CN102665604A - 用于组织修复的固体形式 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于软骨和/或骨的修复、再生、形成增强或其组合的基于霰石和方解石的支架，所述支架包含至少两个相，其中各相的化学含量或结构不同，本发明也提供包含所述支架的试剂盒，用于制备固体霰石或方解石支架的方法及其使用方法。

Description

用于组织修复的固体形式

背景技术

外科介入和移植有时是居恢复由创伤、肿瘤或异常骨骼发育引起的骨和软骨的机械功能和重建其形态所必需的。

多年来，合成材料例如金属和骨接合剂也用于恢复和重建骨骼，但经常导致对周围骨骼的应力遮挡(stress-shielding)和植入物的疲劳故障(fatigue failure)。另一种可能性是自体骨移植，尽管自体骨组织的供应受到限制且骨骼采集很痛，具有感染、出血、外表致残(cosmetic disability)、神经损伤和骨功能损失的风险。另外，显著发病率与自体移植物采集位点有关。这些问题可通过使用由促进骨髓干细胞(也称为间充质干细胞(MSC))的附着、移植、增殖和分化的合成的或天然的生物材料制成的支架对组织工程化来克服。可以通过提供包含与骨单位及其脉管互连形态上相容的空间的支架促进生物成分与生物再生和修复反应之间的关联。

直接的微环境(immediate microenvironment)和三维(3D)组织是一般分化和尤其是软骨形成和成骨性分化中的重要因素。

一些骨组织工程化支架由天然聚合物(例如胶原蛋白、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖)组成。由于其亲水性相互作用、低毒性和低的慢性炎性反应，天然材料提供特别的细胞相互作用、细胞接种方便性的优点。然而，这些支架通常是机械不稳定的且不易造成具有用于移植的特定预定形状的组织结构的产生。为获得机械强度，需要化学改性，这可能导致毒性。

关节的关节软骨表面的缺损和退化引起疼痛和僵硬。保护关节的软骨的损伤可能由作为创伤、运动或重复应力的结果的物理损伤(例如，由于十字韧带受伤引起的骨软骨骨折、继发损害)或由疾病(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、无菌性坏死、剥脱性骨软骨炎)引起。

骨关节炎(OA)由关节(最特别是臀和膝关节)的总体磨损和撕裂引起。骨关节炎在老年人中常见，但事实上到40岁时，大多数个体在其荷重关节中有一些骨关节炎性变化。骨关节炎发病率增加的另一种新趋势是肥胖症的增加。CDC估计30％的美国成人(或六千万人)是肥胖的。肥胖成人比正常体重的成人发生膝OA的可能性大4倍。类风湿性关节炎是导致软骨破坏的炎性病症。其被认为至少部分地是其中患者对该疾病具有遗传倾向性的一种自身免疫性疾病。

损害关节的整形外科防治和修复在治疗患者的费用和时间花费方面对医疗职业来说都是沉重的负担。这部分地是因为软骨不具有自我修复的能力。再生长透明软骨从而修复软骨缺损的尝试仍然未取得成功。在致力于预防关节的严重退行性变化的尝试中，为了修复缺损并预防关节损害，整形外科是可行的。外科技术的使用通常要求健康组织的移除和捐赠以替换受损的或有病的组织。采用来自自体移植物、同种异体移植物或异种移植物的供体组织的技术不能完全令人满意，因为自体移植物对受试者添加了额外的创伤，而同种异体移植物和异种移植物受限于对宿主受试者的免疫反应性和感染剂的可能传播。利用除了人或动物组织以外的材料用于软骨再生的外科尝试也未获得成功。

至今仍然缺乏修复骨和软骨的机械功能和重建其形态的理想材料。

发明简述

在一些实施方式中，本发明提供用于诱导或加强软骨或骨的修复、再生或形成增强或其组合的基于珊瑚的支架，其中所述支架包含霰石或方解石。

在一些实施方式中，本发明提供用于组织修复的支架，所述支架基本上由两相组成，其中：

-所述两相的第一相包含含有生物相容的聚合物的固体珊瑚或生物栅格(biolattice)，且所述第一相还包含沿着所述第一相的纵轴的一系列空腔，其中所述生物相容的聚合物基本上位于所述系列空腔内；和

-所述两相的第二相包含固体珊瑚或生物栅格。

在一个实施方式中，本发明提供用于软骨或骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有平均直径为约60-160μm的孔隙；和

-至少第二相，其含有平均直径为约170-850μm的孔隙。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架还包含第三相，其含有平均直径为约170-300μm的孔隙，且所述第二相包含平均直径为约350-850μm的孔隙，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

在另一个实施方式中，本发明提供用于软骨或骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有孔隙体积(孔隙度)为约35-55％的孔隙；和

-至少第二相，其含有孔隙体积(孔隙度)为约56-95％的孔隙。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架还包含第三相，其含有孔隙体积为约56-80％的孔隙，其中所述第二相包含孔隙体积(孔隙度)为约81-95％的孔隙，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

在另一个实施方式中，本发明提供用于软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由从珊瑚分离的固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，其对应于固体形式从其中分离的天然珊瑚的平均直径、孔隙体积或其组合；知

-至少第二相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-100％。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架还包含第三相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-35％，且所述第二相包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约40-100％，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

在另一个实施方式中，本发明提供制备用于诱导或增强软骨或骨的形成或修复，或其组合的多相支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使仅一部分固体形式的霰石或方解石与钙螯合剂和酸接触以产生在至少一部分所述固体形式中包含扩大的孔隙的固体形式，和

-在所施加的负压力下洗涤并干燥所述固体形式。

根据该方面，以及在一些实施方式中，所述接触在一定持续时间内和在一定条件下进行，所述时间和条件根据所述支架所需的最终几何形状而变化。

根据该方面和在其他实施方式中，通过所述方法制得的固体形式包含至少两相，所述相的孔隙体积(孔隙度)不同，或所述相包含所述孔隙的平均直径不同的孔隙，或其组合。

在一些实施方式中，本发明提供根据本发明方法制得的支架。

在一个实施方式中，本发明提供用于修复软骨的包含生物栅格的支架，所述生物栅格基本上由能插入软骨修复位点内的方解石组成。在一些实施方式中，所述生物栅格来源于藤壶(Tetraclita rufotincta)。

在一个实施方式中，本发明提供诱导或增强软骨或骨形成或修复或其组合的方法，所述方法包括将本发明的任何支架植入受试者中需要软骨或骨形成、修复或其组合的位点内。

根据该方面和在一些实施方式中，所述方法包括在植入所述支架前，暴露所述需要软骨或骨形成或修复或其组合的位点和任选地暴露位于需要软骨修复或再生的所述受试者中软骨修复位点附近的骨组织。

根据该方面和在一些实施方式中，用于诱导或增强软骨修复或再生的方法包括将至少一部分所述支架固定在位于所述软骨修复位点附近的骨内的步骤。

在另一个实施方式中，本发明提供用于纯化基于珊瑚的支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使所需尺寸和形状的固体霰石与含有氧化剂的溶液接触；和

-洗涤并干燥所述固体霰石，

从而所述步骤之一或各所述步骤在所施加的负压力下进行。

根据该方面和在一些实施方式中，所述方法包括使所述接触在温和的酸性条件下进行。在一些实施方式中，所述溶液包含次氯酸钠。

根据该方面和在一些实施方式中，所述方法还包括在所施加的负压力下使固体霰石经受至少275℃的温度。

在一些实施方式中，所施加的负压力为约0.2到0.00001巴，或在一些实施方式中，所施加的负压力为0.4到0.0000001巴。

在一些实施方式中，本发明提供通过根据本发明该方面的方法制备的基于珊瑚的支架。

本发明提及的所有出版物、专利和专利申请以引用方式全部合并于此，如同具体和单独地指出各单个出版物或专利以引用方式合并一样。在本说明书和合并的参考文献冲突的情况下，将以本说明书为准。当本文中给出数值范围时，该范围包括端点。而且，应理解，除非另有说明或由上下文和本领域技术人员的知识证明，表示为范围的值可以假定为该指定范围内的任何具体的值或亚范围，任选地在本发明的不同实施方式中包括或不包括其中任一个或两个端点，到所述范围下限单位的十分之一，除非上下文明确指示为其它情况。当提到本身具有为整数的单位的值用到百分比时，任何所得分数可以取整到最接近的整数。

附图说明

图1用示意性地描述了将植入物定位在软骨和骨修复的位点内，其中支架1-10的定位使得第一相定位在软骨内且第二相定位在位于附近的骨内。

图2描述软骨和骨缺损内本发明支架的实施方式的成功结合。图2A显示山羊股骨内侧髁中钻孔的照片；D＝6mm，L＝7.5mm。图2B和2C显示受伤位点内支架的植入的照片。图2D显示植入19天后：植入物成功结合在软骨内，观察到血管形成的迹象和完整的半月板。

图3显示骨软骨组织的光学显微照片，其中本发明具体化的支架已经植入。图3A显示本文描述的本发明具体化支架植入山羊股骨内侧髁9周后的低放大倍数(2x)图像，D＝5.2mm，L＝7.5mm；用标准H&E染色显象。图3B显示用Masson三色染色法染色的组织的相当切片。注意到植入物区域(3A中以点矩形突出显示)被编织骨、软骨和纤维组织取代。

类似于图3，图4显示骨软骨组织的光学显微照片，其中本发明具体化支架已经植入，进行了不同的染色方案。图4A表示在山羊股骨内侧髁中植入9周后组织的低放大倍数(2x)图像；D＝5，用番红O(Safranin O)染色，且图4B显示染色用于II型胶原蛋白检测的相当切片。图4A表明覆盖正常骨和缺损区域的软骨均匀红色带的存在。类似地，图4B显示沿着覆盖缺损的软骨带(以及作为内部阳性对照的相邻正常软骨)的II型胶原蛋白的阳性染色。

图5显示骨软骨组织的光学显微照片，其中本发明具体化支架已经植入，其进行H&E染色。切片来自于支架植入后9周获得的山羊股骨内侧髁；D＝5.2mm，L＝7.5mm。图5A是组织的低放大倍数图像，而图5B是图5A中观察到的插入物的较高放大倍数图像。注意到透明软骨(插入物)区域中组织的均匀性。在再生区域内有着软骨细胞的轻微群集，但该区域另外地表现为与相邻软骨组织相当。

图6描述本发明多梯度支架的实施方式的制备和使用。图6A显示将栓子(plug)定位在用于浸渍的筛子内的实施方式。图6B和6C描述从栓子(图C)切下并在可以测定孔隙尺寸的较高放大倍数下可见的顶部(图B)的光学显微图像。图6D示意性地描述本发明的多相支架实施方式。

图7显示MSC培养物的番红O/固绿(Fast Green)染色的显微照片，表明随着细胞是否在霰石(图7D、7E和7F)、霰石和透明质酸(图7G、7H和7I)或无任何支架(对照)(图7A、7B和7C)上随着时间的培养而变化的植入物的软骨形成可能性。

图8显示在霰石支架、霰石+透明质酸和无任何支架上随着时间培养的MSC的番红O/固绿染色的染色细胞区域(图8A)和强度(图8B)。

图9显示在各种支架上培养的MSC的SEM显微照片。图9A和9B表明在基于珊瑚的支架上培养的MSC相对于在珊瑚和包含透明质酸的支架上培养的MSC(图9C和9D)的形态学。

图10显示本发明支架的实施方式，其表明在用跟随蒸发的NaHA 1％溶液浸渍之前(图10A)和之后(图10B)的具体化植入物的软骨相中钻孔的模式。

图11A-C描述本发明支架/植入物的实施方式。根据该方面，一个相包含具有沿着纵轴(11-30)的一系列孔或孔隙的霰石并用透明质酸(11-10)浸渍，且另一相仅包含霰石(11-20)。根据该方面的支架末端是锥形(11-40)，以便于作为紧密配合插入骨软骨修复位点内。图11C显示用固绿染色的具体化支架，其选择性染色该支架的透明质酸成分。

发明详述

本发明尤其提供用于受试者中软骨和/或骨组织的修复和/或形成的支架、工具及其使用方法。本发明还提供用于受试者中软骨和/或骨组织的修复和/或形成的试剂盒。

由以霰石或方解石的结晶形式存在的CaCO₃构成的珊瑚具有支持间充质干细胞快速细胞侵入(cellular invasion)、附着、增殖和分化成软骨和/或骨组织的优点。

三维(3-D)珊瑚支架从周围组织或位于附近的组织吸引间充质干细胞并促进对软骨修复位点的血管形成。这种支架可用于受试者中软骨和/或骨再生、修复和形成增强以用于治疗全厚度软骨缺损(full-thickness cartilagedefect)、部分厚度软骨缺损(partial thickness cartilage defect)和/或骨软骨缺损。

术语“珊瑚”和“霰石”在本发明中可互换使用。

本发明基于珊瑚或基于方解石的支架也可以用于受试者中骨的再生、修复和形成增强以治疗骨病症、疾病或紊乱。

本发明提供单独用于软骨和/或骨再生、修复和形成增强的珊瑚或方解石支架的出人意料的应用，而且，可制备所述珊瑚/方解石支架并特别地且最佳地插入需要治疗的受试者的软骨和/或骨内，从而用于软骨和/或骨再生、修复和形成增强的方法。

特别地，本发明提供当所述珊瑚支架基本上由两相组成时软骨和/或骨再生、修复和形成增强最佳的令人意外的应用，其中所述两相的第一相包含含有生物相容聚合物的固体珊瑚或生物栅格，且所述第一相还包含沿着第一相中的纵轴的一系列空腔；且所述两相的第二相仅包含固体珊瑚或生物栅格，其中所述生物相容聚合物主要位于所述系列空腔内。

特别地，当本发明描述的支架与插入软骨内的相中的生物相容聚合物(例如透明质酸)结合时，本发明提供较大软骨形成的意外优点。根据该方面的支架的另一个优点是包含生物相容聚合物(例如透明质酸)的相内预钻通道或纵向设置的孔洞的存在，该孔洞用生物相容的聚合物(例如透明质酸)浸渍并用作位于需要软骨修复的区域内的相中的生物相容聚合物(例如透明质酸)的储库(reservoir)。生物相容聚合物(例如透明质酸)的定位使得迁移祖细胞(progenitor cells)更多地遍及该支架的相，从而刺激软骨再生和修复。在一些实施方式中，沿着支架的相的纵轴的孔隙内含有浓缩的生物相容聚合物(例如透明质酸)的通道提供参与软骨形成的募集细胞的趋化性引导，和/或在一些实施方式中，影响向其迁移的细胞的软骨形成群体的局部募集和分化。在一些实施方式中，沿着支架的相的纵轴的孔隙内含有浓缩的生物相容聚合物(例如透明质酸)的通道有助于软骨基质动态平衡。

根据该方面，与第一相相比，第二相的孔隙度和较大刚性更适于插入骨内并提供用于修复骨软骨缺损的载体。因此，在一些实施方式中，本发明支架完美地适合于结合在跨越不同类型组织(即骨和软骨)的缺损位点内。

在一些实施方式中，本发明提供用于组织修复的支架，所述支架基本上由两相组成，其中：

-所述两相的第一相包含含有透明质酸的固体珊瑚或生物栅格，且所述第一相还包含沿着所述第一相中的纵轴的一系列空腔；和

-所述两相的第二相包含固体珊瑚或生物栅格。

在一些实施方式中，根据该方面，所述第一相的高度为1-3mm，或在一些实施方式中，为0.5-5mm，或在一些实施方式中，为1-7mm。在一些实施方式中，根据该方面，透明质酸优先地分布在该相中产生的空腔内。在一些实施方式中，一薄层透明质酸可以进一步在植入物上方形成，这假定植入物的顶区有对于植入物的海绵状外层。

在一些实施方式中，所述生物相容的聚合物(例如透明质酸)是亲水性的，且当滑液在支架上方的顶层与其接触时或在植入过程中当盐水与其接触时，植入物吸收液体并恢复为水凝胶，与植入前的脱水/干燥状态相反。在一些实施方式中，这种恢复提供植入位点的机械保护。

在一些实施方式中，当植入后的如所述的“重构”时，所述外层可从支架洗脱到周围位点中，从而在该位点参与修复的刺激或增强，尤其包括用作参与修复过程的细胞的化学引诱物。

根据该方面和在一些实施方式中，所述第一相还包含一系列纵向的孔洞。这种纵向孔洞可以为15-60个孔洞，其遍及沿着根据该方面的植入物纵轴的相。在一些实施方式中，所述孔洞或扩大的孔隙的直径为约250-450μm。在一些实施方式中，所述孔洞或扩大的孔隙的直径为约125-650μm，或在一些实施方式中，为约175-550μm。

