CN113730577A - 一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料及其制备方法。该水凝胶材料包括接枝有己二酸二酰肼和苯硼酸的透明质酸和氧化有醛基的葡聚糖，制备步骤包括：利用EDC/NHS催化的酰化反应将己二酸二酰肼接枝到透明质酸上；通过苯硼酸对位上的醛基和修饰有己二酸二酰肼的透明质酸的氨基通过席夫碱反应将苯硼酸接枝到透明质酸上；葡聚糖通过高碘酸钠法产生醛基，形成氧化葡聚糖；接枝有苯硼酸和己二酸二酰肼的透明质酸和氧化葡聚糖按质量比混合在温和条件下形成水凝胶。该水凝胶可以用于活性氧水平偏高的病理组织环境，已证实在心肌梗死方面具有良好的治疗效果，在其他生物医学领域也具有良好的应用前景。

Description

一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝 胶材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料及其制备方法。
背景技术
组织修复过程中，注射性材料可良好的满足缺损组织形状的不规则性，且具有微创性，把二次伤害降到最低。可注射性水凝胶常用的有如海藻酸盐、纤维蛋白、壳聚糖、细胞外基质及其衍生物等具有良好的生物相容性天然生物材料。
透明质酸(HA)是一种存在于脊椎动物组织细胞外基质(ECM)中的非硫酸盐-葡糖胺聚糖，由于其能够与细胞表面受体(如CD44)结合，并参与调节细胞分化和增殖，被认为是一种适合促进组织修复的天然多糖聚合物。在可注射水凝胶中，力学强度非常弱的水凝胶可以用针头注射，但其材料的强度不够强，不能满足组织修复的负荷环境。因此，含有动态化学键(氢键相互作用、金属配位相互作用、主-客体相互作用、离子相互作用、亲疏水相互作用、亚胺键/酰腙键、硼酸酯键和二硫键)的具有自修复功能的水凝胶可满足这一条件，常被用来制备可注射性水凝胶。著名的德国化学家雨果·希夫在1864年发现了亚胺键，因此，基于亚胺的化合物也通常被称为“席夫碱”。席夫碱水凝胶在许多疾病治疗模型中(如肿瘤治疗，心肌梗死，骨关节炎及脑梗)都有较好的应用。
活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是主要由线粒体电子转移链产生的氧代谢物，包括有氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等，可对蛋白质、脂类、多核苷酸等细胞大分子进行氧化修饰。体内活性氧水平和抗氧化剂抑制水平之间存在不平衡时，即会发生氧化应激。越来越多的证据表明，氧化应激与多种疾病，包括皮肤创伤、心肌梗死、缺血再灌注损伤、骨关节炎、和许多神经退行性疾病之间存在很强的联系。在炎症部位发现ROS过量产生，可通过众多信号通路，如PI3K/Akt/mTOR通路、MAPK通路、钙调磷酸酶通路和NF-KB通路ASK1/JNK通路诱导致细胞死亡，进一步提高组织正常修复的困难性。因此，检测并清除炎症部位的ROS尤为必要。
梗死心肌注射清除ROS水凝胶可有效减少氧化损伤。如Zhu等人[1]设计了一种带有TEMPO基团的热响应性可注射水凝胶，TEMPO上的氮氧化物自由基可清除ROS，减少心肌细胞凋亡，并支持注射水凝胶的磁共振成像。
苯硼酸(PBA)是一种高活性的活性氧清除剂。其与ROS的氧化还原反应将PBA分解为硼酸和对醌甲氧基。含PBA的生物材料可有效减少氧化损伤，用于治疗各种疾病。对于心肌梗死的治疗，Li等人[2]交联了带有双端PBA分子和负载bFGF的PVA凝胶。将水凝胶注入心包腔，通过释放bFGF达到治疗效果。然而，抗氧化剂PVA-PBA水凝胶本身未能维持心脏功能，可能是由于与心肌内ROS接触不足。Chen等人[3]证明心肌内注射超支化PEG-PBA水凝胶能维持射血分数，但没有提供体内清除ROS作用的直接证据。现阶段常用于聚合物侧链修饰的是苯硼酸频那醇酯结构，其对H2O2有较高的反应敏感性，为10μM-1mM，但其水解受pH值影响，反应通常需要氢氧根离子，所以在低pH值下频那醇酯从苯基上的裂解受到抑制。直接暴露的硼酸基团则可以避免这个问题。另外，在聚合物纳米颗粒体系中，通过柔性醚侧链将PBA接枝到聚合物上比将PBA连接到更靠近聚合物主链的地方更有利，反应性的差异是由于ROS和PBA的可及性不同造成的。
本发明提出将活性氧清除剂-苯基硼酸接枝在侧链上，且不作为凝胶交联点，在消除ROS同时，可以较大程度地保证水凝胶结构的完整性，且在反应后期促进水凝胶降解。心肌内注射本发明的侧链接枝的PBA的水凝胶可以满足PBA和ROS之间的充分接触，从而促进清除反应，减少炎症的爆发，抑制心肌梗死进一步恶化。
参考：
[1]Zhu Y,et al.,Reactive oxygen species scavenging with abiodegradable,thermally responsive hydrogel compatible with soft tissueinjection.Biomaterials,2018.177:p.98-112.
