CN112294752A - AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备，包括以下步骤：步骤1、将壳聚糖经过磺化处理形成壳聚糖硫酸酯，通过静电吸附作用将壳聚糖硫酸酯与壳聚糖通过主链链接，形成CS/SCS空白纳米凝胶材料；步骤2、将硝酸银溶液与CS/SCS空白纳米凝胶材料混合，得到负载银离子的纳米凝胶材料；步骤3、将负载银离子的纳米凝胶材料进行原位还原，将空腔内的银离子原位还原为纳米银负载其中，得到AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。本发明构建的基于纳米材料对于纳米银吸附力，可以维持纳米银的缓慢释放，实现抑菌杀菌效果，并具有良好的生物安全性。

Description

AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备
技术领域
本发明涉及纳米凝胶载药体系技术领域，具体而言涉及一种AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备。
背景技术
如今，因铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及其耐药菌等常见菌种传播而引起的感染死亡案例正在逐年增多，其危害令人触目惊心。当前，临床上治疗细菌感染的常用策略是静脉滴注抗生素或对感染部位进行局部冲洗，这些方法虽已使用广泛，但其作用时间较短且需多次给药，并伴有较严重的细胞毒性和组织损伤。近年来，银因具有广谱抗菌活性、不会诱导产生病原抗性及较低的细胞毒性等优异性能在生物医疗领域已得到广泛应用。相较于银而言，银纳米粒子(纳米银)因具有更大的比表面积和可调节的尺寸，故具有更为卓越的抗菌活性。虽然目前已发展了多种递送材料，但各种材料因其高的细胞毒性或者无法长时间负载材料的缺点，仍不能克服疗效低、副作用大等问题。故，开发一些新的治疗方法和抗菌材料来实现对细菌感染的高效治疗具有重要意义。
银离子抗菌机制主要有以下几点：1)纳米银溶解并释放银离子；2)银离子与细菌细胞膜的相互结合显著增加了膜的通透性；3)银离子通过破坏细菌的DNA使细菌死亡。虽具有良好的抗菌活性，但纳米银在单独使用时也面临诸多问题，如以胶体溶液形式制备的纳米银在生物介质中极不稳定，而由于团聚引起的比表面积减小将显著降低其抗菌活性；纳米银极易被氧化并快速释放出来大量银离子，因而在体内应用时，无法实现长效抗菌，且极易造成严重的细胞毒性和组织损伤。
为实现银离子的可控递送与释放，目前已发展出多种负载材料，如基于物理包裹的石墨烯，基于静电吸附的薄膜，以及基于近PH响应释放的功能化合物。但是，由于存在交换释放可控性差、吸附量有限且释放时间快等缺点，使得他们都不是作为银离子递送的最佳选择，对周围正常组织损伤小且能长时间释放成为了关注的重点。为此，通过文献阅读，我们找到壳聚糖硫酸酯这一材料，经过摸索，我们构建了可以长时间释放且生物相容性良好的可控递送系统，该系统可利用静电吸附性来缓慢释放Ag离子，从而产生长久释放的效果，从而长时间抑制住细菌滋生，达到减少反复给药的次数，降低细胞毒性。更重要的是，在该研究中，我们还证实了银离子的杀菌机制，这是一种通过破坏细菌细胞膜进入细菌体内，使得细菌氧化应激产生大量ROS，且与细菌DNA作用减少细菌呼吸，最终细菌裂解死亡。进而实现对细菌感染的高效治疗，且不会对正常细胞产生毒副作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备，对壳聚糖进行硫酸化修饰，提高壳聚糖对目标金属离子的选择性吸附，应用于长时间递送Ag离子、生物反应性良好的抗菌纳米凝胶载药体系针对细菌感染治疗，该纳米凝胶可以长时间作用伤口周围的细菌，同时可以对伤口周围正常组织损伤极低。
