BR112015019534B1

BR112015019534B1 - processo para seleção de substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, processo para conversão de substrato sólido subótimo em substrato sólido otimizado para promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, substrato sólido e kit compreendendo o referido substrato sólido

Info

Publication number: BR112015019534B1
Application number: BR112015019534A
Authority: BR
Inventors: Altschuler Nir
Original assignee: Cartiheal 2009 Ltd
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2020-04-07
Also published as: CA2900129C; US20150374880A1; WO2014125477A1; ZA201505574B; DK2956183T3; EP2956183B1; US20200276359A1; JP2016507307A; IL240252A0; JP2016509873A; US11878090B2; CA2900129A1; CA2900176A1; HK1212260A1; US10806823B2; US11116873B2; EP2956183A1; RS62080B1; US9770531B2; US20160184477A1

Abstract

resumo substratos sólidos para a promoção de crescimento celular e de tecido a presente invenção refere-se a substratos sólidos para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido. esta invenção também provê substratos sólidos para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido. esta invenção também provê substratos sólidos para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido é caracterizado por uma aspereza da superfície substancial (ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica. a invenção também provê processos para a seleção de um substrato sólido com base em coral otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada e aplicações dos mesmos.

Description

“PROCESSO PARA SELEÇÃO DE SUBSTRATO SÓLIDO COM BASE NO DERIVADO DO ESQUELETO DE ORGANISMO MARINHO OTIMIZADO PARA PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO CELULAR OU DE TECIDO OU FUNÇÃO RESTAURADA, PROCESSO PARA CONVERSÃO DE SUBSTRATO SÓLIDO SUBÓTIMO EM SUBSTRATO SÓLIDO OTIMIZADO PARA PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO CELULAR OU DE TECIDO OU FUNÇÃO RESTAURADA, SUBSTRATO SÓLIDO E KIT COMPREENDENDO O REFERIDO SUBSTRATO SÓLIDO

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série 61/763.981, Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série 61/763.985, Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série 61/764.467, e Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série 61/764.496, todos os quais foram depositados em 13 de fevereiro de 2013, assim como reivindica o benefício para o Pedido Provisório NorteAmericano Número de Série 61/773.219 e Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série 61/773.228, ambos os quais foram depositados em 6 de março de 2013, todos os quais são por meio deste incorporados aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O crescimento, regeneração e reparo do tecido são frequentemente necessários para restaurar a função e reconstruir a morfologia do tecido, por exemplo, como um resultado da exposição a trauma, neoplasia, crescimento de tecido anormal, envelhecimento e outros.

[003] Os materiais sintéticos também têm sido usados como um substrato para promover a montagem e reparo do

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2/138 tecido ex vivo e similarmente para restaurar e reconstruir diferentes tecidos, por exemplo, para o osso, por muitos anos, com sucesso misto. Outra possibilidade é o enxerto de tecido autólogo, embora o fornecimento de tecido autólogo seja limitado e sua coleta possa ser dolorosa com o risco de infecção, hemorragia, deficiência estética, danos nos nervos e perda de função. Em adição, morbidez significativa é associada aos locais de coleta de autoenxerto. Estes problemas podem ser superados pela engenharia do tecido usando substratos sólidos feitos de biomateriais sintéticos ou naturais que promovem a adesão, migração, proliferação e diferenciação de células-tronco, por exemplo, célulastronco mesenquimais (MSCs).

[004] Muitas doenças e condições cujo tratamento se beneficiaria da capacidade de promover o crescimento celular e de tecido de uma maneira específica do local, promovendo o crescimento e a incorporação de tecido novo dentro de um local doente ou danificado.

[005] Nas aplicações em osso e cartilagem, o microambiente imediato e a organização tridimensional (3D) são fatores importantes na diferenciação em geral e particularmente na diferenciação condrogênica e osteogênica.

[006] Algumas estruturas artificiais (“estruturas artificiais) para a engenharia de tecido ósseo consistem em polímeros naturais, tais como colágeno, alginato, ácido hialurônico, e quitosana. Os materiais naturais oferencem as vantagens de interação celular específica, fácil semeadura de células devido a suas interações hidrofílicas, baixa toxicidade e baixa resposta inflamatória crônica. No

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3/138 entanto, estas estruturas artificiais são frequentemente mecanicamente instáveis e não contribuem prontamente para a criação de estruturas de tecido com um formato predefinido específico para o transplante. Para obter a resistência mecânica, modificação química é necessária, o que pode levar à toxicidade.

[007] Os defeitos e a degeneração das superfícies da cartilagem articular das articulações causam dor e rigidez. O dano à cartilagem que protege as articulações pode resultar de dano físico como um resultado de trauma, esportes ou esforços repetitivos (por exemplo, fratura osteocondral, dano secundário devido à lesão do ligamento cruzado) ou de doença (por exemplo, osteoartrite, artrite reumatoide, necrose asséptica, osteocondrite dissecante).

[008] A osteoartrite (OA) resulta de desgaste e laceração geral das articulações, mais notavelmente as articulações do quadril e joelho. A osteoartrite é comum nos idosos, mas de fato por volta dos 40 a maioria das pessoas tem alguma mudança osteoartrítica nas suas articulações que suportam o peso. Outra tendência emergente que aumenta a prevalencia da osteoartrite é o aumento na obesidade. O CDC estima que 30% dos adultos americanos (ou 60 milhões de pessoas) são obesos. Os adultos obesos são 4 vezes mais suscetíveis a desenvolver OA de joelho do que os adultos com o peso normal. A artrite reumatoide é uma condição inflamatória que resulta na destruição da cartilagem. Ela é considerada, pelo menos em parte, uma doença autoimune com doentes tendo uma predisposição genética à doença.

[009] A prevenção e o reparo ortopédico das

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4/138 articulações danificadas é uma carga significativa sobre a profissão médica tanto em termos de gasto como de tempo usado no tratamento dos pacientes. Em parte, isto é porque a cartilagem não possui a capacidade de autorreparo. Tentativas de fazer crescer novamente a cartilagem hialina para o reparo dos defeitos na cartilagem pemanecem ineficazes. A cirurgia ortopédica é disponível a fim de reparar os defeitos e impeder o dano articular em um esforço para prevenir sérias mudanças degenerativas em uma articulação. O uso de técnicas cirúrgicas frequentemente requer a remoção e doação de tecido saudável para substituir o tecido danificado ou com doença. As técnicas que utilizam tecido doado de autoenxertos, aloenxertos ou xenoenxertos são totalmente insatisfatórios visto que os autoenxertos adicionam trauma a um indivíduo e os aloenxertos e xenoenxertos são limitados pela reatividade imunológica ao indivíduo hospedeiro e a possível transferência de agentes infecciosos. As tentativas cirúrgicas em utilizar materiais que não o tecido humano ou animal para a regeneração da cartilagem have been unsuccessful.

[0010] Mais amplamente, há também uma carência de substratos sólidos apropriados para outras aplicações, da mesma forma, no crescimento celular e de tecido, expansão e modelagem.

[0011] Um material ideal que restaure a função do tecido e facilite a reconstrução da morfologia de tal tecido está ainda em falta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0012] Em algumas modalidades, a presente invenção

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5/138 provê substratos sólidos otimizados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada. Em algumas modalidades, a invenção provê um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, compreendendo o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico para o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, e seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%.

[0013] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido compreende um derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado e é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido e cujo substrato sólido tem sido exposto a determinados procedimentos de purificação e/ou processamento pós-isolamento.

[0014] Em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta invenção e obtido por meio de processos desta invenção é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 80%, e em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta

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6/138 invenção e obtido por meio de processos desta invençãoé caracterizado por um valor da capacidade de absorçãode fluido específico de pelo menos 85%, e em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta invenção e obtido por meio de processos desta invenção é caracterizado por um valor da capacidade de absorçãode fluido específico de pelo menos 90%, e em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta invenção e obtido por meio de processos desta invenção é caracterizado por um valor da capacidade de absorçãode fluido específico de pelo menos 95%, e em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta invenção e obtido por meio de processos desta invenção é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 97%. Em algumas modalidades, o substrato sólido de acordo com esta invenção e obtido por meio de processos desta invenção é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 75-100%.

[0015] Em algumas modalidades, o termo um valor da capacidade de absorção de fluido específico também é referido aqui como SFUC ou SWC, todos os quais devem ser considerados intercambiáveis.

[0016] Em algumas modalidades, um valor da capacidade de absorção de fluido específico desta invenção é determinado usando um aparelho, que é automatizado. Em alguns aspectos e como exemplificado e ainda descrito a seguir, a avaliação do valor da capacidade de absorção de fluido específico de várias amostras pode ser avaliada simultânea ou sequencialmente, como parte de um processo

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7/138 ampliado automatizado apropriado para a produção comercial. Em alguns aspectos, tal aparelho pode ainda prover a seleção individual e transporte de amostras tendo características desejadas.

[0017] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, ou um processo para a obtenção do mesmo, cujo substrato sólido compreende um derivado do esqueleto de organismo e é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido.

[0018] Como um versado na técnica apreciará, um ângulo de contato pode ser determinado como descrito e exemplificado aqui, usando metodologia e equipamento padrão, por exemplo, por meiod e goniometria. Em algumas modalidades, tais métodos podem fazer uso de processos como descrito em P.A. Thomson, W.B. Brinckerhoff, M.O. Robbins, in: K.L. Mittal (Ed.), Contact Angle Wettability and Adhesion, VSP, Utrecht, 1993, pp. 139-158; E.L. Decker, S. Garof, Langmuir 13 (1997) 6321; e M.G. Orkoula et al. : Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 157 (1999) 333-340; Hiemenz, P. C; Rajagopalan, R. Principles de Colloid and Surface Chemistry, 1997, 3rd Ed., Marcel Dekker, Inc; Applied Colloid and Surface Chemistry Chapter 2: Surface Tension and wetting, by Richard Pashley, Marilyn Karaman, 2004, John Wiley and sons, todos os quais são por meio deste incorporados em sua totalidade.

[0019] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada ou um processo para a

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8/138 obtenção do mesmo, cujo substrato sólido é caracterizado por aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica.

[0020] Em algumas modalidades, o coral ou derivado de coral é aragonita, calcita, misturas dos mesmos, ou outros polimorfismos dos mesmos.

[0021] Em algumas modalidades, a composição estrutural do coral ou derivado de coral é determinada por difração de raios X (XRD) ou manchamento positivo para a solução de Feigl.

[0022] Em algumas modalidades, o substrato sólido é isolado de uma espécie Porites, espécies Goniopora, Millepora ou uma espécie Acropora.

[0023] Em algumas modalidades, o substrato sólido é isolado de uma craca ou molusco. Em algumas modalidades, o substrato sólido é compreendido de nácar.

[0024] Em algumas modalidades, a invenção provê um kit compreendendo um ou mais substratos sólidos como descrito aqui. Em algumas modalidades, o kit compreenderá uma série de substratos sólidos caracterizadoss por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% e/ou produzidos por um processo desta invenção, onde os materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho no kit têm um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 75% a 99%, e em algumas modalidades, o kit contém uma série de substratos sólidos caracterizadoss por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 80% a 99%, e em algumas modalidades, o kit contém uma série de substratos sólidos caracterizadoss

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9/138 por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 85% a 99% e, em algumas modalidades, o kit contém uma série de substratos sólidos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 90% a 99% e, em algumas modalidades, o kit contém uma série de substratos sólidos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 95% a 99% ou, in outras modalidades, de 95% a 100%.

[0025] Em outra modalidade, a invenção provê um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

• o isolamento de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho;

• o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%.

[0026] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido por 0,1-15 minutos para

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10/138 promover a absorção de fluido espontânea do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea.

[0027] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido e aplicar pressão negativa ao dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para promover a absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor total de absorção de fluido.

[0028] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no peso no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[0029] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, a mudança no peso no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é devido à absorbância do dito fluido dentro dos interstícios no dito material sólido ou, em algumas modalidades, devido à absorbância do dito fluido dentro dos poros no dito material sólido ou, em algumas modalidades, a mudança no peso no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é devido à absorbância do dito fluido dentro dos interstícios no dito material sólido e devido à absorbância do dito fluido dentro dos poros no dito material sólido, o qual, em algumas modalidades, está

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11/138 dentro de ou, em algumas modalidades, entre cristais de coral individuais.

[0030] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no volume de fluido do fluido aplicado ao dito material sólido com base em coralina.

[0031] Em algumas modalidades, esta invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido compreende um derivado do esqueleto de organismo e é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido.

[0032] Em	algumas modalidades, esta	invenção provê	um
processo	para	a seleção	de um substrato	sólido com	base	no
derivado	do	esqueleto	de organismo	otimizado	para	a
promoção	de	crescimento	celular ou de	tecido ou	função

restaurada, o dito processo compreendendo:

• O isolamento ou preparação de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo;

• o	contato do dito material	sólido	com	base	no
derivado	do esqueleto de organismo	com um	fluido	e o
estabelecimento de um ângulo de	contato	para	o	dito
derivado	do esqueleto de organismo; e

• a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizado por um ângulo de contato menor do que 60 graus.

[0033] Em algumas modalidades, os processos desta invenção, os quais facilitam a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo

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12/138 otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada podem incluir um etapa pela qual o contato do material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo com um fluido e o estabelecimento de um ângulo de contato para o dito derivado do esqueleto de organismo ou o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido pode ser realizado em amostras imediatamente próximas a uma amostra de interesse e, em algumas modalidades, de dentro de uma região comparável, por exemplo, em termos de uma região de crescimento de coral em um anel de crescimento, com a seleção prevista para ser baseada em algumas modalidades, no desempenho de regiões próximas e sua obtenção dos critérios desejados para a seleção, como descrito aqui.

[0034] Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é substancialmente compreendido de carbonato de cálcio.

[0035] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda as etapas de:

• o estabelecimento da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cuja superfície substancialmente áspera é determinada por microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica; e

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13/138 • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por uma determinação da presença de uma superfície substancialmente áspera no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[0036] Em	algumas	modalidades, a	invenção provê	um
processo	para	a seleção	de um substrato	sólido com	base	no
derivado	do	esqueleto	de organismo	otimizado	para	a
promoção	de crescimento celular ou de	tecido ou	função

restaurada, o dito processo compreendendo:

• o estabelecimento da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cuja superfície substancialmente áspera é determinada por microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por uma determinação da presença de uma superfície substancialmente áspera no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[0037] Em algumas modalidades, a invenção provê um processo para a seleção de an substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, compreendendo uma combinação das etapas descritas para tais processos como descrito aqui.

[0038] Em algumas modalidades, um processo desta invenção compreende ainda a etapa de contatar o dito substrato sólido com células ou tecido.

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14/138 [0039] Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o contato promove a adesão, proliferação ou diferenciação, ou uma combinação dos mesmos, das ditas células ou células dentro do dito tecido.

[0040] Em algumas modalidades, um fluido é uma solução que contém proteína, que contém sal ou que contém carboidrato, ou em algumas modalidades, o fluido é um fluido biológico, e em algumas modalidades, o fluido biológico é autólogo ou alogeneico com relação a uma célula ou tecido de um indivíduo quando o dito substrato sólido é contatado com uma célula ou tecido do dito indivíduo. Em algumas modalidades, o fluido é água.

[0041] Em algumas modalidades, o substrato sólido promove o crescimento celular ou de tecido no tecido danificado por trauma ou doença.

[0042] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido produzido pelo processo de acordo com qualquer aspecto como descrito aqui.

[0043] Em algumas modalidades, esta invenção provê um processo para a conversão de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho ideal em um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

a) o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico para um grupo de materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor

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15/138 de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido para cada amostra no dito grupo;

b) a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico;

c) o contato do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho de (b) com um material anfifílico, um solvente polar, um material catiônico, um material aniônico, ou uma combinação dos mesmos;

d) a determinação de uma capacidade específica de absorção de fluido como em (a) nos ditos materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho obtidos em (c); e

e) a seleção de materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho obtidos em (d) tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado recém-estabelecido.

[0044] Esta invenção também provê um processo para a conversão de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho ideal em um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

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16/138 de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido para cada amostra no dito grupo;

c) a sujeição do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho de (b) a tratamento com plasma frio, tratamento corona ou uma combinação dos mesmos;

[0045] Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é aumentado em pelo menos 5%. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho selecionado é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 75% e 95%. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 15%. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho selecionado é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 45% e 70%. Em algumas modalidades, o valor da

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17/138 capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 35%. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho selecionado é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 1% e 40%. Em algumas modalidades, o substrato sólido é compreendido substancialmente de um coral ou derivado com base em coral. Em algumas modalidades, o substrato sólido é compreendido substancialmente de aragonita, calcita, hidroxiapatita ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de converter ou revestir total ou parcialmente um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho to hidroxiapatita antes de estabelecer o dito valor da capacidade de absorção de fluido específico em (d) , em que o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é aragonita. Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de converter total ou parcialmente um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho em hidroxiapatita subsequente ao estabelecimento do dito valor da capacidade de absorção de fluido específico em (d), em que o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é principalmente carbonato de cálcio. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho pode ser usado como um preenchedor ósseo ou material substituto para o osso. Em algumas modalidades, o material anfifílico, um solvente polar, um material catiônico ou um material aniônico é tween, pluronic, etanol, azul metileno, ácido

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18/138 hialurônico, sulfato de condroitina ou uma combinação dos mesmos.

[0046] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de aplicar um método de limpeza secundário aos ditos materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho de (b), após o contato com o dito material anfifílico, solvente polar, material catiônico, material aniônico, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o método de limpeza secundário inclui a aplicação de calor, ultrassons, pressão positiva, pressão negativa, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho compreende ainda um preenchedor ósseo, cimento ósseo, biovidro ou material substituto para o osso.

[0047] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito derivado do esqueleto de organismo marinho material sólido com um fluido por 0,1-15 minutos, ou em algumas modalidades, de 1-2 segundos a 20 minutos, ou em algumas modalidades de 0,5-40 minutos, permitindo a absorção de fluido espontânea do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea. Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido por 12 até 24 horas, ou em algumas modalidades, por 2 até 15 horas, ou em algumas modalidades, por 1 até 24 horas, ou em algumas modalidades, por 6 até 24 horas, ou em algumas modalidades, por 18 até

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19/138 horas, permitindo a absorção de fluido espontânea do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea.

[0048] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido e aplicar pressão negativa ao dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para prover a absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor total de absorção de fluido. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no peso no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no volume de fluido de fluido aplicado ao dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho. Em algumas modalidades, o fluido é uma solução que contém proteína, que contém sal ou que contém carboidrato. Em algumas modalidades, o fluido biológico é autólogo com relação a um célula ou tecido de um indivíduo quando o dito substrato sólido é contatado com uma célula ou tecido do dito indivíduo. Em algumas modalidades, o fluido é água. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é isolado de uma espécie Porites, espécies Goniopora, Millepora ou uma espécie Acropora. Em algumas modalidades, o substrato sólido é isolado de uma craca ou molusco, ou

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20/138 osso ou marfim ou dentina. Em algumas modalidades, o substrato sólido é compreendido de nácar.

[0049] Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho aproxima-se da forma de um cilindro, cone, tacha, pino, parafuso, barra retangular, placa, disco, pirâmide, grânulo, pó, areia de coral, esfera, osso, côndilo, costela, vértebra ou cubo. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho aproxima-se de um formato que acomoda um local de crescimento ou reparo de tecido desejado. Em algumas modalidades, o material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho compreende uma depressão ou depressões ao longo de um eixo de coordenadas cartesianas do dito material sólido com base em coralina.

[0050] Em algumas modalidades, esta invenção provê um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

• o isolamento ou preparação de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho;

• o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico de o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido; ou estabelecimento de um valor de ângulo de contato; e

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21/138 • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% ou caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido;

• o estabelecimento da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cuja superfície substancialmente áspera é determinada pela microscopia eletrônica de varredura, difração de raios X ou microscopia de força atômica; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por uma determinação da presença de uma superfície substancialmente áspera on o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[0051] Em algumas modalidades, esta invenção provê um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

• o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico de o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção

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22/138 de fluido; ou o estabelecimento de um valor de ângulo de contato;

• a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% ou caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido; e • o estabelecimento de uma composição ou estrutura cristalina do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, pelo uso de difração de raios X ou manchamento positivo por mancha Feigl.

[0052] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados aqui são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade como se cada publicação individual ou patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. No caso de um conflito entre o relatório descritivo e uma referência incorporada, o relatório descritivo tem a prioridade. Onde faixas numéricas são dadas neste documento, parâmetros de referência são incluídos dentro da faixa. Além disso, devese entender que a menos que indicado o contrário ou de outra forma evidente do contexto e entendimento de alguém versado na técnica, os valores que são expressos como faixas podem assumir qualquer valor específico ou subfaixa dentro das faixas determinadas, opcionalmente, incluindo ou excluindo um ou ambos os parâmetros de referência, em diferentes modalidades da invenção, até a décima unidade do limite inferior da faixa, a mneos que o contexto dite claramente o contrário. Onde uma percentagem é recitada em

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23/138 referência a um valor que tem intrinsecamente unidades que são números inteiros, qualquer fração resultante pode ser arredondada até o número inteiro mais próximo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0053] A figura 1 provê uma série de fotografias de implantes, que foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibir um fluido biológico, neste caso, sangue humano total. As figuras 1A-1C mostram 3 tipos de padrões de absorção dentro de pequenas amostras de substrato sólido de coral, absorção razoavelmente completa como determinado pela observação da mudança de cor na superfície, absorção moderada e absorção mínima, respectivamente. As figuras 1D1F mostram um bloco maior do substrato sólido de coral do qual os implantes menores foram isolados.

[0054] A figura 2 apresenta um fluxograma para um protocolo de triagem incorporado para a identificação do substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada.

[0055] A figura 3 demonstra a correlação entre a absorção de fluido biológica antes da implantação e a cura do local ao longo do tempo. Os locais de implantação tratados com implantes caracterizados por absorção significativa de água e sangue ou absorção mínima dos mesmos dentro do implante antes da implantação, foram avaliados macroscopicamente, em 4 semanas após. O tecido consistente com a aparência da cartilagem cobria substancialmente o implante, em amostras com significativa absorção de fluido, enquanto amostras que foram caracterizadas por absorção de fluido mínima/diminuída

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24/138 apresentaram uma cobertura mais fibrosa sobre a implantação do implante (Figura 3A versus 3D, respectivamente). A análise de raios X e micro-CT dos respectivos implantes caracterizada por absorção de fluido mínima/diminuída [Figuras 3B e 3C] versus aquela caracterizada por significativa absorção de fluido [Figuras 3E e 3F] demonstrou que o implante caracterizado por significativa absorção de fluido pareceu estar apropriadamente integrado dentro do local de implantação com nenhuma reação adversa significativa com excelente osteointegração, osteocondução e osteotransdução, enquanto os implantes caracterizados por absorção de fluido mínima/diminuída pareceram induzir a reabsorção do osso, lise e perda de integridade mecânica possivelmente devido à atividade aumentada de osteoclastos.

