CN109718395A - 基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶及制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶及其制备方法和应用，原料包括以下重量百分含量的组分：组分A：氧化海藻酸钠，5～18％；组分B：水溶性壳聚糖和3，3’‑二硫代双(丙酰肼)中的一种或两种的混合，0.1～20％；溶剂余量。按照比例配置成均匀溶液，与现有技术相比，本发明利用“席夫碱”及酰胺键等动态亚胺键实现交联，在人体温度及酸碱的温和条件下即可形成凝胶，不需添加任何具有生物毒性的引发剂。所述水凝胶凝胶速度快，成形后具有可注射性。所述水凝胶温和的制备条件、优异的压缩性能、生物相容性及可注射性使其在软骨修复领域具有广阔的应用前景。

Description

基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶及制法和应用

技术领域

本发明涉及可注射水凝胶技术领域，特别是基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

软骨是一种再生能力极差的组织，由于自身不含血管及淋巴，软骨细胞难以迁移，组织自我修复能力差，损伤或缺失后的修复是临床医学的一大难题之一，目前治疗手段以软骨移植为主。

水凝胶是一种通过聚合物亲水基团间相互作用形成的具有三维网络的独特材料。水凝胶材料网络内包裹大量水，与天然人体组织结构非常相似，在组织修复领域受到广泛关注，如作为组织损伤部位的植入填充物、组织工程中细胞培养时的三维支架以及细胞、药物、活性分子、生长因子等的释放载体。在上述应用中，作为植入物的水凝胶，具备可注射性将帮助其在微创治疗领域取得更为广泛的应用。通过注射的方式植入将有效减小伤口面积及病患痛苦，提高手术安全性，使其临床应用更加方便。

海藻酸钠是从植物中提取的一种天然多糖类聚合物材料，且具有一定抗菌及止血效果。壳聚糖使一种碱性多糖，由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到，具有优异的生物相容性及微生物降解性。海藻酸钠及壳聚糖材料来源广泛，且均具有良好的生物相容性，是医用高分子材料制备的理想原材料。然而目前利用天然海藻酸钠及壳聚糖形成的凝胶常存在凝胶时间长、机械强度差、需酸性或碱性环境才能凝胶化等问题，不能满足修复软骨组织的应用要求。

因此，制备出材料结构接近人体组织，凝胶化时间适宜，生物相容性及机械性能良好且具有可注射性的水凝胶材料对于软骨修复具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种机械性能好、凝胶条件适用于人体环境，可用于生物医疗和临床治疗的基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶及制法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，原料包括以下重量百分含量的组分：

组分A：氧化海藻酸钠，5～18％；

组分B：水溶性壳聚糖和3，3’-二硫代双(丙酰肼)中的一种或两种的混合，0.1～20％；

溶剂余量。

本发明水凝胶利用海藻酸钠经氧化反应获得的醛基及水溶性壳聚糖中的氨基发生席夫碱反应，以及氧化海藻酸钠的醛基与3，3’-二硫代双(丙酰肼)中的酰肼键生成可逆酰腙键实现水凝胶的动态交联。水凝胶三维网络结构见图1.经机械测试证明，所述水凝胶具有良好的压缩性能。

所述的组分B中水溶性壳聚糖的重量百分含量为0.5～10％，3，3’-二硫代双(丙酰肼)的重量百分含量为0.1～3％。

其中3，3’-二硫代双(丙酰肼)通过以下方法制得：

(1)称取3，3’-二硫代二丙酸二甲酯溶于无水甲醇，加入水合肼，3，3’-二硫代二丙酸二甲酯与水合肼的摩尔比为1：4，磁力搅拌8-16小时，搅拌温度为3-50℃；