[2]Li Z,et al.Injection of ROS-Responsive Hydrogel Loaded with BasicFibroblast Growth Factor into the Pericardial Cavity for HeartRepair.Advanced Functional Materials,2021.31(15):p.2004377.
[3]J Chen,et al."An injectable hydrogel based on phenylboronic acidhyperbranched macromer encapsulating gold nanorods and Astragaloside IVnanodrug for myocardial infarction."Chemical Engineering Journal,2020.413:127423.
发明内容
本发明的目的是提供一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法。该水凝胶具有可注射性及活性氧消除功能，在病理环境中有改善炎症环境作用。
本发明提供一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料，其特征在于，是由两种聚合物溶液混合成胶制得的，所述两种聚合物为接枝有己二酸二酰肼及苯硼酸的透明质酸(HA-ADH-PBA)和氧化葡聚糖(O-Dex)。本发明提供一种制备侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将透明质酸(HA)溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到HA的PBS溶液；将溶液置于37℃的水浴中，搅拌，搅拌过程中依次加入己二酸二酰肼(ADH)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应4h，反应过程保持pH＝6；停止调节pH值，继续37℃水浴并搅拌，反应过夜后，调节pH＝7，将反应后混合液滴入到冰乙醇中沉降，离心收集沉淀，将沉淀溶于去离子水并透析5天后冷冻干燥，得到修饰有己二酸二酰肼的透明质酸(HA-ADH)；
2)将Milli-Q水和二甲基亚砜混合，配制成混合溶剂，加入对甲酰基苯硼酸(PBA)以及步骤1)的产物HA-ADH，得到混合溶液；滴入一定量的10％的盐酸溶液进行催化，搅拌下反应过夜；反应结束后，反应液滴入冰乙醇中沉降，离心收集沉淀，真空干燥，得到接枝有己二酸二酰肼及苯硼酸的透明质酸(HA-ADH-PBA)；
3)向单口烧瓶中加入葡聚糖(Dex)，用Milli-Q水完全溶解，置于37℃水浴中，滴加NaIO4水溶液，避光搅拌反应8h；向反应液中加入乙二醇，继续反应1h，反应液滴入至冰乙醇沉降，离心收集沉淀，将沉淀溶于去离子水并透析5天后冷冻干燥，得到氧化葡聚糖(O-Dex)；
4)将步骤2)的产物HA-ADH-PBA和步骤3)的产物O-Dex分别溶于PBS中，两种溶液充分混匀，置于37℃烘箱中成胶，得到侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料(R gel)。
进一步地，所述步骤1)中，透明质酸的分子量为100kDa，所述磷酸盐缓冲液为pH＝6的二倍浓度磷酸盐缓冲液，透明质酸在所述溶液中的浓度为1wt％-10wt％；ADH、EDC、NHS的投料量分别为所述溶液中透明质酸重复单元物质的量的10-30倍、1-5倍、2-10倍；反应过夜的时间为12h；所述调节pH＝7的方法为加入5mol/L的NaOH溶液；透析的截留分子量为8-14kDa。
进一步地，所述步骤2)中，配制所述混合溶剂时，Milli-Q水和二甲基亚砜的体积比为3：1-2：1；对甲酰基苯硼酸的投料量为己二酸二酰肼接枝量物质的量的1-2倍；HA-ADH在所述混合溶液中的质量分数为1％-5％；每1mL反应溶液滴入盐酸溶液的量为20μL；反应过夜的时间为12h。