[0056] A figura 4 provê fotografias de implantes incorporados avaliados quanto a seu ângulo de contato, quando expostos ao fluido. As figuras 4A e 4B mostram onde as amostras que são avaliadas quanto à caracterização de seu ângulo de contato foram cortadas de um bloco maior e as figuras 4C e 4D proveem os valores de ângulo de contato obtidos para as regiões indicadas. A maioria das regiões do bloco avaliadas nas figuras 4A e 4B forneceu um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas nas figuras 4C e 4D forneceram um ângulo de contato

dentre 60 e	90 graus	(Figura	4C) e acima	de	90 graus
(Figura 4D).
[0057] A	figura 5	provê	fotografias	de	implantes
incorporados	avaliados	quanto	a seu ângulo	de	contato,

quando expostos ao fluido. A figura 5A mostra regiões cortadas do bloco maior, as quais foram avaliadas quanto à

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25/138 caracterização de seu ângulo de contato. A maioria das regiões do bloco avaliadas nas figuras 5B e 5C forneceram um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas nas figuras 5B e 5C forneceram um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus e acima de 90 graus (regiões azuis versus vermelhas, respectivamente).

[0058] A figura 6 provê similarmente fotografias de implantes incorporados avaliados quanto a seu ângulo de contato, quando expostos ao fluido. As figuras 6A mostram regiões cortadas do bloco maior, as quais foram avaliadas quanto à caracterização do seu ângulo de contato. A maioria das regiões do bloco avaliadas na figura 6B forneceu um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas na figura 6B forneceram um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus e acima de 90 graus (regiões azuis versus vermelhas, respectivamente).

[0059] A figura 7 demonstra os resultados da análise de ESEM mostrando características de umectação da superfície comparativas. A amostra avaliada na figura 7A mostrou um valor ângulo de queda zero e nenhuma formação de queda, indicando estrutura altamente hidrofílica. A figura 7B descreve uma amostra, que após a aplicação de fluido, falhou em umectar quando água foi aplicada. A figura 7C mostra que após a redessecação, as gotas de água eram evidentes na superfície, consistentes com um fenótipo de fraca umectação da superfície. A figura 7D apresenta os resultados para uma amostra diferente, com resultados consistentes com o ângulo de contato menor do que 60 graus e a figura 7E apresenta os resultados para uma amostra diferente, com ângulo de contato maior do que 60 graus.

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26/138 [0060] A figura 8 demonstra a estrutura microscópica, como determinado por ESEM, de substratos isolados caracterizados por absorção de fluido biológica mínima, versus aqueles caracterizados por absorção de fluido biológica substancial em várias ampliações nas amostras com absorção de fluido biológica mínima indicam uma superfície externa muito mais suave quando comparado com amostras com absorção substancial (Figuras 8A-8C versus 8D-8F).

[0061] A figura 9 demonstra a estrutura microscópica como determinado por AFM, de substratos isolados caracterizados por absorção de fluido biológica mínima, versus aqueles caracterizados por absorção de fluido biológica substancial em várias ampliações em amostras com absorção de fluido biológica mínima indicam uma superfície externa muito mais suave quando comparado com amostras com absorção substancial (Figuras 9A-9C versus 9D-9F).

[0062]	A figura	10 traça o valor	de SFUC	como uma
função da	amostra de	coral avaliada,	antes de	e após a
aplicação	de Tween 80	a tais amostras.
[0063]	A figura	11 traça o valor	de SFUC	como uma
função da	amostra de	coral avaliada,	antes de	e após a
aplicação	de Tween 80	e sonicação em tai	s amostras	^.
[0064]	A figura	12 traça o valor	de SFUC	como uma
função da	amostra de	coral avaliada,	antes de	e após a
aplicação	de pluronic	com ou sem Tween 8	0 em tais	amostras.
[0065]	A figura	13 traça o valor	de SFUC	como uma
função da	amostra de	coral avaliada,	antes de	e após a
aplicação	de etanol absoluto em tais amostras.
[0066]	A figura	14 traça o valor	de SFUC	como uma
função da	amostra de	coral avaliada,	antes de	e após a

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27/138 aplicação de azul metileno em tais amostras.

[0067] A figura 15 traça o valor de SFUC como uma função da amostra de coral avaliada, antes de e após a aplicação de ácido hialurônico em tais amostras.

[0068] A figura 16 traça o valor de SFUC como uma função da amostra de coral avaliada, antes de e após a aplicação de sulfato de condroitina em tais amostras.

[0069] A figura 17 traça os valores de SWC de implantes de duas amostras (uma primeira avaliando (n=13) e a segunda avaliando (n=15) corais) expostas sucessivamente à purificação de produtos químicos: hipoclorito& peróxido de hidrogênio e seguido por uma extração de etanol absoluto. *P<0,05; ** P<0,01.

[0070] As figuras 18 e 19 traçam similarmente os valores médios de SWC para implantes expostos à etapa de purificação e após uma etapa de extração de etanol.

[0071] As figuras 20A e 20B descrevem esquematicamente um aparelho automatizado incorporado desta invenção em vista lateral e de topo.

[0072] As figuras 21A-21C apresentam microscopias eletrônicas de varredura de adesão de célula aos substratos de coral tendo um baixo valor da capacidade de absorção de fluido específico (Fig 21A e Fig 21B) versus um alto valor da capacidade de absorção de fluido específico (Fig 21C).

[0073] A figura 22A-B descreve graficamente os valores de proliferação e viabilidade de célula de HEPM como determinado pelo ensaio alamarBlue® em amostras tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico baixo versus alto.

[0074] A figura 23A-F descreve manchamento tradicional

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Feigl como relatado na literatura (Fig 23A-23B) e absorção de sangue versus manchamento Feigl em amostras de coral isoladas e processadas por um processo incorporado desta invenção, antes (Fig 23C, 23D) e após uma etapa adicional de purificação de etanol (Fig 23E, 23F).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO [0075] Esta invenção provê, inter alia, processos para a seleção para e obtenção de substratos sólidos otimizados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada e materiais obtidos dessa forma.

[0076] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido compreende coral e é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido.

[0077] Em algumas modalidades, esta invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido compreende um derivado do esqueleto de organismo e é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido.

[0078] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, cujo substrato sólido compreende um derivado do esqueleto de organismo marinho e é caracterizado por aspereza da superfície substancial (Ra)

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29/138 como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica.

[0079] Substratos sólidos desta invenção compreenderão um material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[0080] Em algumas modalidades, o termo material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho se refere a uma peça sólida ou material moído derivado de um organismo marinho e de um componente do esqueleto do organismo, tal como um exoesqueleto do mesmo processado ainda para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e ainda processado para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir.

[0081] Em algumas modalidades, o termo material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho se refere a um material com base em coralina processado ainda para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir.

[0082] Coral, que é principalmente compreendido de CaCO3, mostrou possuir a vantagem de suportar invasão celular, aderência e proliferação rápida. Coral mostrou ser um substrato eficaz para a facilitação da aderência, proliferação e diferentiação de células-tronco mesenquimais e incorporação final no tecido da cartilagem ou ósseo. Coral também mostrou servir como um excelente substrato para prover aderência e proliferação de vários outros tipos de célula, servindo como um excelente suporte para o crescimento celular e de tecido.

[0083] Os termos coral e carbonato de cálcio e

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30/138 aragonita e calcita podem ser usados intercambiavelmente aqui, a menos que especificamente determinado o contrário.

[0084] Em algumas modalidades, o termo material com base em derivado do esqueleto de organismo marinho se refere a um coral ou derivado de coral ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir. Em algumas modalidades, o termo material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho se refere a material do esqueleto derivado de craca ou molusco ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir e, em algumas modalidades, a inclusão de nácar ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário, e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir é contemplado.

[0085] Em algumas modalidades, o termo material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho se refere a um coral ou derivado de coral, que é isolado de um organismo marinho nativo e subsequentemente processado como descrito aqui, de modo a ser adequado para a implantação dentro de um indivíduo humano ou veterinário, cujo material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho tem sido especificamente submetido a processamento adicional, como descrito aqui, incluindo uma etapa de limpeza e purificação anterior, a fim de converter um material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho isolado

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31/138 subótimo em um material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada.

[0086] Em algumas modalidades, tal otimização inclui especificamente o contato do dito material com base no derivado do esqueleto de organismo marinho sólido com um material anfifílico, um solvente polar, um material

catiônico,	um	material	aniônico, ou	uma combinação dos
mesmos.
[0087]	Em	algumas	modalidades,	o substrato	sólido
contém partículas moídas	derivadas de	coral, suspensas em
uma matriz	biocompatível	. Em algumas modalidades, a	matriz
biocompatível é	um hidrogel.
[0088]	Em	algumas	modalidades,	a referência	a um
implante	ou	tampão	ou substrato	sólido, como	usado

aqui se refere a qualquer modalidade ou modalidades combinadas como descrito aqui com relação aos substratos sólidos e a serem consideradas como sendo incluídas no aspecto descrito desta invenção. Por exemplo, a referência a um substrato sólido, como usada aqui, deve ser interpretada como se referindo a qualquer modalidade de um substrato sólido como descrito aqui sendo aplicável para o propósito indicado ou contendo o atributo indicado, etc.

[0089] Em uma modalidade, substrato sólido se refere a uma plataforma formada usada para o reparo de célula e/ou tecido e/ou função restaurada, em que a plataforma moldada provê um local para tal reparo e/ou função restaurada. Em uma modalidade, o substrato sólido é uma plataforma temporária. Em uma modalidade, plataforma temporária se refere a uma degradação natural de um coral desta invenção

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32/138 que ocorre ao longo do tempo durante tal reparo, em que a degradação natural total ou parcial do coral pode resultar em uma mudança formato do substrato sólido ao longo do tempo e/ou mudança no tamanho do substrato sólido ao longo do tempo.

[0090] Apreciar-se-á que diferentes espécies de coral variam em termos de seu diâmetro médio de poro e volume do poro e a invenção contempla o uso de qualquer tal coral como uma matéria-prima para a preparação dos substratos sólidos como descrito aqui, onde o substrato sólido é caracterizado pelo fato de que ele é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário, e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir.

[0091] Como usado aqui, o termo volume do poro se refere ao volume ou espaços abertos dentro da estrutura artificial porosa desta invenção. O volume do poro é determinado por qualquer meio conhecido na técnica. A porosidade pode ser calculada por métodos padrão, um exemplo dos quais é provido ainda abaixo, vide, por exemplo, Karageorgiou V, Kaplan D. (2005) Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis Biomaterials.;26(27):5474-91, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.

[0092] Apreciar-se-á que o termo coral fará referência a uma matéria-prima da qual aragonita, carbonato de cálcio, calcita ou hidroxiapatita etc. podem ser isolados e ainda processados para serem adequados para a

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33/138 implantação em um indivíduo humano ou veterinário e processados ainda para serem otimizados para a implantação como descrito a seguir.

[0093] Em uma modalidade, os substratos sólidos, processos e/ou kits desta invenção empregam o uso de um coral ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e processado ainda para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir. Em uma modalidade, o coral compreende qualquer espécie, incluindo, inter alia, Porites, Acropora, Goniopora, Millepora, ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, os substratos sólidos, processos e/ou kits desta invenção empregam o uso de nácar, concha do molusco ou pedaços de osso.

[0094] Em uma modalidade, o coral é da espécie Porites. Em uma modalidade, o coral é Porites Lutea. Em uma modalidade, o coral é da espécie Acropora. Em uma modalidade, o coral é Acropora grandis, que em uma modalidade é muito comum, de rápido crecimento e fácil de desenvolver em cultura. Assim, em uma modalidade as amostras de Acropora podem ser facilmente coletadas em áreas cobertas dos recifes de coral e a coleta dos recifes de coral pode ser evitada pelo uso de material do coral cultivado.

[0095] Em outra modalidade, o coral é da espécie Millepora. Em uma modalidade, o coral é Millepora dichotoma. Em uma modalidade, o coral tem um tamanho de poro de 150 pm e pode ser clonado e cultivado, tornando a Millerpora útil como uma estrutura nos substratos sólidos, métodos e/ou kits desta invenção.

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34/138 [0096] Em uma modalidade, o coral é da espécie Goniopora. Em algumas modalidades, o coral é Goniopora albiconus, Goniopora burgosi, Goniopora cellulosa, Goniopora ceylon, Goniopora ciliatus, Goniopora columna, Goniopora djiboutiensis, Goniopora eclipsensis, Goniopora fruticosa, Goniopora gracilis, Goniopora klunzingeri,

Goniopora lobata, Goniopora mauritiensis, Goniopora minor,

Goniopora norfolkensis, Goniopora palmensis,

Goniopora pandoraensis, Goniopora parvistella,

Goniopora pearsoni,

Goniopora pendulus, Goniopora planulata, Goniopora poliformis, Goniopora reptans, Goniopora savignyi, Goniopora somaliensis, Goniopora stokes, Goniopora stutchburyi, Goniopora sultani, Goniopora tenella,

Goniopora tenuidens ou Goniopora viridis.

[0097] Em outra modalidade, o coral é de qualquer uma ou mais das seguintes espécies Favites halicora; Goniastrea retiformis; Acanthastrea echinata; Acanthastrea hemprichi; Acanthastrea ishigakiensis; Acropora aspera; Acropora austera; Acropora sp. brown digitate ; Acropora carduus; Acropora cerealis; Acropora chesterfieldensis; Acropora clathrata; Acropora cophodactyla; Acropora sp. danailike; Acropora divaricata; Acropora donei; Acropora echinata; Acropora efflorescens; Acropora gemmifera; Acropora globiceps; Acropora granulosa; Acropora cf hemprichi; Acropora kosurini; Acropora cf loisettae; Acropora longicyathus; Acropora loripes; Acropora cf lutkeni; Acropora paniculata; Acropora proximalis; Acropora rudis; Acropora selago; Acropora solitary ensis; Acropora cf spicifera as per Veron; Acropora cf spicifera as per

Wallace; Acropora tenuis; Acropora valenciennesi; Acropora

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35/138 vaughani; Acropora vermiculata; Astreopora gracilis; Astreopora myriophthalma; Astreopora randalli; Astreopora suggesta; Australomussa rowleyensis; Coscinaraea collumna; Coscinaraea crassa; Cynarina lacrymalis; Distichopora violacea; Echinophyllia echinata; Echinophyllia cf echinoporoides; Echinopora gemmacea; Echinopora hirsutissima; Euphyllia ancora; Euphyllia divisa; Euphyllia yaeyamensis; Favia rotundata; Favia truncatus; Favites acuticollis; Favities pentagona; Fungia granulosa; Fungia klunzingeri; Fungia mollucensis; Galaxea acrhelia; Goniastrea edwardsi; Goniastea minuta; Hydnophora pilosa; Leptoseris explanata; Leptoseris incrustans; Leptoseris mycetoseroides; Leptoseris scabra; Leptoseris yabei; Lithophyllon undulatum; Lobophyllia hemprichii; Merulina scabricula; Millepora dichotoma; Millepora exaesa; Millipora intricata; Millepora murrayensis; Millipora platyphylla; Monastrea curta; Monastrea colemani; Montipora caliculata; Montipora capitata; Montipora foveolata; Montipora meandrina; Montipora tuberculosa; Montipora cf vietnamensis; Oulophyllia laevis; Oxypora crassispinosa; Oxypora lacera; Pavona bipartita; Pavona venosa; Pectinia alcicornis; Pectinia paeonea; Platygyra acuta; Platygyra pini; Platygyra sp green; Platygyra verweyi; Podabacia cf lanakensis; Porites annae; Porites cylindrica; Porites evermanni; Porites monticulosa; Psammocora digitata; Psammocora explanulata; Psammocora haimeana; Psammocora superficialis; Sandalolitha dentata; Seriatopora caliendrum; Stylocoeniella armata; Stylocoeniella guentheri; Stylaster sp.; Tubipora musica; Turbinaria stellulata; ou qualquer coral conhecido na técnica ou uma

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36/138 combinação dos mesmos.

[0098] Em outra modalidade, os derivados de animais marinhos - tais como coral, esponjas, conchas de moluscos e outros organismos relacionados podem ser usados nos substratos sólidos, métodos e/ou kits desta invenção odem ser Madreporaria, Helioporida da ordem Coenothecalia, Tubipora da ordem Stolonifera, Millepora da ordem Milleporina, ou outras conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, o coral para o uso nos substratos, métodos e/ou kits desta invenção podem compreender coral escleractiniano, incluindo em algumas modalidades, Goniopora e outras. Em algumas modalidades, o coral para o uso nos substratos, métodos e/ou kits desta invenção pode compreender Alveoppora. Em algumas modalidades, o coral para o uso nos substratos, métodos e/ou kits desta invenção pode compreender corais de bambu, incluindo em algumas modalidades, coral da família Isididae, gêneros Keratoisis, Isidella, e outros.

[0099] Em uma modalidade desta invenção, o termo coral se refere ao coral que é cortado de uma única peça de coral e ainda processado para ser adequado para a implantação em um indivíduo humano ou veterinário e ainda processado para ser otimizado para a implantação como descrito a seguir.

[00100] Em algumas modalidades, o substrato sólido é de qualquer formato desejado.

[00101] Em uma modalidade, o coral pode saer usinado emu ma variedade de configurações e formatos bastante complexos tais como estruturas cilíndricas e estruturas roscadas podem ser formadas por máquina apropriada ou outro

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37/138 processamento, tal como processamento químico. Em outra modalidade, o coral pode ser moldado para formar blocos sólidos, hastes ou formas granulares. Em uma modalidade, os materiais de coralina são moldados de tal maneira a se conformarem ao formato de uma estrutura de tecido desejada ou preencherem lacunas e defeitos de contorno em um local de implantação potencial. Em uma modalidade, o coral é implantado em uma orientação que permite a ele entrar em contato com a área de superfície máxima de uma estrutura do tecido localizada adjacente.

[00102] Em algumas modalidades, o substrato sólido aproxima-se da forma de um cilindro, cone, tacha, pino, parafuso, barra retangular, placa, disco, pirâmide, grânulo, pó, areia de coral, esfera, osso, côndilo, costela, vértebra ou cubo. Em algumas modalidades, o substrato sólido aproxima-se de um formato que acomoda um local de crescimento ou reparo de tecido desejado.

[00103] Em algumas modalidades, o substrato sólido compreende uma depressão ou depressões ao longo de um eixo de coordenadas cartesianas do dito substrato sólido.

[00104] Em uma modalidade, o tamanho dos substratos de coral sólidos pode ser qualquer tamanho que seria útil para os propósitos da presente invenção, como seria conhecido por alguém versado na técnica dependendo do propósito. Por exemplo, e em uma modalidade, o substrato sólido pode ser substancialmente o mesmo tamanho que a estrutura que ele pretende substituir, enquanto em outra modalidade, o substrato sólido ou uma porção do mesmo pode ser o tamanho de um defeito, fissura ou fratura tal que ele possa ser colocado nele para intewnsificar/substituir a

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38/138 formação/função do tecido em um local discreto. Em uma modalidade, um coral para o uso em um substrato sólido desta invenção compreende um diâmetro de vazio médio, tamanho de poro médio ou uma combinação dos mesmos apropriados para a semeadura da célula e/ou desenvolvimento de vasculatura.

[00105] Os processos e materiais desta invenção, em algumas modalidades, dependem do isolamento ou preparação do material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para o uso. Em algumas modalidades, tal isolamento e preparação podem incluir, inter alia, a seleção de uma amostra desejada, incluindo a seleção de várias amostras de uma região desejada de um anel de crescimento em uma amostra de coral maior e/ou em algumas modalidades, primeiro o processamento de tal amostra e/ou, em algumas modalidades, pré-triagem de tais amostras quanto a sua absorção de um fluido como descrito aqui e/ou, em algumas modalidades, ainda o processamento de tal amostra, como descrito aqui. De acordo com este aspecto, tal isolamento e preparação serão efetuados antes do estabelecimento descrito de um valor da capacidade de absorção de fluido específico do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, como descrito aqui e, em algumas modalidades, antes da seleção do material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho como caracterizado pelo valor descrito da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% ou valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, ou aspereza da superfície ou positividade em mancha Feigl, como descrito aqui.

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39/138 [00106] Em uma modalidade, o coral é lavado, alvejado, congelado, seco, exposto a forças elétricas, forças magnéticas ou ondas de ultrassom ou micro-ondas ou radiação eltromagnética ou de alta pressão ou uma combinação dos mesmos antes do uso dos mesmos. De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, o coral é exposto a processamento adicional, como descrito a seguir.

[00107] Em algumas modalidades, o substrato sólido é de um tamanho que seja apropriado para o propósito destinado, como será apreciado pelo versado na técnica.

[00108] Por exemplo, e em algumas modalidades, os substratos sólidos para o uso em terapia ou reparo osteocondral podem fazer uso de um substrato que é cilíndrico ou oval no formato e, em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção e/ou para o uso nos kits e métodos como descrito podem ter um diâmetro de cerca de 5-15 mm e uma altura de cerca de 5-25 mm. Em algumas modalidades, o substrato sólido tem um diâmetro de cerca de 1-35 mm, e uma altura de cerca de 1-45 mm, ou cerca de 5-40

mm, e uma altura	de cerca	de	5-60 mm, ou	cerca de 5-15	mm,
e uma altura de	cerca de	5-	45 mm, 5-30	mm, 15-60 mm	ou
larger.
[00109] Por	exemplo,	e	em algumas	modalidades,	os

substratos sólidos desta invenção e/ou para o uso nos kits e métodos como descrito podem fazer uso de um substrato que seja cilíndrico ou oval no formato e, em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção e/ou para o uso nos kits e métodos como descrito podem ter um diâmetro na escala de nanômetro ou micrômetro. Em algumas modalidades, os substratos sólidos para o uso em terapia ou

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40/138 reparo osteocondral podem fazer uso de um substrato que é cilíndrico ou oval no formato e tem um diâmetro de cerca de 1-100 nm ou, em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 50-1000 nm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 10-2000 nm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 100-4000 nm. Em algumas modalidades, os substratos sólidos para o uso em terapia ou reparo osteocondral podem fazer uso de um substrato que é cilíndrico ou oval no formato e tem um diâmetro de cerca de 1-100 pm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 50-1000 pm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 10-2000 pm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 100-4000 pm.

[00110] Por exemplo, e em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção e/ou para o uso nos kits e métodos como descrito podem fazer uso de um substrato que é cilíndrico ou oval no formato e, em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção e/ou para o uso nos kits e métodos como descrito podem ter um diâmetro na escala de milímetro ou centímetro. Em algumas modalidades,

os substratos	sólidos para o	uso	em terapia ou	reparo
osteocondral	podem fazer uso	de	um substrato	que	é
cilíndrico ou	oval no formato e	tem	um diâmetro de cerca	de

1-100 mm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 50-1000 mm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 10-2000 mm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 100-4000 mm. Em algumas modalidades, os substratos sólidos para o uso em terapia ou reparo osteocondral podem fazer uso de um substrato que é cilíndrico ou oval no formato e tem um diâmetro de cerca de

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1-100 cm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 50-1000 cm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 10-2000 cm, ou em algumas modalidades, tendo um diâmetro de cerca de 100-4000 cm.