(2)通过抽滤获得沉淀产物；

(3)利用醇洗、水洗进行产物的纯化，甲醇用量为20-60ml，去离子水用量为2-5ml，即得3，3’-二硫代双(丙酰肼)。

水溶性壳聚糖通过以下方法制得：

(1)称取壳聚糖加入反应器，向反应器中加入丙烯酸水溶液，在磁力搅拌的条件下于50℃反应3天；

(2)溶液冷却到室温，用NaOH调节pH至10-12；

(3)用丙酮将产物进行沉淀，离心分离1-3次，之后透析3天，冷冻干燥3天，即得水溶性壳聚糖。

所述的水溶性壳聚糖包括：N-羧甲基壳聚糖、O-羧甲基壳聚糖、N-羧乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、N-琥珀酰壳聚糖中的一种或几种。

所述的3，3’-二硫代双(丙酰肼)由3，3’-二硫代二丙酸二甲酯与水合肼反应制得。

所述的组分A由氧化剂对海藻酸钠进行氧化处理而制得，氧化度为55％-85％。具体包括以下步骤：

(1)称取海藻酸钠溶于无水乙醇，得到浓度为0.05～0.2g/ml溶液a，将高碘酸钠溶于去离子水得到0.025～0.3g/ml溶液b，磁力搅拌5-30分钟，使其溶解均匀；

(2)待溶解至均匀后，将溶液b混入溶液a中，避光处理，于5-40℃反应3-8h；

(3)待反应完全后，在反应体系中加入乙二醇，消耗多余的高碘酸钠，磁力搅拌0.5-6h后终止反应；

(4)经抽滤、透析、冷冻干燥后，得到纯化的氧化海藻酸钠。

所述的氧化剂包括高碘酸钠、高锰酸钠或高溴酸钠。

所述的溶剂包括去离子水、磷酸缓冲溶液、生理盐水(0.9％的氯化钠水溶液)或组织培养液中的任一种；

所述的组织培养液为89％DMEM培养基，10％FBS胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素溶液)。

所述的可注射水凝胶的固含量为0.5％-15％，优选7-10％。

一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将组分A和组分B加入溶剂中搅拌混合均匀，静置后形成水凝胶。

所述的搅拌是利用磁力搅拌配制溶液，配制温度为5℃-60℃，搅拌时间为2-60分钟；

所述的静置的环境温度为2℃-70℃，优选5℃-45℃，静置时间为2-180分钟。

一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶的应用，其特征在于，用于生物医用及临床治疗等领域的人体组织，尤其是软骨组织的缺损修复及组织工程细胞载体，以及各类手术中的伤口粘合材料。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

(1)本发明所述水凝胶以天然多糖聚合物材料为原料。多糖材料与人体细胞外基质中的硫酸软骨素等天然多糖在结构上具有相似性，因此所述水凝胶具有更强的生物相容性。

(2)本发明所述水凝胶的多糖类聚合物原料为海藻酸钠与壳聚糖，增强了所述水凝胶的安全性与实用性。海藻酸钠是一种廉价易得的天然高分子材料，可从褐藻等植物中提取，具有廉价易得、低毒性，生物相容性强等特点；壳聚糖具有良好的生物相容性及生物降解性，还具有一定的抑菌和抗肿瘤作用。本发明所述水凝胶原料海藻酸钠与壳聚糖来源广泛，且已应用于组织工程及药物释放体系领域。

(3)本发明所述水凝胶的交联机理为利用动态共价键中的席夫碱及酰腙键实现，属于“点击化学”反应，反应步骤简单，重复率高且产物产率高。交联反应的反应条件温和，室温或体温下的中性环境即可发生。交联反应过程不需添加任何具有生物毒性的引发剂，且缩合反应的副产物为水分子。因此所述水凝胶能够在人体生理条件下实现水凝胶的交联。

(4)本发明所述基于动态亚胺键的多糖类聚合物水凝胶还具有可注射性。因席夫碱及酰腙键具有可逆性，当收到外力作用时，动态亚胺键会断裂；外力撤销后动态亚胺键会再次形成，因此所述水凝胶具有优异的自修复性能及可注射性，使其在生物医用及临床治疗的应用中更加方便。