进一步地，所述步骤3)中，葡聚糖在Milli-Q水溶液中的质量分数为1％-5％；NaIO4与葡聚糖重复单元的投料摩尔比为1：1-1：9；乙二醇的投料量为NaIO4物质的量的0.5-1倍；透析的截留分子量为8-14kDa。
进一步地，所述步骤4)中，HA-ADH-PBA在PBS溶液中的浓度为5wt％-10wt％；O-Dex在PBS溶液中的浓度为10wt％-20wt％；HA-ADH-PBA的PBS溶液与O-Dex的PBS溶液等体积混合；置于37℃烘箱中成胶的时间为2-3h。
本发明的有益效果是：
本发明中的接枝有苯硼酸的具有活性氧消除功能的席夫碱水凝胶材料具有良好的生物相容性。该苯硼酸在双氧水的攻击下，分解为硼酸和对醌甲氧基，双氧水也被反应为水和氧气，呈现出双氧水消除功能。加上席夫碱动态化学键的自愈合能力，水凝胶可以通过注射器注射至病理部位，且在温和条件下恢复力学性能。该水凝胶可适用于活性氧水平较高的病理组织环境。
本发明提出将活性氧清除剂-苯基硼酸接枝在侧链上，可以较大程度的保持活性剂的灵活性，与心梗部位的充分接触。反应同时，可以较大程度地保证水凝胶结构的完整性。心肌内注射本发明的侧接枝PBA的水凝胶可以满足PBA和ROS之间的充分接触，从而促进清除反应，减少炎症的爆发，抑制心肌梗死进一步恶化。
附图说明
图1为HA-ADH-PBA和O-Dex的合成路线；
图2为HA-ADH，HA-ADH-PBA的核磁氢谱；
图3为O-Dex的核磁氢谱；
图4为水凝胶R gel的SEM图；
图5为水凝胶R gel的红外光谱；
图6为水凝胶R gel在不同条件下的降解行为；
图7为实施例3中水凝胶R gel对心肌细胞氧化应激保护的实验结果，(a)为对心肌细胞氧化应激保护的荧光图片，(b)为心肌细胞的流式图，(c)为心肌细胞的统计图；
图8为实施例4中水凝胶R gel治疗大鼠心肌梗死的实验结果，(a)为Masson染色图片，(b)为统计纤维化面积的统计图；
图9为实施例4中水凝胶R gel治疗大鼠心肌梗死，评估心功能恢复情况的统计图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明的技术方案，但这些实施例并不用于限制本发明。
实施例1：
第一步：将HA(1g,0.01mmol)溶解于pH＝6的2倍浓度PBS(1M HCl调节)中，然后加入ADH(13.05g,75mmol)，调节pH保持不变。待完全溶解后，依次加入EDC(3.9g)和NHS(1.15g)，同时pH保持在6不变，反应在37℃的水浴进行4h，后将反应过夜。反应结束后将反应液的pH调到中性。反应混合液滴入到800mL冰乙醇中沉淀。离心收集沉淀物，溶解于水中透析(MWCO＝14kDa)5天，冷冻干燥得到产物HA-ADH。
第二步：将HA-ADH(400mg)、PBA(105.8mg)溶解在8mL混合溶剂(体积比水:DMSO＝3:1)中，加入1滴10％HCl溶液作为催化剂。将反应混合液滴入至80mL冰乙醇沉淀，离心收集沉淀，并将沉淀重新溶解在水中，再用冰乙醇沉淀，如此重复三次，最后沉淀物在真空干燥箱中进行干燥得到产物HA-ADH-PBA。
第三步：将葡聚糖(Mw＝70KDa)溶于100mL Milli-Q中，，在避光条件下加入535mgNaIO4。反应在37℃水浴下反应8小时后加入140μL乙二醇，继续反应1小时。反应结束后将反应混合液放入透析袋中(MWCO＝8kDa)透析5天，冷冻干燥得到氧化葡聚糖O-Dex。
第四步：将50mg HA-ADH-PBA溶解在1mLPBS中，100mg O-Dex溶解在1mLPBS中，分别取同体积的聚合物溶液混合均匀，置于37℃烘箱中成胶，两小时后得到水凝胶材料。
本实施例HA-ADH-PBA和氧化葡聚糖的合成路线如图1所示；本实施例得到的HA-ADH，HA-ADH-PBA的核磁氢谱如图2所示；本实施例所得到的氧化葡聚糖O-Dex核磁氢谱如图3所示；本实施例得到的水凝胶R gel的SEM图如图4所示；本实施例所得到的水凝胶R gel的红外谱图如图5所示。表明制备的水凝胶材料为接枝有苯硼酸的席夫碱水凝胶材料R gel。
实施例2：
