CN101280467A - 一种壳聚糖基纳米纤维的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳聚糖基纳米纤维的制备方法与应用，该制备方法包括如下步骤：将药物或生长因子等生物活性物质溶解或分散于浓度为0.01％～3％(g/ml)的壳聚糖己二酸溶液中，然后加入胶原或明胶溶解；将生物降解性的聚阴离子溶于去离子水中，配成与壳聚糖具有相同浓度的溶液；将壳聚糖混合溶液缓慢加入聚阴离子溶液中，室温搅拌均匀后，经离心、洗涤、冷冻干燥即得负载生物活性物质的纳米纤维。本发明制备的壳聚糖基纳米纤维可生物降解，具有仿细胞外基质的结构，并可实现生物活性物质的控制释放，胶原或明胶的加入可改善纳米纤维的细胞相容性及调控生物活性物质的释放速度，在组织工程、临床创伤修复等领域应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种壳聚糖基纳米纤维的制备方法与应用。
背景技术
天然高分子壳聚糖具有低毒性、良好的生物相容性和生物可降解性，在生物医用领域应用广泛。一方面，壳聚糖的结构与细胞外基质(ECMs)中的糖胺聚糖有相似之处，能制备成具有不同微观形貌的宏观形状，并且具有一定力学强度适应不同部位的组织缺损修复要求的三维多孔支架，可作为细胞的三维载体，用于组织工程领域，修复或重建病损组织；另一方面，可负载药物及生物活性物质，实现其缓慢释放或控制释放，用于药物/生物活性物质的缓控释放体系。而特别是在组织工程、创伤修复及药物/生物活性物质释放等领域，纳米制备技术的应用可以进一步改进壳聚糖的生物医用性能[M.N.V.Ravi Kumar，R.A.A.Muzzarelli，C.Muzzarelli，H.Sashiwa，A.J.Domb，Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives，Chem.Rev.104，6017～6084(2004).]。
壳聚糖纳米粒子的制备可以采用共价交联法、去溶剂法和离子交联法等。其中离子交联技术是利用多价阴离子，如三聚磷酸钠、海藻酸钠、聚丙烯酸等，与壳聚糖阳离子之间的静电作用而产生交联，从而实现纳米化。由于离子交联法具有制备条件温和，工艺简单，不涉及化学试剂和有机溶剂的使用，而且可以调节尺寸和表面特性，可以较好地负载多肽、蛋白质等生物活性物质，并保持其生物活性等一系列优点，因此离子交联技术已被成功应用于壳聚糖纳米粒子的制备，以实现药物及其他生物活性物质，如多肽、蛋白质和基因等的缓控制释放[K.A.Janes，P.Calvo，M.J.Alonso，Polysaccharide colloidalparticles as delivery systems for macromolecules，Adv.Drug Deliv.Rev.47，83～97(2001).]。
细胞在动物体内生存的微环境(细胞外基质)大多是由直径为50～150nm的蛋白多糖和胶原纤维构成的三维纳米支架，因此具有与天然细胞外基质相似的组成及结构的壳聚糖纳米纤维是构造组织工程支架的优良材料。高分子纳米纤维的制备方法主要有：静电纺丝、自组装和相分离等，目前使用较多的是采用静电纺丝技术来制备壳聚糖纳米纤维及壳聚糖纳米复合纤维[1.K.Ohkawa，D.Cha，H.Kim，etal.Electrospinning of Chitosan.Macromol.Rapid Commun.25，1600～1605(2004).2.Bhattaai N，Edmondson D，Veiseh O，et al.Electrospunchitosan-based nanofibers and their cellular compatibility，Biomaterials，26，6176～6184(2005).]。但通常，静电纺丝技术需要专门设备且工艺较复杂，而且制备得到的纳米纤维直径约为数百纳米，与天然细胞外基质的纳米纤维相比偏大。
如果能改进离子交联技术制备出仿生模拟的具有良好生物相容性的壳聚糖基纳米纤维，并负载上药物或生长因子等生物活性物质，实现缓释和控制释放，则能极大地开阔壳聚糖基纳米纤维在组织工程、临床创伤修复等领域的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用离子交联技术制备负载药物或生物活性物质的生物可降解的壳聚糖基纳米纤维的方法。
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种壳聚糖基纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)将生物活性物质溶解或分散在壳聚糖的稀酸溶液中，再加入明胶或胶原溶解；
(2)将生物降解性聚阴离子完全溶解于去离子水中；
(3)将步骤(1)所得溶液缓慢加入步骤(2)所得溶液中，室温搅拌均匀；
(4)将步骤(3)所得溶液经离心、洗涤、冷冻干燥，即得负载生物活性物质的壳聚糖基纳米纤维产物。
上述步骤(1)中，生物活性物质为药物、生长因子等，如消炎药物、激素、骨形成发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经胶质生长因子(GGF)、表皮生长因子(EGF)等，生物活性物质与壳聚糖的质量比为0～1∶4。
上述步骤(1)中，壳聚糖优选脱乙酰度为70～100％、分子量为2000～150万的壳聚糖；壳聚糖在稀酸溶液中的浓度为0.01～3％(g/mL)。
上述步骤(1)中，稀酸为己二酸，稀酸浓度为0.5～5％(g/mL)。
上述步骤(1)中，胶原或明胶含量控制在壳聚糖质量的0％～20％以内。
上述步骤(2)中，生物降解性聚阴离子是三聚磷酸盐、海藻酸盐、透明质酸盐、及酸性壳聚糖衍生物等，如羧甲基壳聚糖、丁二酸化壳聚糖、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖磷酸酯，生物降解性聚阴离子在去离子水中的浓度与壳聚糖在己二酸溶液中的浓度相同。
上述步骤(3)中，步骤(1)所得溶液与步骤(2)所得溶液的体积比为1∶1～4∶1；步骤(1)所得溶液加入步骤(2)所得溶液中时，加入速度为0.1～1mL/min；将两份溶液搅拌均匀后混合液体系的pH值为3～6。
上述步骤(4)中，离心处理速度尽量高，可为10000～50000rpm，优选离心速度为20000rpm；离心时间为10～30min；洗涤采用0.01～1mol/L的NaOH溶液及去离子水，优选0.05～0.1mol/L的NaOH溶液及去离子水；冷冻干燥的预冷冻温度尽量低，可为-20℃～-200℃，优选-80℃；冷冻干燥时间为8h～48h。