(5)天然多糖类聚合物水凝胶的力学性能较差，难以在实际生活中取得应用。本发明所述水凝胶利用席夫碱与酰腙键两种动态共价键实现双重交联，经机械测试证明，具有两种不同动态亚胺键的水凝胶与具有一种动态亚胺键的水凝胶相比，压缩测试的应力及应变值均明显提升，见图2。另外，本发明所述水凝胶还具有更优异的压缩循环性能，循环10次后力学性能几乎没有下降，见图3。

附图说明

图1为冻干后水凝胶扫描电镜形貌图；

图2为不同组分水凝胶的应力-应变压缩测试；

图3为不同组分水凝胶的循环压缩测试。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1.用分析天平称取10g海藻酸钠溶于50mL的无水乙醇，将12g高碘酸钠溶于50mL的去离子水，磁力搅拌20分钟。待溶解至均匀后，将高碘酸钠溶液混入海藻酸钠溶液中，避光处理，于25℃反应6h。待反应完全后，用移液枪量取20mL乙二醇至反应体系中，磁力搅拌2h后终止反应。经抽滤2次、透析3天、冷冻干燥3天后得到纯化的氧化海藻酸钠。

2.用分析天平称取2.04g 3，3‘-二硫代二丙酸二甲酯溶于50mL的无水甲醇，加入2.55ml水合肼，于10℃环境磁力搅拌14小时，减压抽滤，所得产物依次用20ml甲醇、4ml水、20ml甲醇清洗过滤，干燥后得到白色粉末。

3.用分析天平称量氧化海藻酸钠，将其溶解于去离子水，通过磁力搅拌配制质量分数为10％的氧化海藻酸钠均匀水溶液；用分析天平称量N-羧甲基壳聚糖、3，3‘-二硫代双(丙酰肼)，将二者溶解于去离子水中，通过磁力搅拌制成N-羧甲基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合水溶液。N-羧甲基壳聚糖占所述混合溶液的质量百分比为5.5％；3，3‘-二硫代双(丙酰肼)占所述混合溶液的质量百分比为1.4％。

4.将均匀的氧化海藻酸钠加入N-羧甲基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合溶液，经磁力搅拌混合均匀，于20℃静置10分钟即可得到水凝胶。

所得冻干后水凝胶扫描电镜形貌图如图1所示，可以看出水凝胶呈三维网络结构，经机械测试证明，所述水凝胶具有良好的压缩性能，具有两种不同动态亚胺键的水凝胶与具有一种动态亚胺键的水凝胶相比，压缩测试的应力及应变值均明显提升，见图2。另外，本发明所述水凝胶还具有更优异的压缩循环性能，循环10次后力学性能几乎没有下降，见图3。

实施例2

1.用分析天平称取10g海藻酸钠溶于50mL的无水乙醇，将6.12g高碘酸钠溶于30mL的去离子水，磁力搅拌20分钟。待溶解至均匀后，将高碘酸钠溶液混入海藻酸钠溶液中，避光处理，于25℃反应5h。待反应完全后，用移液枪量取12mL乙二醇至反应体系中，磁力搅拌1h后终止反应。经抽滤2次、透析3天、冷冻干燥3天后得到纯化的氧化海藻酸钠。

2.用分析天平称取1.02g 3，3‘-二硫代二丙酸二甲酯溶于50mL的无水甲醇，加入1.27g水合肼，于25℃室温环境磁力搅拌10小时，减压抽滤，所得产物依次用15ml甲醇、3ml水、10ml甲醇清洗过滤，真空干燥。

3.用分析天平称量氧化海藻酸钠，将其溶解于pH值为7.4的磷酸缓冲溶液，通过磁力搅拌配制质量分数为14％的氧化海藻酸钠均匀溶液；用分析天平称量O-羧甲基壳聚糖、3，3‘-二硫代双(丙酰肼)，将二者溶解于pH值为7.4的磷酸缓冲溶液，通过磁力搅拌制成O-羧甲基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合溶液。O-羧甲基壳聚糖占所述混合溶液的质量百分比为7.8％；3，3‘-二硫代双(丙酰肼)占所述混合溶液的质量百分比为0.84％。

