CN104758939A - 一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备及应用。所述水凝胶由苯硼酸改性的壳聚糖和带有活性官能团的交联剂通过亚胺键和葡苯硼酸酯两种动态共价键交联而成，具有可注射型和自修复性能。亚胺键在正常生理pH值下较稳定，在弱酸性pH值下会发生水解，对pH值变化具有敏感性。苯硼酸酯在有葡萄糖存在时会发生竞争反应，使水凝胶的网络结构发生改变，具有葡萄糖响应性。通过调控苯硼酸改性壳聚糖和交联剂的结构、组成和功能基团，能够调节水凝胶的流变性能，控制其对底物的活性释放，该体系可作为药物载体，用于输送各种抗肿瘤和糖尿病药物，也可作为组织工程支架材料，用于细胞的包封和培养，实现药物和细胞层面的协同治疗。

Description

一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于亚胺和苯硼酸酯两种动态共价键交联的具有pH/葡萄糖双响应性、可注射性和自修复性的壳聚糖基水凝胶的制备方法，以及该水凝胶作为药物载体和组织工程支架材料的应用。

背景技术

水凝胶是由水溶性或亲水性高分子通过化学交联(共价键、离子键)或者物理交联(氢键、范德华力、物理缠绕)形成的三维网络结构，性质柔软，能在水中溶胀，吸收大量水的同时能保持一定的形状，具有柔软性和弹性，类似于活体组织，在生物医药领域有广泛的应用(Adv.Drug Delivery Rev.2001，53，19；Drug Discovery Today 2002，7，569.)。

水凝胶可作为双目标载体，即组织再生中细胞的支撑材料和药物控制释放载体，实现细胞和药物双效治疗。本着微创医疗和可注射组织工程的目的，原位凝胶体系受到了广泛的关注。凝胶基体在注射前将生物分子或者细胞混合在溶液中，经注射可以将负载了生物分子或细胞的支架材料植入到需要部位，凝胶化后，便成为药物制剂中的药物释放基点或组织再生的细胞生长基点，避免了手术植入的痛苦和繁琐，且原位细胞固定也有利于填充一个不规则的组织缺陷(Chem.Soc.Rev.2008，37，1473.)。

自修复水凝胶在破损后能够自动修复，具有类似于某些生物系统的性质。作为一种新型功能材料，在生物医药如药物释放和组织工程领域引起了广泛的兴趣。与传统凝胶不同，在注射后破损的自修复凝胶碎块能再生成一个整体的网络，停留在目标位点，提高药物释放的效率。

向高分子主链引入具有环境响应性的官能基团可以构筑环境响应性水凝胶，即智能水凝胶。智能水凝胶能对环境刺激做出响应，如pH、温度、离子强度、生化信号和磁场等，实现对药物的控制释放。针对不同生理微环境中的刺激信号设计具有环境响应性的智能药物释放载体，能够有效提高药物的生物利用度，降低毒副作用，增强治疗效果。具有pH/葡萄糖响应性的水凝胶在糖尿病药物和抗肿瘤药物释放体系具有十分重要的意义和应用前景。

使用动态共价键构筑的水凝胶(即动态键凝胶)在具有较高机械强度的同时还具有可注射性和自修复性能，且由于敏感基团是化学键，从而极大的拓宽了可选择高分子材料的范围，可构筑具有多重响应性的水凝胶。到目前为止，酰腙键、烷氧胺键、双硫键、三硫酯、DA反应等均已应用于动态材料的合成中。