为实现上述目的，本发明的第一方面提出一种AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将壳聚糖经过磺化处理形成壳聚糖硫酸酯，通过静电吸附作用将壳聚糖硫酸酯与壳聚糖通过主链链接，形成CS/SCS空白纳米凝胶材料；
步骤2、将硝酸银溶液与CS/SCS空白纳米凝胶材料混合，得到负载银离子的纳米凝胶材料；
步骤3、将负载银离子的纳米凝胶材料进行原位还原，将空腔内的银离子原位还原为纳米银负载其中，得到AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
优选地，所述步骤3还包括：
冷冻干燥AgNPs@CS/SCS纳米凝胶，其中纳米凝胶粒径在240-290nm。
优选地，所述步骤2中还包括：
透析去除多余的硝酸银溶液。
优选地，所述步骤1中，CS/SCS空白纳米凝胶材料的制备包括以下步骤：
在二氯乙酸和甲酰胺的混合溶剂中，加入壳聚糖，制备壳聚糖有机溶液；
加入磺化试剂，60℃条件下反应1h，形成黄色粘稠溶液，抽滤除去未反应的壳聚糖；
加入冷却的95％乙醇，在4℃冰箱放置2h，真空抽滤提取出粗品的壳聚糖硫酸酯，并进行清洗；
洗涤后的壳聚糖硫酸酯溶解在饱和NaHCO3溶液中，用透析袋在去离子水中透析48h，冷冻干燥得到最终的壳聚糖硫酸酯；然后在壳聚糖硫酸酯溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，滴加完毕后搅拌30min，透析袋中透析48h，冷冻干燥得到CS/SCS空白纳米凝胶材料。
优选地，所述壳聚糖硫酸酯在壳聚糖链上的取代度为0.58。
优选地，所述步骤2的具体处理包括以下步骤：
将硝酸银溶液滴入CS/SCS空白纳米凝胶材料的水溶液中，搅拌均匀后，透析去除未包裹入空白材料的硝酸银溶液，得到负载银离子的纳米凝胶。
优选地，所述步骤3中，将得到的带有银离子的纳米凝胶溶解在水溶液中，缓慢滴加NaBH4溶液，反应4h后，透析袋中透析48h，得到载银壳聚糖硫酸酯纳米凝胶，即AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
优选地，在透析过程中，透析袋截留分子量1000Da。
根据本发明的第二方面还提出一种根据前述方法制备得到的AgNPs@CS/SCS纳米凝胶载药体系。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明构建的基于可控递送同时释放具有杀菌效果的银离子纳米凝胶载药体系可将纳米凝胶递送至细菌周围，更加容易与细菌接触，可以在使用较小的药物剂量情况下取得更好的治疗效果；
2)本发明构建的基于银离子是一种经过验证的良好的杀菌材料，它会破坏细菌细胞膜，降低细胞呼吸作用，增加细菌细胞内的ROS含量，使得细菌死亡，从而可以阻止细菌的继续损害正常组织；
3)本发明构建的基于壳聚糖因其良好的生物相容性经常被用来作为药物递送材料，而且对壳聚糖进行硫酸化修饰(即在壳聚糖的主链上引入硫酸根离子)不仅不会改变壳聚糖的基本骨架和理化性能，还能显著增强其生物相容性、细胞靶向、抗炎、抗凝血等活性，这些使得材料负载纳米银效率更高且细胞毒性更低；
4)本发明构建的基于纳米材料对于纳米银吸附力，可以维持纳米银的缓慢释放，且每次释放的纳米银含量可达到杀死细菌的作用，但又不足以对正常细胞造成巨大损伤。因此，在正常组织周围纳米凝胶并没有毒性，且纳米凝胶所用到的载体CS/SCS能够被细胞降解，具有良好的生物安全性。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
图1为本发明所构建的纳米凝胶载药体系的纳米凝胶不同载药浓度(a)2％(b)3％(c)4％的粒径图
图2为本发明所构建的纳米凝胶载药体系的纳米凝胶AgNPs@CS/SCS在一段时间内材料稳定示意图。其中，(a)为不同纳米银浓度的纳米凝胶在纯水中保存一周的颜色变化示意图，(b)为不同纳米银浓度的纳米凝胶在纯水中保存一周的粒径变化示意图。
图3为细菌与材料共同孵育之后，不同细菌溶液中(a)BCA、(b)ROS和(c)ATP的浓度变化示意图。