[00111] Será apreciado pelos versados na técnica que o tamanho do substrato possa ser assim selecionado de modo a ser adequado a uma aplicação particular, por exemplo, ao usar um material para a estrutura artificial para o reparo do osso, então o tamanho pode se aproximar das dimensões de um osso longo no indivíduo. Consequentemente, esta invenção não deve ser limitada pelo tamanho do substrato sólido.

[00112] O diâmetro médio dos vazios dentro das fases dos substratos sólidos desta invenção pode ser determinado por qualquer meio, incluindo análise de imagens digitais.

[00113] Em algumas modalidades, o coral para o uso de acordo com a presente invenção pode ser reparado como descrito em publicação do Pedido Internacional PCT número WO 2009/066283, publicação do Pedido Internacional PCT número WO 2010/058400, publicação do Pedido Internacional PCT número WO 2010/146574 e publicação do Pedido Internacional PCT número WO 2010/146574, cada um dos quais é totalmente incorporado por referência aqui em sua totalidade.

[00114] Em algumas modalidades, o coral é isolado de uma fonte natural por métodos conhecidos e como descrito aqui. Em algumas modalidades, cuidado deve ser tomado para isolar fatias de coral de uma região de um ou mais anéis de crescimento dentro de uma amostra de coral maior, cuja região mostrou possuir o valor apropriado da capacidade de absorção de fluido específico, o valor apropriado de ângulo

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42/138 de contato e/ou aspereza da superfície, como descrito aqui e, em algumas modalidades, é então exposto a processamento adicional como descrito a seguir.

[00115] Os processos desta invenção promovem a obtenção de um substrato sólido desta invenção, caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico como desejado para a aplicação específica, por exemplo, de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido.

[00116] Como descrito e exemplificado aqui, por exemplo, como descrito em Exemplos 3 e 4, um valor da capacidade de absorção de fluido específico pode ser determinado pela avaliação da absorção espontânea de um fluido biológico versus uma capacidade de absorção total para uma dada amostra e pela obtenção do nível de capacidade de absorção de fluido específico, pelo que se o valor for acima de 75%, então tal substrato sólido será usado em aplicações que promovem o crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada.

[00117] Em algumas modalidades, o processo para a seleção do substrato sólido compreende o isolamento de uma amostra de um material sólido com base em coralina e o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico do material, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido e seleção de material caracterizado por um valor da

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43/138 capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos

75% .

[00118]	Em	algumas	modalidades,	o fluido	biológico	é
sangue e,	em	algumas	modalidades,	o fluido	biológico	é
água. Em	algumas modalidades, o	fluido	biológico	é
hidrofílico	^.
[00119]	Em	algumas	modalidades,	o fluido	biológico	é

autólogo com relação a um célula ou tecido de um indivíduo quando o dito substrato sólido é contatado com tal célula ou tecido do dito indivíduo.

[00120] Entender-se-á que o fluido biológico pode ser qualquer que seja biocompatível e cuja incorporação seja apropriada dentro de um substrato sólido para a aplicação desejada.

[00121] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de contatar o material com um fluido por 2-15 minutos para promover absorção de fluido espontânea do dito fluido dentro do dito material sólido com base em coralina para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea. Em algumas modalidades, o processo pode permitir o contato do material com um fluido por 0,5-15 minutos ou, em algumas modalidades, de 0,5-5 minutos ou, em algumas modalidades, 10—60 minutos ou, em algumas modalidades, de 60 a 90 minutos ou, em algumas modalidades, outros intervalos para promover absorção de fluido espontânea. O versado na técnica apreciará que a quantidade de tempo na qual o fluido é aplicado para determinar a absorção espontânea possa ser estendida ou encurtada em função das dimensões e geometria do substrato de amostra sendo avaliado. Em algumas modalidades, quando uma amostra maior está sendo

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44/138 avaliada, o processo compreende ainda a etapa de contatar o material com um fluido por 2-24 horas para promover a absorção de fluido espontânea do dito fluido dentro do dito material sólido com base em coralina para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea.

[00122] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido e aplicar pressão negativa ou em algumas modalidades pressão mecânica ao dito material sólido com base em coralina para promover a absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido com base em coralina para chegar ao dito valor total de absorção de fluido. Em algumas modalidades, a aplicação de pressão positiva é por meio da aplicação de um vácuo ou em algumas modalidades pressão mecânica ao substrato imerso no fluido promovendo a entrada do fluido nele.

[00123] Em algumas modalidades, o processo pode compreender ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base em coralina com um fluido e aplicar pressão positiva ao dito material sólido com base em coralina para promover a absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido com base em coralina para chegar ao dito valor total de absorção de fluido. De acordo com este aspecto e, em algumas modalidades, cuidado deverá ser tomado para assegurar que a aplicação de pressão não comprometa de forma alguma a integridade estrutural do substrato sólido.

[00124] Em algumas modalidades, a aplicação de pressão positiva é por meio de qualquer meio manual, por exemplo,

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45/138 por meio do uso de qualquer aplicador, seringa, etc., pressão gravitacional e outros, como será apreciado pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, a aplicação de pressão positiva é por meio de osmose forçada, centrifugação e outros. Em algumas modalidades, as combinações dos métodos descritos e outros são previstos.

[00125] Em algumas modalidades, uma etapa de prétriagem pode ser empreendndia. Por exemplo, e em algumas modalidades, uma fatia de coral de uma espessura desejada é tomada, que, por exemplo, pode ser perpendicular ao crescimento do anel da amostra de coral. A fatia pode ser avaliada quanto a rápida absorção de um fluido biológico, tal como, por exemplo, absorção de um fluido proteínaáceo colorido, tal como sangue. Em algumas modalidades, o sangue de qualquer fonte pode ser usado, tal como, por exemplo, de gado ou outras fontes.

[00126] As amostras que proveem uma rápida absorção como parte do procedimento pré-triado descrito podem ser avaliadas quanto ao seu valor da capacidade de absorção de fluido específico.

[00127] Por exemplo, e em algumas modalidades, amostras menores ou estruturas artificiais específicas podem ser isoladas do bloco do qual a fatia de coral foi tirada para a pré-triagem de regiões que foram determinadas pela prétriagem para prover rápida absorção do fluido biológico.

[00128] Em algumas modalidades, a estrutura artificial e/ou amostras menores são secas e a seguir submetidas a processamento adicional. Tal processamento adicional, por exemplo, assegura a remoção de matéria, que renderia os implantes impróprios para a implantação em indivíduos

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46/138 humanos ou veterinários. Em algumas modalidades, tal processamento produz um produto que é adequado para a implantação, de acordo com qualquer orientação do órgão regulador, tal como, por exemplo, the ASTM F 1185-03: Especificação Padrão para Composição de Hidroxilapatita para Implantes Cirúrgicos ou ASTM F 1581-08: Especificação Padrão para Composição de Osso Anorgânica para Implantes Cirúrgicos.

[00129] Em algumas modalidades, tal processamento adicional inclui a oxidação de resíduos orgânicos na estrutura artificial e/ou amostras menores e a subsequente eliminação do agente de oxidação usado. Em alguns aspectos, tal agente de oxidação pode incluir hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio (soluções dos mesmos) ou uso de ambos, que em algumas modalidades, é seguido pela aplicação de um solvente polar.

[00130] Em algumas modalidades, tais etapas de processamento adicionais podem ser empreendidas após o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico e, em algumas modalidades, tais etapas de processamento adicionais podem ser empreendidas antes de estabelecer o valor da capacidade de absorção de fluido específico para a amostra(s).

[00131] De acordo com este aspecto e, em algumas modalidades, tal estrutura artificial ou amostras menores podem ser totalmente secas e a seguir avaliadas quanto a seu valor de absorção de fluido espontânea, por exemplo, como descrito em Exemplo 1 abaixo. Por exemplo, a amostra seca pode ser imersa em água e o valor de absorção de fluido espontânea avaliado, seguido por uma avaliação do

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47/138 valor total de absorção de fluido. De acordo com este aspecto e em uma modalidade, as amostras que produzem um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% sãos elecionadas para o processamento adicional. Em algumas modalidades, as amostras que produzem um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 60-95% são selecionadas para o processamento adicional.

[00132] Em alguns aspectos, tal processamento adicional inclui um processo para melhorar ou ainda otimizar um valor da capacidade de absorção de fluido específico de uma dada estrutura artificial e/ou amostra, incluindo processos para orimizar a mesma como descrito aqui. Em algumas modalidades, tal processamento adicional pode incluir a sujeição da estrutura artificial e/ou amostra à exposição ao solvente polar, como descrito aqui.

[00133] Em algumas modalidades, a invenção também provê um processo para a conversão de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho ideal em um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

a) o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico para um grupo de materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido para cada amostra no dito

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48/138 grupo;

c) sujeição do dito	material sólido com	base	no
derivado do esqueleto	de	organismo marinho de	(b)	ao
tratamento com plasma	fr	io, tratamento corona	ou	uma
combinação dos mesmos;
d) a determinação	de	uma capacidade específica	de
absorção de fluido como	em	(a) nos ditos materiais	sólidos
com base no derivado	do	esqueleto de organismo	marinho

obtidos em (c); e

[00134] Em algumas modalidades, o processamento adicional contempla especificamente o tratamento com plasma frio, tratamento corona ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o processamento adicional pode incluir a conversão da superfície em hidroxiapatita, por exemplo, por meio de reação hidrotérmica, por métodos conhecidos.

[00135] Em algumas modalidades, os substratos sólidos para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada desta invenção compreendem um derivado do esqueleto de organismo caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido.

[00136] O exemplo 5 demonstrou que substratos sólidos caracterizados por um valor de ângulo de contato menor do

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49/138 que 60 graus são comparáveis a amostras tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% e, portanto, tais amostras também devem ser consideradas como compreendendo parte desta invenção.

[00137] Métodos para a determinação de um ângulo de contato são bem-conhecidos e qualquer método apropriado pode ser usado. Uma modalidade de tal método é provida aqui com relação ao exemplo 5 e como descrita a seguir.

[00138] Em algumas modalidades, a composição estrutural do coral ou derivado de coral é determinada por difração de raios X (XRD) ou manchamento positivo para solução Feigl.

[00139] Em algumas modalidades, o termo manchamento positivo para solução Feigl ou positividade em mancha Feigl se refere a um padrão de manchamento consistente com um padrão de manchamento Feigl padrão (preto) como conhecido na técnica e como descrito aqui, indicativo de uma estrutura cirstalina de aragonita.

[00140] Similarmente, em algumas modalidades desta invenção, é provido um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

• a seleção de um material sólido com base no derivado

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50/138 do esqueleto de organismo caracterizado por um ângulo de contato menor do que 60 graus.

[00141] Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base em coral desta invenção podem ser convertidos parcial ou totalmente em hidroxiapatita por métodos conhecidos.

[00142] De acordo com este aspecto, um substrato sólido caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido pode ser convertido em hidroxiapatita e a atividade indicada está presente no substrato convertido.

[00143] Em outra modalidade, o substrato sólido caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido pode ser convertido em hidroxiapatita e a atividade indicada está presente no substrato convertido.

[00144] Em outro aspecto, um substrato sólido é convertido em hidroxiapatita, e o mesmo é a seguir avaliado quanto à presença de um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido, e tais substratos satisfazendo os critérios determinados são especificamente selecionados e abrangidos pelo presente pedido.

[00145] Em outro aspecto, um substrato sólido é

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51/138 convertido em hidroxiapatita, e o mesmo é a seguir avaliado em termos de seu ângulo de contato e se o ângulo é menor do que 60 graus, e tais substratos satisfazendo os critérios determinados são especificamente selecionados e abrangidos pelo presente pedido.

[00146] De acordo com este aspecto e em uma modalidade, os substratos sólidos como aqui definidos, tais como, por exemplo, amostras de coral ou nácar ou outros como descrito aqui são avaliados pela seleção de uma amostra seca para o uso nos processos como descrito aqui, cuja região de isolamento de um bloco maior pode ser determinada, a fim de prover informação referente às características da área no bloco de cujas amostras adicionais podem ser isoladas e a seguir usadas.

[00147] Em alguns aspectos, a amostra é seca sob vácuo e/ou aquecida ou pressurizada ou tratada a vapor.

[00148]	Em algumas	modalidades, para	aspectos
relacionados	a um valor	da capacidade de absorção de fluido
específico,	tal valor é	uma	função da mudança em	peso no
dito materia	l sólido com	base	em coralina.
[00149]	De acordo	com	este aspecto e em	algumas

modalidades, o peso seco para cada amostra é gravado e o fluido como descrito aqui é adicionado em um recipiente de ensaio.

[00150] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, a razão de pelo menos 1:1 do tamanho da amostra em mm para o volume de fluido adicionado em ml é aplicado ao recipiente. Em algumas modalidades, a quantidade de fluido aplicada está em excesso quando comparada vom o tamanho da amostra.

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52/138 [00151] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, uma vez que a absorção inicial de fluido é avaliada, de acordo com este aspecto e em algumas modalidades, a amostra do substrato sólido é a seguir colocada em contato com o fluido e o peso da amostra do substrato sólido é avaliado. Em outras modalidades, a gravidade específica é avaliada pela centrifugação gradiente pelo princípio arquimediano.

[00152] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, a absorção de fluido espontânea é avaliada e um valor de absorção de fluido espontânea é estabelecido, com base na mudança no peso da amostra.

[00153] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no volume de fluido de fluido aplicado ao dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho. De acordo com este aspecto, a absorção de fluido espontânea é avaliada e um valor de absorção de fluido espontânea é estabelecido com base na absorção completa do volume aplicado à amostra.

[00154] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, o processo a seguir compreende ainda o contato de uma quantidade significativamente aumentada de fluido com a amostra e a aplicação de pressão ao mesmo para promover máxima absorção de fluido até a capacidade total de absorção de fluido da amostra.

[00155] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, como observado, tal pressão pode ser pressão positiva ou negativa e o tempo de aplicação é por um período de tempo suficiente para assegurar a absorção

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53/138 máxima do fluido aplicado na amostra do derivado do esqueleto de organismo marinho.

[00156] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, tal tempo pode incluir um intervalo de 0,5-60 minutos, ou em algumas modalidades, quando um amostra maior está sendo avaliada, tal tempo pode incluir um intervalo de 2-24 horas para chegar ao dito valor de absorção de fluido espontânea. Apreciar-se-á que os intervalos de tempo recitados aqui sejam aplicáveis para qualquer modalidade com relação os mesmos, como descrito aqui. O versado na técnica apreciará que a quantidade de tempo para a qual o fluido é aplicado para determinar a capacidade total de absorção de fluido possa ser estendida ou encurtada em função das dimensões e geometria do substrato de amostra sendo avaliado.

[00157] De acordo com estes aspectos, a capacidade total de absorção de fluido é assim avaliada e o valor da capacidade de absorção de fluido específico é a seguir determinado.

[00158] Em algumas modalidades, a invenção contempla especificamente substratos sólidos tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico excedendo o valor de corte de 75%, para a amostra a ser observada otimizada como um substrato sólido para promover crescimento celular ou de tecido. Apreciar-se-á que a invenção contemple o valor de corte determinado para promover um valor razoável que reduza a presença de falsos positivos apreciáveis, isto é, substratos sólidos que não são tão ideiais para as aplicações determinadas.

[00159] Em algumas modalidades, a invenção contempla

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54/138 especificamente substratos sólidos caracterizados por teremem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, para a amostra a ser observada otimizada como um substrato sólido para promover o crescimento celular ou de tecido. Apreciar-se-á que a invenção contemple o valor de corte determinado para promover um valor razoável que reduza a presença de falsos positivos apreciáveis, isto é, substratos sólidos que não sejam tão ideais para as aplicações determinadas.

[00160] Deve-se observar que a utilizadade para os substratos de coralina para promover o crescimento de tecido tal como cartilagem e osso foi mostrada anteriormente. Surpreendentemente, verificou-se agora que embora numerosos substratos com base em coral isolados possam ser usados para tal reparo, função consistente e superior foi verificada quando os substratos foram escolhidos especificamente para sua absorção espontânea intensificada de fluidos biológicos. Surpreendentemente, verificou-se não somente que os materiais com base em coral podem ser um material eficaz para promover crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada, mas que as características de absorção de fluido espontânea da amostra de coral selecionada para o uso na mesma forneceram aividade ainda maior a esse respeito.

[00161] Sem estar ligado por teoria e representando

modalidades	não limitantes	dos	substratos, processos	e
aplicações	desta	invenção,	a	seleção	específica	de
substratos	sólidos	com base	no	derivado	do esqueleto	de

organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos

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75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por teremem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, pode selecionar uma amostra cuja vascularização é intensificada ou, em algumas modalidades, cujo acesso à linfa é intensificado ou, em algumas modalidades, cuja capacidade de absorção anunica uma afinidade com os materiais associados à matriz extracelular ou, em algumas modalidades, cuja capacidade de absorção anuncia uma afinidade com a atração celular incluindo extravasamento dos vasos próximos.

[00162] Em outras modalidades, os substratos, processos e aplicações desta invenção, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, ou tendo uma aspereza da superfície descrita, podem selecionar uma amostra que seja particularmente útil em aplicações anticâncer.

[00163] Em outras modalidades, os substratos, processos e aplicações desta invenção, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus,

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56/138 ou tendo uma aspereza da superfície descrita, quando em contato com um fluido, podem selecionar uma amostra que seja particularmente útil na promoção de osteointegração, osteocondução, osteotransdução, condrogênese ou regeneração da cartilagem.

[00164] Em outras modalidades, os substratos, processos e aplicações desta invenção, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, ou tendo uma aspereza da superfície descrita, podem selecionar uma amostra que seja particularmente útil na promoção de suporte tridimensional ex vivo e estrutura para crescimento de célula, tecido ou órgão. Em algumas modalidades, tal crescimento de célula, tecido ou órgão pode incluir aquele para o crescimento e desenvolvimento do coração, músculo, fígado, pele, rim, vaso sanguíneo e neuronal.

[00165] Em outras modalidades, os substratos, processos e aplicações desta invenção, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, ou tendo uma aspereza da

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57/138 superfície descrita, podem selecionar uma amostra que seja particularmente útil na promoção ex vivo ou in vitro do crescimento, proliferação e/ou diferenciação de célulatronco para aplicações das mesmas, incluindo a provisão das mesmas para o suporte tridimensional e estrutura para o crescimento de célula, tecido ou órgão que surge das mesmas, por exemplo, para aplicações no crescimento e desenvolvimento do coração, músculo, fígado, pele, rim, vaso sanguíneo e neuronal.

[00166] Deve-se entender que quaisquer destes mecanismos e outros podem ser responsáveis pelo fenômeno do crescimento celular ou de tecido intensificado ou função restaurada, e que qualquer tal mecanismo associado com a aplicação de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% deve ser considerado parte desta invenção.

[00167] Em algumas modalidades, amostras assim processadas e caracterizadas por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido pode então ser usada para o isolamento de regiões localizadas proximamente de uma seção da qual tal amostra foi tirada, cujas amostras podem então ser usadas confiavelmente e consideradas otimizadas de acordo com os processos desta invenção. Em algumas

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58/138 modalidades, com relação às amostras com base em coral, tais regiões podem incluir a região do anel de crescimento anual total dentro do coral do qual a amostra foi derivada.

[00168] Em algumas modalidades, as amostras assim processadas e caracterizadas por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, ou seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizados por terem um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, podem ser então totalmente secas e utilizadas para a implantação em um indivíduo ou para o uso como um substrato ex vivo para o crescimento de célula, tecido ou órgão para a subsequente implantação.

[00169] Em algumas modalidades e como exemplificado no exemplo 9 aqui, os substratos, processos e aplicações desta invenção, pelos quais substratos sólidos com base em um derivado do esqueleto de organismo marinho são caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico, valor de ângulo de contato ou aspereza da superfície promovem adesão e viabilidade de célula melhorada a tais substratos. De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, os ensaios de adesão da célula e viabilidade da célula demonstram que as amostras consideradas otimizadas para a absorção de fluido promovem maior aderência e viabilidade da célula total ao longo do tempo.

[00170] Em algumas modalidades, quando a amostra é utilizada in vivo em subsequentes aplicações, em alguns aspectos, a amostra é primeiro contatada com fluidos biológicos ou materiais autólogos do hospedeiro antes da

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59/138 implantação na mesma, verificando o fenótipo de absorção de fluido intensificado observado como descrito aqui.

[00171] Um substrato sólido desta invenção pode em algumas modalidades ser em vez de ou simultaneamente caracterizado por uma aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica, difração de raios X ou análise da solução Feigl quanto ao manchamento positivo ou outros meios conhecidos para o estabelecimento do mesmo, como será apreciado pelo versado na técnica.

[00172] Como descrito e exemplificado aqui, por exemplo, como descrito nos Exemplos 6, certas seções do coral isolado proveem um fenótipo diferente, quando comparado a amostras coletadas de outra região de uma peça de coral maior. Tal fenótipo pode ser refletido na capacidade de absorção da amostra, aspereza da estrutura da superfície ou ambos, com a diferença dewterminada resultando em uma amostra caracterizada na promoção de crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada.

[00173] Em algumas modalidades, o processo para a seleção do substrato sólido compreende o isolamento de uma amostra de um material sólido com base em coralina e o estabelecimento da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cuja superfície substancialmente áspera é determinada por microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica, difração de raios X ou manchamento positivo para solução Feigl e seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado

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60/138 por uma determinação da presença de uma superfície substancialmente áspera no dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, ou manchamento positivo (preto) por meio de manchamento da solução Feigl.

[00174] Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base em coral desta invenção podem ser convertidos parcial ou totalmente em hidroxiapatita por métodos conhecidos.

[00175] Em outro aspecto, um substrato sólido é convertido em hidroxiapatita, e o mesmo é a seguir avaliado quanto à presença de aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica ou análise XRD e tais substratos satisfazendo os critérios determinados são especificamente selecionados e abrangidos pelo presente pedido.

[00176] Sem estar ligado por teoria e representando modalidades não limitantes dos substratos, processos e aplicações desta invenção, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra), como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, pode selecionar uma amostra cuja vascularização é intensificada ou em algumas modalidades, cujo acesso à linfa é intensificado ou, em algumas modalidades, cuja capacidade de absorção anuncia uma afinidade com materiais associoados à matriz extracelular ou, em algumas modalidades, cuja capacidade de absorção anuncia uma

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61/138 afinidade com atração celular incluindo extravasamento de vasos próximos.