随着生物医药技术的迅速发展，对于水凝胶材料提出了更新更高的要求：(1)具有良好的生物相容性和生物降解性，不引起细胞坏死和炎症反应，不需手术取出；(2)能原位形成凝胶，可通过注射方式植入体内，避免手术植入的痛苦和繁琐；(3)具有较好的环境响应性，设计精细结构，能够根据生理微环境的差别调节所包覆分子的释放速度，实现可控释放；(4)具有一定的机械强度和自修复能力，能够承受体内和外界的挤压和摩擦，破损后能够自动修复。目前的报道中，很少同时考虑这些性能，尤其是关于集多重环境响应性、可注射性和自修复性能三效合一的水凝胶材料的制备及其在药物载体中的应用探索还未见报道。因此，制备集多重环境响应性、可注射性和自修复性能三效合一的水凝胶材料，研究其在生物医学领域中的应用具有是十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备方法，目的之二是提供该水凝胶在生物医学领域中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备，包括以下步骤：A.将苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物溶于水，得到溶液a；B.将含有多羟基和醛基官能团的交联剂溶于水，得到溶液b；C.将上述溶液a与溶液b混合，搅拌后，形成水凝胶；所述步骤A中的苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物的结构式为：

其中，R为H或CH2OH；R’为HNC＝O)或R”为甲基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、卤素、羟基、羟甲基、酯基中的一种；n＝9～200。

在人体内，正常组织和病变部位的生理微环境存在差别，如糖尿病人体内的葡萄糖浓度偏高；而在肿瘤部位，由于肿瘤细胞的代谢比正常细胞旺盛，其摄取葡萄糖能力是正常细胞的10倍左右，细胞内葡萄糖浓度高于正常细胞。糖酵解最终产物为乳酸，肿瘤细胞内pH值低于正常生理pH值。

苯硼酸酯是苯硼酸及其衍生物与多羟基化合物形成的复合物，在有葡萄糖存在时，会发生竞争反应，被用于构筑葡萄糖响应体系，比葡萄糖氧化酶和凝集素体系具有更好的稳定性和设计的多样性。亚胺键具有生理pH响应性，可通过调节pH值触发键的形成与破坏，不需要引发剂，且该反应的小分子产物为水，避免了体系制备过程中杂质的引入，被用于构筑pH响应性体系。

本发明进一步的将苯硼酸官能团与亚胺键结合，制备了一种pH葡萄糖双敏感水凝胶，能同时对葡萄糖信号与pH信号做出响应。具体的，本发明通过苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物与带有活性官能团的交联剂反应生成pH响应的亚胺和葡萄糖响应的苯硼酸酯两种动态键，构筑具有pH葡萄糖双响应性的自修复可注射水凝胶。亚胺键在正常生理pH值下较稳定，在弱酸性pH值下会发生水解，对从7.4到4.5或更低的pH值变化具有敏感性。苯硼酸酯在有葡萄糖存在时会发生竞争反应，使水凝胶的网络结构发生改变，对外界葡萄糖浓度具有响应性。

作为优选，所述步骤C中形成所述水凝胶的温度为4℃～40℃，形成水凝胶的时间为1s～1h，形成水凝胶时溶液的pH值为3～10。

作为优选，所述步骤C中的pH值可用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、巴比妥纳-盐酸、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化纳缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、盐酸、氢氧化钠中的至少一种进行调节。

作为优选，所述步骤B中的交联剂为I/II或I/III的组合，其中，I、II、III具有以下结构式，

I：

II：

III：

其中，R为酯基或酰胺基或醚基，n＝9～150，m＝9～150。

本发明的目的之二是提供上述水凝胶在生物医学领域中的应用，将药物溶液和/或细胞分散液加入到苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物溶液中，将制备的水凝胶作为药物载体或组织工程支架材料的应用。具体的，本发明所述的水凝胶可以作为药物载体，可用于负载抗肿瘤及糖尿病药物如阿霉素、紫杉醇、胰岛素、SiRNA等中的一种或多种，以形成载药水凝胶，并依靠亚胺和苯硼酸酯的pH/葡萄糖响应性，在分子水平上智能地控制药物从水凝胶中释放的速度和药物释放部位，实现药物的协同治疗。

本发明所述的水凝胶也可以作为组织工程支架材料，可用于细胞的包封和3D培养，可同时负载药物，形成水凝胶/细胞/药物复合体，从组织修复和药物治疗两个层面同时进行医治。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过亚胺和苯硼酸酯两种动态键构筑水凝胶，该水凝胶具有生物相容性和pH/葡萄糖双响应性，同时动态凝胶还具有自修复性和可注射性，可通过注射的方式植入到病灶部位，避免了手术植入的痛苦和繁琐，并且有利于填充不规则的损伤部位。