图4为4h内，空白凝胶以及不同浓度材料对(a)金黄色葡萄球菌和(b)大肠杆菌的杀灭作用示意图。
图5为4h内，空白凝胶以及不同浓度材料对(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌的生物膜消融作用示意图。
图6为一周内，空白凝胶以及不同浓度材料对(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌的杀灭作用以及对(c)金黄色葡萄球菌生物膜的消融作用和(d)一周内的生物膜变化照片。
图7为纳米凝胶治疗小鼠植入体感染后，(a)小鼠伤口部位和(b)植入体变化图。
图8为纳米凝胶治疗小鼠植入体感染后，(a)植入体表面残留生物膜的SEM图以及(b)残存细菌数量示意图。
图9为纳米凝胶治疗小鼠植入体后，伤口组织和各重要器官的H&E染色图。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
根据本发明的实施例提出的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系，采用银离子作为有效的杀菌剂，且壳聚糖作为一种良好的生物递送材料，因此，本发明选用壳聚糖作为原材料的情况下磺化形成壳聚糖硫酸酯，可以缓慢释放的Ag离子的纳米凝胶作为抗菌材料。
在可选的实施例中，总体上本发明AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系在制备过程中包括以下步骤：
步骤1、将壳聚糖经过磺化处理形成壳聚糖硫酸酯，通过静电吸附作用将壳聚糖硫酸酯与壳聚糖通过主链链接，形成CS/SCS空白纳米凝胶材料；
步骤2、将硝酸银溶液与CS/SCS空白纳米凝胶材料混合，得到负载银离子的纳米凝胶材料；
步骤3、将负载银离子的纳米凝胶材料进行原位还原，将空腔内的银离子原位还原为纳米银负载其中，得到AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
优选地，所述步骤3还包括：
冷冻干燥AgNPs@CS/SCS纳米凝胶，其中纳米凝胶粒径在240-290nm。
本发明对壳聚糖进行硫酸化修饰，即在壳聚糖的主链上引入硫酸根离子，不仅不会改变壳聚糖的基本骨架和理化性能，还能显著增强其生物相容性、细胞靶向、抗炎、抗凝血等活性。更重要的是，硫酸根的引入还可显著提高壳聚糖对如银离子的选择性吸附Ag离子，从而可以进行抗细菌治疗。
体内环境非常复杂，想要达到有效治疗，必须保证材料可以持续递送到需求部位。因此，本发明选用通过壳聚糖和壳聚糖硫酸酯相互吸附形成的纳米凝胶作为递送材料，使药物可以持续长时间递送至细菌周围。
具体地，选用壳聚糖作为原材料，经过磺化试，引入硫酸根基团，本发明中硫酸根基团的取代度为0.58。
为保证银离子作为杀菌材料能够安全的递送至体内且不对正常组织和细胞产生毒性，本发明选用以壳聚糖为原材料，磺化的壳聚糖硫酸酯作为另一条链，通过静电吸附作用形成的空白纳米凝胶CS/SCS作为载体。
具体地，在上述提到的银离子负载过程中，硝酸银与空白纳米凝胶的质量比分别是1：10、2：15、1:6。
为了方便杀菌材料进入体内被细胞吸收，纳米凝胶CS/SCS尺寸控制在240-280nm之间。
在具体实施过程中，本发明提供具有递送、可控缓慢释放银离子的多功能抗菌材料递送系统的制备方法。首先，通过磺化试剂，将硫酸根基团引入合成壳聚糖硫酸酯，接着静电吸附作用将壳聚糖和壳聚糖硫酸酯吸附在一起得到空白纳米纳米凝胶CS/SCS。然后，通过搅拌的方法在空白纳米凝胶内部负载大量银离子，最后，在纳米凝胶空腔内原位形成纳米银。
优选地，在步骤2中，需要避光操作，将硝酸银溶液缓慢的滴加到含有空白纳米凝胶的水溶液中，之后将混合溶液搅拌48h，在水溶液中透析，得到负载有银离子的纳米凝胶CS/SCS。