根据该方面和在一些实施方式中，一系列孔洞或孔隙可通过植入物的物理操作组合，例如和在一些实施方式中，固体霰石或方解石可以如本发明所述进行分离、清洁和另外地制备，以及钻头可用于形成如本发明所述的一系列孔洞/孔隙。在一些实施方式中，可以实现其他手段，例如支架材料的选择性溶解，其中沿着纵轴的选择性溶解通过本领域已知方法完成，包括本发明描述和例证的那些。

根据该方面，所述第二相将包含固体珊瑚或生物栅格，其不进行进一步改性来改变该相的孔隙度，或在一些实施方式中，其可如下文进一步所描述进行改性以特定地改变该相的孔隙体积或平均孔径，从而这种改性在整个相中基本上是均匀的。

植入物的第一相中生物相容的聚合物(例如透明质酸)的结合可通过任何方法实现，包括压力驱动的应用，例如，经由真空、离心力或机械压力的应用。在一些实施方式中，重力足以允许透明质酸适当且相对均匀地渗透到植入物的所需深度，从而产生本发明描述的第一相。根据该方面，在一个实施方式中，例如使用固绿/番红O染色，植入物的肉眼观察表明透明质酸通过该相的均匀分布并且到达随应用时间和条件变化的所需深度。

根据该方面和在一些实施方式中，当将支架用于骨和/或软骨修复的位点时，或在一些实施方式中，当将支架用于骨和软骨受影响并需要修复和/或再生的缺损位点时，本领域技术人员将了解，所述支架的第二相插入骨缺损位点内而第一相插入软骨缺损位点内。

在一些实施方式中，这种支架可以给予患有需要修复的骨缺损的受试者，其中到达骨缺损导致在覆盖软骨中产生缺损，且本发明支架允许受影响的两种组织的愈合。在其他实施方式中，这种支架可以给予患有需要修复的软骨缺损的受试者，其中用于刺激软骨修复的支架的最佳插入需要将所述支架锚定在底层骨(underlying bone)中，例如，通过在底层骨中产生最小的孔隙用于支架插入，且一旦插入，所述支架促进覆盖软骨和底层骨两者的修复。

在其他实施方式中，这种支架可以给予患有骨软骨缺损的受试者，其中骨和软骨组织都需要作为疾病发病机理的部分的修复。在一些实施方式中，根据该方面的支架尤其适用于这种应用。

本发明也提供当所述珊瑚支架包含至少两相时软骨和/或骨再生、修复和形成增强最佳化的令人意外的应用，所述相包含孔隙，且各相内孔隙的平均直径是变化的，和/或当所述珊瑚支架包含至少两相时软骨和/或骨再生、修复和形成增强最佳化的令人意外的应用，所述相的各自的孔隙体积(孔隙度)是变化的。

应理解，术语“珊瑚”是指可从中分离霰石和/或方解石的起始材料。

在一个实施方式中，本发明提供用于诱导或增强软骨或骨增生、修复、形成增强或其组合的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有平均直径为约60-160μm的孔隙；和

-至少第二相，其含有平均直径为约170-850μm的孔隙。

应理解根据该方面，术语“第一相”和“第二相”不是指相插入骨软骨缺损内的特定次序，且第一相或第二相可以定向以邻近修复位点内的软骨，与其中所述第一相邻近软骨修复位点而插入的上文描述的支架的前述实施方式相反。根据该方面，所述支架可以进一步改性以包含指定的孔隙平均直径，且任一相可进一步包含生物相容的聚合物(例如透明质酸)和沿着所述相的纵轴的一系列孔隙或孔洞，其中所述生物相容的聚合物(例如透明质酸)基本上位于该系列孔隙或孔洞内。

在一些实施方式中，涉及霰石的术语“固体形式”是指由珊瑚获得的固体霰石，所述霰石经处理以去除碎屑、蛋白及其他颗粒物质，然而，这种来源于珊瑚的材料不水热转化的(hydrothermically transformed)也不磨碎和再悬浮的。

在一些实施方式中，用于制备本发明支架的珊瑚可以本领域已知的任何方法处理，例如，如PCT国际申请号PCT/IL2009/000828所描述的，其以引用方式全部合并于此。在一些实施方式中，所述珊瑚可根据本发明方法加工。

在一些实施方式中，本发明提供用于纯化基于珊瑚的支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使所需尺寸和形状的固体霰石与含有氧化剂的溶液接触；和

-洗涤并干燥所述固体霰石，

其中所述步骤之一或各所述步骤在施加的负压力下进行。

根据该方面和在一些实施方式中，所施加的负压力为约0.2到0.00001巴，或在一些实施方式中，所施加的负压力为约0.4到0.0000001巴。

根据该方面和在一些实施方式中，用于本发明方法的氧化剂可以是任何合适的氧化剂，其促进有机碎屑从基于珊瑚的支架中的去除。

在一些实施方式中，所述氧化剂尤其可包括硝酸钾(KNO₃)、次氯酸盐及其他次卤酸盐化合物、碘及其他卤素、亚氯酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、高锰酸盐、硝酸铵铈(IV)、六价铬化合物、氯铬酸吡啶(PCC)和铬酸盐/重铬酸盐化合物、过氧化物、亚砜、过硫酸或硝酸、丙酮、过二硫酸铵、1，4-苯醌、N-叔丁基苯亚磺酰胺(N-tert-butylbenzensulfinilmidoyl)、氯化物、叔丁基过氧化氢、叔丁基次氯酸、3-氯过氧苯甲酸、间-氯过苯甲酸、异丙基苯过氧化氢、二甲亚砜、过氧化氢、氧化锰、间-氯过苯甲酸、N-甲基吗啉-N-氧化物、甲基三氧化铼(MTO)、草酰氯、N-叔丁基苯亚磺酰胺氯化物、过硫酸氢钾(oxone)、氧、臭氧、过乙酸、高碘酸、过氧酸、特戊醛、高锰酸钾、过二硫酸钾、过氧单硫酸钾、2-丙酮、亚氯酸钠、过碳酸钠、高碘酸钠、苯乙烯、三氯异氰尿酸(TCCA)、2，2，6，6-四甲基哌啶氧TEMPO、叔丁基过氧化氢、叔丁基次氯酸酯、四丁铵过氧二硫酸盐、三甲基乙醛。在一些实施方式中，所述氧化剂是次氯酸钠。

根据该方面和在一些实施方式中，所述方法包括在温和的酸性条件下进行所述接触。

根据该方面和在一些实施方式中，所述方法包括在所施加的负压力下使固体霰石经受至少275℃的温度。

根据本发明的该方面，所述方法包括在所施加的负压力下使霰石与氧化剂接触、在所施加的负压力下洗涤并干燥霰石，或两步骤都在所施加的负压力下进行。根据本发明的该方面，所施加的负压力为0.2到0.00001巴，或在一些实施方式中，为约0.4到0.0000001巴。

本发明的支架、试剂盒、处理和方法使用固体珊瑚形式。

本发明的固体形式或支架可以来源于霰石或方解石。

在一些实施方式中，术语涉及方解石的“固体形式”是指从珊瑚分离的方解石，所述方解石经处理以去除碎屑、蛋白及其他颗粒物质，然而，这种材料既不水热转化的也不磨碎和再悬浮的。在一些实施方式中，“固体形式”方解石是指通过制备霰石固体形式而获得的方解石，所述形式然后通过本领域已知方法转化为方解石，例如通过将所述形式在真空中暴露于高温。

本领域已知的将霰石转化为方解石的任何方法可用于制备本发明的方解石支架。

在一些实施方式中，本发明支架包含一系列孔隙，且存在于本发明支架中的至少两相在存在于各相中的孔隙的平均直径方面是变化的。在一些实施方式中，所述支架包含至少第一相，其含有平均直径为约60-160um的孔隙。在一些实施方式中，所述第一相含有平均直径为约60-90μm的孔隙，或在一些实施方式中，为约80-130μm，或在一些实施方式中，为约120-160oμm。

在一些实施方式中，所述支架包含至少第二相，其含有平均直径为约170-850μm的孔隙。在一些实施方式中，所述第二相含有平均直径为约170-400μm的孔隙，或在一些实施方式中，为约250-500μm，或在一些实施方式中，为约450-700μm，或在一些实施方式中，为约550-850μm。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架还包含第三相，其含有平均直径为约150-300μm的孔隙，且所述第二相包含平均直径为约350-850μm的孔隙，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。在一些实施方式中，这种至少第三相在本文中可互换地称为“中间相”。

在一些实施方式中，所述支架是圆柱形的，直径为约5-15mm，且高度为约5-25mm。在一些实施方式中，所述支架的直径为约1-35mm，且高度为约1-45mm，或约5-40mm，和高度为约5-60mm，或约5-15mm，和高度为约5-45mm。

本发明支架的相内孔隙的平均直径可通过任何方法测定，包括下文进一步举例说明的数字图像分析。在一个实施方式中，用于本发明支架的珊瑚包含适于细胞接种和/或脉管系统发育的平均孔隙直径。

本发明的固体形式包含至少两相，所述相由于构成支架的材料的多孔特性而包含孔隙。在一些实施方式中，所述相的各相孔隙体积(孔隙度)是变化的。

在一个实施方式中，本发明提供用于修复软骨的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有孔隙体积为约35-55％的孔隙；和

-至少第二相，其含有孔隙体积为约56-95％的孔隙。

应理解根据该方面，术语“第一相”和“第二相”不是指该相插入缺损位点(例如骨软骨缺损内)的特定次序，且第一相或第二相可以定向为邻近例如修复位点内的软骨，这与其中所述第一相邻近软骨修复位点而插入的上文描述的支架的前述实施方式相反。根据该方面，所述支架可以进一步改性从而包含含有具有指定孔隙体积的孔隙的相，且任一相可进一步包含生物相容的聚合物(例如透明质酸)和沿着所述相的纵轴的一系列孔隙或孔洞，其中所述生物相容的聚合物(例如透明质酸)基本上位于该系列孔隙或孔洞内。

如本发明所使用的，术语“孔隙体积”是指本发明多孔支架内的容积或开放空间。孔隙体积通过本领域已知的任何方法测定。孔隙度可通过标准方法计算，其中一个例子在下文进一步提供，例如参见Karageorgiou V，Kaplan D.(2005)″Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis″Biomaterials.；26(27)：5474-91，其以引用方式全部合并于此。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架包含至少第一相，其含有孔隙体积为约35-45％的孔隙，和在一些实施方式中，所述支架包含第一相，其含有孔隙体积为约40-55％的孔隙。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架包含至少第二相，其含有孔隙体积为约56-70％的孔隙，和在一些实施方式中，为约60-74％，或所述支架包含第二相，其含有孔隙体积为约65-75％的孔隙，或在一些实施方式中，为约70-85％，或在一些实施方式中，为约80-95％。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架还包含第三相，其含有孔隙体积为约80-95％的孔隙，其中所述第二相包含平均直径为约56-80％的孔隙和所述第二相位于所述第一相和第三相之间。

在一个实施方式中，术语“约”是指与所指定值的1-10％的差异，或在另一个实施方式中，指5-15％的差异，或在另一个实施方式中，指最多10％的差异，或在另一个实施方式中，指最多25％的差异，除非上下文指出差异将不会产生超过100％的值。

在一些实施方式中，本发明提供用于软骨、骨修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由从珊瑚分离的固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，其对应于所述固体形式从其中分离的天然珊瑚的平均直径、孔隙体积或其组合；和

-至少第二相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-100％。

应理解根据该方面，术语“第一相”和“第二相”不是指该相插入缺损位点，例如骨软骨缺损内的特定次序，且第一相或第二相可以定向为邻近例如修复位点内的软骨，这与其中所述第一相邻近软骨修复位点而插入的上文描述的支架的前述实施方式相反。根据该方面，所述支架可以进一步改性从而包含含有具有指定孔隙体积的孔隙或具有指定平均直径的孔隙或其组合的相，且任一相可进一步包含生物相容的聚合物(例如透明质酸)和沿着所述相纵轴的一系列孔隙或孔洞，其中所述生物相容的聚合物(例如透明质酸)基本上位于该系列孔隙或孔洞内。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-35％，且在一些实施方式中，为约60-74％，或所述支架包含具有孔隙体积为约45-65％的孔隙的第二相，或在一些实施方式中，为约50-85％，或在一些实施方式中，为约80-95％。

在一些实施方式中，本发明提供用于软骨、骨修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由从珊瑚分离的固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，其对应于所述固体形式从其中分离的天然珊瑚的平均直径、孔隙体积或其组合；和

-至少第二相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-900％。

应理解根据该方面，术语“第一相”和“第二相”不是指该相插入缺损位点，例如骨软骨缺损内的特定次序，且第一相或第二相可以定向为邻近例如修复位点内的软骨，这与其中所述第一相邻近软骨修复位点而插入的上文描述的支架的前述实施方式相反。根据该方面，所述支架可以进一步改性从而包含含有具有指定孔隙体积的孔隙或具有指定平均直径的空隙或其组合的相，且任一相可进一步包含生物相容的聚合物(例如透明质酸)和沿着所述相纵轴的一系列孔隙或孔洞，其中所述生物相容的聚合物(例如透明质酸)基本上位于该系列孔隙或孔洞内。

在一些实施方式中，根据该方面，所述支架包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙的第二相和第三相，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-900％，其中在一些实施方式中，所述第三相包含平均直径、孔隙体积或其组合为第一相的平均直径、孔隙体积或其组合的约300-900％的孔隙，或在一些实施方式中，为300-450％，或在一些实施方式中，为425-600％，或在一些实施方式中，为575-900％，且所述支架包含含有平均直径、孔隙体积或其组合为第一相的平均直径、孔隙体积或其组合的约15-200％的孔隙的第二相，或在一些实施方式中，为50-125％，或在一些实施方式中，为125-200％。

根据该方面和在一个实施方式中，所述支架将包含第三相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-35％，且所述第二相包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约40-100％，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

应理解不同种类的珊瑚的平均孔径和孔隙体积是变化的，且本发明预期任何这种珊瑚用作制备本发明描述的支架的起始材料，其中所述支架的特征在于其具有至少两相，其中第一相包含制备支架的珊瑚的天然孔隙和孔隙体积，和第二相，其孔隙扩大，其整体孔隙体积增加，或其组合。

在一个实施方式中，本发明提供用于修复软骨的支架，其含有基本上由方解石组成的生物栅格，所述方解石能够插入软骨修复位点内。在一些实施方式中，所述生物栅格来源于藤壶。

术语生物栅格是指含CaCO₃的生物材料，其是结晶或无定形的且尤其来源于珊瑚或藤壶类。

来自天然石灰石的碳酸钙的方解石多形体已有描述{Fujita Y，Yamamuro T，Nakamura T，Kotani S，Ohtsuki C，Kokubo T.J Bimed Mater Res.1991 Aug；25(8)：991-1003}。通过加热从天然珊瑚中分离的霰石体外转化方解石的方法也有描述(Fricain JC，Bareille R，Ulysse F，Dupuy B，Amedee J.J.Biomed Mater Res.1998 Oct；42(1)：96-102)。

在另一个实施方式中，本发明提供用于组织修复的支架，所述支架包含至少两相，其中所述两相的第一相包含珊瑚或生物栅格，且第二相包含生物相容的一种或多种聚合物。

在一个实施方式中，术语“邻近”是指某物靠近特定场所设置。在一个实施方式中，通过使支架的升高区域与位于或邻近软骨修复位点的组织接触从而将本发明支架强有力地强制保持在软骨修复位点内的位置。

通过优化支架的具体定位，如下所述的本发明珊瑚支架的多孔晶体结构能够达到位于组织周围环境内的有益组分。例如，珊瑚的多孔晶体结构允许血管向内生长，从而为在软骨修复期间渗入支架的软骨产生血液供应。通过渗透入骨髓空隙，位于骨髓内的间充质干细胞此时得以到达支架的暴露表面。在一个实施方式中，渗透入骨髓空隙的支架区域从骨髓吸引间充质干细胞并促进软骨修复位点的血管形成。在一个实施方式中，渗透入骨髓空隙的支架区域促进被吸引到支架的间充质干细胞的附着、增殖或分化或其组合。

因此，对本领域技术人员而言是显而易见的是：所述支架在软骨修复位点内的具体定位将排列本发明的支架以使得所述支架对于软骨修复最为有效。

在一些实施方式中，穿透骨并稳定地插入骨髓内的支架区域也是将支架定位并限制在软骨修复位点的支架区域，或在一些实施方式中，穿透骨并稳定地插入骨髓内的支架区域不是将支架定位并限制在软骨修复位点内的支架区域。在一个实施方式中，所述区域以这样的方式插入：支架的其他部分不与位点处的组织接触。在另一个实施方式中，所述区域以这样的方式插入：支架的侧壁与软骨修复位点处的组织形成接触。