[00177] Em algumas modalidades, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra), como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui são úteis na promoção de atividade anticâncer. Em algumas modalidades, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra), como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, são úteis na promoção de osteointegração, osteocondução, osteotransdução, condrogênese ou regeneração da cartilagem, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a seleção específica de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizados pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra) como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, são úteis na promoção de suporte estrutural tridimensional ex vivo para o crescimento de células, tecido ou órgão, o qual, em algumas modalidades, é particularmente adequado para aplicações no coração, músculo, fígado, pele, rim, vaso sanguíneo ou neurônios.

[00178] Deve-se entender que quaisquer destes

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62/138 mecanismos e outros podem ser responsáveis pelo fenômeno de crescimento celular ou de tecido intensificado ou função restaurada e que qualquer tal mecanismo associado à aplicação de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, caracterizado pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra) como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, deve ser entendido como sendo parte desta invenção.

[00179] Em algumas modalidades, as amostras assim processadas e caracterizadas pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra), como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, podem então ser usadas para o isolamento de regiões localizadas proximalmente de uma seção da qual a amostra foi tirada, cujas amostras podem então ser confiavelmente usadas e consideradas como sendo otimizadas de acordo com os processos desta invenção. Em algumas modalidades, com relação às amostras com base em coral, tais regiões podem incluir a região do anel de crescimento anual inteira dentro do coral do qual a amostra foi derivada.

[00180] Em algumas modalidades, as amostras assim processadas e caracterizadas pelo valor desejado da capacidade de absorção de fluido específico ou aspereza desejada da superfície (Ra), como medido pelos métodos para a determinação destas características como descrito aqui, podem então ser utilizadas para a implantação em um

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63/138 indivíduo ou para o uso como um substrato ex vivo para o crescimento celular ou de tecido para a subsequente implantação.

[00181] Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção podem ser processados/preparados para formar um preenchedor ósseo ou material substituto para o osso.

[00182] Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção são úteis em aplicações ortopédicas, incluindo o uso como parafusos ortopédicos, próteses e outros como será apreciado pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção são úteis em aplicações que requerem um material preenchedor, tal como o preenchedor de lacuna.

[00183] Em algumas modalidades, tais preenchedores podem incluir vidros ativos, como são conhecidos pelos versados na técnica. Outros produtos comerciais podem ser combinados com os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção. Em algumas modalidades, os materiais preenchedores ósseos descritos nas patentes norte-americanas a seguir podem ser combinadas com os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção: 5.939.039; 6.325.987; 6.383.519; 6.521.246; 6.969.501; e 6.991.803, todas as quais são por meio desta incorporadas por referência em sua totalidade.

[00184] Em algumas modalidades, os substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho

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64/138 desta invenção são úteis em aplicações que fazem uso de estruturas de reforço, por exemplo, como parafusos de reforço, enxertos, de outros. Em algumas modalidades, os métodos e materiais desta invenção são úteis na fixação de parafusos, prótese e outras estruturas adequadfas para tal aplicação.

[00185] Em algumas modalidades, os métodos e materiais desta invenção são úteis na cura de feridas. Em algumas modalidades, os materiais desta invenção que incluem um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho sólido, de acordo com qualquer modalidade do mesmo como descrito aqui, incluindo, inter alia,

substratos em	uma escala	de	milímetro ou centrímetro	ou, em
algumas modalidades, uso	de	substratos	sólidos	com	base no
derivado do	esqueleto	de	organismo	marinho	em	pó ou
granulado são	previstos.
[00186] Em algumas	modalidades, t	al cura	de	feridas
pode incluir	a cura de	queimaduras,	tecido	necrótico,

úlceras diabéticas, feridas cirúrgicas e qualquer ferida, como será apreciado pelo versado na técnica.

[00187] Em algumas modalidades, os métodos e materiais desta invenção são úteis em aplicações no tratamento da necrose avascular, cisto ou tumor ósseo, por exemplo, após a excisão cirúrgica dos mesmos.

[00188] Em algumas modalidades, os métodos e materiais desta invenção são úteis em aplicações na cirurgia do esqueleto cranio-facial e aplicações de reconstrução do esqueleto.

[00189] Em outras modalidades, o substrato pode ser uma mistura de vários materiais de origem marinha ou uma

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65/138 mistura de osso e grânulos de coral ou grânulos de cartilagem e coral. Em algumas modalidades, o substrato sólido pode ser um material compósito compreendido de amostras múltiplas dos derivados do esqueleto de organismo marinho, como descrito aqui.

[00190] Em uma modalidade desta invenção, o substrato sólido pode ser material derivado do esqueleto de organismo marinho isolado sozinho ou, em algumas modalidades, o substrato pode compreender ainda um material adicional.

[00191]	Em	algumas modalidades,	tal material	adicional
pode incluir	um polímero.
[00192]	O	termo polímero se refere, em algumas
modalidades,		à presença de uma	camada de	material
polimérico	em	associação com pelo	menos uma	porção do

material de substrato sólido. Em algumas modalidades, tal camada de polímero é um revestimento para o material de substrato sólido.

[00193] Em algumas modalidades, tal revestimento pode ser sobre a totalidade do substrato sólido e, em algumas modalidades, tal revestimento pode penetrar dentro dos vazios e/ou poros e/ou depressões do substrato sólido. Em algumas modalidades, tal revestimento pode aplicado seletivamente em uma região particular do substrato sólido, tal que ele cira uma fase separada sobre o substrato sólido e, em algumas modalidades, tal polímero pode ser assim aplicado que uma camada de polímero espessa ou fase seja associada com uma porção de um substrato sólido, dessa forma criando uma fase de polímero separada em associação com o substrato sólido como descrito aqui.

[00194] Em uma modalidade, o revestimento do polímero

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66/138 provê recursos adicionados aos substratos sólidos como descrito aqui, por exemplo, maior resistência à tração, maior flexibilidade, reduzida fragilidade e outros atributos, ao substrato sólido e, em algumas modalidades, o revestimento do polímero resulta em maior atração celular e fixação aos substratos sólidos como descrito aqui, o que por sua vez, inter alia, resulta em reparo intensifdicado em termos de quantidade, qualidade e tempo de reparo. Em algumas modalidades, o revestimento do polímero intensifica a proliferação e/ou diferenciação de células em tecido maduro desejado que, por sua vez, inter alia, resulta em reparo intensificado em termos de quantidade, qualidade e tempo de reparo.

[00195] Em uma modalidade desta invenção, um revestimento do polímero é permeável. Em uma modalidade, o revestimento do polímero permeável compreende uma membrana porosa especial. Em uma modalidade, o termo permeável se refere a ter poros e aberturas. Em uma modalidade, o revestimento do polímero permeável desta invenção tem poros e aberturas que permitem a entrada de nutrientes, um composto terapêutico, uma população de célula, um quelante ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o revestimento do polímero permeável desta invenção tem poros e aberturas que permitem a saída/liberação de nutrientes, um composto terapêutico, uma população de células, um quelante ou uma combinação dos mesmos.

[00196] Em uma modalidade, um revestimento do polímero desta invenção é descontínuo. Em uma modalidade, uma região ou uma pluralidade de subregiões do coral desta invenção compreendem uma ausência de revestimento do polímero,

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67/138 permitindo o contato direto entre o coral e o ambiente.

[00197] Em algumas modalidades, o substrato sólido incorpora um polímero biocompatível entre eles, o que está associado com o componente de aragonita ou calcita, por meio de qualquer associação física ou química. Em algumas modalidades, o polímero é uma parte de um hidrogel, que é incorporado nos substratos sólidos desta invenção. Em algumas modalidades, tais substratos sólidos contendo hidrogel podem depois disso ser liofilizados ou dessecados e podem depois disso ser reconstituídos.

[00198] Em algumas modalidades dos substratos sólidos desta invenção, o polímero pode ser aplicado ao substrato sólido de modo a formar uma fase separada ou, em algumas modalidades, o polímero pode ser aplicado como uma camada sobre o substrato sólido ou, em algumas modalidades, o substrato sólido pode compreender ambos os polímeros como uma camada associada interna e externamente com uma fase separada fixada a mesma compreendendo os mesmos ou um material polimérico diferente.

[00199] Tais substratos sólidos contendo polímero podem ser particularmente adequados para o reparo da cartilagem, regeneração ou intensificação da formação da mesma. Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, por exemplo, no tratamento de defeitos osteocondrais, o substrato sólido com base em coralina é de uma dimensão adequada para a incorporação dentro do osso afetado e compreende ainda uma fase contendo polímero, cuja fase, quando inserida dentro do local de defeito afetado, é próxima à cartilagem afetada. Em outro aspecto e representando uma modalidade desta invenção, o substrato

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68/138 sólido compreende um polímero, que permeou dentro dos vazios e poros do substrato sólido, cujo substrato sólido é inserido dentro de um local de reparo da cartilagem e cujo polímero facilita o crescimento, regeneração ou cura da cartilagem do local de defeito.

[00200] Tais substratos sólidos contendo polímero podem ser particularmente adequados para o reparo do osso, regeneração ou intensificação de formação do mesmo. Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, por exemplo, no tratamento de edema do osso, rompimento ou fragmentação, doença ou defeito do osso, o substrato sólido com base em coralina é de uma dimensão adequada para a incorporação dentro do osso afetado e compreende ainda um polímero, cujo polímero permeou dentro dos vazios e poros do substrato sólido, cujo substrato sólido é inserido dentro do osso e cujo polímero facilita o crescimento do osso, regeneração ou cura do local de defeito.

[00201] Em uma modalidade, um revestimento do polímero desta invenção compreende um polímero natural compreendendo, colágeno, fibrina, elastina, seda, ácido hialurônico, hialuronato de sódio, ácido hialurônico reticulado, quitosana, quitosana reticulada, alginato, alginato de cálcio, alginato de cálcio reticulado e quaisquer combinações dos mesmos.

[00202] Em uma modalidade, o polímero compreende polímeros naturais modificados sinteticamente e pode incluir derivados de celulose tais como alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose e nitroceluloses. Exemplos de derivados de celulose adequados incluem metil celulose, etil celulose,

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69/138 hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, hidroxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, acetato butirato de celulose, acetato ftalato de celulose, carboximetil celulose, triacetato de celulose e sal de sódio de sulfato de celulose .

[00203] Em uma modalidade, desta invenção, um polímero compreende um polímero biodegradável sintético. Em uma modalidade desta invenção, um polímero biodegradável sintético compreende alfa-hidróxi ácidos incluindo ácido poli-láctico, ácido poliglicólico, enantiômeros dos mesmos, copolímeros dos mesmos, poliortoésteres e combinações dos mesmos.

[00204] Em uma modalidade, um polímero desta invenção compreende um poli(cianoacrilato), poli(alquilcianoacrilato), poli(cetal), poli(caprolactona), poli(acetal), poli(a-hidroxi-éster), poli(a-hidroxi-éster), poli(hidroxil-alcanoato), poli(propileno-fumarato), poli (imino-carbonato), poli(éster), poli(éteres), poli(carbonatos), poli(amida), poli(siloxano), poli(silano), poli(sulfeto), poli(imidas), poli(ureia), poli(amida-enamina), poli(ácido orgânico), poli(eletrólitos), poli(p-dioxanona), poli(olefina), poloxâmero, polímeros inorgânicos ou organometálicos, elastômero ou quaisquer de seus derivados ou um copolímero obtido por uma combinação dos mesmos.

[00205] Em uma modalidade, um polímero desta invenção compreende poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA). Em outra modalidade, o polímero compreende poli(D,L-lactida) (PLA). Em outra modalidade, o polímero compreende poli(D,L

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70/138 glicolida) (PGA). Em uma modalidade, o polímero compreende um glicosaminoglicano.

[00206] Em uma modalidade, o polímero compreende polímeros degradáveis sintéticos, que podem incluir, mas não são limitados a polihidroxiácidos, tais como poli(lactida)s, poli(glicolida)s e copolímeros dos mesmos; poli(etileno tereftalato); poli(ácido hidroxibutírico); poli(ácido hidroxivalérico); poli[lactida-co-(ecaprolactona)]; poli[glicolida-co(ε-caprolactona)]; poli(carbonato)s, poli(pseudoaminoácidos); poli(aminoácidos); poli(hidroxialcanoato)s; poli (anidridos); poli(ortoéster)s; e misturas e copolímeros dos mesmos.

[00207] Em uma modalidade desta invenção, um polímero compreende proteínas tais como zeína, zeína modificada, caseína, gelatina, glúten, albumina de soro, colágeno, actina, α-fetoproteína, globulina, macroglobulina, coesina, laminina, fibronectina, fibrinogênio, osteocalcina, osteopontina, osteoprotegerina ou outros, como será apreciado por alguém versado na técnica. Em outra modalidade, um polímero pode compreender açúcares cíclicos, ciclodextrinas, derivados sintéticos de ciclodextrinas, glicolipídeos, glicosaminoglicanos, oligossacarídeo, polissacarídeos tais como alginato, carragenina (χ, λ, μ, κ) , quitosana, celuloses, sulfato de condroitina, curdlan, dextranos, elsinan, furcellran, galactomanana, gelan, glicogênio, goma arábica, hemicelulose, inulina, goma caraia, levan, pectina, polulan, pululano, profiran, escleroglucano, amido, goma tragacanto, welan, xantana, xilan, xiloglucano, ácido hialurônico, quitina ou um

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71/138 poli(3-hidroxialcanoato)s, tal como ρο1ι(βhidroxibutirato), po1i(3-hidroxioctanoato) ou poli(3hidroxiácidos graxos) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00208] Em uma modalidade, o polímero compreende um polímero bioerodível tal como poli(lactida-co-glicolida)s, poli(anidrido)s, e poli(ortoéster)es, que têm grupos carboxílicos expostos na superfície externa à medida que a superfície lisa do polímero erode, os quais também podem ser usados. Em uma modalidade, o polímero contém ligações lábeis, tais como polianidridos e poliésteres.

[00209] Em uma modalidade, um polímero pode compreender derivados químicos dos mesmos (substituições, adições e a eliminação de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno, hidroxilações, oxidações e outras modificações feitas rotineiramente por aqueles versados na técnica), as misturas de, por exemplo, proteínas ou carboidratos sozinhos ou em combinação com polímeros sintéticos.

[00210] Em uma modalidade desta invenção, o polímero é biodegradável. Em uma modalidade, o termo biodegradável ou formas gramaticais dos mesmos, se refere a um material desta invenção, que é degradado no ambiente biológico do indivíduo no qual ele é encontrado. Em uma modalidade, o material biodegradável sofre desgradação, durante a qual, produtos ácidos ou, em outra modalidade, produtos básicos são liberados. Em uma modalidade, a biodegradação envolve a degradação de um material nas suas subunidades de componente, por meio de, por exemplo, digestão, por um processo bioquímico. Em uma modalidade, a biodegradação pode envolver a clivagem de ligações (sejam covalentes ou de outra forma), por exemplo, em uma estrutura principal do

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72/138 polímero desta invenção. Em outra modalidade, a biodegradação pode envolver a clivagem de uma ligação (seja covalente ou de outra forma) interna a uma cadeia lateral ou uma que conecta uma cadeia lateral a, por exemplo, uma estrutura principal do polímero.

[00211] Em uma modalidade, um coral desta invenção é covalentemente associado ao revestimento do polímero por meio do uso de um agente de reticulação. Em uma modalidade, a frase agente de reticulação se refere a um agente que facilita a formação de uma ligação covalente entre 2 átomos. Em uma modalidade, o agente de reticulação é um agente de reticulação de comprimento zero.

[00212] Em uma modalidade, o agente de reticulação é (1 etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDAC), NSulfohidroxi-succinamida (Sulfo NHS), 5-iodopirimidinas, Ncarbalcoxidi-hidroquinolinas, pirroloquinolinaquinonas, genipin ou uma combinação dos mesmos.

[00213] Em uma modalidade, o agente de reticulação é um reticulado homobifuncional, tais como, por exemplo, um éster de N-hidroxissuccinimida (por exemplo, dissuccinimidil suberato ou ditiobis(succinimidilpropionato), imidoéster homobifuncional (por exemplo, dimetiladipimidato ou dimetil pimelimidato), reticulador reativo em sulfidrila (por exemplo, 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)propionamido]butano), derivado de difluorobenzeno (por exemplo, 5-diflúor-2,4dinitrobenzeno), aldeído (por exemplo, formaldeído, glutaraldeído), bis-epóxido (por exemplo, 1,4-butanodiol diglicidil éter), hidrazida (por exemplo, di-hidrazida de ácido adípico), derivado de bis-diazônio (por exemplo, oPetição 870170008664, de 08/02/2017, pág. 76/154

73/138 tolidina), bis-alquilhaleto, ou uma combinação dos mesmos.

[00214] Em uma modalidade, o agente de reticulação é um reticulador heterobifuncional, tais como, por exemplo, um reticulador aminorreativo e reativo em sulfidrila (por exemplo, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato, um reticulador reativo em carbonila e reativo em sulfidrila (por exemplo, hidrazida de ácido 4-(4-Nmaleimidofenil)butírico) ou uma combinação dos mesmos.

[00215] Em algumas modalidades, o agente de reticulação é um reticulador trifuncional, tal como, por exemplo, éster de 4-azido-2-nitrofenilbiocitin-4-nitrofenila, sulfossuccinimidil-2-[6-biotinamido]-2-(pazidobenzamido)hexanoamido]etil-1,3'-ditiopropionato (sulfo-SBED) ou uma combinação dos mesmos.

[00216] Em outra modalidade, o agente de reticulação é uma enzima. Em uma modalidade desta invenção, o agente de reticulação compreende uma transglutaminase, uma peroxidase, uma xantina oxidase, uma polimerase ou uma ligase ou uma combinação dos mesmos.

[00217] A escolha da concentração do agente de reticulação utilizado para a atividade variará, como uma função do volume, agente e polímero escolhido, em uma dada aplicação, como será apreciado por alqguém versado na técnica.

[00218] Em uma modalidade, a associação de um coral desta invenção com um revestimento do polímero desta invenção compreende uma associação física e/ou mecânica. Por exemplo, em uma modalidade, uma associação física e/ou mecânica pode compreender a inibição de qualquer meio, secagem ao ar, usando um agente de reticulação, aplicação

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74/138 de calor, aplicação de vácuo, aplicação de métodos de liofilização, congelamento, aplicação de forças mecânicas ou qualquer combinação dos mesmos, para promover a associação física entre um coral e um revestimento do polímero como descrito aqui.

[00219] Em algumas modalidades, a escolha do polímero, ou aplicação de polímero a um substrato sólido como descrito aqui pode ser assim escolhida, por uma capacidade adicionada de aumentar a absorção de fluido. Similarmente, a superfície do substrato sólido pode ser tratada para aumentar a absorção de fluido dentro dele, da mesma forma. Em algumas modalidades, tal tratamento da superfície pode incluir aplicação de plasma ao substrato sólido.

[00220] Tornar-se-á aparente a alguém versado na técnica que as propriedades fícias e/ou químicas de uma aplicação de polímero a um substrato sólido desta invenção e componentes do mesmo podem influenciar métodos do uso desta invenção e kits dos mesmos, para induzir ou intensificar o reparo de cartilagem e/ou osso.

[00221] Em uma modalidade, o polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção tem uma espessura dentre 2,0 pm e 0,1 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero tem uma espessura de cerca de 1,0 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero desta invenção tem uma espessura dentre 10 pm e 50 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção tem uma espessura de cerca de 10-25, ou cerca de 15-30, ou cerca de 25-50 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero como aplicado ao substratos sólidos desta invenção tem uma espessura de cerca de

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0,0001-0,1 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção tem uma espessura de cerca de 20-200 pm. Em uma modalidade, o revestimento do polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção tem uma espessura de cerca de 100-1500 pm.

[00222] Em algumas modalidades, o polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção é um revestimento fino, que é associado com os substratos sólidos desta invenção e tem uma espessura como indicada acima.

[00223] Em algumas modalidades, o polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção é aplicado sobre os substratos sólidos desta invenção, tal que, em algumas modalidades, os poros e vazios dentro dos substratos sólidos da invenção podem ser preenchidos com polímeros como descrito aqui e tal camada de polímero como aplicada pode ter uma espessura de cerca de 60-900 pm.

[00224] Em algumas modalidades, o polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção é para um término ou uma porção do revestimento formando uma fase de polímero adicional sobre os substratos sólidos da invenção. De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, a camada de polímero quando aplicada terá uma espessura dentre cerca de 0,01-10 mm.

[00225] Em algumas modalidades, múltiplos substratos sólidos compreendendo aditivos poliméricos são implantados em um local de implantação desejado, em que a espessura do polímero aplicado a um primeiro substrato sólido pode variar quando comparada com uma espessura de polímero

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76/138 quando aplicada a um segundo substrato sólido, implantado no local desejado. As variações em tal espessura podem refletir a faixa descrita aqui.

[00226] Em uma modalidade, a espessura do polímero como aplicado aos substratos sólidos desta invenção influencia as características físicas de um substrato sólido desta invenção. Por exemplo, a espessura de uma aplicação polimérica pode influenciar a elasticidade, resistência à tração, adesividade ou retentividade ou qualquer combinação dos mesmos de um substrato sólido desta invenção. Em uma modalidade, a aplicação do polímero aumenta a elasticidade de um substrato sólido desta invenção. Em uma modalidade, uma aplicação polimérica aumenta a resistência à tração de um substrato sólido desta invenção. Em uma modalidade, a adesividade de uma aplicação polimérica se refere à adesão de células-tronco mesenquimais, vasos sanguíneos, tecido em um local de reparo desejado, incluindo reparo de cartilagem, tecido da cartilagem ou tecido ósseo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, uma aplicação polimérica diminui a adesividade de um substrato sólido desta invenção. Em uma modalidade, uma aplicação polimérica aumenta a adesividade de um substrato sólido desta invenção. Alguém versado na técnica reconhecerá que uma aplicação polimérica pode aumentar a adesividade para um item enquanto diminuindo a adesividade para outro item. Por exemplo, em uma modalidade, a aplicação polimérica aumenta a adesividade para uma célula-tronco mesenquimal e diminui a adesividade de um agente infeccioso. Em uma modalidade, a retentividade de uma aplicação polimérica se refere à retenção de uma população de célula. Em uma modalidade, a

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77/138 população de células retida dentro de um revestimento do polímero é uma população de células-tronco mesenquimais, população de condrócitos, população de osteoblastos, etc. Em uma modalidade, a retentividade de uma aplicação polimérica se refere à retenção de compostos efetores.

[00227] Em uma modalidade, a espessura da aplicação polimérica influencia a proliferação e/ou diferenciação de células aplicadas aos substratos sólidos desta invenção, ou influencia a ativação ou migração de células associadas com o crescimento celular ou de tecido/função restaurada aos substratos desta invenção ou uma combinação dos mesmos.