2、交联的亚胺键在正常生理条件下稳定，但其可经由肿瘤组织的弱酸环境和相应细胞器低pH值的诱导而断裂；苯硼酸酯在有葡萄糖存在时会发生竞争反应，使水凝胶的网络结构发生改变，具有葡萄糖响应性，从而在分子水平上智能的控制药物释放的速度。亚胺键和苯硼酸酯对构筑可敏感地响应生理环境中pH和葡萄糖浓度变动的药物载体体系意义重大。

3.本发明中的水凝胶可以作为药物载体，用于负载抗肿瘤药物和糖尿病药物，如阿霉素、柔红霉素、去甲氧基柔红霉素、喜树碱及其衍生物、紫杉醇、甲氨蝶呤、姜黄素、伊立替康、苦参碱、丹酚酸、胰岛素、SiRNA等中的一种或多种，以形成包覆多种药物的载药水凝胶，实现药物的协同治疗。同时，该水凝胶还可以作为细胞支架材料，用于负载各种治疗所需细胞，以形成细胞/水凝胶3D复合物，实现细胞层面的治疗和修复。

4、本发明的水凝胶其制备方法简单、操作方便。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细的描述，但不限于实施例所公开的内容。

实施例1

基于苯硼酸改性壳聚糖(CSPBA)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二醇(PVA/PEGCHO)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

(1)CSPBA的合成。

将177mg 3-羧基苯硼酸、123.3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入250ml圆底烧瓶，加入60ml甲醇溶解，室温下搅拌20min后，加入166.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和壳聚糖溶液(0.5g溶于60ml 0.3％ HAc)，室温下搅拌24h后，将反应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变3-羧基苯硼酸和壳聚糖的摩尔比，可制备不同苯硼酸接枝率的CSPBA。

(2)PEGCHO的合成。

称取6.0g对醛基苯甲酸，8.25g N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，305mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入250ml圆底烧瓶中，加入100ml二氯甲烷使反应物混合均匀，37℃水浴恒温搅拌，滴加80ml溶有10g聚乙二醇(PEG)的二氯甲烷溶液，恒温搅拌24h。将反应物过滤除去沉淀N，N’-二环己基脲(DCU)。滤液浓缩后用异丙醇进行重结晶，得到的粗产物先后用异丙醇及冰乙醚洗涤三次；真空干燥除溶剂后，用水洗方法以除去过量DCC，冷冻干燥后得到白色粉末状产物。使用不同分子量的PEO或PEO-PPO共聚物可制备不同结构的醛基交联剂。

(3)CSPBA/PVA/PEGCHO pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg CSPBA溶于0.5ml水，10mg PEGCHO溶于0.25ml水，10mgPVA溶于0.25ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将三种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例2

基于苯硼酸改性壳聚糖(CSPBA)和氧化葡聚糖(Odex)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

(1)氧化葡聚糖的合成。

称取1g葡聚糖溶于30ml水中，加入0.597g高碘酸钠(溶于20ml水中)，室温下避光反应24h后，加入0.257g丙三醇，继续搅拌15min，将反应混和液转移到透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变葡聚糖和高碘酸钠的摩尔比，可制备醛基含量不同的氧化葡聚糖。

(2)CSPBA/Odex pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg CSPBA溶于0.5ml水，10mg Odex溶于0.5ml水，分别用2MHCl和NaOH调节pH值至7.5，将两种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例3

基于苯硼酸改性氯化壳聚糖(ClCSPBA)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二醇(PVA/PEGCHO)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

(1)ClCSPBA的合成

将117.7mg 3-羧基苯硼酸、40.7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到250ml圆底烧瓶，加入60ml甲醇溶解，室温下搅拌20min后，加入67.9mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和0.5g氯化壳聚糖溶液(溶于60ml水)，室温下搅拌24h后，反应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变3-羧基苯硼酸和氯化聚糖的摩尔比，可制备不同苯硼酸接枝率的ClCSPBA。