本发明制备的壳聚糖基纳米纤维可应用于组织工程、创伤修复、药物及生物活性物质释放等领域。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的制备方法中，胶原或明胶的加入可改善纳米纤维的细胞相容性及调控生物活性物质的释放速度；2.本发明通过改进离子交联技术制备负载药物或生物活性物质的生物可降解的壳聚糖基纳米纤维，制备得到的壳聚糖基纳米纤维不仅能够在形态上实现对天然细胞外基质的仿生模拟，表现出良好的细胞和组织相容性，而且可以保持所负载药物或生长因子等生物活性物质的生物活性，实现其缓释和控制释放；3.本发明的制备方法工艺简单，制备得到的壳聚糖基纳米纤维在组织工程、临床创伤修复等领域中的应用前景广阔。
附图说明
图1为壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的透射电镜照片；
图2为壳聚糖/海藻酸钠纳米纤维的透射电镜照片；
图3为胶原/壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的透射电镜照片；
图4为明胶/壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的透射电镜照片；
图5为负载地塞米松的壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的药物体外释放曲线图；
图6为负载牛血清白蛋白(BSA)的壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的体外释放曲线图。
具体实施方式
实施例1 壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备
壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取0.003克壳聚糖(脱乙酰度85％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.01％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；
(2)称取0.001克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.01％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将0.01％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液以1mL/min的速度加入至0.01％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液中，保持并控制混合液总体系pH为3～6之间直至滴加结束，再搅拌1小时；
(4)将上述步骤(3)所得溶液经20000rpm离心30min，去上清收集沉淀，将沉淀先后用0.1mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，再于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后即得壳聚糖/三聚磷酸钠的纳米纤维，其直径约为50nm，如图1所示。
实施例2 壳聚糖/海藻酸钠纳米纤维的制备
壳聚糖/海藻酸钠纳米纤维的制备方法，其步骤如下：
(1)称取0.03克壳聚糖(脱乙酰度91％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；
(2)称取0.01克海藻酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.1％(g/mL)的海藻酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液以1mL/min的速度加入至0.1％(g/mL)的海藻酸钠溶液中，保持并控制混合液总体系的pH为3～5之间直至滴加结束，再搅拌1小时；
(4)将上述步骤(3)所得溶液经20000rpm离心30min，沉淀先后用0.05mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，再于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后即得壳聚糖/海藻酸钠的纳米纤维，其直径约为350nm，如图2所示。
实施例3 胶原/壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备
(1)称取0.03克壳聚糖(脱乙酰度100％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；
(2)称取0.003克胶原溶解于壳聚糖溶液中，得到壳聚糖/胶原的复合溶液；称取0.01克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液以1mL/min的速度加入至0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液中，保持并控制混合液总体系pH为3～5之间直至滴加结束，再搅拌1小时；
(4)将上述步骤(3)所得的溶液经20000rpm离心30min，沉淀先后用0.1mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，再于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后得到胶原/壳聚糖/三聚磷酸钠的纳米纤维，其直径约为300nm，如图3所示。
实施例4 明胶/壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备
(1)称取0.03克壳聚糖(脱乙酰度100％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；