在一些实施方式中，所述支架为适应于修复位点的形状。

在一些实施方式中，所述支架近似为圆柱形、锥形、钉形、针形、螺杆形、长方杆形、板形、圆盘形、金字塔形、颗粒形、球形或立方形。

在一些实施方式中，本发明支架可用于与其他已知和/或可获得材料结合，用于刺激/增强骨和/或软骨修复。在一些实施方式中，本发明支架可用于固定另外的支架，例如用于整个关节修复或韧带修复，或其他结缔组织修复。

在一些实施方式中，例如，本发明支架可用作针，与其他支架结合用于骨修复或再生等。应理解本发明支架(单独或与其他适当材料组合)在治疗、修复或刺激骨和/或软骨生长中的任何用途将被认为是本发明的一部分。

应理解本发明支架可以是适应于根据本发明方法的应用的任何适当的形状或尺寸。例如和在一些实施方式中，为了将本发明支架应用于受试者的长骨内，支架尺寸可缩放为接近支架植入的位点的尺寸，且根据需要，缩放数量级可为毫米到厘米。类似地，本发明支架的形状可以为本发明支架可加工或处理成的任何形状，且可以具有适于实现所需骨和/或软骨的生长、修复或再生的任何构型。

在一些实施方式中，所述支架包含沿着所述支架的直角坐标轴的一个或多个空腔，且在一些实施方式中，所述轴是所述支架的长轴。

在一些实施方式中，本发明提供用于软骨、骨修复、再生或形成增强或其组合的试剂盒，其含有本发明支架，用于在软骨、骨修复、再生或形成增强或其组合中使用所述支架的指导(directions)，以及任选地用于所述支架最佳插入、用细胞接种所述支架或其组合的一种或多种工具。

在一个实施方式中，用前驱细胞接种珊瑚。在一个实施方式中，所述前驱细胞是间充质干细胞。在一个实施方式中，所述细胞可以是间充质细胞；软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前驱细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合。在另一个实施方式中，前驱细胞可以指软骨细胞和其他细胞的组合；骨细胞和其他细胞的组合；滑膜细胞和其他细胞的组合；骨髓细胞和其他细胞的组合；间充质细胞和其他细胞的组合；基质细胞和其他细胞的组合；干细胞和其他细胞的组合；胚胎干细胞和其他细胞的组合；从成人组织分离的前驱细胞和其他细胞的组合；外周血液祖细胞和其他细胞的组合；从成人组织分离的干细胞和其他细胞的组合；遗传转化细胞和其他细胞的组合。在本发明的一个实施方式中，用于本发明方法的前驱细胞由受体哺乳动物(即自体的)或同源哺乳动物的器官组织制备。在另一个实施方式中，可以使用同种异体的和异种的前驱细胞。

在一些实施方式中，所述支架包含第三相，其含有组成与所述第一相不同的珊瑚。

在一些实施方式中，所述第三相定位于所述第一相和所述第二相之间。

在一些实施方式中，所述第三相位于所述第一相的近端和所述第二相的远端。

在一些实施方式中，所述第三相位于所述第二相的近端和所述第一相的远端。

在一些实施方式中，所述第一相或所述第二相插入邻近软骨下骨的区域中。

在一些实施方式中，所述支架可包含第三相，其可以插入邻近软骨下骨的区域。

在一些实施方式中，插入的相包含至少末端修饰，其增强组织修复。

在一个实施方式中，软骨修复位点可被认为在软骨和/或缺损或可能缺损的位点处或其附近包含3维(3D)空间。在一个实施方式中，该3D空间包含至少壁或底或其组合，且本发明可描述这种位点内相对于所述壁或底的定位，或在一些实施方式中，定位可相对于邻近所述壁或底的组织位点内的插入。在一些实施方式中，定位包括支架或其区域通过软骨和/或骨组织的壁和/或底或者软骨和/或骨组织的缺损或损伤或可能的缺损或损伤位点的插入，从而出现骨组织中的插入。

本领域技术人员将了解，软骨和/或骨组织修复位点的形状和本发明3D支架的形状提供许多不同的组合以将支架稳固地定位在软骨修复和/或骨位点内。在一个实施方式中，在将本发明方法用于软骨修复和/或骨修复之前使本发明支架成形。在一个实施方式中，在将本发明方法用于软骨和/或骨修复的同时使本发明支架成形。通过在本发明方法中使用支架的同时使支架成形，可精确选择支架的尺寸以用于支架在修复位点内的特定定位。应理解可将多个本发明支架放置在软骨和/或骨修复位点内或者成形并放置在软骨和/或骨修复位点内。

在一些实施方式中，本发明所称的“支架”、“植入物”或“栓子”是指涉及被认为包括在本发明所描述的方面中的支架的本文描述的任何实施方式或组合实施方式。例如，本发明所称的“支架”应理解为是指可适用于指定目的或包含指定特征等的本发明描述的支架的任何实施方式。

在一个实施方式中，“支架”是指用于软骨和/或骨修复的成形平台，其中该成形平台提供软骨和/或骨再生的位点。在一个实施方式中，所述支架是临时平台。在一个实施方式中，“临时平台”是指在软骨和/或骨修复期间随着时间发生的本发明珊瑚的自然降解，其中珊瑚的完全或部分的自然降解可导致支架形状随着时间发生变化和/或支架尺寸随着时间发生变化。

在一个实施方式中，珊瑚成形为待生长的组织的形式。例如，珊瑚可以成形为一片软骨组织，例如膝或肘的半月板；关节；骨的关节面；肋骨架；髋；骨盆；耳；鼻；韧带；支气管和椎间盘。

在一些实施方式中，本发明提供用于修复与物理创伤有关的软骨和/或骨组织缺损和/或与受试者的疾病或紊乱有关的软骨和/或骨组织缺损的珊瑚支架。

在本发明的一个实施方式中，术语“珊瑚”是指从单片珊瑚切下来的珊瑚。在一个实施方式中，所述珊瑚具有孔样孔穴或裂隙。

在一个实施方式中，在用于软骨和/或骨修复的方法之前使珊瑚支架成形。在一个实施方式中，在软骨和/或骨修复方法的同时使珊瑚支架成形，例如，可在可能最好地观察修复位点的外科手术期间使珊瑚支架成形，从而优化所使用的支架的形状。

在一个实施方式中，本发明支架、方法和/或试剂盒利用珊瑚的用途。在一个实施方式中，所述珊瑚包括任何种，尤其包括滨珊瑚属(Porites species)、鹿角珊瑚属(Millepora species)、千孔珊瑚属(Acropora species)或其组合。

在一个实施方式中，所述珊瑚来自于滨珊瑚属。在一个实施方式中，所述珊瑚是澄黄滨珊瑚(Porites Lutea)。在大多数种中，孔隙与固体之比通常为0.4到0.6，且孔隙相完全互连，从而形成互相贯通固体碳酸钙相的高度规则网络。在一个实施方式中，该均匀且互连的结构尤其可用作本发明支架、方法和/或试剂盒中的框架。

在一个实施方式中，所述珊瑚来自于鹿角珊瑚属。在一个实施方式中，所述珊瑚是巨枝鹿角珊瑚(Acropora grandis)，在一个实施方式中，其是非常常见的、生长迅速的且易于在培养中生长。因此，在一个实施方式中，鹿角珊瑚样品可以在珊瑚礁的掩蔽区域中容易地收集，且通过利用培养的珊瑚材料可以避免从珊瑚礁中收集。

巨枝鹿角珊瑚的平均骨骼密度是2.7g/ml。因为该珊瑚种的骨骼是致密和坚固的，其例如可通过研磨容易地加工成具有不同尺寸的各种成形产物或结构的构型。这种材料特别适用于植入装置，尤其是负重关节，例如膝关节和髋关节，其中强度是植入装置的重要性质。因此，在一个实施方式中，鹿角珊瑚用作本发明支架、方法和/或试剂盒的框架。

在另一个实施方式中，所述珊瑚来自于千孔珊瑚属。在一个实施方式中，所述珊瑚是两叉千孔珊瑚(Millepora dichotoma)。在一个实施方式中，所述珊瑚的孔隙大小为150μm，且可以克隆和培养，使得千孔珊瑚属可用作本发明支架、方法和/或试剂盒的框架。

在另一个实施方式中，所述珊瑚来自于以下种的任何一种或多种：海孔角蜂巢珊瑚(Favites halicora)；网状菊花珊瑚(Goniastrea retiformis)；棘星珊瑚(Acanthastrea echinata)；Acanthastrea hemprichi；Acanthastreaishigakiensis；粗糙鹿角珊瑚(Acropora aspera)；简单轴孔珊瑚(Acroporaaustera)；珊瑚虫属“brown digitate”；荆棘鹿角珊瑚(Acropora carduus)；谷鹿角珊瑚(Acropora cerealis)；鹿角珊瑚(Acropora chesterfieldensis)；方格鹿角珊瑚(Acropora clathrata)；Acropora cophodactyla；珊瑚虫属“danai-like”；两叉轴孔珊瑚(Acropora divaricata)；童氏轴孔珊瑚(Acropora donei)；棘鹿角珊瑚(Acropora echinata)；蓝花盘珊瑚(Acropora efflorescens)；芽枝鹿角珊瑚(Acropora gemmifera)；鹿角珊瑚(Acropora globiceps)；颗粒鹿角珊瑚(Acropora granulosa)；Acroporacf hemprichi；Acropora kosurini；Acropora cf loisettae；Acroporalongicyathus；罗立轴孔珊瑚(Acropora loripes)；粗短轴孔珊瑚(Acroporacf lutkeni)；Acropora paniculata；Acropora proximalis；Acropora rudis；石松鹿角珊瑚(Acropora selago)；单独鹿角珊瑚(Acropora solitaryensis)；Acropora cf spicifera as per Veron；Acropora cf spicifera as per Walldce；柔枝轴孔珊瑚(Acropora tenuis)；华伦轴孔珊瑚(Acropora valenciennesi)；巨锥轴孔珊瑚(Acropora vaughani)；穗枝轴孔珊瑚(Acroporavermiculata)；疣星孔珊瑚(Astreopora gracilis)；多星孔珊瑚(Astreoporamyriophthalma)；蓝德尔星孔珊瑚(Astreopora randalli)；Astreoporasuggesta；澳纹珊瑚(Australomussa rowleyensis)；柱形筛珊瑚(Coscinaraea collumna)；壳状筛孔珊瑚(Coscinaraea crassa)；刺蕺珊瑚(Cynarina lacrymalis)；紫侧孔珊瑚(Distichopora violacea)；棘刺叶珊瑚(Echinophyllia echinata)；梳状珊瑚科(Echinophyllia cfechinoporoides)；宝石刺孔珊瑚(Echinopora gemmacea)；粗糙棘叶珊瑚(Echinopora hirsutissima)；榔头珊瑚(Euphyllia ancora)；花瓶珊瑚(Euphyllia divisa)；Euphyllia yaeyamensis；圆形角菊珊瑚(Faviarotundata)；Favia truncatus；Favites acuticollis；五边角蜂巢珊瑚(Favities pentagona)；颗粒石芝珊瑚(Fungia granulosa)；Fungiaklunzingeri；Fungia mollucensis；Galaxea acrhelia；艾氏菊花珊瑚(Goniastrea edwardsi)；Goniastea minuta；Hydnophora pilosa；环柔纹珊瑚(Leptoseris explanata)；壳状柔纹珊瑚(Leptoseris incrustans)；类菌柔纹珊瑚(Leptoseris mycetoseroides)；凹凸柔纹珊瑚(Leptoserisscabra)；叶形柔纹珊瑚(Leptoseris yabei)；波状石叶珊瑚(Lithophyllonundulatum)；赫氏叶状珊瑚(Lobophyllia hemprichii)；粗裸肋珊瑚(Merulina scabricula)；两叉千孔珊瑚(Millepora dichotoma)；Millepora exaesa；纠结千孔珊瑚(Millipora intricata)；Milleporamurrayensis；板叶千孔珊瑚(Millipora platyphylla)；简短园菊珊瑚(Monastrea curta)；Monastrea colemani；曲纹表孔珊瑚(Montiporacaliculata)；疣表孔珊瑚(Montipora capitata)；浅窝蔷薇珊瑚(Montiporafoveolata)；Montipora meandrina；结节蔷薇珊瑚(Montiporatuberculosa)；Montipora cf vietnamensis；Oulophyllia laevis；Oxyporacrassispinosa；撕裂尖孔珊瑚(Oxypora lacera)；Pavona bipartita；脉结牡丹珊瑚(Pavona venosa)；莴苣梳状珊瑚(Pectinia alcicornis)；牡丹梳珊瑚(Pectinia paeonea)；尖边扁脑珊瑚(Platygyra acuta)；小脑纹珊瑚(Platygyra pini)；扁脑珊瑚“green”；维氏脑纹珊瑚(Platygyraverweyi)；Podabacia cf lanakensis；疣滨珊瑚(Porites annae)；指表孔珊瑚(Porites cylindrica)；Porites evermanni；Porites monticulosa；指形表孔珊瑚(Psammocora digitata)；Psammocora explanulata；血红沙珊瑚(Psammocora haimeana)；浅薄沙珊瑚(Psammocorasuperficialis)；锯齿屣珊瑚(Sandalolitha dentata)；浅杯排孔珊瑚(Seriatopora caliendrum)；甲胄柱群珊瑚(Stylocoeniella armata)；罩柱群珊瑚(Stylocoeniella guentheri)；柱星珊瑚(Stylaster sp.)；笙珊瑚(Tubipora musica)；小星陀螺珊瑚(Turbinaria stellulata)；或本领域已知的任何珊瑚或其组合。

在另一个实施方式中，用于本发明支架、方法和/或试剂盒的珊瑚可以是石珊瑚目、蓝珊瑚目的苍珊瑚科(Helioporida)、匍匐珊瑚目的笙珊瑚属、多孔螅目的千孔珊瑚科或本领域已知的其他珊瑚。在一些实施方式中，用于本发明支架、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括造礁石珊瑚，在一些实施方式中包括角孔珊瑚属及其他。在一些实施方式中，用于本发明支架、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括汽孔珊瑚(Alveoppora)。在一些实施方式中，用于本发明支架、方法和/或试剂盒的珊瑚可以包括竹珊瑚，在一些实施方式中，包括来自竹珊瑚科(Isididae)、掌状珊瑚属(genera Keratoisis)、Isidella及其他。

如上面所描述，定位并限制本发明支架的支架区域的能力取决于该区域的几何形状和所述支架将植入的软骨和/或骨修复位点处的几何形状。在一个实施方式中，该区域的几何形状包含尖锐边缘(sharp edge)。在一个实施方式中，该区域的几何形状包含圆形边缘。在一个实施方式中，区域的几何形状包含锯齿状边缘。

在本发明的一个实施方式中，软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度包括对软骨和/或骨修复最有益的深度和角度。在一个实施方式中，最有益的最佳深度和角度包括这样的位置：使得本发明支架可接近间充质干细胞库、组织环境、血管、营养物、效应化合物或治疗化合物或者其组合。

在本发明的一个实施方式中，术语“深度”是指本发明支架从静置在修复位点的开放表面上的假想线延伸到软骨和/或骨修复位点处的组织底面之下的位置的量度。

本领域技术人员应理解，支架的其他区域的深度可以不在任何组织表面之下。例如和在本发明的一个实施方式中，基于成形如圆筒形凹坑(cylindrical pit)的软骨修复位点，所画的横越凹坑开口的假想线代表凹坑顶部。在一个实施方式中，支架的定位导致支架整体低于凹坑顶部，并因此处于低于越过开口的假想线的深度。在一个实施方式中，支架定位导致部分支架高于凹坑顶部，因此并非完全在软骨修复位点内。将支架放置在给定深度的益处可以取决于支架和周围组织(软骨修复位点内或接近软骨修复位点)所形成的接触。

类似地和在本发明的另一个方面，关于本发明支架植入骨内，植入位点也可以想象为凹坑，其中所画的假想线横越凹坑开口，代表凹坑顶部。根据该方面，支架的定位导致支架整体低于凹坑顶部，或在一些实施方式中，支架的定位可以导致部分支架高于凹坑顶部，因此并非整个支架在骨修复位点内。将支架放置在给定深度的益处可以取决于支架和周围组织(软骨修复位点内或接近软骨修复位点)所形成的接触。