优选地，在步骤3中，35℃条件下缓慢滴加现配的NaBH4溶液，反应4h后加入透析袋中透析48h，通过硼氢化钡的还原作用在纳米凝胶空腔内原位形成纳米银，得到纳米凝胶AgNPs@CS/SCS。
更具体地，步骤1中，透析时截留分子量为3500Da，其余步骤透析时截留分子量为1000Da。
更具体地，步骤1中，所述的二氯乙酸和甲酰胺溶液的体积比为1：10。
更具体地，步骤2中，所述的壳聚糖硫酸酯与壳聚糖的质量比为4：1，所得到的空白纳米凝胶粒径保持在240-280nm之间。
更具体地，步骤3中，所述硝酸银与空白凝胶的质量比分别为1：10、2：15、1:6。
优选地，所述步骤1中，CS/SCS空白纳米凝胶材料的制备包括以下步骤：
在二氯乙酸和甲酰胺的混合溶剂中，加入壳聚糖，制备壳聚糖有机溶液；
加入磺化试剂，60℃条件下反应1h，形成黄色粘稠溶液，抽滤除去未反应的壳聚糖；
加入冷却的95％乙醇，在4℃冰箱放置2h，真空抽滤提取出粗品的壳聚糖硫酸酯，并进行清洗；
洗涤后的壳聚糖硫酸酯溶解在饱和NaHCO3溶液中，用透析袋在去离子水中透析48h，冷冻干燥得到最终的壳聚糖硫酸酯；然后在壳聚糖硫酸酯溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，滴加完毕后搅拌30min，透析袋中透析48h，冷冻干燥得到CS/SCS空白纳米凝胶材料。
优选地，所述壳聚糖硫酸酯在壳聚糖链上的取代度为0.58。
优选地，所述步骤2的具体处理包括以下步骤：
将硝酸银溶液滴入CS/SCS空白纳米凝胶材料的水溶液中，搅拌均匀后，透析去除未包裹入空白材料的硝酸银溶液，得到负载银离子的纳米凝胶。
优选地，所述步骤3中，将得到的带有银离子的纳米凝胶溶解在水溶液中，缓慢滴加NaBH4溶液，反应4h后，透析袋中透析48h，得到载银壳聚糖硫酸酯纳米凝胶，即AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
【实施例1】
基于递送缓慢释放具有杀菌效果的纳米凝胶载药体系的构建
首先，将DMF与氯磺酸混合搅拌1h后，得到磺化试剂。壳聚糖溶解于二氯乙酸和甲酰胺的混合溶剂中，成为壳聚糖有机溶液。紧接着，将壳聚糖有机溶液加入到磺化试剂，60℃条件下反应1h，形成黄色粘稠溶液。抽滤除去未反应的壳聚糖。最后加入95％乙醇，在4℃冰箱放置2h，真空抽滤提取出壳聚糖硫酸酯粗品并用乙醇清洗数次。洗涤后的壳聚糖硫酸酯溶解在NaHCO3溶液中，透析袋在去离子水中透析48h，冷冻干燥得到壳聚糖硫酸酯。
然后，在壳聚糖硫酸酯溶液内缓慢滴加壳聚糖溶液(壳聚糖硫酸酯与壳聚糖的质量比为4：1)。滴加完毕后搅拌30min，透析袋中透析48h，得到空白纳米凝胶溶液CS/SCS。
然后，避光操作，将硝酸银溶液逐滴滴入上述步骤中得到的空白纳米凝胶CS/SCS溶液中，搅拌48h，透析去除游离物质，得到负载银离子的纳米凝胶(硝酸银与空白凝胶的质量比分别为1：10、2：15、1:6)。最后，35℃条件下缓慢滴加现配的NaBH4溶液，反应4h后加入透析袋中透析48h，得到纳米凝胶AgNPs@CS/SCS。
【实施例2】
体外纳米材料稳定性
为探究纳米材料在体外的稳定性，我们通过马尔文粒径仪和透射电镜检测纳米材料一段时间内的粒径变化。取三种负载不同银离子的纳米凝胶1ml,分别在1D，2D，3D，4D,5D,7D的同一时间对粒径进行检测。
如图1-2所示，当纳米银负载量在2％时，粒径稳定在210nm附近，当负载量增加到3％时，粒径在190nm附近稳定，然后随着负载量的增加，当负载达到5％时，由于静电吸附作用，材料粒径尺寸稳定在90nm附近。之后，随着时间延长，材料颜色状态以及材料粒径尺寸在纯水溶液中均维持原状，粒径也没有明显变化，由此我们认为，材料稳定性良好。
【实施例3】
纳米凝胶作用于细菌的杀菌机理
本发明通过Enhanced ATP assay kit试剂盒检测ATP,DCFH-DA活性氧探针检测活性氧和Enhanced BCA protein assay kit试剂盒检测BCA.