[00228] A incorporação de um polímero biocompatível tal como ácido hialurônico dentro de um substrato sólido desta invenção pode ser realizada por meio de qualquer meio, incluindo, em algumas modalidades, aplicação acionada por pressão, por exemplo, por meio de aplicação sob vácuo, força centrífuga ou pressão mecânica. Em algumas modalidades, a força gravitacional é suficiente para permitir a penetração homogênea apropriada e relativamente do ácido hialurônico em uma profundidade desejada do implante. De acordo com este aspecto, em uma modalidade, a inspeção visual do implante, por exemplo, usando o manchamento com verde rápido/safranina O, demonstra distribuição uniforme do ácido hialurônico através do substrato em uma profundidade desejada em função do tempo e condições de aplicação.

[00229] Em uma modalidade, os substratos sólidos desta invenção podem compreender ainda um composto efetor, que em algumas modalidades, pode estar associado diretamente aos substratos sólidos desta invenção ou, em algumas

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78/138 modalidades, pode ser associado com um polímero e aplicado em conexão com o memso.

[00230] Em uma modalidade, tais compostos efetores podem incluir íons de prata, íon de cobre ou outros metais ou combinações dos mesmos. Em outra modalidade, a liberação deste composto pode ser facilitada pela aplicação de carga elétrica.

[00231] Em outra modalidade, um primeiro implante pode ser revestido com um metal tal como prata e um segundo implante pode ser revestido com um segundo metal tal como ouro. A aplicação de campo elétrico ou o acionamento por bateria pode fazer com que uma carga elétrica flua entre os materiais implantados e levem à esterilização da área devido à descarga de íons de prata. Tal implementação pode, por exemplo, ser útil no tratamento de osteomielite.

[00232] Em uma modalidade, o composto efetor compreende um componente de um kit desta invenção para o uso para a incorporação em um substrato sólido desta invenção como descrito aqui.

[00233] Em uma modalidade desta invenção, o composto efetor compreende uma citocina, uma proteína morfogenética

do osso (BMP) ,	fatores	de crescimento, um quelante,	uma
população	de	células,	um composto terapêutico ou	um
antibiótico	ou	qualquer	combinação dos mesmos.
[00234]	Em	uma modalidade desta invenção, a frase	um

composto terapêutico se refere a um peptídeo, uma proteína ou um ácido nucleico ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o composto terapêutico é um composto antibacteriano, antiviral, antifúngico ou antiparasítico. Em outra modalidade, o composto terapêutico tem atividade

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79/138 citotóxica ou anticâncer. Em outra modalidade, o composto terapêutico é uma enzima, um receptor, uma proteína do canal, um hormônio, uma citocina ou um fator de crescimento. Em outra modalidade, o composto terapêutico é imunoestimulador. Em outra modalidade, o composto terapêutico inibe respostas inflamatórias ou imunes. Em uma modalidade, o composto terapêutico compreende um fator próangiogênico.

[00235] Em uma modalidade, o composto efetor compreende um inibidor anti-helmíntico, um anti-histamina, um imunomodulador, um anticoagulante, um tensoativo, um anticorpo, um receptor beta-adrenérgico, um bloqueador de canal de cálcio, um inibidor de ECA, um fator de crescimento, um hormônio, um DNA, um siRNA ou um vetor ou qualquer combinação dos mesmos.

[00236] Em uma modalidade, a frase composto efetor se refere a qualquer agente ou composto, que tem um propósito ou aplicação específica que é útil no tratamento, prevenção, inibição, supressão, atraso ou redução de incidência de infecção, uma doença, um distúrbio ou uma condição, quando aplicado aos substratos sólidos, kits e/ou métodos desta invenção. Um composto efetor desta invenção, em uma modalidade, produzirá um efeito desejado que é exclusivo da capacidade de imagear o composto. Em algumas modalidades, o composto efetor pode ser útil mmo imageamento de um local no qual o composto está presente, no entanto, tal capacidade é secundária ao propósito ou escolha do uso do composto.

[00237] Em uma modalidade desta invenção, o termo composto efetor deve ser entendido como incluindo os

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80/138 termos fármaco e agente, assim como, quando referido aqui, e representa uma molécula cuja incorporação dentro do substrato sólido e/ou kits desta invenção ou cujo uso dos mesmos é desejado. Em uma modalidade, o agente é incorporado diretamente dentro de um substrato sólido, e/ou kit desta invenção. Em outra modalidade, o agente é incorporado dentro de um substrato sólido e/ou kit desta invenção, seja pela interação física com um revestimento do polímero, um coral ou partículas de coral desta invenção, e/ou um kit desta invenção ou associação com a mesma.

[00238] Em uma modalidade, o composto efetor é um composto terapêutico.

[00239] Em uma modalidade, a frase um composto terapêutico, se refere a uma molécula, que, quando provida a um indivíduo em necessidade, provê um efeito benéfico. Em alguns casos, a molécula é terapêutica pelo fato de que ela dunciona para substituir uma ausência ou presença diminuída de tal molécula em um indivíduo. Em uma modalidade, a molécula é um ácido nucleico codificando a expressão de uma proteína que é ausente, tal como nos casos de um mutante nulo endógeno sendo compensado pela expresssão da proteína estranha. Em outras modalidades, a proteína endógena é mutada e produz uma proteína não funcional, compensada pela expressão de uma proteína funcional heteróloga. Em outras modalidades, a expressão de uma proteína heteróloga é aditiva em níveis endógenos baixos, resultando em expressão intensificada cumulativa de uma dada proteína. Em outras modalidades, a molécula estimula uma cascata de sinalização que provê a expressão ou secreção ou outros de um elemento crítico para o funcionamento celular ou de hospedeiro.

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81/138 [00240] Em outra modalidade, o composto terapêutico pode ser insulinas naturais ou não naturais, amilases, proteases, lipases, quinases, fosfatases, glicosil transferases, tripsinogênio, quimotripsinogênio, carboxipeptidases, hormônios, ribonucleases, deoxirribonucleases, triacilglicerol lipase, fosfolipase A2, elastases, amilases, fatores de coagulação sanguínea, UDP-glucuronil transferases, ornitina transcarbamoilases, enzimas citocromo p450, adenosina deaminases, fatores tímicos do soro, fatores humorais tímicos, timopoietinas, hormônios de crescimento, somatomedinas, fatores coestimulatórios, anticorpos, fatores estimuladores de colônia, eritropoietina, fatores de crescimento epidérmicos, fatores eritropoieticos hepáticos (hepatopoietina), fatores de crescimento de célula do fígado, interleucinas, interferonas, fatores de crescimento negativos, fatores de crescimento de fibroblasto, fatores de crescimento de transformação da família α, fatores de crescimento de transformação da família β, gastrinas, secretinas, colecistoquininas, somatostatinas, serotoninas, substância P, fatores de transcrição ou combinações dos mesmos.

[00241] Em qualquer uma das modalidades aqui descrita, substratos sólidos de coralina e seu uso nos métodos da presente invenção podem compreender ainda ou ser implantados com outros compostos tais como, por exemplo, antioxidantes, fatores de crescimento, citocinas, antibióticos, anti-inflamatótios, imunossupressores, conservante, medicação contra dor, outros produtos terapêuticos e agentes excipientes. Em uma modalidade,

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82/138 exemplos de fatores de crescimento que podem ser administrados em adição ao inibidor de HMG-CoA redutase incluem, mas não são limitados a, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de transformação alfa (TGF-a), fator de crescimento de transformação beta (TGF-β), fator de crescimento de células endoteliais humanas (ECGF), fator de estímulo de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), proteína morfogenética do osso (BMP), fator de crescimento do nervo (NGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento tipo insulina (IGF), proteína morfogenética derivada da cartilagem (CDMP), plasma rico em plaquetas (PRP), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) ou quaisquer combinações dos mesmos. Exemplos de antibióticos incluem produtos antimicrobianos e antibacterianos.

[00242] Em uma modalidade, compostos efetores para o uso em um substrato sólido e/ou um kit desta invenção e/ou um método desta invenção podem compreender, inter-alia, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um peptídeo, um oligonucleotídeo, um ligante para um alvo biológico, um imunoconjugado, um grupo funcional quimomimético, um glicolipídeo, um agente de marcação, uma enzima, um quelato de íon de metal, um cofator de enzima, um composto citotóxico, um composto bactericida, um composto bacteriostático, um composto fungicida, um composto fungistático, um produto quimoterapeutico, um fator de crescimento, um hormônio, uma citocina, uma toxina, um profármaco, um antimetabolito, um inibidor de microtúbulo, um material radioativo ou uma porção de direcionamento ou

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83/138 qualquer combinação dos mesmos.

[00243] Em uma modalidade, os substratos sólidos e/ou kits desta invenção e/ou métodos desta invenção compreendem ou fazem uso de um oligonucleotídeo, um ácido nucleico ou um vetor. Em algumas modalidades, o termo oligonucleotídeo é intercambiável com o termo ácido nucleico e pode ser referir a uma molécula, que pode incluir, mas não é limitada a, sequências procarióticas, mRNA eucariótico, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genômicas de DNA eucariótico (por exemplo, mamífero) e ainda sequências de DNA sintéticas. O termo também se refere a sequências que incluem quaisquer dos análogos base conhecidos de DNA e RNA.

[00244] Substratos sólidos e/ou kits desta invenção e/ou métodos de uso desta invenção podem compreender ácidos nucleicos, em uma modalidade ou, em outra modalidade, os substratos sólidos e/ou kits desta invenção e/ou métodos de use desta invenção podem incluir a distribuição dos mesmos, como uma parte de um vetor particular. Em uma modalidade, segmentos de polinucleotídeo que codificam sequências de interesse podem ser ligados em sistemas de vetor de expressão comercialmente disponíveis adequados para células mamárias de transdução/transformação e para o direcionamento da expressão de produtos recombinantes dentro das células transduzidas. Apreciar-se-á que tais sistemas de vetor comercialmente disponíveis podem ser facilmente modificados por meio de técnicas recombinantes comumente usadas a fim de substituir, duplicar ou mutar as sequências promotoras ou intensificadoras existentes e/ou introduzir quaisquer sequências de polinucleotídeo

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84/138 adicionais tais como, por exemplo, sequências que codificam os marcadores de seleção adicionais ou sequências que codificam os polipeptídeos repórter.

[00245] Em uma modalidade, os compostos efetores para o uso em um substrato sólido e/ou um kit desta invenção e/ou um método desta invenção pode compreender, inter alia, uma citocina, uma proteína morfogenética de osso (BMP), fator de crescimento, um quelante, uma população de células, um composto terapêutico, um composto anti-inflamatório, um composto pró-angiogênico ou um antibiótico ou qualquer combinação dos mesmos.

[00246] Em algumas modalidades, os kits e/ou substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção compreendem materiais osteoindutivos conhecidos, cimentos ósseos, vidros ósseos ou preenchedores ósseos ou uma combinação dos mesmos.

[00247] Em algumas modalidades, os cimentos ósseos podem incluir qualquer cimento conhecido, incluindo βfosfato de tricálcio, fosfato de monocálcio mono-hidratado (MCPM) (Ca(H2PO4)2H2O) e misturas dos mesmos, incluindo cimento Brucita. Em algumas modalidades, o cimento pode incluir fosfato de cálcio amorfo (ACP), fosfato de dicálcio di-hidratado (DCPD), fosfato de dicálcio anidro (DCPA), αfosfato de tricálcio (α-TCP), fosfato de dicálcio (DCP), fosfato de tetracálcio (TTCP), fosfato de monocálcio monohidratado (MCPM), carbonato de cálcio (CC) e outros e misturas dos mesmos.

[00248] Em algumas modalidades, os kits e/ou substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho desta invenção compreendem materiais osteoindutivos

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85/138 conhecidos e, em algumas modalidades, comercialmente disponíveis, incluindo, por exemplo, vidros bioativos, componentes de cimento ósseo tais como β-TCP, poli(-metil metacrilato).

[00249] Em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção podem ser semeados com células, populações de células ou tecido.

[00250]	Em algumas modalidades,	as células	ou tecido
compreendem	células-tronco	ou	progenitoras	ou	uma
combinação	dos mesmos.
[00251]	Em uma modalidade	desta	invenção, as	células	ou
tecido como	usados de acordo	com os	substratos,	métodos	de

uso ou kits desta invenção são construídos para expressar um produto desejado.

[00252] Em uma modalidade, a frase uma população de células se refere a uma população de células transfectada, uma população de células transduzida, uma população de células transformada ou uma população de células isolada de um indivíduo ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as células transfectas, transduzidas ou transformadas podem ser semeadas no substrato sólido ou, em algumas modalidades, podem ser incorporadas em uma aplicação polimérica no mesmo ou uma combinação dos mesmos.

[00253] Em uma modalidade, uma população de células desta invenção compreende células-tronco mesenquimais. Em uma modalidade, as células-tronco mesenquimais são transformadas.

[00254] Em uma modalidade, uma população de células compreende células benéfocas no reparo de um tecido para o qual a implantação de um substrato sólido desta invenção é

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86/138 desej ada .

[00255] Em algumas modalidades, as células são benéficas em e/ou promovem a formação e/ou reparo de cartilagem e/ou osso. Tais células podem incluir condroblastos ou condrócitos; fibrocondrócito; osteócito; osteoblasto; osteoclasto; sinoviócito; célula da medula do osso; célula estromal; célula-tronco; célula-tronco embriônica; célula precursora, derivado de tecido adiposo; célula progenitora de sangue periférico; célula-tronco isolada de tecido adulto; célula geneticamente transformada; ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, uma célula precursora pode se referir a uma combinação de condrócitos e outras células; uma combinação de osteócitos e outras células; uma combinação de sinoviócitos e outras células; uma combinação de células da medula óssea e outras células; uma combinação de células mesenquimais e outras células; uma combinação de células estromais e outras células; uma combinação de célulastronco e outras células; uma combinação de células-tronco embriônicas e outras células; uma combinação de células precursoras isoladas de tecido adulto e outras células; uma combinação de células progenitoras de sangue periférico e outras células; uma combinação de células-tronco isoladas de tecido adulto e outras células; e uma combinação de células geneticamente transformadas e outras células, as células precursoras para o uso no método da presente invenção são preparadas de um tecido do órgão do mamífero destinatário (isto é, autólogo) ou um mamífero singeneico. Em outra modalidade, as células precursoras alogeneicas e xenogeneicas podem ser utilizadas.

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87/138 [00256] Em uma modalidade, o substrato sólido desta invenção incorpora células-tronco ou progenitoras ou precursoras. Tais células podem ser obtidas diretamente de um doador mamífero, por exemplo, células próprias de um paciente de uma cultura de células de um doador ou de linhagens de cultura celular estabelecidas. Em algumas modalidades, o mamífero é um camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia, hamster, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, cão, gato, macaco ou um ser humano. Células das mesmas species e/ou do mesmo perfil imunológico podem ser obtidas por biópsia sea do paciente ou de um parente próximo. Usando técnicas e condições de cultura de célula padrão, as células são a seguir desenvolvidas em cultura até o confluente e usadas quando necessário. As células podem ser cultivadas até um número suficiente de células ter sido obtido para uma aplicação particular.

[00257] Em uma modalidade, o substrato sólido desta invenção incorpora qualquer célula que possa participar no reparo do tecido, por exemplo, na formação ou reparo da cartilagem e/ou osso. Em algumas modalidades, tais células representam autoenxertos pelo fato de que as células são cultivadas ex vivo para semear as células nos substratos sólidos da invenção e tais substratos sólidos semeados são implantados no indivíduo.

[00258] Em algumas modalidades, tais células podem representar aloenxertos ou xenoenxertos, que podem ser incorporados dentro dos substratos sólidos desta invenção e implantados dentro de um local de reparo.

[00259] Em uma modalidade, um coral desta invenção compreende uma população de células de cultura do coral in

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88/138 vitro por um período de tempo suficiente para semear as células no coral. Em uma modalidade, a população de células é uma população mesenquimal de célula-tronco, condrócito; fibrocondrócito; osteócito; osteoblasto; osteoclasto; sinoviócito; célula da medula óssea; célula estromal; célula-tronco; célula-tronco embriônica; célula precursora, derivada de tecido adiposo; célula progenitora de sangue periférico; célula-tronco isolada de tecido adulto; célula geneticamente transformada; ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, as células-tronco mesenquimais; condrócito; fibrocondrócito; osteócito; osteoblasto; osteoclasto; sinoviócito; célula da medula óssea; célula estromal; célula-tronco; célula-tronco embriônica; célula precursora, derivada de tecido adiposo; célula progenitora de sangue periférico; célula-tronco isolada de tecido adulto; célula transformada geneticamente; ou uma combinação dos mesmos, semeada in vitro, é transformada. Em uma modalidade, a população de células compreende uma população de células benéfica para o reparo da cartilagem. Em uma modalidade, a cultura compreende um quelante. Em uma modalidade desta invenção, o quelante em uma cultura compreende um quelante de cálcio.

[00260] Em algumas modalidades, o substrato sólido pode ainda servir como um substituto para o osso ou preenchedor de vazio ósseo. Em algumas modalidades, o substrato sólido pode ainda incorporar um substituto para o osso ou preenchedor de vazio ósseo. Em algumas modalidades, tal material contendo osso pode compreender osso autólogo ou alogeneico. Em algumas modalidades, este material contendo osso pode compreender osso animal.

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89/138 [00261] Como exemplificado aqui, sangue, água e outros

fluidos	hidrofílicos como descrito foram aplicados a
amostras	de coral e a absorção do fluido dentro das
amostras	de coral foi avaliada.

[00262] A figura 1 descreve os resultados de estudos de absorção representativos conduzidos como descrito, mostrando padrões de absorção, absorção substancial e parcial, absorção mínima ou nenhuma de um fluido, respectivamente, dependendo da amostra avaliada. Esta variabilidade no padrão de absorção forneceu surpreendentemente um meio de selecionar substratos sólidos com eficácia otimizada no crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada após a implantação.

[00263] O exemplo 2, como provido aqui, demonstra correlação entre a absorção de fluido biológico substancial dentro do substrato sólido de coral implantado e subsequente cura no local da implantação, de uma maenira surpreendentemente superior, quando comparado aos substratos de coral sólidos, os quais tinham absorção de fluido biológico mínima.

[00264] Também exemplificado é o desenvolvimento de um protocolo de triagem estabelecido para selecionar tal substrato sólido com base em coral otimizado para promover crescimento celular ou de tecido, provido no exemplo 3.

[00265] O exemplo 5 provê suporte para a caracterização de substratos sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo tendo um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido, como sendo um meio de seleção comparável como aquele provido pelo valor da capacidade de absorção de fluido específico, como

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90/138 descrito acima.

[00266] Esta invenção provê a aplicação inesperada de selecionar idealmente substratos sólidos com base em coral sendo úteis no crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada e exemplificada aqui é a aplicação particular ppara o reparo e intensificação de formação da cartilagem e osso.

[00267] Em particular, esta invenção provê a aplicação insesperada que a regeneração (opcionalmente com a osteointegração, osteocondução e osteotransdução), reparo e intensificação de formação do osso é ideal quando o substrato sólido é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico foi determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de

fluido espontânea dividido	por	um valor	total	de	absorção
de fluido e tal substrato	é inserido dentro	de	um local
para o reparo do osso.
[00268] Em particular,	esta	invenção	provê	a	aplicação

inesperada que a regeneração, reparo e intensificação de formação do osso são ideais quando o substrato sólido é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido e tal substrato é inserido dentro de um local para o reparo do osso.

[00269] Em outras modalidades, esta invenção provê a vantagem inesperada em termos de maior condrogênese, quando o substrato sólido é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido

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91/138 específico foi determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido e tal substrato foi inserido dentro do local de defeito da cartilagem.

[00270] Em outras modalidades, esta invenção provê a vantagem inesperada em termos de maior condrogênese, quando o substrato sólido é caracterizado por ter um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido e tal substrato foi inserido dentro do local de defeito da cartilagem.

[00271] Esta invenção em algumas modalidades também provê a aplicação inesperada de selecionar idealmente os substratos sólidos com base em coral sendo úteis no crescimento celular e de tecido e/ou função restaurada, e exemplificada aqui é a aplicação particular para reparo e intensificação de formação da cartilagem e osso.

[00272] Em particular, esta invenção provê a aplicação inesperada que a regeneração, reparo e intensificação de formação do osso opcionalmente com osteointegração, osteocondução e osteotransdução são ideais quando o substrato sólido é caracterizado por uma aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica ou análise de XRD e tal substrato é inserido dentro de um local para o reparo do osso.

[00273] Em outras modalidades, esta invenção provê a vantagem inesperada em termos de maior condrogênese, quando o substrato sólido é caracterizado por aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica ou

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92/138 análise de XRD e tal substrato foi inserido dentro do local de defeito da cartilagem.

[00274] Em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção podem ser aplicados para o uso em um indivíduo com um defeito no osso com necessidade de reparo, em que o acesso ao defeito no osso resulta na criação de um defeito na cartilagem subjacente e os substratos sólidos desta invenção permitem a cura do osso ou dos tecidos do osso e cartilagem afetados.

[00275] Em outras modalidades, tais substratos sólidos podem ser administrados a um indivíduo com um defeito na cartilagem com necessidade de reparo, em que a inserção ideal do substrato sólido para o estímulo de reparo na cartilagem necessita de ancoragem da estrutura artificial no osso subjacente, por exemplo, pela criação de vazio no osso subjacente para a inserção dos substratos sólidos, e uma vez inseridos, o substrato sólido facilita o reparo de ambos a cartilagem subjacente e o osso subjacente.

[00276] Em outras modalidades, tal substrato sólido pode ser admnistrado a um indivíduo com um defeito osteocondral, onde ambos o tecido do osso e da cartilagem estão com necessidade de reparo como parte da patogênese do distúrbio. Os substratos sólidos de acordo com este aspecto são, em algumas modalidades, particularmente adequados para tais aplicações.

[00277] Será apreciado pelos versados na técnica que as aplicações, em particular, quando relacionadas à terapia do osso podem incluir o uso de um substrato sólido que incorpora qualquer elemento adicional, como descrito aqui, incluindo, por exemplo, aloenxerto de osso, autoenxerto de

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93/138 osso, substituto para os ossos, preenchedores de vazio do osso conhecidos, compostos terapêuticos e os similares.

[00278] Em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção podem ser usados ewm conjunto com outros materiais conhecidos e/ou disponíveis para o estímulo/intensificação da célula e/ou crescimento do tecido e/ou função restaurada, por exemplo, pela promoção do reparo no osso e/ou na cartilagem.

[00279] Em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção podem ser utilizados para afixar os substratos sólidos adicionais, por exemplo, para o uso no reparo da articulação ou repair ligamento total ou outro reparo do tecido conectivo.

[00280] Em algumas modalidades, os substratos sólidos desta invenção podem ser usados, por exemplo, como um pino, em conjunto com outras estruturas artificiais para o reparo ou regeneração do osso, etc. Deve-se entender que qualquer uso dos substratos sólidos desta invenção, sozinhos ou em conjunto com outros materiais apropriados, para o tratamento, reparo ou estímulo de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada deve ser considerado como parte desta invenção.