在一个实施方式中，术语“角度”是指由沿着支架的长轴的假想线和垂直于上述放置在软骨和/或骨修复位点开口处的线的假想的铅垂线形成的弧的量度，其中所述弧围绕该假想的铅垂线以顺时针方向前进。因此，在一个实施方式中，本发明支架可以定位并限制在最佳深度和角度，这样支架平行于垂直线，且因此所述角度将是0度。在一个实施方式中，本发明支架可以垂直于假想的铅垂线定位，并因此所述角度将是90度。在一个实施方式中，支架以等于或小于10度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于35度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于55度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于75度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于95度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于115度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于125度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于145度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以等于或小于165度的角度进行定位和限制。在一个实施方式中，支架以小于180度的角度进行定位和限制。

在一些实施方式中，插入多个支架从而最大限度地占据缺损位点，这样各支架材料可以以不同的角度和/或形状和/或深度和/或孔隙度插入，从而适应于适当插入到软骨和/或骨修复位点内的所需区域中。应理解上述定位角度可以是对于插入特定软骨和/或骨缺损位点的一个或多个支架而言。

支架的暴露表面与软骨和/或骨修复位点处或邻近软骨和/或骨修复位点的组织之间的接触提供生物活性表面，在本发明方法中，其可诱导或增强软骨和/或骨修复。例如，在一个实施方式中，支架的暴露表面提供吸引间充质干细胞的生物活性表面。在另一个实施方式中，暴露表面提供用于间充质干细胞附着、生长、增殖或分化或其组合的场所，所有这些过程诱导或增强软骨修复。另外，支架的暴露表面可以吸引血管。而且，软骨和/或骨修复位点处或邻近软骨和/或骨修复位点的组织可以是富含对软骨和/或骨修复有益的营养物、效应化合物、治疗化合物或其组合的源，这样支架暴露表面和这种组织之间的接触诱导或增强软骨和/或骨修复。

在一个实施方式中，支架的放置角度以至于支架与软骨和/或骨修复位点内的壁区域接触。在一个实施方式中，本发明支架可以定位和限制以使得支架与软骨和/或骨修复位点处的或邻近的组织之间存在最大的接触。在一个实施方式中，本发明支架可以定位和限制以使得支架区域穿透软骨下骨和/或骨髓孔隙，且支架与软骨和/或骨修复位点处的或邻近的组织之间存在最大的接触。在一个实施方式中，支架的暴露表面与软骨和/或骨修复位点处的或邻近的组织之间的接触提供支架的最大表面积用于与间充质干细胞群、血管、效应化合物或组织环境的其他组分或其组合相互作用。

本发明支架可包括多个升高部分。支架的不同部分可以提供不同的功能。例如，在一个实施方式中，支架的升高部分可以将支架保持在软骨和/或骨修复位点内的适当位置，或支架的升高部分可以起吸引、生长、增殖或分化间充质干细胞的作用，或支架的升高部分可以起适配本发明工具的作用，或其组合。

在一个实施方式中，100％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少80％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少60％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少40％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少20％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少10％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。在一个实施方式中，至少1％的多个升高部分具体定位并限制珊瑚。

在一个实施方式中，将本发明支架定位并限制在软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度提供将部分支架暴露表面穿透通过骨组织。

通过优化支架的具体位置，如下所述，本发明支架的多孔晶体结构能够接近位于组织环境内的有益组分。例如，支架的多孔晶体结构使得血管能够内生长从而为在软骨和/或骨修复期间渗透支架的软骨和/或骨建立血液供给。在一个实施方式中，支架吸引间充质干细胞并促进在软骨修复位点的血管形成。

因此，对本领域技术人员而言是显而易见的是：软骨和/或骨修复位点内支架的具体定位布置本发明的支架以使得支架对于软骨和/或骨修复而言最有效。

在一个实施方式中，“支架”是指用于软骨和/或骨修复的成形平台，其中所述成形平台提供软骨和/或骨形成和/或再生的位点。在一个实施方式中，所述支架是临时平台。在一个实施方式中，“临时平台”是指在软骨修复期间随着时间的过去发生的本发明珊瑚的完全或部分的自然降解，其中珊瑚的自然降解可导致支架形状随着时间过去发生变化和/或支架尺寸随着时间过去发生变化。

在一个实施方式中，珊瑚成形为待生长的组织的形式。例如，珊瑚可以成形为一片软骨性组织或骨性组织，例如膝或肘的半月板；关节；骨关节面；肋骨架；髋；骨盆；耳；鼻；支气管；椎间盘；韧带；椎骨；胫骨；股骨；肩和颌。

在一些实施方式中，本发明提供用于修复与物理创伤有关的软骨和/或骨组织缺损和/或与受试者中疾病或紊乱有关的软骨和/或骨组织缺损的珊瑚支架。

在本发明的一个实施方式中，术语“珊瑚”是指从单片珊瑚切下来的珊瑚。在一个实施方式中，所述珊瑚具有孔隙样孔穴或空隙。

在一个实施方式中，珊瑚支架在用于软骨和/或骨修复的方法之前成形。在一个实施方式中，珊瑚支架在与软骨和/或骨修复方法的同时成形，例如，珊瑚支架可在可能最好地观察修复位点的外科手术期间成形，从而优化所使用支架的形状。

在一个实施方式中，支架尺寸可以是可用于本发明目的的任何尺寸，如本领域技术人员所知的。在一个实施方式中，支架或其部分可以大约是软骨和/或骨修复位点的尺寸。在一个实施方式中，支架或其部分可以大约是软骨和/或骨缺损的尺寸，以使得所述支架可以放置在软骨和/或骨修复位点内。在另一个实施方式中，支架可以大于软骨和/或骨缺损的尺寸。例如，在一个实施方式中，本发明支架可以大于软骨和/或骨缺损的尺寸，从而所述支架可以延伸到具有间充质细胞可用性的位点。在一个实施方式中，支架可以小于软骨和/或骨缺损的尺寸。

在一些实施方式中，支架尺寸将是毫米尺度，例如，具有至少一条约为2-200mm的长轴，或在一些实施方式中，约为1-18mm，或在一些实施方式中，约为0.5mm-3mm，或在一些实施方式中，约为6-12mm，或在一些实施方式中，约为10-15mm，或在一些实施方式中，约为12-40mm，或在一些实施方式中，约为30-100mm，或在一些实施方式中，约为50-150mm，或在一些实施方式中，约为100-200mm。

在一些实施方式中，支架尺寸将是厘米尺度，例如具有至少一条约为0.5-30cm的长轴。

在一个实施方式中，所述支架的尺寸可以和组织修复位点处组织孔隙的尺寸大致相同。该组织孔隙可能由于软骨和/或骨缺损、软骨和/或骨退化引起，或可能在软骨和/或骨修复方法期间人工生成，或其组合。在一个实施方式中，所述组织孔隙不含软骨和/或骨组织。在一个实施方式中，支架或其部分可以是软骨和/或骨缺损的尺寸，以使得所述支架可以放置在软骨和/或骨修复位点内从而在软骨和/或骨修复位点处增强软骨和/或骨形成。在另一个实施方式中，支架可以大于软骨和/或骨缺损的尺寸，以使得所述支架可以到达具有间充质干细胞可用性的位点。

在一些实施方式中，将植入物装配到组织修复位点内时紧密配合是理想的。依据该方面和在一些实施方式中，可能希望使本发明支架的末端变细从而易于插入紧密空间内，以达到植入物的最佳紧密配合。例如，图11显示本发明具体支架的示意图，其中在支架的第二相中插入骨中的末端变细(11-40)，从而适应更容易的紧密配合。

在本发明的一个实施方式中，“约”是指其中符合满足具体需要的手段的量，例如，所述尺寸可以主要是但不完全是指定的尺寸，但它满足软骨和/或骨修复位点处的软骨和/或骨修复的具体需要。在一个实施方式中，“约”是指密切或接近，但并非正好。存在小的误差幅度。该误差幅度不会超过正或负该相同整数值。例如，约0.1微米将表示不低于0但不高于0.2。

在一个实施方式中，术语“孔隙”是指未被占据的空间。例如，本发明中，在一个实施方式中，孔隙可以是支架内天然未被占据的空间。在一个实施方式中，孔隙可以是修复位点处未被占据的空间。在一个实施方式中，孔隙可以是本发明支架内未被占据的空间。在一个实施方式中，孔隙可以是气孔或气孔区域的体积。

在一个实施方式中，珊瑚进行洗涤、漂白、冷冻、干燥、灭菌的或其组合。在一些实施方式中，珊瑚按如下进一步所说明处理。在一些实施方式中，一旦加工成本发明支架，珊瑚在植入软骨和/或骨修复位点内之前，用所需的一种或多种细胞群体接种。

在一个实施方式中，本发明提供制备用于修复软骨的多相支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使仅一部分固体形式的霰石或方解石与钙螯合剂和酸接触，从而在至少一部分所述固体形式中产生包含扩大孔隙的固体形式，和

-在所施加的负压力下洗涤和干燥所述固体形式。

在一些实施方式中，所述钙螯合剂是EDTA。在一个实施方式中，所述螯合剂可以包括：乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(EDTA)、O，O′-二(2-氨基苯基乙二醇)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、反式-1，2-二氨基环己烷-乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(CyDTA)、1，3-二氨基-2-羟丙烷-乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(DPTA-OH)、二亚乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(DPTA)、乙二胺-N，N′-二丙酸二盐酸盐(EDDP)、乙二胺-N，N′-二(亚甲基膦酸)半水合物(EDDPO)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N，N′，N′-三乙酸(EDTA-OH)、乙二胺-N，N，N′，N′-四(亚甲基膦酸)(EDTPO)、O，O′-二(2-氨乙基)乙二醇四乙酸(EGTA)、N，N′-二(2-羟苄基)乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、1，6-六亚甲基二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(HDTA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(HIDA)、亚氨基二乙酸(IDA)、1，2-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(甲基-EDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、次氮基三丙酸(NTP)、次氮基三(亚甲基膦酸)三钠盐(NTPO)、N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)和三亚乙基四胺-N，N，N′，N″，N″-六乙酸(TTHA)、rhod-2、DMSA、FLUO 3、FURA 2、INDO 1、QUIN 2，或本领域已知其他螯合剂，或其组合。

在一些实施方式中，所述酸是甲酸。在一些实施方式中，所述酸是弱酸，例如苦味酸、乙酸或本领域技术人员已知的其他酸。在一些实施方式中，所述酸是强酸，例如盐酸、硝酸、硫酸或本领域技术人员已知的其他酸。在一些实施方式中，所述酸是卤化氢、卤素含氧酸，例如：次氯酸、氯酸、高氯酸、高碘酸、氟磺酸、硝酸、磷酸、氟锑酸、氟硼酸、六氟磷酸、乙酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、草酸、酒石酸或铬酸。

不被理论束缚，本发明方法使用钙螯合剂，其用作为珊瑚材料的缓脱钙剂(decalcificator)。螯合剂(例如EDTA)与无机晶体外层上存在的离子钙结合，缓慢减小晶体的尺寸。在一些实施方式中，单独添加螯合剂足以获得本发明支架。

根据该方面，所述珊瑚材料进一步与酸例如甲酸接触。不被理论束缚，与仅接触螯合剂的样品相比，添加酸使得珊瑚材料更快速地溶解。

在一些实施方式中，螯合剂和酸的结合使用产生受控的溶解，从而提供均匀的孔径大小和体积。

在一些实施方式中，螯合剂或酸的选择、各自的浓度或其组合将提供由此获得的本发明基于珊瑚的支架内扩大的孔隙的额外控制。应理解本领域技术人员将采用高浓度或低浓度的弱酸或强酸，并选择某种钙螯合剂来获得由本发明方法制备的本发明所述支架中扩大孔隙的所需孔隙体积或平均直径，且这种选择将被认为是本发明方法的具体化的方面。例如和在一些实施方式中，在约5分钟到约24小时的时程中，螯合剂浓度为约0.1％-约20％，以及在一些实施方式中，根据该方面，在约0.1分钟到约24小时的时程中，酸浓度为约0.01％到约10％。

根据该方面和在一些实施方式中，所述接触在一定持续时间内和在一定条件下进行，所述时间和条件根据所述支架的所需最终几何形状而变化。

在本发明的一个实施方式中，术语“部分”是指整体的受限部分。在一个实施方式中，对于由于本发明方法而暴露的表面，术语“部分”是指整个暴露表面的受限部分。例如，在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于100％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于90％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于80％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于70％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于60％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于50％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于40％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于30％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于20％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于10％的暴露表面。在一个实施方式中，一部分暴露表面包括小于1％的暴露表面。

在本发明的一个实施方式中，术语“表面”是指物体的外部或上边界。

在本发明的一个实施方式中，术语“暴露”是指对周围环境开放从而在本发明支架和浸渍介质之间可以发生接触。

根据该方面和在其他实施方式中，由所述方法制备的固体形式包括至少两相，所述相的孔隙体积不同，或所述相包含所述孔隙的平均直径不同的孔隙，或其组合。在一些实施方式中，本发明所述方法是一种手段，通过该手段可以制备上文描述的支架。

在一些实施方式中，本发明提供根据本发明方法制备的支架。

在一些实施方式中，本发明方法形成所制备的包含相的支架，所述相所包含孔隙的平均直径不同，或由此获得的支架的相内的孔隙体积不同，或其组合不同，该平均直径和/或孔隙体积比本发明描述的范围小或大。应理解由本发明方法制得的这种支架代表本发明的预期实施方式和本发明的一部分。

在一个实施方式中，本发明支架包含整个支架内的固体。本领域技术人员可以理解，本发明固体支架仍然包含孔隙样孔穴和/或空隙。

在一个实施方式中，本发明支架包含沿着支架的直角坐标轴的空腔。在一个实施方式中，所述空腔沿着本发明支架的长轴。在一个实施方式中，术语“空腔”是指本发明支架内的空穴。在一个实施方式中，所述空腔包含至少支架中的单个开口，以使得所述空穴能暴露于外部环境。在一个实施方式中，所述空腔为本发明支架提供额外的暴露表面区域。

在一些实施方式中，本发明支架包含多个空腔，其可以是沿任何方向，或在一些实施方式中，本发明支架包含支架内的空腔网络，或在一些实施方式中，多个支架植入修复位点，其中支架空腔对准以形成整个植入支架内的空腔网络。

本领域技术人员可以理解，在本发明支架内选择性地产生空腔或孔隙(自始至终这两个字可互换使用)的方法可通过本领域技术人员已知的任何方法实现，例如，根据本发明描述的方法，例如，通过用浸渍溶液的滴注应用来取代部分支架的浸入浸渍来选择性产生本申请之间内的孔隙。

本发明支架的暴露表面区域提供用于间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞等的附着、生长、增殖或分化或其组合的场所，及用于血管形成的场所。因此，本发明支架的表面区域最终提供用于软骨和/或骨组织再生的有益场所。在本发明的一个实施方式中，支架包含空腔，其中与没有空腔的类似支架相比，空腔的存在增加支架的暴露表面积。

在本发明的一个实施方式中，所述支架包含聚合物涂层。

在一些实施方式中，术语“聚合物涂层”是指与至少一部分支架材料结合的聚合物材料层。在一些实施方式中，这种涂层可以覆盖整个支架，和在一些实施方式中，这种涂层可以渗入支架的孔隙和/或气孔和/或空腔内。在一些实施方式中，这种涂层可以选择性地施加到支架的特定区域，从而它在支架上生成单独的相，和在一些实施方式中，这种聚合物可以施加以使得厚的聚合物层或相与一部分支架结合，从而产生与本发明描述的支架结合的单独的聚合物相。在一些实施方式中，包括生物相容的聚合物。

在一个实施方式中，所述聚合物涂层强化所述支架，和在一些实施方式中，所述聚合物涂层导致更大的细胞吸引和附着到支架上，这随之又特别导致修复量、质量和时机方面的增强修复。在一些实施方式中，所述聚合物涂层增强细胞增殖和/或分化成软骨和/或骨，这随之又特别导致修复量、质量和时机方面的增强修复。

在本发明的一个实施方式中，聚合物涂层是渗透性的。在一个实施方式中，所述渗透性聚合物涂层包括特殊的多孔膜。在一个实施方式中，术语“渗透性的”是指具有气孔和开口。在一个实施方式中，本发明渗透性的聚合物涂层具有允许营养素、治疗化合物、细胞群体、螯合剂或其组合进入的气孔和开口。在一个实施方式中，本发明渗透性的聚合物涂层具有允许营养素、治疗化合物、细胞群体、螯合剂或其组合离开/释放的气孔和开口。

