于所述受试者的细胞或组织是自体的。
8.权利要求1的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料包含生物相容性聚合物。
9.权利要求8的方法，其中将所述生物相容性聚合物并入所述基质中的空隙或孔中，或其中所述生物相容性聚合物附着至所述基质的外表面。
10.权利要求8的方法，其中所述生物相容性聚合物包含天然聚合物，所述天然聚合物包含糖胺聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、丝、壳聚糖、藻酸盐及其任何组合。
11.权利要求10的方法，其中所述糖胺聚糖是透明质酸、透明质酸钠、交联的透明质酸或其组合。
12.权利要求1或8的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料进一步包含细胞因子、生长因子、治疗性化合物、骨诱导剂、生物活性玻璃、骨填料、骨水泥、药物或其任何组合，其中所述治疗性化合物或药物包含抗炎化合物、抗感染化合物、促血管生成因子或其组合。
13.权利要求1或8的方法，其中所述固体基质提供三维支持和细胞、组织和器官在培养物中的生长，用于应用于心脏、肌肉、肝脏、皮肤、肾脏、结缔组织或神经组织应用中。
14.用于将对于促进细胞或组织生长或恢复功能次优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质转化为优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质的方法，所述方法包括：
a.建立基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料组的比流体吸收能力值，所述比流体吸收能力值通过建立所述组中的各样品的自发流体吸收值除以总流体吸收值而测定；
b.选择当与流体接触0.1–15分钟，允许所述流体自发流体吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述自发流体吸收值时特征在于一定比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，所述流体是含蛋白、含盐或含碳水化合物的溶液，或作为水、血液或血浆的生物流体，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料由珊瑚或基于珊瑚的衍生物组成；
c.使(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与两亲材料、极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触；
d.测定(c)中获得的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料中如(a)中的比流体吸收能力；和
e.选择(d)中获得的具有新建立的增加的比流体吸收能力值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，其中所述增加的比流体吸收能力值增加至少5％，且其中所选择的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的特征在于75％直至且包括100％的比流体吸收能力值。
15.权利要求14的方法，其中所述增加的比流体吸收能力值增加至少15％。
16.权利要求14的方法，其中所述固体基质基本上由霰石、方解石、羟基磷灰石或其组合组成。
17.权利要求14的方法，其中所述两亲材料、极性溶剂、阳离子材料或阴离子材料是吐温、普朗尼克、乙醇、亚甲基蓝、透明质酸、硫酸软骨素或其组合。
18.权利要求14的方法，其进一步包括在与所述两亲材料、极性溶剂、阳离子材料、阴离子材料或其组合接触之后将次级清洗方法应用于(b)的所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的步骤，其中所述次级清洗方法包括应用热、超声、正压、负压或其组合。
19.权利要求14的方法，其中所述方法进一步包括使所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料与流体接触且将负压应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以提供所述流体最大吸收入所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料以达到所述总流体吸收值的步骤。
20.权利要求14的方法，其中所述比流体吸收能力值是所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的重量变化的函数，或其中所述比流体吸收能力值是将流体应用于所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料的流体体积变化的函数。
21.权利要求1或14的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料近似圆柱、圆锥、tac、销、螺钉、矩形棒、板、盘、角椎体、颗粒、粉末、珊瑚沙、骨节、肋、骨盆、椎骨、骨、软骨组织、球或立方体的形式，或其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料近似容纳所需组织生长或修复的位点的形状。
22.权利要求1或14的方法，其中所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料包含沿着所述基于珊瑚的固体材料的笛卡尔坐标轴的一个或多个凹陷。
23.通过权利要求1或14的方法产生的用于促进细胞或组织生长或恢复功能的优化的基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质，所述基于海洋生物骨骼衍生物的固体基质当与流体接触时特征在于至少75％的比流体吸收能力值或特征在于具有小于60度的接触角值的基于海洋生物骨骼衍生物的固体材料，所述流体是含蛋白、含盐或含碳水化合物的溶液，或作为水、血液或血浆的生物流体。
24.试剂盒，其包含至少一种权利要求23的固体基质。
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