[00281] Apreciar-se-á que os substratos sólidos desta invenção podem ser de qualquer formato ou tamanho adequado para acomodar sua aplicação de acordo com os métodos desta invenção. Por exemplo, e em algumas modalidades, para as aplicações dos substratos sólidos desta invenção dentro de ossos longos de um indivíduo, as dimensões do substrato sólido será dimensionada para se aproximar daquelas do local no qual a estrutura artificial será implantada e

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94/138 podem ser em uma ordem de magnitude em uma escala de milímetros para centímetros, conforme necessário. Similarmente, os formatos dos substratos sólidos da invenção podem ser qualquer formato no qual os substratos sólidos desta invenção podem ser usinados ou processados e podem ter qualquer configuração como será apropriado para obter a aplicação desejada para o crescimento da célula e/ou tecido e função restaurada.

[00282] Em uma modalidade, o coral é moldado na forma do tecido a ser desenvolvido. Por exemplo, o coral pode ser moldado como uma peça de tecido cartilaginoso, tal como um menisco para um joelho ou cotovelo; vértebra, aplicações na espinha, crânio, disco, uma articulação; uma superfície articular de um osso, a caixa torácica, um quadril, uma bacia, um ouvido, um nariz, um ligamento, os tubos bronquiais e os discos intervertebrais.

[00283] Esta invenção provê, em algumas modalidades, substratos sólidos de coralina para o uso no reparo de defeitos do tecido da cartilagem e/ou ósseo associados com trauma físico ou defeitos no tecido da cartilagem ou ósseo associados com uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

[00284] Em uma modalidade, o substrato sólido de coralina é moldado antes do uso em um método de reparo da cartilagem e/ou do osso. Em uma modalidade, os substratos sólidos de coralina são moldados concorrentes com um método de reparo da cartilagem e/ou do osso, por exemplo, os substratos sólidos de coralina podem ser moldados durante a cirurgia quando o local de reparo puder ser melhor observado, otimizando assim o formato dos substratos sólidos de coralina usados.

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95/138 [00285] Em algumas modalidades, múltiplos substratos sólidos de coralina são inseridos para ocupar ao máximo um local de defeito, tal que cada substrato sólido de coralina pode ser inserido em um diferente ângulo e/ou formato e/ou profundidade e/ou porosidade para acomodar a inserção apropriada na região desejada dentro de um local de implantação desejado. Deve-se entender que a referência aos ângulos ou posicionamento pode ser com relação a um ou mais

substratos	sólidos de	coralina inseridos em	um local	de
implantação	part	icular.
[00286]	Em	uma	modalidade, a frase	reparo	na
cartilagem	se	refere	à restauração de um defeito	na
cartilagem	a um	estado	mais saudável. Em uma	modalidade,	a

restauração de cartilagem resulta na regeneração do tecido da cartilagem. Em uma modalidade, a restauração da cartilagem resulta na regeneração de um defeito da cartilagem articular com espessura total ou parcial. Em uma modalidade, a restauração da cartilagem resulta na regeneração completa ou parcial do tecido da cartilagem em um local de reparo na cartilagem. Em uma modalidade, o reparo na cartilagem pode resultar na restauração/reparo de tecido ósseo ausente ou defeituoso, em que o reparo de um defeito na cartilagem necessita da remoção de tecido ósseo em um local de reparo na cartilagem. Em uma modalidade, a restauração da cartilagem resulta na regeneração de defeito osteocondral. Em uma modalidade, o reparo na cartilagem compreende a restauração dos defeitos na cartilagem das articulações (por exemplo, articulações do joelho, cotovelo, quadril, ombro), de orelhas, de um nariz ou de uma traqueia.

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96/138 [00287] Em algumas modalidades, o reparo na cartilagem se refere ao tratamento, prevenção ou melhoria ou anulação dos sintomas de ou melhoria ou anulação da patogênese de osteoartrite e mudanças degenerativas na cartilagem.

[00288] Em uma modalidade, a frase reparo do osso se refere a um defeito no osso até um estado mais saudável. Em uma modalidade, a restauração do osso resulta na regeneração de tecido ósseo. Em uma modalidade, a restauração do osso resulta no preenchimento de qualquer fratura ou vazio dentro de um tecido ósseo. Em uma modalidade, a restauração do osso resulta em regeneração completa ou parcial de tecido ósseo em um local de reparo do osso. Em uma modalidade, o reparo do osso pode resultar na restauração/reparo de tecido ósseo ausente ou defeituoso. Em uma modalidade, o reparo do osso compreende a restauração dos defeitos no osso de qualquer osso, o

tratamento	de edema do	osso e outros	distúrbios do osso,
conforme ne	cessário.
[00289]	Em algumas	modalidades,	a frase reparo do
osso se	refere ao	tratamento de	um indivíduo com

osteoporose, doença de Paget, displasias fibrosas, edema do osso ou osteodistrofias. Em outra modalidade, o indivíduo tem enfermidade no osso e/ou cartilagem. Em outra modalidade, o indivíduo tem outros distúrbios de remodelagem do osso que incluem osteomalacia, raquitismo, artrite reumatoide, acondroplasia, osteocondrite, hiperparatiroidismo, osteogênese imperfeita, hipofosfatasia congênita, lesões fibromatosas, mieloma múltiplo, rotatividade ossea anormal, doença do osso osteolítica,

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97/138 doença periodontal ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, distúrbios de remodelagem de osso incluem doenças ósseas metabólicas que são caracterizadas por perturbações na matriz orgânica, mineralização do osso, remodelagem do osso, fatores endócrinos, nutricionais e outros que regulam a homeostase esquelética e mineral ou uma combinação dos mesmos. Tais distúrbios podem ser heditários ou adquiridos e, em uma modalidade, são sistêmicos e afetam o sistema esquelético inteiro.

[00290] Em algumas modalidades, a frase reparo do osso se refere ao tratamento, prevenção ou melhoria ou anulação dos sintomas de, ou melhoria ou anulação da patogênese de defeitos osteocondrais, cistos ósseos, tumores, necrose avascular e outras doenças ou condições relacionadas.

[00291] Substratos sólidos, kits e métodos da invenção também podem ser usados para intensificar a formação de osso e/ou cartilagem em condições onde um déficit de osso e/ou cartilagem é causado por fatores outros que não os distúrbios de remodelagem de osso. Tais déficits de osso incluem fraturas, trauma do osso, condições associadas à cirurgia do osso pós-traumática, cirurgia articular pósprótese, pós-operatório de cirurgia ortopédica e plástica, quimioterapia do osso, pós-operatório dental e radioterapia do osso. Fraturas incluem todos os tipos de fraturas microscópicas e macroscópicas. Em uma modalidade, alguns exemplos de fraturas incluem fratura por avulsão, fratura cominutiva, fratura transversal, fratura obliqua, fratura espiral, fratura segmental, fratura deslocada, fratura impactada, fratura em galho verde, fratura em toro, fratura

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98/138 por fadiga, fratura intra-articular (fratura epifisária), fratura fechada (fratura simples), fratura aberta (fratura composta) e fratura oculta. Em uma modalidade, fraturas que devem ser tratadas usando os métodos da presente invenção são fraturas de não união.

[00292] Em uma modalidade, métodos desta invenção são utilizados para o reparo induzido ou intensificado de um defeito ou distúrbio ou doença de cartilagem e/ou osso. Em uma modalidade, o defeito na cartilagem resulta de um trauma, um desgaste, uma lesão esportiva, um defeito de cartilagem articular com espessura total, um defeito da articulação ou um dano por esforços repetitivos (por exemplo, fratura osteocondral, dano secundário devido à lesão do ligamento cruzado). Em uma modalidade, o distúrbio de cartilagem compreende uma doença da cartilagem. Em uma modalidade, métodos desta invenção induzem ou intensificam o reparo na cartilagem em osteoartrite, artrite reumatoide, necrose asséptica, osteocondrite dissecante, danos de cartilagem articular, condromalácia patelar, condrossarcoma, condrossarcoma de cabeça e pescoço, costocondrite, encondroma, hallux rigidus, desgaste do labrum do quadril, osteocondrite dissecante, rompimento do menisco, policondrite recidivante, artrite canina, defeito do quarto arco branquial ou orelha de couve-flor. Em uma modalidade, os métodos desta invenção induzem ou intensificam o reparo na cartilagem em distúrbios degenerativos da cartilagem compreendendo distúrbios caracterizados, pelo menos em parte, pela degeneração ou disfunção metabólica de tecidos conjuntivos do corpo, incluindo não apenas as articulações ou estruturas

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99/138 relacionadas, incluindo músculos, bursas (membrana sinovial), tendões, ligamentos e tecido fibroso, mas também a placa epifisária, sistema meniscal e discos intervertebrais.

[00293] Em uma modalidade, os substratos sólidos, kits e métodos da invenção também podem ser usados para aumentar o reparo da fratura em osso longo; generar osso nos defeitos segmentares; prover um substituto para o enxerto de osso para fraturas; facilitar a reconstrução do tumor ou fusão da coluna vertebral; prover um tratamento local (por injeção) para o osso fraco ou osteoporótico, tal como em osteoporose do quadril, vertebras ou pulso ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, os substratos sólidos, kits e métodos da invenção também podem ser usados em um método para acelerar o reparo de ossos longos fraturados; tratar a união retardada ou não união de fraturas de osso longo ou pseudoartrose de dusões da coluna vertebral; induzir a formação de novo osso em necrose avascular do quadril ou joelho ou uma combinação dos mesmos.

[00294] Em uma modalidade, métodos desta invenção são avaliados pelo exame do local de reparo do tecido da cartilagem ou ósseo, em que a avaliação é por técnicas de histologia, histoquímica, palpação, biópsia, endoscopia, artroscopia ou imageamento compreendendo Fotografias de raios-X, densitometria computadorizada de raios-X, densitometria computadorizada por fluorescência, CT, MRI ou outro método conhecido na técnica ou qualquer combinação dos mesmos.

[00295] Em uma modalidade, um método desta invenção

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100/138 compreende induzir e intensificar o reparo na cartilagem e/ou osso em que a implantação de um substrato sólido desta invenção dentro de um local de reparo da cartilagem e/ou do osso influencia e melhora o reparo da cartilagem e/ou do osso.

[00296] Em uma modalidade, um método desta invenção induz ou intensifica o reparo da cartilagem e/ou do osso, em que o substrato sólido atrai uma população de células para o substrato sólido, dessa forma influenciando ou melhorando o reparo da cartilagem e/ou do osso.

[00297] Um clínico versado na técnica reconhecerá que métodos desta invenção, os quais ocasionam a implantação de um substrato sólido de coralina dentro de um local de reparo da cartilagem e/ou do osso, podem requerer a preparação de um local de reparo da cartilagem e/ou do osso. Estas preparações podem ocorrer antes de implantação de um substrato sólido de coralina ou simultaneamente com a implantação. Por exemplo, o tecido da cartilagem ou ósseo e/ou outros tecidos próximos a um local de reparo da cartilagem e/ou do osso podem ser inicialmente perfurados para criar um canal de dimensões apropriadas para um substrato sólido de coralina usado nos métodos desta invenção. A seguir, o substrato sólido de coralina é implantado dentro do local de modo que uma região do substrato sólido de coralina penetre nos tecidos perfurados da cartilagem e/ou osso. Alternativamente, o substrato sólido de coralina pode ser fixado em uma ferramenta capaz de penetrar nos tecidos de cartilagem e/ou osso ou outros ou uma combinação dos mesmos. Neste caso, à medida que a ferramenta penetra através do tecido da cartilagem ou

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101/138 ósseo, o substrato sólido de coralina fixado é simultaneamente implantado.

[00298] Em algumas modalidades, após a implantação do substrato sólido de coralina dentro de um local de reparo ou vários substratos sólidos de coralina dentro do local de reparo, o substrato sólido de coralina é processado para otimizar a incorporação e reparo ideal da cartilagem e/ou do osso. Em algumas modalidades, tal processamento pode compreender o corte, lixamento ou de outra forma alisamento da superfície do substrato sólido de coralina ou substratos sólidos de coralina, para o reparo ideal.

[00299] Em algumas modalidades, os substratos sólidos como aqui definidos serão caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido.

[00300] Em algumas modalidades, os substratos sólidos como aqui definidos serão caracterizados como tendo um valor de ângulo de contato menor do que 60 graus, quando em contato com um fluido.

[00301] Em algumas modalidades, os substratos sólidos como aqui definidos serão caracterizados por uma estrutura tal como aquela evidente nas Figuras 8D-8F, quando avaliada por microscopia eletrônica de varredura. Em algumas modalidades, os substratos sólidos como aqui definidos serão caracterizados por uma estrutura tal como aquela evidente nas Figuras 9D-9F, quando avaliada por microscopia de força atômica.

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102/138 [00302] Em algumas modalidades, quando um substrato sólido é preparado por um processo compreendendo:

o isolamento de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho;

estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75%;

ou em algumas modalidades, quando um substrato sólido é preparado por um processo compreendendo:

o contato do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo com um fluido e o estabelecimento de um ângulo de contato para o dito derivado do esqueleto de organismo; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo caracterizado por um ângulo de contato menor do que 60 graus;

ou em algumas modalidades, tal material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho será caracterizado por uma aspereza da superfície substancial (Ra) como medido pela microscopia eletrônica de varredura

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103/138 ou microscopia de força atômica.

[00303] Em algumas modalidades, a presente invenção provê processos para a conversão de derivados do esqueleto de organismo marinho subotimizados em derivados do esqueleto de organismo marinho provendo o crescimento celular ou de tecido ou função restaurada. Em algumas modalidades, a presente invenção provê processos para otimizar os derivados do esqueleto de organismo marinho provendo o crescimento celular ou de tecido intensificado ou função restaurada. Em algumas modalidades, de acordo com este aspecto, o isolamento e processamento inciais de tais derivados do esqueleto de organismo marinho de modo a estar em uma forma compatível com a implantação dentro do tecido de mamífero, por exemplo, em aplicações humanas e veterinárias, podem dimninuir o valor da capacidade de absorção de fluido específico e os processos de otimização desta invenção facilitar a melhoria de tal valor.

[00304] De acordo com este aspecto e em algumas modalidades, tal isolamento e processamento de derivados do esqueleto de organismo marinho para o uso de acordo com esta invenção inclui a exposição a uma solução de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio. De acordo com este aspecto, é norma padrão tratar as amostras de coral/aragonita com hipoclorito de sódio como parte de um primeiro protocolo de limpeza/processamento [vide, por exemplo, Patente Norte-americana número US5433751].

[00305] Embora vários grupos tenham proposto o uso de materiais com base em coral em aplicações terapêuticas em indivíduos humanos, até o momento não houve indicação de que nem todas as amostras de coral de uma dada espécie

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104/138 provejam um efeito terapêutico.

[00306] Surpreendentemente, verificou-se agora que existe variabilidade nas características físicas do coral, as quais causam impacto em sua aplicação terapêutica e, além disso, que determinadas etapas de processamento padrão causam impacto negativo sobre o potencial terapêutico dos materiais com base em coral.

[00307] Ainda mais surpreendente é a descoberta aqui de que a atividade terapêutica pode ser restaurada e/ou melhorada pela aplicação de determinas etapas de processo, por exemplo, a aplicação seletiva de etanol na amostra como parte das etapas de processamento dos materiais com base em coral desta invenção.

[00308] Em algumas modalidades, esta invenção provê um processo para a conversão de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho ideal em um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

a) o estabelecimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico para um grupo de materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção de fluido espontânea dividido por um valor total de absorção de fluido para cada amostra no dito grupo;

b) seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por um

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105/138 valor da capacidade de absorção de fluido específico;

c) o contato do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho de (b) com um material anfifílico, um solvente polar, um solvente apolar, um material catiônico, um material aniônico, ou uma combinação dos mesmos;

[00309] Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 3%. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 5%. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 4,5%. Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em de pelo menos 3%- 15%.

[00310] De acordo com este aspecto, e em algumas modalidades, tal material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 75% e 95%.

[00311] Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em

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106/138 pelo menos 10-15%. De acordo com este aspecto, e em algumas modalidades, tal material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 45% e

70% .

[00312] Em algumas modalidades, o valor da capacidade de absorção de fluido específico aumentado é aumentado em pelo menos 20-35%. De acordo com este aspecto, e em algumas modalidades, tal material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho é caracterizado por um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 1% e 40%.

[00313] Em algumas modalidades, o material anfifílico é um detergente ou tensoativo. Em algumas modalidades, o material anfifílico é tween ou um copolímero não iônico composto de uma cadeia hidrofóbica central de, por exemplo, polioxipropileno (poli(propileno óxido)) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de, por exemplo, polioxipropileno.

[00314] Em algumas modalidades, o solvente polar é um álcool, tal como etanol, metanol, acetona, isopropanol e outros.

[00315] Em algumas modalidades, o solvente polar a é tolueno, hexano, xileno e outros.

[00316] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de aplicar um método de limpeza secundário aos ditos materiais sólidos com base no derivado do esqueleto de organismo marinho de (b), após ou antes de contatar o substrato com os materiais listados em (c).

[00317] Em algumas modalidades, o método de limpeza

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107/138 secundário inclui a aplicação de pressão, calor, ultrassom, etanol, solvente orgânico, tampão de sal, tal como tampão fosfato, tratamento com vapor ou uma combinação dos mesmos.

[00318] Em algumas modalidades, o método de limpeza secundário inclui o tratamento com um solvente orgânico. Em algumas modalidades, o método de limpeza secundário inclui o tratamento enzimático, tal como, mas não limitado a, uso de papaína, tripsina ou condroitinase ABC. Em algumas modalidades, o método de limpeza secundário inclui ultrassom, aquecimento, secagem por atomização, aplicação de alta pressão, imersão sob alta pressão e os similares.

[00319] Em outra modalidade, a invenção provê um processo para a seleção de um substrato sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo compreendendo:

• o estabelecimento da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho, cuja superfície substancialmente áspera é determinada por microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de força atômica; e • a seleção de um material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho caracterizado por uma determinação da presença de uma superfície substancialmente áspera sobre o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho.

[00320] Em algumas modalidades, de acordo com este

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108/138 aspecto, o processo compreende ainda a etapa de contatar o dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho com um fluido e aplicar pressão negativa ao dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para promover a absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido com base no derivado do esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor total de absorção de fluido.

[00321] Em algumas modalidades, a invenção provê um substrato sólido produzido pelo processo de acordo com qualquer aspecto como descrito aqui.

[00322] Tornar-se-á aparente àqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nos substratos sólidos, kits, processo e métodos da presente invenção sem se afastar so espírito do espírito ou escopo da invenção.

[00323] Em uma modalidade, a presente invenção provê preparações combinadas. Em uma modalidade, o termo uma preparação combinada define especialmente um kit de partes no sentido que os parceiros de combinação como definido acima podem ser usados independentemente ou em diferentes combinações, isto é, simultaneamente, concorrentemente, separadamente ou sequencialmente.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Variabilidade de Propriedades Físicas em Substratos

Sólidos com base em Coralina desta Invenção

Materiais e Métodos [00324] Uma serra de disco de diamante foi usada para remover uma camada de coral externa e grandes seções das

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109/138 quais seções menores representativas de dimensões desejadas foram cortadas do bloco de coral.

[00325] O coral do hidrocoral Porites lutea que tem um tamanho de poro médio de 100-150 pm foi coletado de várias regiões dentro de um coral. O coral foi avaliado visualmente quanto a sua aparência, densidade e porosidade. O coral foi então imerso opcionalmente em 5% de hipoclorito de sódio para a remoção de tecido orgânico externo. De forma breve, o coral foi primeiro expoisto a uma solução de 5% de hipoclorito de sódio por 30 minutos, 3 trocas na faixa de temperatura RT a 50°C e pressão subatmosférica usando pressão de vácuo variando de 0,2-0,00001 Bar (0,020, 000001 MPa) . As seções de coral foram então expostas a 10% de uma solução de peróxido de hidrogênio por 15 minutos em uma faixa de temperatura RT-50°C e pressão subatmosférica usando pressão de vácuo variando de 0,20,00001 Bar. As seções limpas foram então lavadas em água destilada por 30 minutos, 3 trocas em uma faixa de temperatura RT-50°C, e pressão subatmosférica usando pressão de vácuo variando de 0,3-0,00001 Bar (0,03-0,000001 MPa).

[00326] O coral foi opcionalmente esterilizado por exposição à radiação gama em uma resistência de pelo menos 22,5 kGy e pode então ser armazenado assepticamente, no material de acondicionamento e, em particular, as amostras menores foram irradiadas, enquanto os blocos maiores avaliados não foram irradiados.

[00327] Cada seção foi então colocada emu ma placa de petri plástica e 2 ml de fluido foram aplicados a cada placa. Observações referentes à absorção do fluido foram

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110/138 registradas. Os fluidos usados incluíam sangue animal, plasma, água e várias soluções coloridas.

Resultados [00328] Para determinar se a remoção de amostra de várias regiões provê materiais, os quais variam em suas características físicas e se tal variabilidade provê qualidades alternativas ao mesmo, sangue e outros fluidos listados foram aplicados às amostras de coral e a absorção do fluido dentro das amostras de coral foi avaliada.

[00329] A figura 1 descreve os resultados de um estudo de absorção representativo conduzido como descrito. As amostras de coral foram isoladas de diferentes regiões de um bloco de coral e avaliadas quanto ao seu padrão e intensidade de absorção de sangue aplicado às mesmas. Surpreendentemente, parece haver nenhuma uniformidade em termos do perfil de absorção e o mesmo não é um fenômeno tudo ou nada.

[00330] A figura 1A, por exemplo, mostra absorção razoavelmente substancial através da estrutura, enquanto a Figura 1C mostra fraca a nenhuma absorção através da mesma e a Figura 1B provê um fenômeno provisório dentro da estrutura pelo fato de que algumas regiões absorvem substancialmente o fluido e algumas regiões absorvem o mínimo a nenhum fluido. As Figuras 1D-1F mostram fatias transversais através das peças de coral das quais tampões de coral foram cortados e preparados, provendo diferentes padrões de absorção dentro das macroestruturas, da mesma forma.

[00331] Outros fluidos foram avaliados em termos de sua absorção dentro das amostras paralelas comparáveis à

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111/138 amostra na Figura 1C. Para servir como uma macha, uma solução salina e solução de proteína, soluções de carboidrato, soluções iônicas foram preparadas e aplicadas e os resultados espelhados substancialmente naquele do sangue aplicado pelo fato de que fraca a nenhuma absorção ocorreu na amostra da Figura 1C. Água simples aplicada na mesma forneceu substancialm ente o mesmo, resultando em fraca a nenhuma absorção dentro da amostra de coral da Figura 1C.