在一个实施方式中，本发明聚合物涂层是非连续的。在一个实施方式中，本发明珊瑚的一个区域或多个子区域不含聚合物涂层，从而允许珊瑚和环境之间的直接接触。

在一些实施方式中，所述支架在其中结合生物相容的聚合物，其经由任何物理或化学结合与霰石或方解石组分结合。在一些实施方式中，所述聚合物是水凝胶的部分，其结合在本发明支架中。在一些实施方式中，这种含水凝胶的支架随后可以冻干或干燥，且随后可以重构。

在包含两个单独相的本发明支架的一些实施方式中，所述生物相容的聚合物仅结合在第一相中或仅结合在第二相中。

这种含聚合物的支架可特别适于软骨修复、再生或其形成的增强。在一些实施方式中，根据该方面，例如，在治疗骨软骨缺损中，所述基于珊瑚的支架为适于结合在受影响的骨内的尺寸，且进一步包括含聚合物的相，当插入受影响的缺损位点内时，该相邻近受影响的软骨。在另一个方面和代表本发明的一个实施方式，所述支架包含聚合物，其渗入支架的孔隙和气孔内，所述支架插入软骨修复位点内且所述聚合物促进软骨生长、再生或缺损位点的康复。

这种含聚合物的支架可特别适于骨修复、再生或其形成的增强。在一些实施方式中，根据该方面，例如，在治疗骨破损或破碎、骨疾病或骨缺损中，所述基于珊瑚的支架为适于结合在受影响的骨内的尺寸，且进一步包含聚合物，其渗入支架孔隙和气孔内，所述支架插入骨内且所述聚合物促进骨生长、再生或缺损位点的康复。

在一个实施方式中，本发明的聚合物涂层包含天然聚合物，其包括胶原蛋白、弹性蛋白、丝(silk)、透明质酸、透明质酸钠、交联透明质酸、壳聚糖、交联壳聚糖、藻酸盐、藻酸钙、交联藻酸钙及其任意组合。

在一个实施方式中，所述聚合物包含合成的改性天然聚合物，且可以包括纤维素衍生物，例如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝化纤维素。适当的纤维素衍生物的实例包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐。

在本发明的一个实施方式中，聚合物包含合成的可生物降解聚合物。在本发明的一个实施方式中，合成的可生物降解聚合物包括α-羟酸，包括聚乳酸、聚乙醇酸、其对应异构体、其共聚物、聚原酸酯(polyorthoesters)及其组合。

在一个实施方式中，本发明聚合物包括聚(氰基丙烯酸酯)、聚(烷基-氰基丙烯酸酯)、聚(缩酮)、聚(己内酯)、聚(缩醛)、聚(α-羟基-酯)、聚(α-羟基-酯)、聚(羟基-链烷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(亚氨基-碳酸酯)、聚(酯)、聚(醚)、聚(碳酸酯)、聚(酰胺)、聚(硅氧烷)、聚(硅烷)、聚(硫醚)、聚(酰亚胺)、聚(脲)、聚(酰胺-烯胺)、聚(有机酸)、聚(电解质)、聚(对-二氧环己酮)、聚(烯烃)、泊洛沙姆、无机或有机金属聚合物、弹性体、或其任何衍生物、或由其组合获得的共聚物。

在一个实施方式中，本发明聚合物包括聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。在另一个实施方式中，所述聚合物包括聚(D，L-丙交酯)(PLA)。在另一个实施方式中，所述聚合物包括聚(D，L-乙交酯)(PGA)。在一个实施方式中，所述聚合物包括糖胺聚糖。

在一个实施方式中，所述聚合物包括合成的可降解聚合物，其可包括但不限于聚羟酸，例如聚(丙交酯)、聚(乙交酯)及其共聚物；聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚(羟丁酸)；聚(羟戊酸)；聚[丙交酯-共-(ε-己内酯)]；聚[乙交酯-共(ε-己内酯)]；聚(碳酸酯)、聚(伪氨基酸)；聚(氨基酸)；聚(羟基链烷酸酯)；聚(酐)；聚(原酸酯)；及其混合物和共聚物。

在本发明的一个实施方式中，聚合物包括蛋白，例如玉米蛋白、改性玉米蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、α-胎蛋白、球蛋白、巨球蛋白、粘连蛋白(cohesin)、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨保护素(osteoprotegerin)或本领域技术人员理解的其他蛋白。在另一个实施方式中，聚合物可以包括环糖(cyclic sugar)、环糊精、环糊精的合成衍生物、糖脂、糖胺聚糖、低聚糖、聚糖例如藻酸盐、角叉菜胶(χ，λ，μ，κ)、壳聚糖、纤维素、硫酸软骨素、凝胶多糖(curdlan)、葡聚糖、爱生兰(elsinan)、红藻胶(furcellran)、半乳糖甘露聚糖、结冷胶(gellan)、糖原、阿拉伯胶、半纤维素、菊粉、刺梧桐树胶、果聚糖、果胶、支链淀粉(pullulan)、茁霉多糖、金属卟啉(prophyran)、硬葡聚糖、淀粉、黄蓍胶、威兰胶(welan)、黄原胶、木聚糖、木糖葡萄糖、透明质酸、甲壳质或聚(3-羟基链烷酸)，例如聚(β-羟丁酸)、聚(3-羟辛酸)或聚(3-羟脂肪酸)，或其任意组合。

在一个实施方式中，所述聚合物包括可生物蚀解聚合物，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(酐)和聚(原酸酯)，其由于聚合物的光滑表面的侵蚀而具有暴露于外表面的羧基，其也可使用。在一个实施方式中，所述聚合物包含不稳定键，例如聚酐和聚酯。

在一个实施方式中，聚合物可以包含其化学衍生物(化学基团如烷基、亚烷基的置换、增加和去除；羟基化；氧化及本领域技术人员常规进行的其他修饰)、例如单独的蛋白质或碳水化合物的或者与合成聚合物组合的混合物。

在本发明的一个实施方式中，聚合物是可生物降解的。在一个实施方式中，术语“可生物降解”或其语法形式是指本发明材料，其在其所存在的受试者生物环境中降解。在一个实施方式中，所述可生物降解的材料经历降解，在降解期间释放酸性产物，或在另一个实施方式中释放碱性产物。在一个实施方式中，生物降解包括材料例如经由消化通过生化过程降解成其组成亚基。在一个实施方式中，生物降解可以包括例如本发明聚合物骨架中键的裂解(不管是共价键或其它键)。在另一个实施方式中，生物降解可以包括侧链内键或例如将侧链连接至聚合物骨架的键(不管是共价键或其它键)的裂解。

在一个实施方式中，本发明珊瑚通过利用交联剂与聚合物涂层共价结合。在一个实施方式中，短语“交联剂”是指促进2个原子之间共价键形成的试剂。在一个实施方式中，所述交联剂是零长度交联剂。

在一个实施方式中，所述交联剂是(1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N-磺基羟基琥珀酰胺(磺基NHS)、5-碘嘧啶、N-烷氧羰基二氢喹啉、吡咯喹啉醌或其组合。

在一个实施方式中，所述交联剂是同型双功能交联剂，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯或二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、同型双功能亚氨酯(例如己二亚氨酸二甲酯或庚二亚氨酸二甲酯)、巯基反应性交联剂(例如1，4-二-[3’-(2’-二硫吡啶)丙酰氨基]丁烷)、二氟苯衍生物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)、醛(例如甲醛、戊二醛)、二-环氧化物(例如1，4-丁二醇二缩水甘油醚)、酰肼(例如己二酸二酰肼)、二-重氮衍生物(例如o-联甲苯胺)、二-烷基卤或其组合。

在一个实施方式中，所述交联剂是异双功能交联剂，例如，胺反应性和巯基反应性交联剂(例如N-琥珀酰亚胺3-(2-二硫吡啶)丙酸酯、羰基反应性和巯基反应性交联剂(例如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)，或其组合。

在一些实施方式中，所述交联剂是三功能交联剂，例如，4-叠氮-2-硝基苯基生物胞素-4-硝基苯基酯、磺基琥珀酰亚胺基-2-[6-生物素酰胺]-2-(对-叠氮苯甲酰胺基)己烷酰胺基]乙基-1，3’-二硫丙酸(磺基-SBED)，或其组合。

在另一个实施方式中，所述交联剂是酶。在本发明的一个实施方式中，所述交联剂包括转谷氨酰胺酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、聚合酶、连接酶或其组合。

在给定应用中，为活性而使用的交联剂浓度的选择将随所选体积、试剂和聚合物而变化，如本领域技术人员所知的。

在一个实施方式中，本发明珊瑚和本发明聚合物涂层的结合包括物理和/或机械结合。例如，在一个实施方式中，物理和/或机械结合可包括采用任何手段的吸收、风干、使用交联剂、施加热、施加真空、施加冻干方法、冷冻、施加机械力或其任意组合，来促进本发明描述的珊瑚和聚合物涂层之间的物理结合。

以下事实对于本领域技术人员而言是显而易见的：聚合物涂层及其组分的物理和/或化学性质可以影响本发明方法及其试剂盒在诱导或增强软骨和/或骨修复中的用途。

在一个实施方式中，本发明的聚合物涂层的厚度为2.0μm到0.1μm。在一个实施方式中，聚合物涂层的厚度为约1.0μm。在一个实施方式中，本发明的聚合物涂层的厚度为10μm到50μm。在一个实施方式中，聚合物涂层的厚度为约10-25、或约15-30、或约25-50μm。

在一些实施方式中，所述聚合物涂层是薄涂层，其与本发明支架结合并具有以上指出的厚度。

在一些实施方式中，所述聚合物涂层涂覆于整个本发明支架，这样，在一些实施方式中，本发明支架内的气孔和孔隙填充本发明描述的聚合物，且这种聚合物涂层的厚度可以为约60-900μm。

在一些实施方式中，所述聚合物涂层涂覆于支架的末端或一部分上，从而在本发明支架上形成额外的聚合物相。根据该方面和在一些实施方式中，所述聚合物涂层的厚度为约0.1-10mm。

在一些实施方式中，含有聚合物涂层的多个支架植入修复位点中，其中第一支架的涂层厚度可相比于植入修复位点的第二支架的涂层厚度发生变化。涂层厚度的变化可反映本发明描述的范围。

在一个实施方式中，聚合物涂层的厚度影响本发明支架的物理特性。例如，聚合物涂层的厚度可以影响本发明支架的弹性、拉伸强度、粘着性或保持力，或其任意组合。在一个实施方式中，聚合物涂层增加本发明支架的弹性。在一个实施方式中，聚合物涂层增加本发明支架的拉伸强度。在一个实施方式中，聚合物涂层的粘性与间充质干细胞、血管、软骨修复位点处组织、软骨组织、或骨组织、或其组合的附着有关。在一个实施方式中，聚合物涂层降低本发明支架的粘着性。在一个实施方式中，聚合物涂层增加本发明支架的粘着性。本领域技术人员将理解，聚合物涂层可以增加对于一个物体的粘着性而降低对于另一个物体的粘着性。例如，在一个实施方式中，所述聚合物涂层增加对间充质干细胞的粘着性而降低感染剂的粘着性。在一个实施方式中，聚合物涂层的保持力与细胞群体的保持有关。在一个实施方式中，保持在聚合物涂层内的细胞群体是间充质干细胞群体、软骨细胞群体、成骨细胞群体等。在一个实施方式中，聚合物涂层的保持力与效应化合物的保持有关。

在一个实施方式中，聚合物涂层的厚度影响施加于本发明支架上的间充质干细胞的增殖和/或分化，或影响与本发明支架的软骨和/或骨形成或修复有关的细胞的活化或迁移，或其组合。

在本发明的一个实施方式中，根据本发明支架、使用方法或试剂盒使用的细胞进行工程化从而表达所需产物。

在一个实施方式中，本发明的聚合物涂层包含效应化合物。在一个实施方式中，所述效应化合物直接应用于本发明支架的聚合物涂层中。在一个实施方式中，所述效应化合物包括本发明试剂盒的成分，从而如本发明所述的用于并入本发明支架中。在一个实施方式中，所述效应化合物不分散在任何溶剂中而直接应用于本发明聚合物涂层中。

在本发明的一个实施方式中，所述聚合物涂层包含效应化合物，其包括细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、生长因子、螯合剂、细胞群体、治疗化合物或抗生素、或其任意组合。

在一个实施方式中，用于本发明支架和/或试剂盒和/或本发明方法中的效应化合物尤其可以包括细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、生长因子、螯合剂、细胞群体、治疗化合物、抗炎化合物、促血管生成化合物或抗生素，或其任意组合。

在一个实施方式中，短语“细胞群体”是指转染细胞群体、转导细胞群体、转化细胞群体或从受试者分离的细胞群体，或其组合。在一些实施方式中，转染、转导或转化细胞可以结合入本发明的聚合物涂层或支架，或其组合中。

在一个实施方式中，转染、转导或转化细胞可以结合入本发明的聚合物涂层或支架中。

在一个实施方式中，本发明细胞群体包括间充质干细胞。在一个实施方式中，所述间充质干细胞是转化的。在一个实施方式中，细胞群体包含有益于软骨和/或骨形成和/或修复的细胞，例如成软骨细胞或软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前驱细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合。在另一个实施方式中，前驱细胞可指软骨细胞和其他细胞的组合；骨细胞和其他细胞的组合；滑膜细胞和其他细胞的组合；骨髓细胞和其他细胞的组合；间充质细胞和其他细胞的组合；基质细胞和其他细胞的组合；干细胞和其他细胞的组合；胚胎干细胞和其他细胞的组合；从成人组织分离的前驱细胞和其他细胞的组合；外周血液祖细胞和其他细胞的组合；从成人组织分离的干细胞和其他细胞的组合；遗传转化细胞和其他细胞的组合。用于本发明方法的前驱细胞由受体哺乳动物(即自体的)或同源哺乳动物的器官组织制备。在另一个实施方式中，可以使用同和异体和异种的前驱细胞。

在本发明一个实施方式中，短语“治疗化合物”是指肽、蛋白或核酸，或其组合。在另一个实施方式中，所述治疗化合物是抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗寄生虫化合物。在另一个实施方式中，所述治疗化合物具有细胞毒性或抗癌活性。在另一个实施方式中，所述治疗化合物是酶、受体、通道蛋白、激素、细胞因子或生长因子。在另一个实施方式中，所述治疗化合物是免疫刺激性的。在另一个实施方式中，所述治疗化合物抑制炎性或免疫反应。在一个实施方式中，所述治疗化合物包括促血管生成因子。

在一个实施方式中，短语“治疗化合物”是指当提供给需要的受试者时，提供有益效果的分子。在一些情况下，所述分子的治疗性在于它起到补充受试者中这种分子的缺失或存在减少的作用。在一个实施方式中，所述分子是编码不存在蛋白的表达的核酸，例如在内源无效突变体的情况下被异种蛋白的表达补偿。在其他实施方式中，内源蛋白发生突变并产生非功能蛋白，这通过异源功能蛋白的表达补偿。在其他实施方式中，异源蛋白的表达是对低的内源水平的附加，导致给定蛋白的累积增强表达。在其他实施方式中，所述分子刺激信号传导级联，该信号传导级联用于细胞或宿主功能的关键成分的表达或分泌或其他。

在另一个实施方式中，所述治疗化合物可以是天然或非天然的胰岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、激酶、磷酸酶、转糖基酶、胰蛋白酶元、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶、激素、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、三酰甘油脂肪酶、磷脂酶A2、弹性蛋白酶、淀粉酶、凝血因子、UDP葡糖醛酸基转移酶、鸟氨酸氨甲酸基转移酶、细胞色素p450酶、腺苷脱氨酶、血清胸腺因子、胸腺体液因子、促胸腺生成素、生长激素、生长调节素、共刺激因子、抗体、集落刺激因子、促红细胞生成因子、表皮生长因子、肝促红细胞生成因子(肝细胞生成素)、肝细胞生长因子、白介素、干扰素、负性生长因子(negativegrowth factor)、成纤维细胞生长因子、α家族转化生长因子、β家族转化生长因子、胃泌素、分泌素、缩胆囊肽、生长激素抑制素、血清素、P物质、转录因子或其组合。

在一个实施方式中，所述效应化合物包括抗寄生虫剂、抗组胺剂、免疫调节剂、抗凝血剂、表面活性剂、抗体、β肾上腺素能受体抑制剂、钙通道阻断剂、ace抑制剂、生长因子、激素、DNA、siRNA或载体，或其任意组合。

