CN111793224A - 具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法及其应用，制备方法包括如下步骤：1）将海藻酸钠氧化为氧化海藻酸钠；2）以0.137 mol/L的己二酸作为溶剂配制含量为0.01%的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液缓慢滴加入聚丙烯酸溶液中，滴加完成后室温下反应1 h，待反应结束后先将溶液在‑80℃冷冻，然后解冻离心洗涤，最后冷冻干燥得到壳聚糖纤维；3）以生理盐水为溶剂配制氧化海藻酸钠溶液和含有壳聚糖纤维的羧甲基壳聚糖溶液，氧化海藻酸钠溶液和羧甲基壳聚糖溶液按体积比为1:2混合进行反应得到多级次纤维网水凝胶。纤维网水凝胶具有可修复性能，与天然细胞外基质结构相似，在三维细胞培养、软组织修复等组织工程领域具有很好的应用前景。

Description

具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
细胞外基质（ECM）作为生物软物质的典型代表广泛存在于各种细胞外空间中，甚至渗透到肌肉、肌腱和其他组织的小空间中。这种由纤维束（微米尺度）和凝胶状基质（纳米尺度）组成的纤维网构成的分层多孔介质，不仅使ECM可以将器官固定于上皮组织并附着在其他底层组织上，同时也能使分子信号进行更高效的长程传递。ECM的这种多级次结构直接影响其物理特性及对机械应力的响应，其纤维的含量，结构及排列在不同的器官组织和不同病生理状态中是不同的，并通过多级次状态的改变影响生命进程。例如ECM的纤维结构影响生长因子信号的传递。生长因子可以结合在ECM纤维的表面，使它们与细胞表面非常接近。ECM通过这种方式促进生长因子与细胞表面之间的相互作用。
传统的水凝胶在ECM模拟方面有许多局限性，首先它们的结构与天然组织的复杂结构相比过于单一，其次它们也缺少机械刺激来诱导细胞表型改变进而引导相应组织结构的形成。
发明内容
本发明的目的是制备一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
提供一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1）以高碘酸钠为氧化剂将海藻酸钠氧化为氧化海藻酸钠；
2）以0.137 mol/L的己二酸作为溶剂配制含量为0.01%的壳聚糖溶液，以蒸馏水为溶剂配制体积分数的1%聚丙烯酸溶液，将壳聚糖溶液缓慢滴加入聚丙烯酸溶液中，滴加完成后室温下反应1 h，待反应结束后先将溶液在-80 ℃冷冻，然后解冻离心洗涤，最后冷冻干燥得到壳聚糖纤维；
3）以生理盐水为溶剂配制氧化海藻酸钠溶液和含有壳聚糖纤维的羧甲基壳聚糖溶液，氧化海藻酸钠溶液的浓度为100 mg/mL，羧甲基壳聚糖溶液的浓度为25 mg/mL，氧化海藻酸钠溶液和羧甲基壳聚糖溶液按体积比为1:2混合进行反应得到多级次纤维网水凝胶。
上述方法中，所述氧化海藻酸钠的氧化度为60%。
上述方法中，制备壳聚糖纤维过程中壳聚糖溶液与聚丙烯酸溶液的最终体积比为1:3。
上述方法中，所述羧甲基壳聚糖溶液中壳聚糖纤维浓度为1 mg/mL。
本发明还提供了一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶，可以应用于细胞培养或软组织修复。
本发明的壳聚糖纤维（CMF）为棒状纤维，直径约为1-几十微米左右。
实施本发明，具有以下有益效果：
1、本发明根据席夫碱反应的原理将氧化海藻酸钠（OSA）和含有壳聚糖纤维（CMF）的羧甲基壳聚糖（CMCS）混合胶联后制备得到了与ECM结构具有高度相似性的纤维水凝胶（OSA-CMCS-CMF）。纤维网水凝胶具有可修复性能，与天然细胞外基质结构相似，在三维细胞培养、软组织修复等组织工程领域具有很好的应用前景。
2、使用席夫碱动态共价键交联得到的水凝胶本身具有动态自愈效果，由于席夫碱反应的酸敏感性，水凝胶还具有一定的pH响应能力。CMF加入后大大改变了水凝胶的微观结构，使水凝胶具有了网状纤维结构，这种网状纤维与大鼠结蹄组织具有高度相似性。这种水凝胶作为基底进行二维细胞培养时表现出优异的生物相容性，并且细胞可以从水凝胶表面迁移至水凝胶内部并在纤维表面聚集生长。以上表明本发明的水凝胶不但结构与ECM相似，且细胞相容性很好，在组织工程领域具有很好的应用前景。
3、本发明提供了一种全新的仿ECM水凝胶的策略且更加简单易行，即通过静电自组装制备出纤维后再通过混合凝胶制备纤维水凝胶。
4、选用的海藻酸钠和壳聚糖都是天然大分子多糖，具有很好的生物相容性，因此本发明制备的水凝胶的生物相容性也很好。
5、本发明选择的材料简单易得，价格低廉，易于实现工业应用。
附图说明
图1是本发明实施例1的仿生纤维网水凝胶制备的流程图；
图2是本发明实施例1的壳聚糖纤维（CMF）的扫描电镜图和透射电镜图；
图3是本发明实施例1的水凝胶的自愈效果图；
图4是大鼠结蹄组织（左）和本发明实施例1的水凝胶（右）的扫描电镜图；
图5是本发明实施例1水凝胶作为基底进行细胞培养后进行侧切后的内部扫描电镜图（左）和光学显微镜下的明场图（右上）与荧光图（右下）。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。
实施例：
使用NaIO4为氧化剂将海藻酸钠（SA）的邻羟基氧化为醛基，反应温度为25 ℃，反应6 h后加入与NaIO4等摩尔量的邻二醇终止反应。反应结束后使用5倍于反应液的无水乙醇析出氧化海藻酸钠（OSA）。将OSA溶解后用分子量为4500的透析袋透析3天，最后通过冷冻干燥得到OSA。海藻酸钠：高碘酸钠的摩尔比为1：0.6。以0.137 mol/L的己二酸溶液作为溶剂配制浓度为0.01%的壳聚糖（CM）溶液，以蒸馏水为溶剂配制体积分数的1%聚丙烯酸(含量为30%的粘稠液体，平均分子量为3000)溶液。将CM溶液缓慢滴入聚丙烯酸溶液中，最终体积比为1:3，滴加完成后室温下反应1 h。反应结束后先将溶液在-80 ℃冷冻，然后解冻离心洗涤，最后冷冻干燥得到壳聚糖纤维（CMF）。以9% NaCl为溶剂配制10%的OSA溶液和含有0.1% CMF纤维的CMCS溶液，然后按体积比为1:2混合进行反应得到仿生纤维网水凝胶（OSA-CMCS-CMF）。以生理盐水为溶剂配制OSA溶液和含有CMF的CMCS溶液，在紫外箱中放置三天灭菌，然后按1:2混合在96孔培养板中，反应后得到纤维网水凝胶。将成纤维细胞（L929）混合培养液后滴入96孔板中，将孔板放入细胞培养箱进行细胞培养。
图1为制备具有自修复性能的多级次纤维网水凝胶的流程图。
图2为制备的壳聚糖纤维（CMF）的扫描电镜图和透射电镜图，扫描电镜图显示CMF的尺寸和ECM种纤维的尺寸相似；透射电镜图（右上角图）则在结构上证明了单根纤维的柱状特征，从图中可以看到CMF的密度均匀，并未出现因为生长周期较长而出现明显的内外密度不均匀现象。
图3是水凝胶的自修复效果图，可以看到将水凝胶切成两半后再将其断面贴在一起，37℃放置4h后水凝胶恢复成完整的一块。
图4是大鼠结蹄组织（左）和本发明水凝胶（右）的扫描电镜图；从大鼠背部的结缔组织的扫描电镜图中可以看到大鼠结蹄组织是由丰富的纤维网络构成的，纤维之间的孔隙直径约为100 µm。从放大图中可以看到组成纤维网络的纤维尺寸并不均一，直径范围分布在几微米到几十微米不等。从右图的水凝胶扫描电镜图中可以看到水凝胶的纤维网状结构，组成这些网状结构的纤维并非都是均一尺寸的，而是存在着多尺寸分布的状态。将水凝胶和大鼠背部疏松结缔组织的扫描电镜图对比可以看出构成它们结构的纤维和孔隙的直径都相当接近。
图5是以本发明的水凝胶为基底进行二维细胞培养后的扫描电镜图（左）和光学显微镜下的明场图与荧光图（右）；从扫描电镜图中看到水凝胶内部的纤维网络以及纤维表面聚集一些球形颗粒（红圈内）。通过与光学显微镜下的细胞大小相互比较可以确定这些附着在纤维上的球形颗粒是细胞。可以看到这些生长在水凝胶内部的细胞沿着纤维丝的方向进行增殖和生长。因为实验中仅将细胞置于凝胶表面培养，但却在水凝胶内部观察到细胞，这表明细胞在生长增殖的过程中可向水凝胶内部发生迁移，并聚集生长在纤维丝附近。
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (5)