[00332] As Figuras 1D-1F fornecem imagens de blocos maiores de coral dos quais as amostras das Figuras 1A-1C foram tiradas, respectivamente. Como se pode ver na Figura 1D, a região da qual a amostra de 1A foi tirade mostra boa absorção do fluido aplicado, neste caso, o sangue, enquanto a região da qual a amostra foi tirada na Figura 1C (isto é, o bloco da Figura 1F) mostra mínima absorção e a região da qual a amostra de Figura 1B foi tirada, mostrada na Figura 1E mostra uma absorção intermediária, pelo fato de que algumas regiões mostram boa absorção, enquanto outras regiões mostram mínima absorção.

[00333] Como demonstrado aqui, o tamanho da amostra avaliada não é limitante e de fato as amostras de vários tamanhos e espessuras podem ser assim avaliadas. Além disso, diferenças na tensão da superfície são evidentes (comparar a Figura 1C com a Figura 1A).

Exemplo 2

Estabelecimento de um Protocolo de Triagem para os Substratos Sólidos com base em Coralina [00334] Com base nas descobertas no Exemplo 1, um protocolo de triagem pode ser estabelecido para selecionar

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112/138 um substrato sólido com base em coral otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada. A Figura 2 provê um fluxograma de um processo de protocolo de triagem previsto. As amostras de coral são identificadas, isoladas e usinadas em um tamanho e formato desejados ou avaliadas em blocos. As amostras são então limpas e, opcionalmente, esterilizadas, a seguir secas. A amostra de coral sendo avaliada pode ser seca sob vácuo e/ou aquecida até o fim.

[00335] Um peso seco para cada amostra pode então ser registrado.

[00336] O fluido como descrito aqui é adicionado a cada recipiente de ensaio em uma razão de aproximadamente 1:1 ou levemente mais, isto é, igual a ou levemente mais do que o tamanho da amostra em mm quando comparado ao volume do fluido em ml que é adicionado ao recipiente.

[00337] A amostra pode então ser pesada e um valor de absorção de fluido espontânea é determinado.

[00338] As amostras podem ser, opcionalmente, secas antes de manipulação adicional da amostra.

[00339] Uma quantidade de fluido significativamente aumentada é colocada em contato com a amostra e um vácuo é aplicado por um período de tempo para assegurar a absorção máxima do fluido aplicado na amostra de coral.

[00340] Uma capacidade total de absorção de fluido é avaliada e o valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado dividindo o valor de absorção de fluido espontânea pela capacidade total de absorção de fluido.

[00341] Se o valor exceder o valor de corte de 75%,

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113/138 então a amostra será observada quanto a sua capacidade de adequação como um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada. Quando a amostra é utilizada in vivo em aplicações subsequentes, em alguns aspectos, a amostra é primeiro contatada com fluidos biológicos autólogos ou materiais do hospedeiro antes de implantação na mesma. Se os valores forem menores do que o valor de corte determinado, então a amostra não é usada como um substrato sólido para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada.

Exemplo 3

Incorporação Melhorada de substrato sólido em função de determinadas Propriedades Físicas em Substratos Sólidos com base em Coralina desta Invenção [00342] A fim de avaliar a consequência da variabilidade fenotípica na absorção de sangue nos tampões do Exemplo 1, os tampões de coral foram preparados usando um método de produção padrão incluindo três lavagens com hipoclorito, tratamento com peróxido de hidrogênio e múltiplas lavagens com água destilada dupla. Sua absorção de fluido espontânea e os valores totais de absorção de fluido foram determinados como descrito em Exemplo 2, com água sendo ao fluido de amostra avaliado neste caso. Os implantres de amostra exibindo um valor de absorção de fluido espontânea de mais do que 75% também foram avaliados quanto a sua capacidade de absorção de sangue espontânea.

[00343] Os implantes foram classificados como vermelho, branco e intermediário, com intermediário se referindo a regiões que são vermelhas e regiões que permanecem brancas.

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Os implantes foram colocados em cada joelho de cabra de modo que cada cabra recebesse implantes caracterizados por um valor de absorção de fluido espontânea de mais do que 75% e implantes que foram caracterizados por um valor de absorção de fluido espontânea menor do que 50%. Os animais foram acompanhados por 4 semanas e em seguida sacrificados.

[00344] A formação recente de cartilagem foi avaliada macroscopicamente e histologicamente. A osteointegração e a formação recente ou reabsorção de osso foi avaliada usando raios X, micro-CT e histologia.

[00345] A Figura 3 demonstra a correlação entre a absorção de fluido biológico antes da implantação e a cura do local ao longo do tempo. Os implantes caracterizados por absorção de água e sangue significativa ou mínima absorção dos mesmos dentro do implante foram implantados dentro de um local com defeito e avaliados macroscopicamente em 4 semanas após a implantação. O tecido consistente com a aparência de hialina da cartilagem cobriu substancialmente o implante em amostras com absorção de fluido significativa, enquanto as amostras que foram caracterizadas por absorção de fluido mínima/diminuída apresentaram uma cápsula mais fibrosa cobrindo a implantação do implante (Figura 3A versus 3D, respectivamente). A análise de raios X e micro-CT dos respectivos implantes caracterizados por absorção de fluido mínima/diminuída [Figuras 3B e 3C] versus aqueles caracterizados por significativa absorção de fluido [Figuras 3E e 3F] demonstrou que os implantes caracterizados por significativa absorção de fluido parecem estar apropriadamente integrados sewntro do local de

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115/138 implantação com nenhuma reação colateral significativa. Os implantes caracterizados por absorção de fluido mínima/diminuída parecem induzir a reabsorção, lise e afrouxamento ósseo do implante.

Exemplo 4

Pré-triagem de Substratos Sólidos com base em Coralina para a Implantação [00346] Para aplicações na promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, substratos sólidos são avaliados quanto a sua capacidade de absorver fluido, tal como, por exemplo, água. Os substratos que fornecem um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% são então implantados no local do tecido desejado. Por exemplo, e representando uma modalidade, tal substrato sólido pode ser implantado dentro da cartilagem e osso vizinho para aplicações no reparo ou regeneração em defeitos osteocondrais ou doença.

[00347] Os substratos sólidos podem ser preparados de acordo com qualquer modalidade como descrito aqui, como será apreciado pelo versado na técnica.

[00348] Os substratos são previstos para o uso em aplicações veterinárias, assim como no tratamento de indivíduos humanos. Em intervalos apropriados, a metodologia padrão é empregada para avaliar a boa incorporação dos substratos e a cura do tecido afetado, por exemplo, raios X, imageamento de CT ou MRI pode ser realizada para verificar a posição dos implantes.

[00349]	A	implantação	pode	ser	em	qualquer local
adequado,	por	exemplo, para o	reparo	da	articulação do
joelho, a	implantação pode	ser	dentro	do	Côndilo Femoral

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Medial (MFC), Côndilo Femoral Lateral (LFC), Patela, Sulco Troclear (TG) e a Tíbia.

[00350] Nas aplicações relacionadas à promoção do crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, observa-se que os substratos sólidos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% superarão significativamente os substratos sólidos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico menor do que 40%, em termos de sua capacidade de promover crescimento celular ou de tecido ou função restaurada no local, promover cura no local da implantação, promover a função do tecido recuperada ou uma combinação dos mesmos.

Exemplo 5

Variabilidade das Propriedades Físicas em Substratos Sólidos com base em Coralina desta Invenção [00351] As superfícies naturais são heterogeneicas devido a sua composição de material variável, aspereza e porosidade da superfície e, assim, demonstram características variáveis de repelência/adesão de água. As medições do ângulo de contato podem caracterizar a umectação de superfícies ásperas, considerando a topografia e a estrutura química da superfície.

[00352] A medição do ângulo de contato foi com goniometria. O ângulo de contato é um ângulo de contato de equilíbrio medido macroscopicamente sobre uma superfície sólida. O mesmo deve ser distinguido dos ângulos de contatos de Young, medidos em superfícies atomicamente lisas, quimicamente homogêneas.

[00353] As regiões foram classificadas em três classes

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117/138 e suas áreas de superfície relativas foram aproximadamente como uma percentagem fora da área de superfície total:

[00354] As regiões caracterizadas por ângulos de contatos dentre 0 e 60 graus aparecem como regiões brancas nas figuras providas. As regiões caracterizadas por um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus são marcadas de azul nas figuras providas e as regiões caracterizadas por um ângulo de contato de 90 graus e maior são marcadas de vermelho nas figuras providas.

[00355] As gotas de água de 1pl -10pl de volume foram depositadas em amostras de coral limpas e secas, com uma seringa de microdosagem precisa. Os ângulos de contatos foram medidos com um goniômetro Rame-Hart (Modelo 500) com uma precisão de 0,1 grau (Bormashenko, 2012) . As medições foram avaliadas quanto a ambos os lados da gota e medidas. O meio de teste empregado foi solução salina fisiológica.

[00356] Três amostras de coral 3x3mm denominadas R43, R34 e R44 foram avaliadas. Antes da avaliação dos ângulos de contato, o valor da capacidade de absorção de fluido específico foi avaliada quanto às amostras de cada bloco e os resultados são apresentados na Tabela 1.

Coral	Espécime (nome)	Valor da capacidade de absorção de fluido específico
43	1	0, 62
2	0,46
3	0, 60
4	0,31
Por1	0, 17

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	Por2	0, 17
Por3	0,37
44	1	0,32
2	0, 82
3	0, 88
34	1	0,70
2	0,39
3	0,33

[00357] A Figura 4 provê fotografias de espécimes de amostra de coral R43 avaliados quanto a seus ângulos de contato. As Figuras 4A e 4B mostram regiões cortadas do bloco maior, que foram avaliadas quanto à caracterização do seu ângulo de contato. A maioria das regiões do bloco avaliadas nas figuras 4A e 4B forneceu um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas nas Figuras 4C e 4D forneceram um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus (Figura 4C) e acima de 90 graus (Figura 4D).

[00358] A Figura 5 provê fotografias de espécimes de amostra de coral R34 avaliados quanto a seus ângulos de contato. A Figura 5A mostra regiões cortadas do bloco maior, que foram avaliadas quanto à caracterização do seu ângulo de contato. A maioria das regiões do bloco avaliadas na figura 5B and 5 forneceu um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas nas Figuras 5B e 4C forneceram um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus e acima de 90 graus (regiões azuis versus vermelhas, respectivamente). A Figura 6 provê similarmente fotografias de espécimes de amostra de coral R44 avaliados quanto a seus ângulos de contato. A Figura 6A mostra

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119/138 regiões cortadas do bloco maior, que foram avaliadas quanto à caracterização do seu ângulo de contato. A maioria das regiões do bloco avaliadas na figura 6B forneceu um ângulo de contato principalmente menor do que 60 graus. Determinadas áreas na Figura 6B forneceram um ângulo de contato dentre 60 e 90 graus e acima de 90 graus (regiões azuis versus vermelhas, respectivamente) .

[00359] As medições do ângulo de contato ficam em paralelo com os valores da capacidade de absorção de fluido específicos obtidos para as respectivas amostras de coral. Consequentemente, os substratos sólidos melhorados para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada desta função podem ser caracterizados por uma determinação de um ângulo de contato ou um valor da capacidade de absorção de fluido específico.

[00360] Além disso, os estudos ambientais de microscopia eletrônica de varredura (ESEM) confirmaram os resultados dos estudos do ângulo de contato apresentados aqui.

[00361] A Tabela 2 apresenta os valores da capacidade de absorção de fluido específicos para as amostras de coral avaliadas por ESEM.

Coral	Espécime (nome)	Valor da capacidade de absorção de fluido específico
R27	7	0, 87
R30	40	0, 04
R43	1	0, 62

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120/138 [00362] A Figura 7 apresenta os resultados da análise de ESEM realizada nas amostras descritas na tabela 2. As amostras avaliadas do bloco R27-7 proveu um valor de ângulo de queda zero e nenhuma formação de queda foi observada (Figura 7A) . A Figura 7B-7C apresenta os resultados da amostra R30-40. A Figura 7B foi capturada após a aplicação do fluido, e observou-se que a amostra não conseguiu molhar quando a água foi aplicada. A Figura 7C mostra que após a redessecação, gotículas de água estavam evidentes na superfície, consistentes com um fenótipo de fraca umectação da superfície.

[00363] As Figuras 7D-7E apresentam os resultados para a amostra R43-1, com resultados consistentes com aqueles vistos para amostra R30-40.

[00364] Tomados juntos, esses resultados são corroborativos dos dados de ângulo de contato, bem como dos valores da capacidade de absorção de fluido específicos obtidos para as respectivas amostras de coral. A amostra tendo valores da capacidade de absorção de fluido específicos obtidos para as respectivas amostras de coral de mais que 7 5% não exibiu nenhuma formação de queda na superfície, consistente com um fenótipo de boa umectação (Figura 7A), enquanto que as amostras com um valor da capacidade de absorção de fluido específico inferior exibiram formação de gotícula durante a dessecação.

Exemplo 6

Características Físicas de Substratos Sólidos com base em Coralina melhorada desta Invenção [00365] Amostras de coral foram processadas como descrito no Exemplo 1, acima. As amostras foram então

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121/138

submetidas	à	microscopia	eletrônica	de	varredura	e
microscopia	de	força atômica	ambientais	, de	acordo com	os
métodos padrão.
[00366]	A	Figura 8A-C	demonstra	a	estrutura	de
superfície	de	um substrato sólido	com	um valor	da

capacidade de absorção de fluido específico mínimo, como comparado aquele de substratos com um valor da capacidade de absorção de fluido específico substancial (comparar Figuras 8A-C e 8D-F). Substratos com um valor da capacidade de absorção de fluido específico inferior exibiram uma estrutura de superfície externa mais suave, em comparação com aqueles com um valor da capacidade de absorção de fluido específico superior, enquanto a estrutura cristalina da última amostra foi facilmente vista.

[00367] Além disso, a microscopia de força atômica demonstrou que os substratos com um valor da capacidade de absorção de fluido específico inferior foram caracterizados por uma superfície externa mais suave (Figura 9A - 9C) . Em contraste marcado, os substratos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico superior, exibiram uma superfície mais áspera (Figura 9D9F).

[00368] Tomados juntos, esses resultados são corroborativos do fato de que a caracterização da estrutura da superfície se correlaciona com os valores da capacidade de absorção de fluido específicos obtidos para as respectivas amostras de coral. A amostra tendo valores da capacidade de absorção de fluido específicos obtidos para as respectivas amostras de coral de mais que 75%, exibiu uma superfície mais áspera, enquanto que as amostras com um

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122/138 valor da capacidade de absorção de fluido específico inferior exibiram uma superfície mais suave.

Exemplo 7

Desenvolvimento de um Processo Para a Conversão de um Grupo Subideal de Substratos Sólidos com base no Derivado do Esqueleto de Organismo Marinho em Substratos Sólidos com base em Derivado do Esqueleto de Organismo Marinho Otimizado

Materiais E Métodos [00369] Amostras de coral do hidrocoral Porites lutea foram isoladas como descrito no Exemplo 1 e tampões foram preparados.

[00370] Os tampões foram então pesados, estabelecendo um peso seco por amostra. Os tampões foram expostos a 2 ml de água duplamente destilada por 5 minutos, em seguida, pesados, provendo um valor de absorção espontânea. Os tampões foram então expostos a um excesso de água duplamente destilada por 30 minutos sob vácuo e, em seguida, pesados para determinar o valor total de absorção de fluido para cada tampão. O valor da capacidade de absorção de fluido específico foi então determinado dividindo os valores de absorção de fluido espontâneos pelos valores totais de absorção de fluido obtidos.

[00371] Cada seção foi, opcionalmente, colocada em uma placa petri de plástico e 2 ml de fluido foram aplicados a cada placa, tal como sangue, e o respectivo fenótipo de absorção de fluido foi preservado em amostras que renderam um valor da capacidade de absorção de fluido particular específico.

[00372] As amostras mostraram rendimento de absorção

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123/138 pobre e tiveram um valor da capacidade de absorção de fluido específico menor do que 40%, as amostras mostraram rendimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico geral intermediário dentre 41% e 74% e as amostras que mostraram rendimento de um valor da capacidade de absorção de fluido específico dentre 75% e 99% entraram em contato então com materiais de teste. Em alguns aspectos, as condições de teste incluíram a aplicação de 5 ml de 0,5% de Tween 80.

[00373] Em alguns aspectos, as condições de teste incluíram sonicação por 15 minutos; aplicação de etanol absoluto; aplicação de 5 ml de plurônico com ou sem aplicação prévia de tween 80. Em alguns aspectos, as condições de teste incluíram a aplicação de 5 ml de Azul metileno em 0,03% de ácido acético ou 0,05% de solução de hialurônico 3M em DDW.

[00374] Seguindo tais tratamentos, as amostras entraram em contato de novo com um fluido como descrito, tal como água, e um valor da capacidade de absorção de fluido específico foi avaliado novamente para cada amostra. A absorção de um fluido dentro do tampão, tais como absorção de sangue, foi verificada macroscopicamente, também.

[00375] As amostras provendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de mais que 50% foram avaliadas da mesma forma e, comparadas com aquelas com um valor menor do que 50%.

Resultados [00376] O Exemplo 2 demonstrou que, os substratos sólidos caracterizados por um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% proveram um

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124/138 crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, e em um determinado bloco isolado de um derivado do esqueleto de organismo marinho, há viabilidade quanto ao número de tampões que pode ser isolado, exibindo o valor da capacidade de absorção de fluido específico desejado. Foi, portanto, de interesse determinar quando as amostras caracterizadas por um valor da capacidade de absorção de fluido específico menor do que 40%, ou dentre 41% e 74%, ou dentre 75% e 99% poderia ser aumentada, melhorando cada capacidade dos substratos em prover crescimento celular ou de tecido ou função restaurada.

[00377] A fim de determinar se seria possível isolar as amostras de tais derivados de esqueleto caracterizados pelas faixas indicadas para cada valor da capacidade de absorção de fluido específico, respectivamente, e para tratar a amostra para, assim, melhorar o valor da capacidade de absorção de fluido específico para ser maior do que o anteriormente obtido, foi realizada uma série de manipulações da amostra.

[00378] O Tween 80 é um tensoativo não iônico e emulsificante derivado de sorbitano polietoxilado e ácido oleico. O Tween 80 foi, portanto, avaliado por sua capacidade de alterar o valor da capacidade de absorção de fluido específico das amostras de coral testadas. A Figura 10 provê os resultados, de uma série de amostras avaliadas. Essencialmente, cada amostra avaliada, tratamento de tween aumentou o valor da capacidade de (SFUC) absorção de fluido específico (SFUC). Algumas amostras exibindo valores de SFUC inferiores foram significativamente intensificadas. As amostras 31-10, 35-5 e outras, exibiram um valor de SFUC

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125/138 inicial menor do que cerca de 30% e mostrou um aumento marcante na SFUC após o tratamento de tween 80, a valores tão elevados quanto 60% e até mais que 80%. Quando sangue foi aplicado às amostras, ocorreu absorção rápida, em nítido contraste à absorção pobre anterior (Figura 10) . Desde o tratamento dos tampões com um composto anfifílico provido para SFUC aumentada em todas as amostras avaliadas, foi de interesse determinar quando outras manipulações melhorariam este fenômeno.

[00379] Para este fim, as amostras as quais o Tween 80 foi aplicado, foram então submetidas à sonicação, também. A Figura 11 demonstra os resultados de tal processo. Como pode ser visto nas figuras, na maioria das amostras, a SFUC obtida com o tratamento e sonicação de tween 80 melhorou o valor de SFUC subsequente. As amostras 30-37, 37-14 e outras, exibiram um aumento na SFUC para mais que o dobro do valor inicial. Em uma série de amostras, o tratamento por sonicação e tween 80 resultou em valores de SFUC de mais de 85%.

[00380] A fim de determinar se outros compostos anfifílicos poderiam prover os mesmos resultados como vistos com tween em termos de aumento no valor de SFUC, plurônico (copolímeros tri-bloco não iônicos compostos de uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido poli(propileno)) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxipropileno) foi aplicado às amostras, em vez de tween, de acordo com os métodos descritos acima. Como pode ser visto na Figura 12, o tratamento com plurônico aumentou SFUC em essencialmente cada amostra testada (comparar barras cinza claro com barras cinza escuro na Figura 12).

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Na maioria dos casos, aplicar tanto plurônico como tween 80 às amostras que aumentaram mais o valor de SFUC obtido.

[00381] A fim de determinar quando os solventes polares proveriam os mesmos resultados, como os vistos com tween em termos de aumento do valor de SFUC, etanol absoluto foi aplicado às amostras. A Figura 13 demonstra que, como foi visto com tween e plurônico, quando o etanol foi aplicado a um grande número de amostras avaliadas, mostrou um aumento na SFUC, embora neste caso, o aumento tenha sido menos substancial quando as amostras com uma SFUC inicial de mais de 70% foram avaliadas.

[00382] A fim de determinar quando os compostos catiônicos proveriam os mesmos resultados que os vistos com tween em termos de aumento no valor de SFUC, as amostras foram expostas a azul metileno, similarmente as descritas para Tween 80 na seção de métodos acima. Como pode ser visto na Figura 14, com efeito, a aplicação de azul metileno às amostras paralelas ao fenômeno observado com etanol, ligeiramente, de modo que aumentos maiores fossem observados com amostras tendo um valor de SFUC menor do que 30%.

[00383] A fim de determinar quando os compostos aniônicos proveriam os mesmos resultados que os vistos com tween em termos de aumento no valor de SFUC, as amostras foram expostas a ácido hialurônico, similarmente as descritas para Tween 80 na seção de métodos acima. Como pode ser visto na Figura 15, com efeito, a aplicação de ácido hialurônico às amostras aumentou os valores de SFUC na maioria das amostras avaliadas, no entanto, tais aumentos foram mais modestos do que aquele avaliado por

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Tween 80.

[00384] Similarmente, como pode ser visto na Figura 16, quando sulfato de condroitina foi usado, um aumento na SFUC foi evidente em cada amostra.

[00385] Para promover os resultados relatados acima, uma série de implantes exibindo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% (n=42) de 3 lâminas de coral diferentes (R-76, R-77, R-78) foi submetida a um processo de purificação, como segue: as amostras foram imersas em uma solução de 5% de NaOCl (P/P) a uma razão de 1:20 (volume de tampão: NaOCl) por 30 minutos sob uma pressão negativa aplicada de pelo menos 0,03 bar (0,003 MPa), depois disso o líquido foi decantado e as amostras foram expostas à pressão negativa aplicada de pelo menos 0,03 bar (0,003 MPa) por 30 minutos adicionais. As amostras foram, então, imersas em uma solução de 10% de H2O2 (P/P) a uma razão de 1:20 (volume de tampão: H2O2) sob uma pressão negativa aplicada de pelo menos 0,03 bar (0,003 MPa) por 15 minutos, depois disso o líquido foi decantado e as amostras foram expostas à pressão negativa aplicada de pelo menos 0,03 bar (0,003 MPa) por 30 minutos adicionais. As amostras foram lavadas repetidamente em água, depois de serem imersas em água estéril a uma razão de 1:20 (volume de tampão: H2O) e em seguida exposta à pressão negativa aplicada de pelo menos 0,03 bar (0,003 MPa) por 30 minutos adicionais. A etapa de lavagem foi repetida pelo menos três vezes. As amostras foram então secas sob uma pressão a vácuo de 0,03 bar por pelo menos 4 a 6 horas. O valor da capacidade de absorção de fluido específico foi então apurado para amostras representativas.