在一个实施方式中，短语“效应化合物”是指当应用于本发明支架、试剂盒和/或方法时，具有用于治疗、预防、阻止、抑制、延迟或降低感染、疾病、紊乱或病症的发生率的特定目的或应用的任何试剂或化合物。在一个实施方式中，本发明效应化合物将产生仅使该化合物成像的能力的预期效果。在一些实施方式中，所述效应化合物可用于使该化合物存在的位点成像，然而，这种能力对使用该化合物的目的或选择而言是次要的。

在本发明的一个实施方式中，当在本发明中提及时，术语“效应化合物”应理解为也包括“药物”和“试剂”，且代表希望其结合在本发明支架和/或试剂盒内或需要其用途的分子。在一个实施方式中，所述试剂直接结合在本发明支架和/或试剂盒中。在另一个实施方式中，所述试剂通过与本发明聚合物涂层、珊瑚或珊瑚颗粒和/或本发明试剂盒的物理相互作用或与其结合而并入本发明支架和/或试剂盒中。

在一个实施方式中，用于本发明支架和/或试剂盒和/或本发明方法中的化合物尤其可以包括抗体或抗体片段、肽、寡聚核苷酸、生物靶标的配体、免疫缀合物、化学模拟官能团、糖脂、标记试剂、酶、金属离子螯合剂、酶辅助因子、细胞毒性化合物、杀菌化合物、抑菌化合物、杀真菌化合物、抑真菌化合物、化学治疗剂、生长因子、激素、细胞因子、毒素、前药、抗代谢物、微管抑制剂、放射性材料或靶向部分，或其任意组合。

在一个实施方式中，本发明支架和/或试剂盒和/或本发明方法包括或利用了寡聚核苷酸、核酸或载体。在一些实施方式中，术语“寡聚核苷酸”可与术语“核酸”互换使用，且可以指可包括但不限于，原核序列、真核mRNA、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA，以及甚至合成DNA序列的分子。该术语也指包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列。

在一个实施方式中，本发明支架和/或试剂盒和/或本发明使用方法可以包括核酸，或在另一个实施方式中，本发明支架和/或试剂盒和/或本发明使用方法可以包括递送作为特定载体的一部分的核酸。在一个实施方式中，编码目的序列的多核苷酸片段可以结合到适于转导/转化哺乳动物细胞和适于引导转导细胞内重组产物的表达的可商购的表达载体系统中。应理解，这种可商购的载体系统可经由常用重组技术容易地改性，从而替换、复制或突变存在的启动子或增强子序列和/或引入任何其他的多核苷酸序列，例如，编码其他选择标记物的序列或编码报告多肽的序列。

在一个实施方式中，本发明支架结合干细胞或祖细胞或前驱细胞。这种细胞可从哺乳动物供体(例如，患者自身细胞)、来自供体的细胞培养物或已建立的培养细胞系中直接获得。在一些实施方式中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、猴、猿或人。相同种和/或相同免疫特性的细胞可通过活检从患者或近亲中获得。使用标准细胞培养技术和条件，然后将细胞加入培养基中生长直到汇合以及必要时使用。可以培养所述细胞直到获得用于特定应用的足够数量的细胞。

在一个实施方式中，本发明支架结合可以参与软骨和/或骨形成或修复的任何细胞。在一些实施方式中，这种细胞代表自体移植物，因为细胞是在体外培养以将该细胞接种在本发明支架上，且这种接种的支架植入受试者体内。

在一些实施方式中，这种细胞可代表同种异体移植物或异种移植物，其可结合在本发明支架中并植入修复位点内。

在一个实施方式中，本发明珊瑚包括来自培养足以将细胞接种在珊瑚上的一段时间的珊瑚体外培养物的细胞群体。在一个实施方式中，所述细胞群体是间充质干细胞群体；软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前驱细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合。在一个实施方式中，体外接种的间充质干细胞；软骨细胞；纤维软骨细胞；骨细胞；成骨细胞；破骨细胞；滑膜细胞；骨髓细胞；基质细胞；干细胞；胚胎干细胞；来源于脂肪组织的前驱细胞；外周血液祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；或其组合被转化。在一个实施方式中，所述细胞群体包括有益于软骨修复的细胞群体。在一个实施方式中，所述培养物包含螯合剂。在本发明的一个实施方式中，培养物中的螯合剂包括钙螯合剂。

在一个实施方式中，本发明的方法诱导或增强软骨和/或骨形成和/或修复，其中所述方法包括将本发明支架植入受试者的软骨和/或骨形成和/或修复位点内，其中所述支架的区域穿过骨，导致所述区域插入骨髓孔隙内，邻近软骨和/或骨形成和/或修复位点。

在一个实施方式中，短语“软骨修复”是指使软骨缺损恢复为更健康的状态。在一个实施方式中，恢复软骨导致软骨组织再生。在一个实施方式中，恢复软骨导致完全或部分厚度的关节软骨缺损的再生。在一个实施方式中，恢复软骨导致软骨修复位点处软骨组织的完全或部分再生。在一个实施方式中，软骨修复可导致缺失或缺损骨组织的恢复/修复，其中软骨缺损的修复需要除去软骨修复位点处的骨组织。在一个实施方式中，恢复软骨导致骨软骨缺损的再生。在一个实施方式中，软骨修复包括恢复关节(例如膝、肘、髋、肩关节)、耳、鼻或气管(wind pipe)的软骨缺损。

在一个实施方式中，短语“骨修复”是指将骨缺损恢复到更健康的状态。在一个实施方式中，恢复骨导致骨组织再生。在一个实施方式中，恢复骨导致骨组织内的任何骨裂或孔隙的填充。在一个实施方式中，恢复骨导致骨修复位点处骨组织的完全或部分再生。在一个实施方式中，骨修复导致缺失或有缺陷的骨组织的恢复/修复。在一个实施方式中，骨修复包括根据需要修复任何骨的骨缺损。

在一些实施方式中，短语“骨修复”是指治疗患有骨质疏松症、佩吉特病、纤维性结构不良或骨营养不良的受试者。在另一个实施方式中，所述受试者具有骨和/或软骨虚弱。在另一个实施方式中，所述受设者具有其他骨重塑疾病，包括骨软化症、软骨病、类风湿性关节炎、软骨发育不全、骨软骨炎(osteochodrytis)、甲状旁腺机能亢进、成骨不全(eogenesis imperfec)、先天性低磷酸酯酶症、纤维瘤损害、多发性骨髓瘤、异常骨转换、溶骨性骨疾病、牙周病，或其组合。在一个实施方式中，骨重塑疾病包括特征在于有机基质紊乱的骨疾病、骨矿化、骨重塑、内分泌、营养及调节骨骼和无机物体内平衡的其他因子，或其组合。这种疾病可以是遗传性或获得性的，且在一个实施方式中，这种疾病是全身性的并影响整个骨骼系统。

本发明支架、试剂盒和方法也可在骨和/或软骨缺陷是由骨重塑疾病以外的因素所引起的病症中用于增强骨和/或软骨形成。这种骨缺陷包括骨折、骨创伤、与创伤骨手术后、关节修复手术后、骨整形手术后、骨化疗、牙科手术后和骨放疗有关的病症。骨折包括所有种类的微观和宏观骨折。在一个实施方式中，骨折的一些实例包括撕脱骨折、粉碎性骨折、横骨折、斜形骨折、扭转骨折、节段性骨折、移位骨折、嵌入骨折、绿枝性骨折、隆起骨折、疲劳骨折、关节内骨折(骨骺骨折)、闭合性骨折(单纯骨折)、开放性骨折(有创骨折)和潜隐骨折。在一个实施方式中，使用本发明方法治疗的骨折是非连接骨折。

在一个实施方式中，本发明支架、试剂盒和方法也可用于增强长骨骨折修复；在节段性缺损中生成骨；提供用于骨折的骨移植替代物；促进肿瘤重建或脊柱融合；提供虚弱骨或疏松骨的局部治疗(通过注射)，例如在髋、椎骨或腕的骨质疏松症中，或其组合。在另一个实施方式中，本发明支架、试剂盒和方法也可用于加快骨折的长骨修复；治疗长骨骨折的延迟连接或不连接或者脊柱融合的假关节；诱导髋或膝的无血管形成性坏死中新骨的形成，或其组合的方法中。

在一个实施方式中，本发明方法包括诱导和增强软骨和/或骨修复，其中将本发明支架植入软骨和/或骨修复位点内影响并改善软骨和/或骨修复。

在一个实施方式中，本发明方法诱导或增强软骨和/或骨修复，其中所述支架将细胞群体吸引至支架上，从而影响并改善软骨和/或骨修复。

本发明支架的3D结构和化学组成对于将支架具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内；对于诱导或增强软骨和/或骨修复的细胞群体的细胞识别、附着、增殖和分化或其组合非常重要。

在一个实施方式中，用于本发明方法的本发明支架在植入受试者之前包含接种的细胞群体。在一个实施方式中，本发明方法诱导或增强软骨和/或骨修复，其中将本发明支架植入受试者促进转化的间充质干细胞的附着、增殖或分化或其组合。在一个实施方式中，本发明方法诱导或增强软骨和/或骨修复，其中将本发明支架植入受试者中促进血管形成。

在一个实施方式中，用于本发明方法中的支架包含至少一个区域，其将珊瑚支架具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度处，以使得将支架植入受试者诱导或增强软骨和/或骨修复。在一个实施方式中，用于本发明方法中的支架包含至少一个区域，其将珊瑚具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度处，以使得植入支架使本发明支架和软骨和/或骨修复位点之间的接触面积最大化。

在一个实施方式中，用于本发明方法中的支架可用于吸收或结合以及递送有助于软骨和/或骨修复或再生过程或具有其他希望的治疗活性的其他治疗活性物质。这种物质例如包括可被引入成型产品或结构的孔穴中的已知的合成或半合成抗生素，或可用于协助或促进骨生长的生长因子(例如转化生长因于)或骨形态发生蛋白中的一种。

在本发明的任何实施方式中，用于本发明方法中的支架还可以包括其他化合物，或和其他化合物一起植入，所述化合物例如为抗氧化剂、生长因子、细胞因子、抗生素、抗炎剂、免疫抑制剂、防腐剂、止痛药、其他治疗剂和赋形剂。在一个实施方式中，除HMG-CoA还原酶抑制剂之外，可以给药的生长因子的实例包括但不限于，表皮生长因子(EGF)、转化生长因于-α(TGF-α)、转化生长因于-β(TGF-β)、人内皮细胞生长因子(ECGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、软骨源形态发生蛋白(CDMP)、血小板源性生长因子(PDGF)或其任意组合。抗生素的实例包括抗微生物剂和抗菌剂。

在一个实施方式中，本发明方法包括将本发明支架植入患有软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病的受试者中。

在一个实施方式中，术语“植入”是指将本发明支架插入并固定在受试者的活位点(living site)中，所述位点包括软骨和/或骨修复位点。在一个实施方式中，本发明方法植入支架，使得该支架的区域此时接近间充质干细胞、营养物、血管、或效应化合物，或其组合。在一个实施方式中，本发明方法包括将本发明支架植入受试者中，其中所述方法导致去除软骨和/或骨和/或其他组织的区域，从而使支架的区域穿过软骨和/或骨和/或其他组织，以及在一些实施方式中，到达骨髓孔隙。

本领域临床医生将认识到，需要将支架植入软骨和/或骨修复位点内的本发明方法可能需要准备软骨和/或骨修复位点。这些准备可以发生在植入支架之前或和植入同时发生。例如，首先可以通过邻近软骨和/或骨修复位点的软骨和/或骨组织和/或其他组织钻孔，来生成尺寸适合于用于本发明方法中的支架的通道。然后将支架植入该位点内，这样支架的区域穿过钻孔的软骨和/或骨组织。或者，所述支架可以附着至能够穿透软骨和/或骨或其他组织或其组合的本发明工具上。在这种情况下，当所述工具穿过软骨和/或骨组织时，附着的支架也同时植入。

在一些实施方式中，在将支架植入修复位点内或将几个支架植入修复位点内之后，处理支架来优化结合及最佳软骨和/或骨修复。在一些实施方式中，这种处理可以包括切割、砂磨或使该一个或多个支架表面光滑的处理，从而获得最佳修复。

在一个实施方式中，本发明方法包括将支架植入人类受试者中。

在一个实施方式中，本发明可包括将支架放置在软骨和/或骨修复位点处的表面上。在一个实施方式中，本发明可包括珊瑚修复位点处的组织环境成分迁移到珊瑚暴露表面上，因此本发明珊瑚和环境之间发生接触。

在一个实施方式中，本发明方法可包括植入支架以使得支架的升高暴露表面与软骨和/或骨修复位点处的组织或邻近组织强制地接触。以这种方式，此时邻近软骨和/或骨修复位点的珊瑚的暴露表面邻近含有软骨组织、骨组织、骨髓组织、间充质干细胞、营养物、血管或其他的效应化合物或其组合的环境，它们可有益于软骨和/或骨修复。

在本发明的一个实施方式中，短语“支架长轴”和“支架纵轴”可互换使用，是指纵向平行于支架延伸的线。术语“纵向”是指支架长度的方向。有可能原来的几何形状经切割以产生原来支架的水平截面。在这种情况下纵向应该从沿着支架长度的原来方向观察。

对于本领域技术人员而言将是显而易见的是：本发明支架的物理和/或化学性质及其组分可影响用于诱导或增强软骨和/或骨修复的本发明的使用方法及其试剂盒。

在一个实施方式中，用于诱导或增强软骨和/或骨修复的本发明方法使用本发明支架的3D几何形状来使得将支架具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内。

在一个实施方式中，术语“邻近”是指某物放置为接近于特定场所。在一个实施方式中，通过使支架的升高区域与位于或接近于软骨和/或骨修复位点的组织接触来使本发明支架强制保持在软骨和/或骨修复位点内的位置中。

本领域技术人员将理解，软骨和/或骨修复位点的形状和本发明3D支架的形状提供将支架稳固定位在软骨和/或骨修复位点内的许多不同的组合。在一种实施方式中，本发明支架在用于软骨和/或骨修复的本发明方法中之前成形。在一种实施方式中，本发明支架在用于软骨和/或骨修复的本发明方法中的同时成形。通过在使支架在用于本发明方法中的同时使支架成形，可精确选择支架的尺寸以用于修复位点内支架的具体定位。

在一个实施方式中，本发明方法包括将支架植入非人类哺乳动物和非哺乳动物受试者中。在一个实施方式中，本发明方法包括将支架植入马、赛马、母牛、公牛、猪、兔、山羊、绵羊、家畜、宠物、狗、猫、猴、猿、鸟和家禽中。

在一个实施方式中，本发明方法用于软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病的诱导或增强修复。在一个实施方式中，所述软骨缺损由创伤、撕裂、运动损伤、全厚度关节软骨缺损、关节缺损或重复应力损伤(例如骨软骨骨折、由于十字韧带损伤引起的继发损害)而引起。在一个实施方式中，所述软骨紊乱包括软骨疾病。在一个实施方式中，本发明方法诱导或增强骨关节炎、类风湿性关节炎、无菌性坏死、剥脱性骨软骨炎、关节软骨损伤、髌骨软化症、软骨肉瘤、头和颈软骨肉瘤、肋软骨炎、内生软骨瘤、拇趾僵硬、髋臼盂唇撕裂、剥脱性骨软骨炎、半月板撕裂、复发性多软骨炎、犬关节炎、第四鳃弓缺损或皱缩耳的软骨修复。在一个实施方式中，本发明方法诱导或增强退行性软骨疾病中的软骨修复，所述疾病包括至少部分地以机体结缔组织的退化或新陈代谢紊乱为特征的疾病，不仅包括关节或相关结构(包括肌肉、粘液囊(滑膜)、腱和纤维组织)，而且包括生长板、半月板系统和椎间盘。

在一个实施方式中，使用本发明支架和/或至少一种工具通过本发明方法修复的软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病包括受试者的关节(例如膝、肘、踝、肩或髋关节)、回旋肌杯(rotator cup)、耳、鼻、气管、骨盆、脊柱、肋骨、颌、颅骨或受试者内发现软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病的任何其他位点。

在一个实施方式中，用于本发明方法和/或试剂盒中的本发明支架的3D形状和化学组成将由熟练的临床医生基于以下因素确定：例如待治疗病症的准确性质、病症严重性、受试者年龄和总体身体条件、体重和个体受试者的反应等。

在一个实施方式中，进行本发明方法期间本发明支架的具体定位将由熟练的临床医生基于以下因素确定：例如待治疗病症的准确性质、病症严重性、受试者年龄和总体身体条件、体重和个体受试者的反应等。