4.将均匀的氧化海藻酸钠加入O-羧甲基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合溶液，经磁力搅拌混合均匀，于室温静置15分钟即可得到水凝胶。

实施例3

1.用分析天平称取10g海藻酸钠溶于50mL的无水乙醇，称取7.8g高锰酸钾溶于50mL的去离子水，磁力搅拌20分钟。待溶解至均匀后，将高碘酸钠溶液混入海藻酸钠溶液中，避光处理，于15℃反应5h。待反应完全后，加入3gNaCl，并用乙醇进行提纯，抽滤2次、透析3天、冷冻干燥3天后得到纯化的氧化海藻酸钠。

2.用移液枪移取1.95ml 3，3’-二硫代二丙酸二甲酯溶于50mL的无水甲醇，加入2.5ml水合肼，于室温磁力搅拌一整夜，减压抽滤，所得产物依次用20ml甲醇、4ml水、10ml甲醇清洗过滤，干燥，白色粉末为产物。

3.用分析天平称取2.5克壳聚糖加入250ml三口烧瓶，向烧瓶中加入含有3.73ml丙烯酸的水溶液100ml，加热至50℃，磁力搅拌反应3天。溶液冷却到室温，用1M/L的NaOH调节pH至10.8.用丙酮进行沉淀，离心分离，再溶于少量的水中，反复三次，透析3天。冷冻干燥3天。

4.用分析天平称量氧化海藻酸钠，将其溶解于生理盐水，通过磁力搅拌配制质量分数为11.11％的氧化海藻酸钠均匀溶液；用分析天平称量羧乙基壳聚糖、3，3‘-二硫代双(丙酰肼)，将其溶解于生理盐水，通过磁力搅拌制成羧乙基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合溶液。羧乙基壳聚糖占所述混合溶液的质量百分比为3.36％；3，3‘-二硫代双(丙酰肼)占所述混合溶液的质量百分比为2.69％。

5.将均匀的氧化海藻酸钠加入N-羧甲基壳聚糖与二硫代双(丙酰肼)混合溶液，经磁力搅拌混合均匀，于20℃静置10分钟即可得到水凝胶。

Claims (10)

1.一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，原料包括以下重量百分含量的组分：

组分A：氧化海藻酸钠，5～18％；

组分B：水溶性壳聚糖和3，3’-二硫代双(丙酰肼)中的一种或两种的混合，0.1～20％；

溶剂余量。

2.根据权利要求1所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的组分B中水溶性壳聚糖的重量百分含量为0.5～10％，3，3’-二硫代双(丙酰肼)的重量百分含量为0.1～3％。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的水溶性壳聚糖包括：N-羧甲基壳聚糖、O-羧甲基壳聚糖、N-羧乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、N-琥珀酰壳聚糖中的一种或几种。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的3，3’-二硫代双(丙酰肼)由3，3’-二硫代二丙酸二甲酯与水合肼反应制得。

5.根据权利要求1所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的组分A由氧化剂对海藻酸钠进行氧化处理而制得，氧化度为55％-85％；所述的氧化剂包括高碘酸钠、高锰酸钠或高溴酸钠。

6.根据权利要求1所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的溶剂包括去离子水、磷酸缓冲溶液、生理盐水或组织培养液中的任一种；

所述的组织培养液的成分为89％DMEM培养基，10％FBS胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素溶液)。

7.根据权利要求1所述的一种基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶，其特征在于，所述的可注射水凝胶的固含量为0.5％-15％。

8.一种权利要求1所述的基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将组分A和组分B加入溶剂中搅拌混合均匀，静置后形成水凝胶。

9.根据权利要求8所述的基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的搅拌是利用磁力搅拌配制溶液，配制温度为5℃-60℃，搅拌时间为2-60分钟；

所述的静置的环境温度为2℃-70℃，静置时间为2-180分钟。

10.一种权利要求1所述的基于动态亚胺键的多糖类聚合物可注射水凝胶的应用，其特征在于，用于生物医用及临床治疗等领域的人体组织，尤其是软骨组织的缺损修复及组织工程细胞载体，以及各类手术中的伤口粘合材料。