如图3所示，相较于对照组或者阳性对照组，经过材料作用的细菌体内ATP含量减少1/3左右，这说明材料可以减少细菌的呼吸作用，使得细菌所需能量不足最终死亡；同时由于细菌的氧化应激反应，细菌体内ROS含量急剧升高至原来的3倍以上，这也是造成细菌死亡的主要原因之一；而细菌溶液中蛋白质含量的增多，这也证实了材料对细菌膜确实存在破坏作用。
【实施例4】
短时间内纳米凝胶对细菌和生物膜的效果
探究纳米凝胶的杀菌效果，本发明采用平板计数法计算菌落数量。对于生物膜的消融效果，采用CV染色法，通过酶标仪检测OD值探究材料的消融效果。
如图4-5所示，经过不同浓度材料对细菌的作用，可以发现对于金黄色葡萄球菌来说，浓度为450μg/ml的材料在120min时就可以将细菌全部杀死；对于大肠杆菌来说，材料浓度在120μg/ml时与细菌共同孵育90min就能将细菌全部杀灭。而对照组细菌数量却无明显变化，因为空白凝胶所带负电荷与细菌膜存在排斥作用，所以control组和空白凝胶组均没有发现明显的杀灭作用。对比而言，我们材料确实具有良好的抗菌效果。
生物膜的消融效果，从实验数据我们可以看出，由于大肠杆菌的细胞膜较薄，所以材料浓度400ug/ml时，就达到了80％左右的破坏率。相比来说，金黄色葡萄球菌在相同浓度相同时间的情况下，破坏率只达到了60％左右。这也是显示出了在实际治疗中，金黄色葡萄球菌更难杀灭的原因之一。因此，在长效抗菌中，我们也只对金黄色葡萄球菌的生物膜进行了长效消融实验，这也更能表现出我们材料优异的彻底的长效杀菌的效果。
【实施例5】
长时间内短时间内纳米凝胶对细菌和生物膜的效果
探究纳米凝胶的杀菌效果，本发明采用平板计数法计算菌落数量。对于生物膜的消融效果，采用CV染色法，通过酶标仪检测OD值探究材料的消融效果。
如图6所示的空白凝胶以及不同浓度材料对(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌的杀灭作用以及对(c)金黄色葡萄球菌生物膜的消融作用和(d)一周内的生物膜变化照片。
在本实施例中，使细菌处于动态生长的过程，同时将材料与细菌相互接触。结果发现，对于大肠杆菌来说，细菌一直处于动态生长中，但是由于材料作用，在它们相互作用的4小时内，细菌数量急剧下降，之后，随着作用时间延长，细菌数量缓慢降低，最终在第六天细菌全部死亡。这说明随着时间延长，材料仍在缓慢释放纳米银，继续对细菌产生作用。而对于金黄色葡萄球菌来说，细菌数量在4小时内也是急剧下降，但在之后的三天内，数量变化不大，我们猜想可能是因为由于细菌的大量死亡，使得细菌生物膜附着在材料，从而降低了银离子与细菌的接触，因此我们后续也针对金黄色葡萄球菌生物膜进行了消融实验。之后，随着生物膜被破坏，银离子继续释放作用于金黄色葡萄球菌，从而最终在第六天，细菌几乎全部死亡。
虽然生物膜也是处于一个动态生长的过程，但是材料作用也相当明显，在第二天的时间材料对于生物膜的破坏率已经达到50％以上，之后随着时间增长，破坏率继续增加，最终在第五天生物膜几乎完全破坏，这也为我们后续的小鼠体内模型的建立提供了基础。
【实施例6】
动物实验
小鼠体内植入体模型构建如下:
导管准备：将长1cm左右，直径2mm左右的导管在108CFU/ML的金黄色葡萄球菌的菌液中孵育48h.菌液中含入500μl的TSB液体培养基。之后，取出导管，在生理盐水中清洗去掉残留的菌液，备用。
在小鼠背部的大腿上侧部位，划开约1cm长的伤口，将导管放入其中，并将伤口缝合。等待30min后，小鼠随机分为三组进行不同处理：
(1)control组，在导管附近皮下注射200μl生理盐水。
(2)治疗组，导管附近皮下注射200μl AgNPs@CS/SCS。
(3)阳性对照组，导管附近皮下注射200μl CS/SCS。
分别在第1天，3天和5天观察伤口处愈合情况以及将导管取出，计算导管上残存的菌落数目。
动物实验结果如图7-9所示：随着材料作用时间的延长，菌体破坏效果越好，细菌存活数量越少，最终在作用时间达到第5天时，细菌数量降低至104CFU/ml,这个数量级已不能引起严重的细菌感染疾病。这表明我们设计的纳米材料法能够消除大部分存在伤口处的细菌。同时，通过从小鼠体内取出的导管数码照片我们也可以发现，治疗组的导管表面相较于对照组更加干净，为了证明这个结果，我们对导管进行了SEM,从图中我们不难发现，治疗组的表明光滑、平整，而对照组和空白胶组凌乱、粗糙，这表明材料对于生物膜具有明显的破坏作用。苏木素-伊红(H&E)染色显示，相较于未经材料治疗的对照组，经AgNPs@CS/SCS治疗5天后,伤口处的细菌(图中箭头所指地方)明显减少，说明纳米凝胶的确具有显著的杀菌效果和较高的生物相容性。同时，通过小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要器官的染色显示，器官均状态良好，说明材料并未对小鼠其他组织造成损伤。而且，我们将经过治疗后的伤口周围的皮肤组织与无伤口出的皮肤组织进行切片对比，也可以发现治疗后的皮肤组织生长状态良好，无明显坏死现象出现，随着治疗时间的延长，治疗组伤口处红肿的消退现象以及结痂速度相较于对照组更快，这些现象都可以说明我们的材料在处理导管感染问题时起到了积极的作用.