(2)ClCSPBA/PVA/PEGCHO pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg ClCSPBA溶于0.5ml水，10mg PEGCHO溶于0.25ml水，10mg PVA溶于0.25ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将三种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例4

基于苯硼酸改性氯化壳聚糖(ClCSPBA)和氧化葡聚糖(Odex)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg ClCSPBA溶于0.5ml水，10mg Odex溶于0.5ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将两种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例5

基于苯硼酸改性羧化壳聚糖(NSCSPBA)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二醇(PVA/PEGCHO)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

(1)NSCSPBA的合成。

将0.5g羧化壳聚糖、20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入250ml圆底烧瓶，加入60ml水溶解，室温下搅拌20min后，加入40mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和0.1g 3-氨基壳聚糖溶液(溶于60ml甲醇)，室温下搅拌24h后，反应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变3-羧基苯硼酸和羧化壳聚糖的摩尔比，可制备不同苯硼酸接枝率的NSCSPBA。

(2)NSCSPBA/PVA/PEGCHO pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg NSCSPBA溶于0.5ml水，10mg PEGCHO溶于0.25ml水，10mg PVA溶于0.25ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将三种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例6

基于苯硼酸改性羧化壳聚糖(NSCSPBA)和氧化葡聚糖(Odex)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg NSCSPBA溶于0.5ml水，10mg Odex溶于0.5ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将两种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例7

基于苯硼酸改性羟乙基脱乙酰壳聚糖(GCPBA)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二醇(PVA/PEGCHO)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

(1)GCPBA的合成。

将27.9mg 3-羧基苯硼酸、19.3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入100ml圆底烧瓶，加入30ml甲醇溶解，室温下搅拌20min后，加入23.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和0.1g羟乙基脱乙酰壳聚糖溶液(溶于30ml水)，室温下搅拌24h后，反应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变3-羧基苯硼酸和羟乙基脱乙酰壳聚糖的摩尔比，可制备不同苯硼酸接枝率的GCPBA。

(2)GCPBA/PVA/PEGCHO pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg GCPBA溶于0.5ml水，10mg PEGCHO溶于0.25ml水，10mgPVA溶于0.25ml水，分别用2M HCl和NaOH调节pH值至7.5，将三种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

实施例8

基于苯硼酸改性羟乙基脱乙酰壳聚糖(GCPBA)和氧化葡聚糖(Odex)pH/葡萄糖双敏感水凝胶的制备。

称取10mg GCPBA溶于0.5ml水，10mg Odex溶于0.5ml水，分别用2MHCl和NaOH调节pH值至7.5，将两种溶液混合，搅拌均匀，约30s后形成透明状凝胶。分别调节各组分溶液的浓度、pH值和比例，均可形成凝胶。

Claims (5)

1.一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备，其特征在于，包括以下步骤：A.将苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物溶于水，得到溶液a；B.将含有多羟基和醛基官能团的交联剂溶于水，得到溶液b；C.将上述溶液a与溶液b混合，搅拌后，形成水凝胶；所述步骤A中的苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物的结构式为：

其中，R为H或CH2OH；R’为HNC＝O)或R”为甲基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、卤素、羟基、羟甲基、酯基中的一种；n＝9～200。

2.根据权利要求1所述的一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备，其特征在于，所述步骤C中形成所述水凝胶的温度为4℃～40℃，形成水凝胶的时间为1s～1h，形成水凝胶时溶液的pH值为3～10。

3.根据权利要求2所述的一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备，其特征在于，所述步骤C中的pH值可用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、巴比妥纳-盐酸、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化纳缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、盐酸、氢氧化钠中的至少一种进行调节。

4.根据权利要求1至3任一项所述的一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的制备，其特征在于，所述步骤B中的交联剂为I/II或I/III的组合，其中，I、II、III具有以下结构式，

其中，R为酯基或酰胺基或醚基，n＝9～150，m＝9～150。

5.一种pH葡萄糖双敏感水凝胶的应用，其特征在于，将药物溶液和/或细胞分散液加入到苯硼酸改性的壳聚糖及其衍生物溶液中，将制备的水凝胶作为药物载体或组织工程支架材料的应用。