1.一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以高碘酸钠为氧化剂将海藻酸钠氧化为氧化海藻酸钠；
2）以0.137 mol/L的己二酸作为溶剂配制含量为0.01%的壳聚糖溶液，以蒸馏水为溶剂配制体积分数的1%聚丙烯酸溶液，将壳聚糖溶液缓慢滴加入聚丙烯酸溶液中，滴加完成后室温下反应1 h，待反应结束后先将溶液在-80 ℃冷冻，然后解冻离心洗涤，最后冷冻干燥得到壳聚糖纤维；
3）以生理盐水为溶剂配制氧化海藻酸钠溶液和含有壳聚糖纤维的羧甲基壳聚糖溶液，氧化海藻酸钠溶液的浓度为100 mg/mL，羧甲基壳聚糖溶液的浓度为25 mg/mL，氧化海藻酸钠溶液和羧甲基壳聚糖溶液按体积比为1:2混合进行反应得到多级次纤维网水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的方法，其特征在于，所述氧化海藻酸钠的氧化度为60%。
3.根据权利要求1所述的制备具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的方法，其特征在于，制备壳聚糖纤维过程中壳聚糖溶液与聚丙烯酸溶液的最终体积比为1:3。
4.根据权利要求1所述的制备具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液中壳聚糖纤维浓度为1 mg/mL。
5.一种具有自修复性能的仿生纤维网水凝胶的应用，其特征在于，应用于细胞培养或软组织修复。
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