第一步：将HA(1g,0.01mmol)溶解于pH＝6的2倍浓度PBS(1M HCl调节)中，然后加入ADH(13.05g,75mmol)，调节pH保持不变。待完全溶解后，依次加入EDC(3.9g)和NHS(1.15g)，同时pH保持在6不变，反应在37℃的水浴进行4h，后将反应过夜。反应结束后将反应液的pH调到中性。反应混合液滴入到800mL冰乙醇中沉淀。离心收集沉淀物，溶解于水中透析(MWCO＝14kDa)5天，冷冻干燥得到产物(HA-ADH)。
第二步：将HA-ADH(400mg)、PBA(105.8mg)溶解在8mL混合溶剂(体积比水:DMSO＝3:1)中，加入2滴10％HCl溶液作为催化剂。将反应混合液滴入至80mL冰乙醇沉淀，离心收集沉淀，并将沉淀重新溶解在水中，再用冰乙醇沉淀，如此重复三次，最后沉淀物在真空干燥箱中进行干燥得到产物(HA-ADH-PBA)。
第三步：将葡聚糖(Mw＝70KDa)溶于100mL Milli-Q中，在避光条件下加入535mgNaIO4。反应在37℃水浴下反应8小时后加入140μL乙二醇，继续反应1小时。反应结束后将反应混合液放入透析袋中(MWCO＝8kDa)透析5天，冷冻干燥得到产物(Ox-Dex)。
第四步：将50mg HA-ADH-PBA溶解在1mLPBS中，200mg O-Dex溶解在1mLPBS中，分别取同体积的聚合物溶液混合均匀，置于37℃烘箱中成胶，两小时后得到水凝胶材料R gel。
实施例3：
检测水凝胶材料R gel对双氧水刺激心肌细胞氧化应激的保护作用。将H9C2细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM中，密度为3×105。24h后，用新鲜培养基、含500μM H2O2的培养基或含500μM H2O2和水凝胶的培养基替换培养基。处理1h后，加入DCFH-DA(1:2000v/v，在DMEM中)。30分钟后，用PBS冲洗3次，去除多余的探针。荧光定量采用荧光显微镜(Olympus,IX81，日本)和BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,USA)。
实施例4：
检测水凝胶材料R gel对SD大鼠心肌梗死的治疗作用。雄性SD大鼠腹腔注射4％水合氯醛1.7mL(200±20g,n＝32，由浙江省医学科学院提供)麻醉。麻醉后，SD大鼠仰卧位，气管插管通气。左开胸显露心脏，切除心包，丝线结扎左冠状动脉前降支，致左心室梗死。心肌苍白和变色显示成功建立心肌梗死模型。50μL水凝胶注入梗死灶及周围心肌。将大鼠分为4组(每组8只):(1)N-R gel；(2)R gel；(3)MI；(4)Sham。处理后，用丝线分别缝合胸部和外皮肤。超声心动图对心脏功能进行评估；Masson染色对心肌梗死部位纤维化程度进行评价。
本发明的采用PBA侧链接枝，不作为交联点的水凝胶R gel，在5mM双氧水条件下，前24h能较大程度地保持结构完整，在pH＝5，5mM双氧水中，水凝胶在6h后逐步开始降解。前期维持水凝胶结构稳定，对组织修复来说也较为重要。本发明中，水凝胶R gel的降解情况如图6所示。
朱等人设计并制备的侧链接枝TEMPO的热响应可注射水凝胶聚(NIPAAM-co-VP-co-MAPLA-co-MATEMPO)，可有效清除活性氧自由基。同样，该水凝胶未加载其他治疗药物，但仍能有效防止心肌梗死时心室壁变薄，减少纤维化，促进血管再生[1]。朱制备的TEMPO接枝温度响应水凝胶在心功能恢复上与对照组无显著性差异，而本发明的R gel在心功能治疗方面具有明显优势。R凝胶治疗8周时，LVEF恢复至71.57±9.98％，与Sham组80.5±6.23％非常接近，远优于MI组的59.4±4.61％，具有显著性差异。

Claims (10)

1.一种侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料，其特征在于，是由两种聚合物溶液混合成胶制得的，所述两种聚合物为接枝有己二酸二酰肼及苯硼酸的透明质酸(HA-ADH-PBA)和氧化葡聚糖(O-Dex)。