在一个实施方式中，本发明方法通过检验软骨和/或骨组织修复位点来评价，其中评估是通过组织学、组织化学、触诊、活检、内诊镜检查、关节镜检查或包含X射线照片、计算机化X射线密度测定法、计算机化荧光密度测定法、CT、MRI或本领域已知的其他其他方法的成像技术，或其任意组合进行。

在一个实施方式中，本发明提供辅助软骨和/或骨修复的器械，其包括将本发明支架引导至软骨和/或骨修复位点的最佳角度处的工具；将本发明支架引导至软骨和/或骨修复位点的最佳角度处的工具；将本发明支架递送至软骨和/或骨修复位点的工具；将本发明支架插入软骨和/或骨修复位点的工具，从而使所述支架穿过软骨和/或骨并插入骨髓孔隙内，邻近所述软骨和/或骨修复位点；将本发明支架在软骨和/或骨修复位点释放的工具；或能提供其组合的工具，其中在将支架放置在软骨和/或骨修复位点内之后，所述工具可与所述支架分开。

在一个实施方式中，本发明器械包括至少单个工具。

在一个实施方式中，本发明方法利用本发明器械，其中植入本发明支架包括将珊瑚具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度处。

在一些实施方式中，这种工具可以包含用于将支架插入修复位点中的工具，所述工具特别地构造成保持支架并将其最佳地定位于位点内。在一些实施方式中，可以将用于不同尺寸或不同形状的支架的多个工具整合在本发明试剂盒内，以适应一个或多个软骨和/或骨修复位点内不同支架的植入。在一些实施方式中，本发明试剂盒包括在插入修复位点后处理支架的工具，从而实现用于最佳软骨和/或骨修复的最佳光滑表面。在一些实施方式中，本发明试剂盒还可以包括用于在修复位点和间充质干细胞源之间产生孔隙的工具。在一些实施方式中，所述试剂盒可以包括工件，其插入常规工具内来病这样一种孔隙，例如，具有容易且适当地钻通附近的骨的尺寸和深度的钻头包括在本发明试剂盒中，从而所述支架可以插入软骨和/或骨修复位点中，其中至少一部分支架或相邻支架插入软骨和/或骨修复位点内并到达下层骨髓，从而作为迁移间充质干细胞的来源以实现软骨和/或骨修复。

本领域技术人员应理解，通过钻通组织以到达骨髓孔隙而生成的通道使得本发明支架能够到达骨髓孔隙并稳固地植入该位点。所述支架必须充分固定在软骨和/或骨修复位点内，这样它不会作为关节连接而移位。本领域临床医生也应理解，钻孔通道的范围使得支架被牢固固定，但该通道不至于非常大以引起周围组织的损害扩大。

软骨和/或骨修复位点的准备也可以包括去除受损软骨或骨组织，或其组合。因此，在一个实施方式中，本发明工具钻出通道，从而去除修复位点处或邻近修复位点的受损组织。

本发明工具可以疚备支架将跟随的通道、指引支架植入和同时植入支架。通过同时准备位点和置入支架，受试者经受的入侵时间或最小侵入性外科手术将被缩短。

在一个实施方式中，将支架放置在软骨修复位点内后，支架区域与工具分离。在一个实施方式中，所述区域与工具分离，其中工具与支架的分离包括紫外线激活的分离、激光激活的分离、转矩依赖性分离或化学激活的分离或其组合。在一个实施方式中，工具与支架的分离留下具体定位在修复位点内的支架。分离机制也不应对修复位点造成额外的创伤。

在一个实施方式中，工具与支架的分离使得支架被具体定位并限制在软骨和/或骨修复位点内的最佳深度和角度处。在一个实施方式中，工具与支架的分离使得支架植入受试者的软骨和/或骨修复位点内，其中支架区域穿过软骨和/或骨，使得所述区域插入骨髓孔隙内，邻近软骨和/或骨修复位点。

在一个实施方式中，本发明提供用于组织修复的试剂盒，包括本发明的支架、本发明的至少一个工具和用于在组织修复中使用该支架的指导。

本领域技术人员应理解，熟练的临床医生对试剂盒的选择将取决于以下因素：例如待治疗病症的准确性质、病症严重性、受试者年龄和总体身体条件、体重和个体受试者的反应等。

因此，在一个实施方式中，本发明试剂盒所包含的支架包括不同的尺寸、形状或化学组合物或其组合。在一个实施方式中，本发明提供用于软骨和/或骨修复的试剂盒，包括本发明的支架、本发明的至少一种工具和用于在软骨修复中使用该支架的指导。

对于本领域技术人员而言将是显而易见的是：在不离开本发明精神和范围的情况下，本发明支架、试剂盒、过程和方法可以进行各种修改和变化。

在一些实施方式中，术语“包含”或其语法形式是指包含本发明的指定组分，也包含其他活性剂，以及制药工业已知的药学可接受的载体、赋形剂、润滑剂、稳定剂等。

在一个实施方式中，本发明提供组合制剂。在一个实施方式中，术语“组合制刘”特别定义为“部件套装”，是指上述定义的组合伴体可单独使用或以不同组合使用，即，同时、共同、单独或相继。

实施例

实施例1：本发明的基于珊瑚支架的应用

本发明的基于珊瑚的支架可插入需要治疗的受试者的软骨、骨或其组合中。

在一些实施方式中，这种放置将包括在该区域钻孔来暴露需要植入的位点，并使支架紧密配合在缺损/位点内。

对于软骨修复、再生等的植入而言，支架植入所需软骨位点中，且在位于附近的骨内，以这种方式，所述珊瑚支架通过两种类型的组织嫁接，即软骨和骨。图1用示意图描述将本发明支架定向在软骨和/或骨修复位点内的草图。

如本领域技术人员所理解，支架可通过本发明描述的任何实施方式制备。

预期所述支架用于兽医学应用，以及用于人类受试者治疗中。应理解可进行动物研究来确定最佳结构和植入参数和过程。

例如，动物研究可包括如本发明所述将支架植入动物受试者内，且外科手术后在较长时期内检查并观察支架。各动物的未经处理的膝用作这种外科手术后的对比对照。以适当的时间间隔，处死动物并进行组织学观察。检查软骨修复位点的适当时期是外科手术后2.5、4、9、12、26、52周。在这一时间，拍摄关节面，从修复位点去除组织，并制备用于组织学观察。具体地，使用精细锯去除由移植区域和周围组织构成的块。进一步处理该材料用于常规组织学，所述处理包括缓慢脱钙。

实施例2：骨软骨缺损的恢复

使用圆形植入物在成年山羊中进行骨软骨缺损的恢复，植入物的直径为6mm，长度为8mm。从各山羊的股骨内髁钻出5.5x8mm芯的软骨和骨组织(图2A)并将植入物压配到软骨和骨修复位点中(图2B和2C)。

外科手术后2.5周获得的一些动物显示植入物很好地结合入天然组织的迹象，且软骨组织在邻近植入物处发育，而且可以看到血管形成迹象(图2C)。

外科手术9周后处死一组动物并从植入物位点获得组织。组织的H&E和Masson三色染色法组织学评估(分别为图3A和3B)显示植入物区域由新形成的软骨和编织骨替代，且软骨是光滑的和几乎完全再生。用于II型胶原蛋白表达的番红O染色和探测显示覆盖正常骨的均匀红色软骨带的存在(图4A)，以及II型胶原蛋白沿着软骨带的沉积(图4B)。再生的软骨基本上不能与相邻的正常软骨区分开。修复表面是光滑的，没有纤维化的证据。而且，证据表明关节软骨水平处缺损完全闭合以及间充质细胞转化为软骨细胞和成骨细胞并形成和重塑(通过破骨细胞)新的软骨下骨。图11A和图11B显示了表现出再生软骨的类似截面的H&E染色。

实施例3：多相固体霰石支架的制备

为生成各相的孔隙体积(孔隙度)不同和/或存在于各相中的孔隙直径不同的多相支架，将直径为5.2mm和长度为7.5mm的栓子置于硅固定器(holder)中，其中仅暴露1mm的栓子顶端，且将带有栓子的固定器以倒置位置放置并浸入反应混合物中，这样仅栓子的顶端1mm与混合物直接接触。

所述栓子首先在室温下在5％二钠盐溶液中浸渍两小时，然后添加99％甲酸溶液，使最终浓度为0.5％，此时所述栓子再次在溶液中浸渍另20分钟。排出混合物，将所述栓子放置于密封容器中并给腔室施加真空后，通过应用真空在约0.2-0.00001巴压力条件下在蒸馏水中洗涤栓子过夜。栓子在室温下在真空中干燥过夜。

图6A描述固定器暴露一部分栓子用于如本发明所述进行浸渍的实施方式。

表1描述从如该实施例所描写进行处理的同一片珊瑚(澄黄滨珊瑚)的不同区域中分离的15个栓子的结果。金刚石锯用于从单个相中切除薄片，处理薄片用于光学显微镜分析，且光学双焦显微镜用于对所述支架成象；并获取图像，通过标准方法评估孔隙直径大小。

在浸渍在反应混合物中的栓子区域内的三个不同植入物中识别30个孔隙，在位于浸渍区域的近端区域内的四个不同植入物中识别41个孔隙，和在位于浸渍区域的远端区域内的四个不同植入物中识别46个孔隙，并测定各孔隙的直径。这些测定的结果显示于下表3中：

表1.

	植入物的浸渍区域	近端区域	远端区域
				平均值	700	200	110
标准差	50.2	69.8	39.9

图6B和6C描述从栓子(图C)切下并在可以测定孔隙尺寸的较高放大倍数下显象的顶部(图B)的光学显微图像。

根据孔隙体积(孔隙度)而言，浸渍部分显示约85-90％的栓子是多孔性的，其近端区域(沿着纵轴的长度约为0.5-1mm，位于浸渍区域的近端)显示约65-75％的孔隙度，而远端区域显示约45-50％的孔隙度。

如(Karageorgiou V，Kaplan D.(2005)″Porosity of 3D biomaterialscaffolds and osteogenesis″Biomaterials.；26(27)：5474-91)描述得到孔隙度。

孔隙度水平可通过以下参数控制：例如所使用的螯合剂的种类和浓度、所使用的酸的种类和浓度、方法进行的温度以及反应时间；而整个扩大的多孔性相的尺寸可通过与反应混合物直接接触的栓子长度来控制。

不同相的孔隙度和尺寸的控制将允许设计用于不同目的的植入物，所述植入物显示不同的强度、物理和结构特性，其具有模拟不同的天然骨和软骨结构的潜能。如各具体的软骨/骨或仅骨缺损所要求的，这种控制将提供植入物与植入的准确预定位置的较高配合性。

实施例4：用透明质酸浸渍的霰石支架比基于霰石的支架在体外更具软骨形成性

为了评估植入物的软骨相的软骨形成潜能，基于霰石的支架与用透明质酸浸渍的霰石支架进行比较。使用鼠间充质干细胞(MSC)ATCC/CRL-12424进行体外试验，并评估其向成软骨细胞系的分化。将5000个MSC接种在含或者不含透明质酸(NaHA 1％)的基于珊瑚(澄黄滨珊瑚种)霰石的1mg小颗粒(大小约1mm)上。不含任何植入物的第三组作为对照。支架制备的方法在本发明中描述。所用透明质酸(HA)是1％透明质酸钠的可注射凝胶，以Arthrease销售，由Bio-Technology General(Israel)LTD制备.Lot：RDO131B。

各颗粒独立培养并单独接种。细胞在补充的DMEM培养基中生长，不添加任何诱导软骨形成的试剂。每2-3天更换培养基，培养21天。在更换培养基期间，注意不要干扰培养物中的颗粒。该试验重复进行三次。

培养一、二和三周后，通过用番红O/固绿染色[Kahveci Z，Minbay FZ，Cavusoglu L(2000)，Safranin O staining using a microwave oven.BiotechHistochem.75(6)：264-8]4％戊二醛溶液固定的细胞而通过培养物染色测定MSC分化。处理染色细胞的数字图像。

图7显示为鲜绿色的所有细胞的细胞质的固绿染色，而由软骨细胞分泌到细胞的胞外基质中的糖胺多糖(GAG)的番红O染色显示为特有的粉红色。

用ImageJ软件分析该图像。颜色强度用于评估软骨形成。分析各图像的番红O(8A)染色细胞区域和粉红色的积分密度(8B)，通过计数指定图像区域(从计算排除颗粒区域)内的粉红色像素的数目来计算所述密度。

在整个研究期间，与单独的霰石相比，用透明质酸浸渍的霰石在染色区域(细胞量)和颜色强度(ECM的GAG的量)方面显示更多的软骨形成。

对照测试包括不存在任何支架的情况下同样培养的细胞的测试，其显示GAG染色明显较少的特征。

用场致发射扫描电子显微镜法(JEOL，JSM-7400F)显象细胞形态。接种在含有透明质酸的霰石上的MSC显示圆形形态并产生致密的细胞外基质，这是成熟软骨细胞典型的(图9C-D)。相反，生长在不含HA的霰石上的MSC显示扁平、成纤维细胞样的形态(图9A-B)。

因此，霰石-HA复合物使得MSC能够附着、增殖并向着软骨形成表型分化。

本发明证明用透明质酸浸渍的霰石的软骨形成潜能以提供更佳的软骨形成，从而支持涉及两相植入物的本发明范围，其中所述软骨相由用生物相容的聚合物(例如透明质酸)浸渍的具有孔洞/孔隙的霰石组成，且骨相仅由霰石或方解石组成。

实施例5：基于霰石和方解石的支架在体内是软骨形成性的

可在任何适当的位置植入，例如，对于膝关节修复，可在股骨内髁(MFC)、股骨侧髁(LFC)、髌骨(Patela)、滑车沟(TG)和胫骨内植入。

可用绵羊、山羊或马的模型系统来测试本发明某种具体支架。在所选植入位置中，例如在MFC的承载区域，用冲压机制造缺损。测定缺损的尺寸，例如，直径和深度分别为5-10mm和6-12mm。

植入物的直径将适合于待测试的骨软骨缺损的直径。例如，植入物的所选直径可以是6mm以覆盖5.8mm直径的缺损，从而确保以压力配合方式良好地固定至所述缺损。可以选择用于对比的非重量负荷位置的第二场所，例如在TG内。

为了治疗大的软骨损害，可以引入具有相同或不同的几何形状和性质的几个植入物来填充缺损。可采用关节镜或采用开放性切口(关节切开术)进行植入。

可进行X射线、CT或MRI成像来核实植入物的位置。

实施例6：软骨相含有孔洞和透明质酸的双相霰石支架的制备，用于包装和分配

霰石芯支架的制备：收集平均孔径为100-150μm的来自水螅珊瑚类澄黄滨珊瑚的珊瑚，目视评估其外观、密度和孔隙度，并进行FTIR分析。也可进行氨基酸定量。然后将珊瑚浸在5％次氯酸钠中以去除外部有机组织。

不被理论束缚，一种通过该方法制备更佳支架的方法是珊瑚内渗透深度的结果，而浸渍方法或在纯化期间使用正压使得气泡被截留在支架的孔隙网络内，导致溶剂几乎不能到达珊瑚的内部隔室。而且，纯化过程有助于以最彻底的方法去除使用的氧化剂，从而为随后植入生物内的支架带来清晰的所需结果。

锯，例如，金刚石圆盘锯，用于去除外部珊瑚层，且从较大的珊瑚块切下所需尺寸的栓子。然后钻透如此获得的栓子的一部分以钻出一系列孔洞，得到所需深度和所需模式/数目，等，例如参见图10A和10B。

根据以下步骤去除珊瑚的有机物质：所述栓子首先在负压力下与含有氧化剂的液体接触，例如，与5％次氯酸钠溶液接触30分钟，在RT到50℃的温度范围内以及使用0.2-0.00001巴的真空压力的低于大气压的压力下交换3次。然后所述栓子在RT到50℃的温度范围内在0.2-0.00001巴的真空压力下与10％过氧化氢溶液接触15分钟。然后用蒸馏水洗涤清洁的栓子30分钟，在RT到50℃的温度范围内以及使用0.2-0.00001巴的真空压力的低于大气压的压力交换3次。

通过暴露在强度为至少22.5kGy的γ辐射下对珊瑚进行杀菌，然后可以以无菌方式贮存在包装材料中。

透明质酸钠1％(上文所述的磷酸盐缓冲盐水中的1％透明质酸溶液)应用于栓子的顶部。将栓子顶部限制在环(例如硅环)内，其超越栓子末端上方的区域，从而在栓子末端形成储库。然后将透明质酸溶液加入储库区域，例如，70ml溶液加到直径为6mm的栓子上以产生2mm的均匀珊瑚相，其中孔洞浸渍透明质酸，以治疗软骨缺损，其固定在超越栓子末端且超出所述末端上方4mm的硅环中。透明质酸溶液的应用进行45-60分钟，然后去除环。栓子插入无菌包装中并密封。然后在真空条件下进行密封包装的蒸发，使栓子蒸干NaHA 1％溶液以形成栓子的软骨相的干燥HA涂层(例如通过冻干/干燥)。从而获得含有干燥产物的无菌包装。