(2)称取0.005克明胶溶解于壳聚糖溶液中，得到壳聚糖/明胶的复合溶液；称取0.01克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将0.1％(g/mL)的壳聚糖/明胶的己二酸溶液以1mL/min的速度加入至0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液中，保持并控制混合液总体系pH为3～5之间直至滴加结束，再搅拌1小时；
(4)将上述步骤(3)所得的溶液经20000rpm离心30min，沉淀先后用0.1mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，再于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后得到明胶/壳聚糖/三聚磷酸钠的纳米纤维，其直径约为200nm，如图4所示。
实施例5 负载地塞米松的壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备及其药物体外释放
(1)称取0.03克壳聚糖(脱乙酰度85％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；称取0.004克地塞米松磷酸盐溶解至上述溶解有0.1％(g/mL)的壳聚糖的己二酸溶液中，得到壳聚糖和地塞米松磷酸盐的复合溶液；
(2)称取0.01克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)得到的壳聚糖地塞米松磷酸盐复合溶液以1mL/min的速度加入0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液中，保持并控制pH为3～5之间直至反应结束；
(4)经20000rpm离心30min，沉淀先后用0.05mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后得到负载地塞米松磷酸盐的壳聚糖/三聚磷酸钠的纳米纤维(包封率为89％)，其直径约为200nm。
(5)采用紫外分光光度仪在278nm波长下测量37℃下纳米纤维在PBS缓冲溶液中地塞米松的释放行为，如图5所示，药物释放的时间较长，药物的累积释放百分数也随时间延长而增大，具有缓慢释放的特征。
实施例6 负载牛血清白蛋白(BSA)的壳聚糖/三聚磷酸钠纳米纤维的制备及其体外释放
(1)称取0.03克壳聚糖(脱乙酰度85％)溶于30毫升2％(g/mL)的己二酸溶液中，配制浓度为0.1％(g/mL)的壳聚糖己二酸溶液；称取0.003克BSA溶解至上述溶解有0.1％(g/mL)的壳聚糖的己二酸溶液中，得到壳聚糖和BSA的复合溶液；
(2)称取0.01克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)得到的壳聚糖/BSA复合溶液以1mL/min的速度加入0.1％(g/mL)的三聚磷酸钠溶液中，保持并控制pH为3～5之间直至反应结束；
(4)经20000rpm离心30min，沉淀先后用0.05mol/L的NaOH溶液及去离子水清洗，于-80℃下预冷冻，冷冻干燥24h后得到负载BSA的壳聚糖/三聚磷酸钠的纳米纤维(包封率为56％)，其直径约为300nm。
(5)采用紫外分光光度仪在280nm波长下测量37℃下纳米纤维在PBS缓冲溶液中BSA的释放行为，如图6所示，表现出缓慢释放的特征。
Claims (10)
1、一种壳聚糖基纳米纤维的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)将生物活性物质溶解或分散在壳聚糖的稀酸溶液中，再加入明胶或胶原溶解；
(2)将生物降解性聚阴离子溶解于去离子水中；
(3)将步骤(1)所得溶液缓慢加入步骤(2)所得溶液中，室温搅拌均匀；
(4)将步骤(3)所得溶液经离心、洗涤、冷冻干燥，即得壳聚糖基纳米纤维。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述生物活性物质为消炎药物、激素、骨形成发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、神经胶质生长因子、表皮生长因子；生物活性物质与壳聚糖的质量比为0～1∶4。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述壳聚糖为脱乙酰度为70～100％、分子量为2000～150万的壳聚糖；壳聚糖在稀酸溶液中的浓度为0.01～3％g/mL。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述稀酸为己二酸；稀酸浓度为0.5～5％g/mL。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述胶原或明胶含量控制在壳聚糖质量的0～20％以内。
6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述生物降解性聚阴离子是三聚磷酸盐、海藻酸盐、透明质酸盐、酸性壳聚糖衍生物；生物降解性聚阴离子在去离子水中的浓度与壳聚糖在己二酸溶液中的浓度相同。
7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述酸性壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、丁二酸化壳聚糖、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖磷酸酯。
8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中，步骤(1)所得溶液与步骤(2)所得溶液的体积比为1∶1～4∶1；步骤(1)所得溶液加入步骤(2)所得溶液中时，加入速度为0.1～1mL/min；室温搅拌均匀后混合液体系的pH值为3～6。
9、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中，所述离心速度为10000～50000rpm；所述洗涤采用0.01～1mol/L的NaOH溶液及去离子水；所述冷冻干燥的预冷冻温度为-20℃～-200℃，冷冻干燥时间为8h～48h。
10、权利要求1～9所述任一项方法制备的壳聚糖基纳米纤维在可组织工程、创伤修复、药物及生物活性物质释放中的应用。
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