2.侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将透明质酸(HA)溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到HA的PBS溶液；将溶液置于37℃的水浴中，搅拌，搅拌过程中依次加入己二酸二酰肼(ADH)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应4h，反应过程保持pH＝6；停止调节pH值，继续37℃水浴并搅拌，反应过夜后，调节pH＝7，将反应后混合液滴入到冰乙醇中沉降，离心收集沉淀，将沉淀溶于去离子水并透析5天后冷冻干燥，得到修饰有己二酸二酰肼的透明质酸(HA-ADH)；
2)将Milli-Q水和二甲基亚砜混合，配制成混合溶剂，加入对甲酰基苯硼酸(PBA)以及步骤1)的产物HA-ADH，得到混合溶液；滴入一定量的10％的盐酸溶液进行催化，搅拌下反应过夜；反应结束后，反应液滴入冰乙醇中沉降，离心收集沉淀，真空干燥，得到接枝有己二酸二酰肼及苯硼酸的透明质酸(HA-ADH-PBA)；
3)向单口烧瓶中加入葡聚糖(Dex)，用Milli-Q水完全溶解，置于37℃水浴中，滴加NaIO4水溶液，避光搅拌反应8h；向反应液中加入乙二醇，继续反应1h，反应液滴入至冰乙醇沉降，离心收集沉淀，将沉淀溶于去离子水并透析5天后冷冻干燥，得到氧化葡聚糖(O-Dex)；
4)将步骤2)的产物HA-ADH-PBA和步骤3)的产物O-Dex分别溶于PBS中，两种溶液充分混匀，置于37℃烘箱中成胶，得到侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料(R gel)。
3.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，透明质酸的分子量为100kDa，所述磷酸盐缓冲液为pH＝6的二倍浓度磷酸盐缓冲液，透明质酸在所述溶液中的浓度为1wt％-10wt％；ADH、EDC、NHS的投料量分别为所述溶液中透明质酸重复单元物质的量的10-30倍、1-5倍、2-10倍；所述调节pH＝7的方法为加入5mol/L的NaOH溶液。
4.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，配制所述混合溶剂时，Milli-Q水和二甲基亚砜的体积比为3：1-2：1；对甲酰基苯硼酸的投料量为己二酸二酰肼接枝量物质的量的1-2倍；HA-ADH在所述混合溶液中的质量分数为1％-5％。
5.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，葡聚糖在Milli-Q水溶液中的质量分数为1％-5％；NaIO4与葡聚糖重复单元的投料摩尔比为1：1-1：9；乙二醇的投料量为NaIO4物质的量的0.5-1倍。
6.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤3)中，透析的截留分子量为8-14kDa。
7.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，HA-ADH-PBA在PBS溶液中的浓度为5wt％-10wt％。
8.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，O-Dex在PBS溶液中的浓度为10wt％-20wt％。
9.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，HA-ADH-PBA的PBS溶液与O-Dex的PBS溶液等体积混合。
10.根据权利要求2所述的侧链接枝有苯硼酸的具有消除活性氧功能的席夫碱水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，置于37℃烘箱中成胶的时间为2-3h。
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