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (12)

1.一种AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将壳聚糖经过磺化处理形成壳聚糖硫酸酯，通过静电吸附作用将壳聚糖硫酸酯与壳聚糖通过主链链接，形成CS/SCS空白纳米凝胶材料；
步骤2、将硝酸银溶液与CS/SCS空白纳米凝胶材料混合，得到负载银离子的纳米凝胶材料；
步骤3、将负载银离子的纳米凝胶材料进行原位还原，将空腔内的银离子原位还原为纳米银负载其中，得到AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
2.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤3还包括：
冷冻干燥AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
3.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤2中还包括：
透析去除多余的硝酸银溶液。
4.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，CS/SCS空白纳米凝胶材料的制备包括以下步骤：
在二氯乙酸和甲酰胺的混合溶剂中，加入壳聚糖，制备壳聚糖有机溶液；
加入磺化试剂，60℃条件下反应1h，形成黄色粘稠溶液，抽滤除去未反应的壳聚糖；
加入冷却的95％乙醇，在4℃冰箱放置2h，真空抽滤提取出粗品的壳聚糖硫酸酯，并进行清洗；
洗涤后的壳聚糖硫酸酯溶解在饱和NaHCO3溶液中，用透析袋在去离子水中透析48h，冷冻干燥得到最终的壳聚糖硫酸酯；然后在壳聚糖硫酸酯溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，滴加完毕后搅拌30min，透析袋中透析48h，冷冻干燥得到CS/SCS空白纳米凝胶材料。
5.根据权利要求4所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖硫酸酯在壳聚糖链上的取代度为0.58。
6.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体处理包括以下步骤：
将硝酸银溶液滴入CS/SCS空白纳米凝胶材料的水溶液中，搅拌均匀后，透析去除未包裹入空白材料的硝酸银溶液，得到负载银离子的纳米凝胶。
7.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将得到的带有银离子的纳米凝胶溶解在水溶液中，缓慢滴加NaBH4溶液，反应4h后，透析袋中透析48h，得到载银壳聚糖硫酸酯纳米凝胶，即AgNPs@CS/SCS纳米凝胶。
8.根据权利要求7所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，在透析过程中，透析袋截留分子量1000Da。
9.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，硝酸银与空白纳米凝胶的质量比分别是1：10、2：15或者1:6。
10.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，壳聚糖与壳聚糖硫酸酯质量比为1:4。
11.根据权利要求1所述的AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，纳米凝胶粒径在240-290nm。
12.一种根据权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到的AgNPs@CS/SCS纳米凝胶载药体系。
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