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128/138 [00386] As amostras foram então imersas em etanol absoluto a uma razão de 1:10 (volume de tampão: etanol) sob condições de vácuo de pelo menos 0,03 bar (0, 003 MPa) por 30 minutos, seguida de decantação da solução, e lavagem em água estéril como descrito no parágrafo anterior. O valor da capacidade de absorção de fluido específico (SWC) foi então apurado para amostras representativas e os resultados estão providos na Figura 17, mostrando os valores de SWC médios das amostras indicadas. Como é evidente da figura, o valor de SWC melhorou de uma maneira estatisticamente significativa quando o protocolo de limpeza básico foi seguido por uma etapa de extração com um solvente polar, neste caso, etanol.

[00387] As Figuras 18-19 mostram os valores de SWC médios obtidos por uma série de amostras, antes e depois de uma etapa de extração de etanol aplicada após a etapa de isolamento/processamento básico. Como é evidente da miríade das amostras avaliadas, inesperadamente, o valor da capacidade de absorção de fluido específico é aumentado após a etapa de isolamento/processamento básico, quando uma etapa de extração é executada usando um solvente polar, tal como etanol.

Exemplo 8

Processo Automatizado e Aparelho para Isolamento e Preparação de Substratos Sólidos com base no Derivado de Esqueleto de Organismo Marinho Otimizado [00388] Amostras de coral do hidrocoral Porites lutea foram isoladas como descrito no Exemplo 1 e implantes foram preparados. Os implantes de 20-10 foram colocados no cassete de conservação 20-20, e o revestimento 20-70 foi

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129/138 colocado no dispositivo. Pressão negativa é aplicada por meio de vácuo 20-30 por um período de tempo prescrito, até que os implantes estejam totalmente secos e, em seguida, a aplicação é interrompida. Em seguida, o aparelho pesa individualmente cada implante para estabelecer um peso seco. Um ciclo automático é iniciado, que facilita o enchimento e um nível de fluido desejado é mantido durante o processo. Os cassetes 20-20 são individualmente levantados e abaixados em um primeiro nível de fluido, por meio do manipulador de cassete 20-40 dentro do fluido para permitir a absorção de fluido espontânea, e o manipulador de implante 20-60 orienta/move individualmente os implantes individuais para determinação do peso, para determinar o valor de absorção de fluido espontânea seguido opcionalmente de uma passagem de cada implante por uma estação de secagem/transferência. Os implantes individuais são todos pesados e retornados ao seu lugar dentro dos cassetes. Os cassetes 20-20 são novamente levantados e abaixados individualmente em um segundo, o nível significativamente mais elevado de fluido, por meio do cassete manipulador 20-40 dentro do excesso de fluido para facilitar a imersão total dos implantes e a pressão negativa é aplicado novamente pelo vácuo 20-30 por um período de tempo definido, garantindo a máxima absorção de fluido dentro de cada implante. O manipulador de implante 20-60 move/orienta de novo individualmente os implantes individuais para uma segunda determinação de peso, que provê o valor total de absorção de fluido. A unidade de processamento de dados do aparelho determina e provê uma saída do valor de absorção de fluido específico,

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130/138 opcionalmente de forma específica identificando quais amostras devem ser selecionadas com base nos critérios indicados.

[00389] Entender-se-á que as dimensões do cassete serão interpretadas para acomodar implantes de tamanhos variados. O aparelho pode ser construído para dimensionar, bem como, acomodar um número maior ou menor de cassetes, e os materiais serão adequados para os vários fluidos a serem avaliados por sua absorção dentro dos implantes definidos. Sensores e relés apropriados são incorporados para, por exemplo, prover um sistema de alerta em caso de malfunção e o aparelho pode compreender ainda uma unidade de processamento de dados, para calcular o valor da capacidade de absorção de fluido específico do valor total e espontâneo de absorção de fluidos determinado obtido. A análise estatística também pode ser incluída como parte do pacote de processamento de dados provido, opcionalmente, com os aparelhos reivindicados desta invenção.

Exemplo 9

Célula de Adesão Melhorada e Viabilidade com Substratos Sólidos com base em Derivado do Esqueleto de Organismo Marinho Otimizado

Materiais E Métodos [00390] As células Humanas Embrionárias Palatais Mesênquimas (HEPM) foram cultivadas em meio de crescimento apropriado.

[00391] Implantes de coral otimizados (tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de mais de 75%) e não otimizados (tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico menor do que 60%) de cada

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131/138 coral, foram semeados com células HEPM a uma densidade de 1,65x104 e 0,8x10⁴ células/10 pl, respectivamente, incubando as células com a estrutura artificial por 15 min a 37 °C, seguido de adição de mais meio e incubação adicional por até 7 dias. O crescimento médio foi substituído a cada 2 dias.

[00392] As células contendo estruturas artificiais foram fixadas em 4% de formaldeído, lavadas e secas por meio de soluções gradientes de etanol, e soluções gradientes de HMDS e, em seguida, avaliadas por SEM.

[00393]	A	fixação e	morfologia da célula	foram
observadas	por	SEM no dia	1,3 e 7 pós-semeadura,	após a
fixação.
[00394]	A	viabilidade	da célula foi avaliada	com um

ensaio metabólico alamarBlue®, seguindo o protocolo do fabricante. As amostras foram tiradas no dia 1 e 7 póssemeadura. A fluorescência foi avaliada a 544 nm e 590 nm (excitação e emissão, respectivamente) usando um ascensor Fluoreskan, um leitor de fluorescência de microplato (Labotal), dados em triplica.

[00395] Um meio contendo F fresh 200 l alamarBlue® (1: 10 respectivamente) foi adicionado para cada estrutura artificial e incubado por mais 18 horas (total de 24 horas).

Resultados [00396] A fixação da célula foi observada antes de 1 dia pós-semeadura em todas as amostras avaliadas, quando otimizadas (opt), ou seja, tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de mais de 75%, e não otimizadas (nonopt), ou seja, tendo um valor da capacidade

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132/138 de absorção de fluido específico menor do que 60%, como avaliado pela análise de SEM.

[00397] As amostras não otimizadas, tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 26% mostraram que as células aderiram ao coral, com extensões de célula visíveis (pods) localizadas proximamente à superfície do coral (Figura 21A) . Embora, as extensões celulares fazem contato com o substrato de coral, a maior parte do corpo da célula parece não fazer contato prontamente. A Figura 21B apresenta uma maior ampliação da área armazenada na Figura 21A, mostrando o contato das extensões celulares terminais com o coral, mas a célula não está achatada ou em pleno contato sobre todo seu corpo com o coral.

[00398] No contraste marcante, as amostras otimizadas, tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 95% mostrou que as células aderiram bem ao coral, incluindo o espalhamento de todo corpo da célula sobre o coral (Figura 21C).

[00399] As células HEPM semeadas em amostras de coral non-opt e opt foram avaliadas por ensaio alamarBlue®, que quantifica a proliferação de várias linhas celulares humanas e animais. No dia 1 pós-semeadura, os valores estão normalizados aos obtidos por culturas de células semeadas em um poço de poliestireno sozinho. 100% é determinado como o valor de viabilidade da célula no poço de poliestireno no dia 1 (Figura 22A). A Figura 22B representa a viabilidade da célula HEPM nos vários corais 7 dias pós-semeadura. Em cada coral, os valores do dia 7 foram divididos pelos valores do dia 1, para que o aumento de dobra na

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133/138 viabilidade da célula seja mostrado. Como é prontamente apreciado, as amostras otimizadas renderam um valor de viabilidade de célula significativamente aumentado comparado às amostras não otimizadas. A viabilidade da célula HEPM aumentou com uma média de 42 vezes mais no dia 7 comparada ao dia 1, enquanto que os aumentos no coral SWC R29 baixo e o grupo de controle foi de apenas 13 e 7 vezes, respectivamente.

[00400] Tomados juntos, os ensaios de viabilidade de célula e adesão de célula demonstraram que as amostras consideradas otimizadas para absorção de fluido promovem maior viabilidade e aderência de célula total ao longo do tempo.

Exemplo 10

Associação de Forma Cristalina com o Isolamento e

Processamento	de Implantes	para	Render	Substratos	Sólidos
com base no	Derivado do	Esqueleto de	Organismo	Marinho
Otimizado
Materiais	E Métodos
[00401]	As amostras	de	coral	foram isoladas e

preparadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. As amostras foram manchadas de acordo com o protocolo como descrito em [Chemical staining methods used in the identification of carbonate minerals, Tamer AYAN, Mineral Research e Exploration Institute de Turkey http://www.mta. gov.tr/v2.0/eng/dergi... pdf/65/11.pdf] . Em suma, a solução de Feigl é preparada de acordo com os métodos padrão. As amostras de coral são então manchadas com a solução de Feigl, e as amostras avaliadas previamente quanto ao seu valor da capacidade de absorção de fluido

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134/138 específico também são manchadas. Neste caso, 2 amostras como avaliadas no Exemplo 9, uma Amostra R91, tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 95%, e uma Amostra R48, tendo um valor da capacidade de absorção de fluido específico de 42% foram avaliadas.

Resultados [00402] Os corais são compostos principalmente de carbonato de cálcio (~ 98%) . O carbonato de cálcio pode estar em diferentes formas cristalinas, tais como aragonita e calcita. Os pólipos de coral podem secretar um esqueleto de aragonita sob sua ectoderme basal, formando um complexo exoesqueleto, o que representa um arquivo em camadas cronológico. Em algumas regiões, a estrutura de aragonita dissolve e calcita ou micrite é formada, normalmente em um estágio posterior, por um processo conhecido como diagênese.

[00403] Foi mostrado que mais precipitados de calcita são encontrados em corais antigos (época Miocena) comparados aos corais modernos. A Figura 23-A mostra um coral Mioceno manchado com a solução de Feigl, onde a região preta representa a estrutura cristalina de aragonita. A Figura 23-B mostra um coral manchado por coloração de Feigl, quando nenhuma aragonita estava presente na amostra, já que nenhuma cor preta é observada [ambas as figuras foram capturadas da Diagênese de bandas de crescimento em corais de Scleractinia fóssil:

identification and modes of preservation, Reuter et al. Facies (2005), 51 : 146-159, cuja referência está totalmente incorporada aqui na íntegra].

[00404] A solução de Feigl manchas a aragonita de

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135/138 preto. Quando as amostras de coral são vistas macroscopicamente, na ausência de aragonita em uma determinada amostra, a amostra aparecerá na cor branca ou cinza.

[00405] Portanto, era de interesse determinar quando a estrutura de cristal estava correlacionada com o valor da capacidade de absorção de fluido específico e quando os processos de otimização neste documento foram impactados quanto o protocolo de coloração de Feigl. Para este fim, as amostras de coral R91 e R48 foram avaliadas por seu valor da capacidade de absorção de fluido específico, incluindo uma primeira avaliação macroscópica de absorção de sangue de cabra, e submetida a outro processamento, incluindo uma etapa de extração de etanol como descrita no Exemplo 7.

[00406] A Figura 23 apresenta os resultados de análise de amostras essencialmente idênticas tiradas de R91 e R48, tanto antes de e após uma etapa de purificação adicional de etanol. Enquanto o padrão bruto da coloração de Feigl se aproximou do da absorção de sangue em cada respectiva amostra (compare a Figura 23C com a Figura 23D e Figura 23E com a Figura 23F), os padrões de coloração não são idênticos. Além disso, como é mais prontamente observado ao comparar as amostras de R48 antes e depois do tratamento de etanol, foi observado um aumento na absorção de sangue e coloração positiva de Feigl, indicando maior otimização das amostras, quando submetidas a uma etapa adicional de processamento descrita.

[00407] Tomadas juntas, parece que as amostras que enriqueceram de aragonita em comparação com as não aragonitas são mais prontamente associadas com um valor da

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136/138 capacidade de absorção de fluido específico maior, absorção de sangue espontânea e mancha preta usando a solução de Feigl, que podem ser melhoradas pelas etapas de processamento adicionais específicas, como descrito aqui.

[00408] Ficará entendido por aqueles versados na técnica que, várias alterações na forma e detalhes podem ser realizadas sem se distanciar do espírito e escopo da invenção como estabelecido nas reivindicações em anexo. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de apurar usando não mais que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas neste documento. Tais equivalentes se destinam a estar abrangidos no escopo das reivindicações.

[00409] Em algumas modalidades, o termo compreende ou formas gramaticais do mesmo se referem à inclusão dos componentes indicados desta invenção, bem como a inclusão de outros agentes ativos e veículos, excipientes, emolientes, estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis etc. como são conhecidos na indústria farmacêutica.

[00410] Em uma modalidade desta invenção, cerca de se refere a uma qualidade, em que os meios de satisfazer uma necessidade específica são conhecidos, por exemplo, o tamanho pode ser grande, mas não total que não especificado, mas ele atende a necessidade específica de reparação de cartilagem em um local de reparação de cartilagem. Em uma modalidade, cerca de se refere a estar próximo ou aproximado de, mas não exatamente. Uma pequena margem de erro está presente. Esta margem de erro não pode exceder mais ou menos o mesmo valor inteiro. Por exemplo, cerca de 0,1 micrômetro pode significar não menos que 0,

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137/138 mas não mais que 0,2. Em algumas modalidades, o termo “cerca de” com relação a um valor de referência abrange um desvio da quantidade por não mais que 5%, não mais que 10% ou não mais que 20%, seja acima ou abaixo do valor indicado. Em uma modalidade, o termo “cerca de” se refere a uma variância de 1-10%, ou em outra modalidade, 5-15%, ou em outra modalidade, até 10%, ou em outra modalidade, até 25% de variância dos valores indicados, exceto quando o contexto indicar que a variância não deve resultar em um valor que ultrapasse 100%.

[00411] Nas reivindicações os artigos, tais como “um, “uma” e “o/a, significam um ou mais de um a menos indicado o contrário ou de outro modo evidente do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem “ou” ou “e/ou” entre membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregados ou do contrário relevantes a um determinado produto ou processo, a menos que indicado do contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades, nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado, ou de outro modo relevante para um determinado produto ou processo. A invenção também inclui modalidades, nas quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou do contrário relevante para um determinado produto ou processo. Além disso, deve-se entender que a invenção provê, em várias modalidades, todas as variações, combinações e permutações, nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos etc. de uma ou mais das reivindicações listadas estejam

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138/138 inseridos em outra reivindicação dependente, na mesma reivindicação base, a menos que indicado de outra forma ou, a menos que esteja evidente a uma pessoa de habilidade comum na técnica, caso surja uma inconsistência ou contradição. Quando os elementos estão presentes como listas, por exemplo, no formato de grupo de Markush ou similar, deve-se ficar entendido que cada subgrupo dos elementos também está descrito, e qualquer (quaisquer) elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve-se ficar entendido que, em geral, quando a invenção ou aspectos da invenção, estiver/estiverem referido(s) como compreendendo elementos, características particulares etc. determinadas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em, tais elementos, características etc. Para fins de simplicidade, essas modalidades não foram estabelecidas especificamente em cada caso in haec verba, neste documento. Determinadas reivindicações estão apresentadas na forma dependente para fins de conveniência, mas o Requerente se reserva do direito de reescrever qualquer reivindicação dependente no formato independente para incluir os elementos ou limitações da reivindicação independente e qualquer (quaisquer) outra(s) reivindicação(ões) à(s) qual(i)s tal reivindicação depende, e tal reivindicação reescrita deve ser considerada equivalente em todos os aspectos à reivindicação dependente em qualquer forma que estiver (seja emendada ou não) antes de ser reescrita na forma independente.

Claims

1. Processo para a seleção de um substrato sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo caracterizado por compreender:

• isolar ou preparar um material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho, em que o referido material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho é composto de um derivado de coral ou à base de coral; estabelecer um valor da capacidade de absorção de fluido específico do dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade de absorção de fluido específico é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção espontânea de fluido dividido por um valor total de absorção de fluido; ou estabelecer um valor de ângulo de contato; e • selecionar um material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho definido por ter um valor da capacidade de absorção de fluido específico de pelo menos 75% ou definido por ter um valor de ângulo de contato menor do que 6 0 graus, quando em contato com um fluido por de 0,1-60 minutos, permitindo a absorção espontânea de fluido do dito fluido dentro do dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor de absorção espontânea de fluido, cujo fluido é uma solução contendo proteína, sal ou carboidrato, ou um fluido biológico que é água, sangue ou plasma.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,

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2/8 caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho contém partículas moídas derivadas de coral, suspensas em uma matriz biocompatível ou compreende ainda um preenchedor ósseo ou material substituto para o osso.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita matriz biocompatível é um hidrogel.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho pode ser usado como um preenchedor ósseo ou material substituto para osso.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a etapa de colocar em contato o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho com um fluido e aplicar pressão negativa ao dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho para promover absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor total de absorção de fluido.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito valor da capacidade específica de absorção de fluido é uma função da mudança no peso no dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho ou o dito valor da capacidade específica de absorção de fluido é uma função da mudança no volume de fluido de fluido aplicado ao dito material sólido à base de derivado

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3/8 de esqueleto de organismo marinho.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito fluido biológico é autólogo com relação a uma célula ou tecido de um indivíduo quando o dito substrato sólido é colocado em contato com uma célula ou tecido do dito indivíduo.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho compreende um polímero biocompatível.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito polímero biocompatível é incorporado dentro dos vazios ou poros no dito substrato ou o dito polímero biocompatível é fixado a uma superfície externa do dito substrato.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito polímero biocompatível compreende um polímero natural compreendendo um glicosaminoglicano, colágeno, fibrina, elastina, seda, quitosano, alginato e quaisquer combinações dos mesmos.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito glicosaminoglicano é ácido hialurônico, hialuronato de sódio, ácido hialurônico reticulado ou uma combinação dos mesmos.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho compreende ainda uma citocina, um fator de crescimento, um composto terapêutico, um agente osteoindutivo, um vidro

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4/8 bioativo, um preenchedor ósseo, um cimento ósseo, um fármaco ou qualquer combinação dos mesmos, em que o dito composto terapêutico ou fármaco compreende um composto anti-inflamatório, um composto anti-infeccioso, fatores pró-angiogênicos ou uma combinação dos mesmos.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de que o dito substrato sólido provê suporte tridimensional e crescimento de células, tecidos e órgãos em cultura para aplicações no coração, músculo, fígado, pele, rim, tecido conectivo ou tecido neuronal.

14. Processo para a conversão de um substrato sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho subótimo em um substrato sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho otimizado para a promoção de crescimento celular ou de tecido ou função restaurada, o dito processo caracterizado por compreender:

a. estabelecer um valor da capacidade específica de absorção de fluido para um grupo de materiais sólidos à base de derivado de esqueleto de organismo marinho, cujo valor da capacidade específica de absorção de fluido é determinado pelo estabelecimento de um valor de absorção espontânea de fluido dividido por um valor total de absorção de fluido para cada amostra no dito grupo;

b. selecionar um material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho definido por um valor específico da capacidade de absorção de fluido, quando em contato com um fluido por de 0,1-15 minutos, permitindo a absorção espontânea de fluido do dito fluido dentro do dito material sólido à base de derivado de esqueleto de

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5/8 organismo marinho para chegar ao dito valor de absorção espontânea de fluido, cujo fluido é uma solução contendo proteína, sal ou carboidrato, ou um fluido biológico que é água, sangue ou plasma, em que o referido material sólido à base de derivado do esqueleto de organismo marinho é composto de um derivado de coral ou à base de coral;

c. colocar em contato dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho de (b) com um material anfifílico, um solvente polar, um material catiônico, um material aniônico ou uma combinação dos mesmos;

d. determinar uma capacidade específica de absorção de fluido como em (a) nos ditos materiais sólidos à base de derivado de esqueleto de organismo marinho obtidos em (c); e

e. selecionar materiais sólidos à base de derivado de esqueleto de organismo marinho obtidos em (d) tendo um valor da capacidade específica de absorção de fluido

aumentado recém-estabelecido, em que o dito valor da capacidade específica de absorção de fluido aumentado é aumentado em pelo menos 5%, e em que o material sólido à base de derivado de

esqueleto de organismo marinho selecionado é definido por um valor da capacidade específica de absorção de fluido dentre 75% e até e incluindo 100%.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito valor da capacidade específica de absorção de fluido aumentado é aumentado em pelo menos 15%.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 14,

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6/8 caracterizado pelo fato de que o dito substrato sólido é composto de aragonita, calcita, hidróxiapatita ou uma combinação dos mesmos.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito material anfifílico, um solvente polar, um material catiônico ou um material aniônico é tween, plurônico, etanol, azul metileno, ácido hialurônico, sulfato de condroitina ou uma combinação dos mesmos.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender ainda a etapa de aplicar um método de limpeza secundário aos ditos materiais sólidos à base de derivado de esqueleto de organismo marinho de (b), após o contato com o dito material anfifílico, solvente polar, material catiônico, material aniônico, ou combinações dos mesmos, em que o dito método de limpeza secundário inclui aplicar calor, ultrassons, pressão positiva, pressão negativa, ou uma combinação dos mesmos.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender ainda a etapa de colocar em contato o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho com o fluido e aplicar pressão negativa ao dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho para prover absorção máxima do dito fluido dentro do dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho para chegar ao dito valor total de absorção de fluido.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito valor da capacidade específica de absorção de fluido é uma função da mudança no

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7/8 peso no dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho ou o dito valor da capacidade de absorção de fluido específico é uma função da mudança no volume de fluido de fluido aplicado ao dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho aproxima-se da forma de um cilindro, cone, tacha, pino, parafuso, barra retangular, placa, disco, pirâmide, grânulo, pó, areia de coral, côndilo, costela, pélvis, vértebra, tecido cartilaginoso ósseo, esfera ou cubo ou o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho aproxima-se de um formato que acomoda um local de crescimento ou reparo de tecido desejado.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito material sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho compreende uma depressão ou depressões ao longo de um eixo de coordenadas cartesianas do dito material sólido à base de coralina.

23. Substrato sólido à base de derivado de esqueleto de organismo marinho otimizado caracterizado por ter um valor da capacidade específica de absorção de fluido de pelo menos 75% ou ter um valor de ângulo de contato menor que 60 graus, quando em contato com um fluido, cujo fluido é uma solução contendo proteína, sal ou carboidrato, ou um fluido biológico que é água, sangue ou plasma para promover crescimento celular ou de tecido ou função restaurada

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8/8 selecionada pelo processo como definido na reivindicação

14 .

24. Kit caracterizado por compreender pelo menos um substrato sólido como definido na reivindicação 23.