图11用示意图描述本发明支架的实施方式，其中包含一系列孔洞或孔隙11-30的第一相11-10显示位于第二相11-20的顶部。第二相的末端可以是锥形11-40，以使得所讨论支架易于紧密配合。

本领域技术人员应理解在不离开附加权利要求所给出的本发明精神和范围的前提下，可进行形式和细节上的各种改变。本领域技术人员将认识到或能够仅采用常规实验确定本文描述的发明的具体实施方式的许多等价物。这种等价物应包括在权利要求的范围内。

在本发明的一个实施方式中，“约”是指满足具体需要的手段的量，例如，所述尺寸可主要是但不完全是指定的尺寸，但它满足软骨和/或骨修复位点处软骨和/或骨修复的具体需要。在一个实施方式中，“约”是指邻近或接近，但并非正好。存在小的误差幅度。该误差幅度不会超过正或负相同整数值。例如，约0.1微米将表示不低于0但不高于0.2。在一些实施方式中，就基准值而言的术语“约”包括高于或低于指定值的不超过5％、不超过10％或不超过20％的偏离。

权利要求项中，例如“一(a)”、“一个(an)”和“所述”是指一个或一个以上，除非有相反说明或从上下文来看显然相反。组内成员之间包括“或”或者“和/或”的权利要求书和说明书被认为满足一个、超过一个或所有组内成员存在于、用于或与另外与给定产品或方法相关，除非有相反说明或从上下文来看显然相反。本发明包括只有一个组内成员存在于、用于或另外与给定产品或方法相关的实施方式。本发明也包括其中超过一个或所有组内成员存在于、用于或另外与给定产品或方法相关的实施方式。而且，应理解，在各种实施方式中，本发明提供所有的变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列的权利要求中的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等被引入从属于相同基础权利要求的另一个权利要求中，除非另有陈述或除非这对本领域技术人员而言将出现矛盾或不一致。当要素以列表形式存在时，例如，马库什组合形式等，应理解也公开了所述要素的各亚组，且任何要素可从该组中去除。应理解，通常，当本发明或本发明方面被指包含特定要素、特征等时，本发明或本发明方面的某些实施方式由或基本上由这种要素、特征组成。为简化起见，这些实施方式没有在每种情况下具体列出这些术语。为方便起见，某些权利要求以从属权利要求的形式存在，但申请人保留将任何从属权利要求重新撰写成独立形式来包括该权利要求引用的独立权利要求或任何其他权利要求的要素或限定的权利，且这种重新撰写将被认为在各方面与从属权利要求相同，不管在重新撰写成独立形式之前该权利要求为什么形式(修改或未修改)。

Claims (104)

1.用于组织修复的支架，所述支架基本上由两相组成，其中：

-所述两相的第一相包含含有生物相容的聚合物的固体珊瑚或生物栅格，且所述第一相还包含沿着所述第一相的纵轴的一系列空腔，其中所述生物相容的聚合物基本上位于所述系列空腔内；和

-所述两相的第二相包含固体珊瑚或生物栅格。

2.权利要求1所述的支架，其中所述生物相容的聚合物是透明质酸、壳聚糖的透明质酸钠，或其组合。

3.权利要求1所述的支架，其中所述珊瑚来自滨珊瑚属、千孔珊瑚属或鹿角珊瑚属。

4.权利要求3所述的支架，其中所述珊瑚是澄黄滨珊瑚。

5.权利要求3所述的支架，其中所述珊瑚是两叉千孔珊瑚。

6.权利要求3所述的支架，其中所述珊瑚是巨枝鹿角珊瑚。

7.权利要求6所述的支架，其中所述生物相容的聚合物还包含抗炎化合物、抗感染化合物、生长因子、螯合剂、抗生素、细胞群体、促血管生成因子或其组合。

8.权利要求1所述的支架，其中所述第一相插入邻近软骨的区域且所述第二相插入邻近软骨下骨的区域。

9.用于软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有平均直径为约60-160μm的孔隙；和

-至少第二相，其含有平均直径为约170-850μm的孔隙。

10.权利要求9所述的支架，其还包含第三相，含有平均直径为约170-300μm的孔隙，且所述第二相包含平均直径为约350-850μm的孔隙，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

11.用于软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其含有孔隙体积为约35-55％的孔隙；和

-至少第二相，其含有孔隙体积为约56-95％的孔隙。

12.权利要求11所述的支架，其还包含第三相，含有孔隙体积为约56-80％的孔隙，其中所述第二相包含平均孔隙体积为约81-95％的孔隙，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

13.权利要求9-12所述的支架，其中所述固体形式从滨珊瑚属、千孔珊瑚属或鹿角珊瑚属中分离。

14.权利要求13所述的支架，其中所述固体形式从澄黄滨珊瑚中分离。

15.权利要求13所述的支架，其中所述固体形式从巨枝鹿角珊瑚中分离。

16.权利要求1-4所述的支架，其中所述支架为适应于修复位点的形状。

17.权利要求9-12所述的支架，其中所述支架近似于圆柱形、锥形、螺杆形、长方杆形、板形、圆盘形、金字塔形、颗粒形、球形或立方形。

18.权利要求9-12所述的支架，其中所述支架在至少所述第一相或至少所述第二相中还包含沿着所述支架的直角坐标轴的一个或多个空腔。

19.权利要求9-12所述的支架，其中所述支架包含生物相容的聚合物。

20.权利要求19所述的支架，其中所述生物相容的聚合物仅结合在所述第一相中或仅结合在所述第二相中。

21.权利要求19所述的支架，其中所述生物相容的聚合物包含含有糖胺聚糖的天然聚合物。

22.权利要求19所述的支架，其中所述糖胺聚糖是透明质酸。

23.权利要求9-12所述的支架，其中所述支架还包含细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、螯合剂、治疗化合物、或抗生素或其任意组合。

24.权利要求23所述的支架，其中所述治疗化合物包括抗炎化合物、抗感染化合物、生长因子、促血管生成因子或其组合。

25.权利要求9-12所述的支架，其中用细胞群体接种所述支架，所述群体包括间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞或其组合。

26.权利要求9-12所述的支架，其中所述支架是圆柱形的，直径为约5-15mm，且高度为约5-25mm。

27.用于诱导或增强软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的方法，所述方法包括将权利要求1或权利要求9-12的支架植入受试者中的需要软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的位点内。

28.权利要求27所述的方法，其中所述方法包括在植入所述支架前，暴露所述软骨修复的位点，和任选暴露位于所述受试者中的软骨修复位点附近的骨组织。

29.权利要求28所述的方法，还包括将至少部分所述支架固定在位于所述软骨修复位点附近的骨内的步骤。

30.权利要求29所述的方法，其中所述方法促进细胞群体对所述支架的附着、增殖或分化或其组合。

31.权利要求29所述的方法，还包括在所述植入之前，用间充质干细胞接种所述支架。

32.权利要求29所述的方法，其中所述受试者患有软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病。

33.权利要求29所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

34.权利要求29所述的方法，其中所述受试者是动物受试者。

35.权利要求29所述的方法，其中所述软骨缺损或紊乱包括全部或部分厚度的关节软骨缺损；骨软骨缺损；骨关节炎、关节缺损或由创伤、运动或重复应力引起的缺损。

36.权利要求29所述的方法，其中所述支架定位以使所述至少第二多孔相植入软骨组织内或邻近软骨组织，且所述至少第一多孔相植入骨组织内或邻近骨组织。

37.用于修复软骨的试剂盒，其包括权利要求1或权利要求9-12所述的支架；用于在组织修复中使用所述支架的指导；以及任选用于所述支架最佳插入的工具。

38.权利要求37所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一系列具有不同尺寸、形状或其组合的支架。

39.制备用于软骨修复的多相支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使仅一部分固体形式的霰石或方解石与钙螯合剂和酸接触，从而产生在至少一部分所述固体形式中包含扩大的孔隙的固体形式，和

-在所施加的负压力下洗涤并干燥所述固体形式。

40.权利要求39所述的方法，其中所述钙螯合剂是EDTA且所述酸是甲酸。

41.权利要求39所述的方法，其中所述接触在一定持续时间内和在一定条件下进行，所述时间和条件根据所述支架所需的最终几何形状而变化。

42.权利要求39所述的方法，其中通过所述方法制得的所述固体形式包含至少两相，所述相的孔隙体积(孔隙度)不同，或所述相包含所述孔隙的平均直径不同的孔隙，或其组合。

43.根据权利要求39的方法制备的支架。

44.试剂盒，其包括权利要求43所述的支架、用于在组织修复中使用所述支架的指导以及任选用于所述支架的最佳插入的工具。

45.权利要求44所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一系列不同尺寸、形状或其组合的支架。

46.用于诱导、增强或更新软骨或骨的修复、再生或形成诱导或其组合的方法，所述方法包括将权利要求43的支架植入受试者中需要软骨或骨修复、再生或形成诱导或其组合的位点内。

47.权利要求46所述的方法，其中所述方法包括在植入所述支架前，暴露需要软骨修复、再生或形成诱导或其组合的所述位点，和任选地暴露位于所述受试者中所述位点附近的骨组织。

48.权利要求47的方法，还包括将至少部分所述支架固定在位于所述位点附近的骨内的步骤。

49.权利要求48的方法，还包括在所述植入之前，用间充质干细胞接种所述支架。

50.权利要求46所述的方法，还包括使所述支架与生物产物接触的步骤，所述生物产物是自体的或同种异体的。

51.权利要求50所述的方法，其中所述生物产物是血液、血浆、血清或从其分离的材料。

52.权利要求47所述的方法，其中所述受试者患者软骨或骨缺损、紊乱或疾病。

53.权利要求47所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

54.权利要求47所述的方法，其中所述受试者是动物受试者。

55.权利要求47所述的方法，其中所述软骨缺损、紊乱或疾病包括全部或部分厚度的关节软骨缺损；骨软骨缺损；骨关节炎、关节缺损或由创伤、运动或重复应力引起的缺损。

56.权利要求47所述的方法，其中所述支架具有包括锥形、钉形、螺杆形、圆柱形、长方杆形、板形、圆盘形、金字塔形、颗粒形、球形或立方形的形状。

57.用于纯化基于珊瑚的支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-使具有所需尺寸和形状的固体霰石与含有氧化剂的溶液接触；和

-洗涤并干燥所述固体霰石，

从而所述步骤之一或各所述步骤在所施加的负压力下进行。

58.权利要求57所述的方法，其中所述方法包括使所述接触在温和的酸性条件下进行。

59.权利要求58所述的方法，其中所述溶液包括次氯酸钠。

60.权利要求57所述的方法，其中所述方法还包括在所施加的负压力下使固体霰石经受至少275℃的温度。

61.权利要求57所述的方法，其中所述施加的负压力为0.2到0.00001巴。

62.由权利要求57的方法制备的基于珊瑚的支架。

63.用于软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的支架，所述支架由从珊瑚分离的固体形式的霰石或方解石组成，且还包含：

-至少第一相，其包含具有对应于固体形式从其中分离的天然珊瑚的平均直径、孔隙体积或其组合的平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙；和

-至少第二相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-100％。

64.权利要求63所述的支架，还包含第三相，其包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约15-35％，且所述第二相包含具有平均直径、孔隙体积或其组合的孔隙，所述平均孔径、孔隙体积或其组合比所述第一相的平均孔径、孔隙体积或其组合大大约40-100％，且所述第三相位于所述第一相和第二相之间。

65.权利要求63所述的支架，其中所述固体形式从滨珊瑚属、千孔珊瑚属或鹿角珊瑚属中分离。

66.权利要求65所述的支架，其中所述固体形式从澄黄滨珊瑚中分离。

67.权利要求63所述的支架，其中所述支架为适应于修复位点的形状。

68.权利要求63所述的支架，其中所述支架近似于圆柱形、锥形、螺杆形、长方杆形、板形、圆盘形、金字塔形、颗粒形、球形或立方形。

69.权利要求63所述的支架，其中所述支架包含沿着所述支架的直角坐标轴的一个或多个空腔。

70.权利要求63所述的支架，其中所述支架包含生物相容的聚合物。

71.权利要求70所述的支架，其中所述生物相容的聚合物结合在至少一部分所述支架中。

72.权利要求63所述的支架，其中用细胞群体接种所述支架，所述群体包括间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞或其组合。

73.用于诱导或增强软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的方法，所述方法包括将权利要求63的支架植入受试者中需要软骨、骨的修复、再生或形成增强或其组合的位点内

74.权利要求73所述的方法，其中所述方法包括在植入所述支架前，暴露所述软骨修复的位点，和任选地暴露位于所述受试者中软骨修复位点附近的骨组织。

75.权利要求74所述的方法，还包括将至少一部分所述支架固定在位于所述软骨修复位点附近的骨内的步骤。

76.权利要求73所述的方法，其中所述受试者患有软骨和/或骨缺损或紊乱或疾病。

77.权利要求73所述的方法，其中所述软骨缺损或紊乱包括全部或部分厚度的关节软骨缺损；骨软骨缺损；骨关节炎、关节缺损或由创伤、运动或重复应力引起的缺损。

78.用于修复软骨的试剂盒，其包括权利要求63所述的支架；用于在组织修复中使用所述支架的指导；以及任选的用于所述支架最佳插入的工具。

79.权利要求78所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一系列不同尺寸、形状或其组合的支架。

80.用于软骨修复的支架，包括基本上由能够插入软骨修复位点内的方解石组成的生物栅格。

81.权利要求80所述的支架，其中所述生物栅格来源于藤壶。

82.权利要求80所述的支架，其中所述支架为适应于修复位点的形状。

83.权利要求80所述的支架，其中所述支架近似为圆柱形、锥形、螺杆形、长方杆形或立方形。

84.权利要求80所述的支架，其中所述生物栅格包含沿着所述支架的直角坐标轴的空腔。

85.权利要求83所述的支架，其中所述轴是所述支架的长轴。

86.权利要求80所述的支架，其中所述生物栅格包含生物相容的聚合物。

87.权利要求86所述的支架，其中所述聚合物包括胶原蛋白、弹性蛋白、丝、透明质酸、壳聚糖及其任意组合。

88.权利要求86所述的支架，其中所述聚合物包括合成的生物可降解的聚合物。

89.权利要求88所述的支架，其中所述合成的生物可降解的聚合物包括α-羟酸，包括聚乳酸、聚乙醇酸、其对应异构体、其共聚物、聚原酸酯及其组合。

90.权利要求80所述的支架，其中所述支架还包含细胞因子、骨形态发生蛋白(BMP)、螯合剂、细胞群体、治疗化合物、抗生素或其任意组合。

91.权利要求90所述的支架，其中所述细胞群体包括间充质干细胞和/或涉及软骨修复的其他细胞。

92.权利要求90所述的支架，其中所述治疗化合物包括抗炎化合物、抗感染化合物、生长因子、促血管生成因子或其组合。

93.用于诱导或增强软骨修复的方法，所述方法包括将权利要求80所述的支架植入受试者中软骨修复位点内。

94.权利要求93所述的方法，其中所述方法促进细胞群体对所述支架的附着、增殖或分化或其组合。

95.权利要求94所述的方法，其中所述细胞群体包括间充质干细胞。

96.权利要求93所述的方法，其中所述受试者患有软骨缺损或紊乱。

97.权利要求93所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

98.权利要求93所述的方法，其中所述受试者是动物受试者。

99.权利要求93所述的方法，其中所述软骨缺损或紊乱包括全部厚度的关节软骨缺损；骨关节炎、关节缺损或由创伤、运动或重复应力引起的缺损。

100.权利要求93所述的方法，其中所述支架具有包括锥形、钉形或螺杆形的形状。

101.用于修复软骨的试剂盒，其包括权利要求80所述的支架、用于在组织修复中使用所述支架的指导以及任选地用于所述支架最佳插入的工具、间充质干细胞或其组合。

102.权利要求101所述的试剂盒，其中所述支架包括不同尺寸和形状。

103.权利要求101所述的试剂盒，所述试剂盒根据软骨修复位点包括所述支架、所述工具组合和所述指导。

104.权利要求1、9、11、43、63或80的支架或其组合在需要的受试者中诱导或增强软骨修复或治疗软骨疾病或紊乱的用途。

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