CN110772667A - 一种羊膜材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羊膜材料及其制备方法,包括以下步骤:(1)取羊膜,使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍;(2)将步骤(1)清洗后的羊膜置于pH为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中进行交联;(3)用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;(4)将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;(5)对干燥后的羊膜进行灭菌。本发明方法操作工艺简便,不需特殊仪器,便于规模化生产;通过使用原花青素进行交联并优化其使用条件,能有效克服使用化学交联剂处理带来的毒性问题,得到的羊膜材料保留良好组织相容性能和活性,更具有强度佳、保质期长等优点,具有重要的医用及经济价值。

Description

一种羊膜材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,涉及一种羊膜材料;具体涉及一种羊膜材料及其制备方法。
背景技术
羊膜是一类无淋巴管神经及血管,无免疫原性的生物膜。羊膜具备显著的抗纤维化特性,对新生血管以及感染具有明显的抑制功能。羊膜富含IV、V型胶原、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)等,能显著促进上皮细胞的生长、增殖和分化,利于上皮类创伤的愈合。此外,羊膜富含蛋白抑制类生物因子,可以抑制胶原纤维过度增生,预防组织粘连。并且羊膜的来源途径广泛、包括人在内的胎生的哺乳动物生产时均具有胎盘,作为生产后的废弃物,胎盘(羊膜)的取材操作简洁且成本低,因此在眼表损伤修复、皮肤损伤/烧伤修复、肌腱重建、外科手术防黏连等领域具有极大应用前景。
然而,目前临床使用的羊膜材料主要是从产妇资源捐献的胎盘剥离而来,一般是未经处理,质地较薄,机械强度较差,容易卷曲,易撕裂,临床使用操作不便利且短期内会溶解而失去功能,因此临床操作常采用缝合及多次/多层贴敷的方法以满足长时间使用的需求。为解决此问题,有研究及专利报道使用化学试剂,如戊二醛、甲醛等,对羊膜进行化学交联,虽然可以一定程度提升羊膜的力学强度,但化学交联试剂的残留会引起生物毒性,限制了其临床的使用。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是提供一种安全性好,组织相容性、力学强度佳的羊膜材料及其制备方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种羊膜材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)取羊膜,使用无菌缓冲溶液清理羊膜表面残留的血液及污渍;
(2)将步骤(1)清洗后的羊膜置于pH值为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中;
(3)用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;
(4)将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;
(5)对干燥后的羊膜进行灭菌。
本发明的羊膜材料制备方法简单便捷,处理过程无需使用酸碱、有机溶剂及化学试剂对组织进行处理,尽量保留天然羊膜的致密结构及生物特性。另外,本发明方法使用天然提取物原花青素代替传统的化学交联剂,更温和,进一步避免了因为化学交联剂残留带来的生物毒性。另外,区别于其它的可与组织相互作用的天然试剂,如番茄红素或虾青素,原花青素具有更好的水溶性,可以更好的与羊膜通过产生多重氢键相互作用,在更少的影响羊膜活性基础上,保留羊膜良好的组织相容性且对羊膜的力学性质进行有效提升。交联处理羊膜的条件将直接影响到样品的理化性质和生物功能,为了得到力学性质良好且最大可能保护羊膜所含生物活性分子以提高其生物功能,通过实验发现使用原花青素的质量百分比为0.5~5%(原花青素质量百分含量达到5%基本饱和),在较好地保持羊膜原有结构和活性、延长保质期的同时,能够显著提高制备得到的羊膜材料的力学强度。
作为本发明的优选实施方式,所述羊膜为经健康人胎盘或动物胎盘剥离得到;所述胎盘为新鲜胎盘或经冷冻保藏后室温解冻后的胎盘;所述动物包括猪或牛。
本发明的羊膜来源广泛,可取材于人、猪、牛等多各对象,可规模化的获得原材料,为产品在产业上的广泛应用打下基础。
作为本发明的优选实施方式,步骤(1)中所述无菌缓冲液为PBS缓冲溶液。
作为本发明的优选实施方式,步骤(2)中所述交联缓冲液为PBS缓冲溶液。
作为本发明的优选实施方式,步骤(2)中所述交联缓冲溶液含有质量百分比为0.5%的原花青素。
随着原花青素的浓度增加,羊膜的强度逐渐增加,在质量百分比为0.5%时,基本达到最大,随后变化较缓,考虑到成本问题,使用含有质量百分比0.5%的原花青素的缓冲溶液最佳。
作为本发明的优选实施方式,步骤(2)中所述交联缓冲溶液的pH值为7.4。
经测试优化,所述交联缓冲溶液pH值为7.4时,所得羊膜材料的生物活性更佳。
作为本发明的优选实施方式,步骤(2)中的交联步骤为于4~45℃中恒温浸泡1min~72h。
作为本发明的优选实施方式,步骤(3)中所述清洗缓冲液为无菌PBS溶液,或含有青霉素、链霉素、两性霉素中至少一种的无菌PBS溶液。
进一步地,所述青霉素浓度为10~250μg/mL,所述链霉素浓度为10~250μg/mL,所述两性霉素浓度为0~10μg/mL。
作为本发明的优选实施方式,所述步骤(4)的冷冻干燥过程为:温度为-40~0℃,气压为0.0001bar~800bar,处理10min~120h。
作为本发明的优选实施方式,所述步骤(5)的灭菌处理为辐照灭菌;辐照源为高能电子加速器,辐照量为10~30kGy。
本发明还要求保护根据本发明所述方法制得的羊膜材料。
本发明操作工艺简便,不需特殊仪器,可规模化生产;本发明羊膜材料制备时采用原花青素进行交联并对交联条件进行优化,能有效避免由于传统化学交联剂残留带来的细胞或组织毒性问题,相对于其他的天然交联剂交联效果更佳,能更好地保留材料的致密结构、组织相容性和生物活性,更进一步显著地提高材料的力学性能,延长降解周期;本发明羊膜材料的制备方法简洁,来源广泛,制备得到的羊膜材料性质较现有方法制备得到的材料有显著的提升,具有重要的医用及经济价值。
附图说明
图1为本发明中使用无菌PBS冲洗清理后的新鲜羊膜。
图2为本发明中原花青素处理过的羊膜。
图3为本发明得到原花青素处理羊膜材料和新鲜羊膜的透光率对比。
图4为本发明得到原花青素处理羊膜材料和新鲜羊膜的降解特性对比。
图5为在不同pH值进行交联,所制备的羊膜材料生物活性的对比。
图6为本发明使用不同浓度的原花青素处理得到的羊膜材料力学强度对比。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
取新鲜胎盘,并剥离羊膜,按本发明方法进行处理:使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍;清洗后的羊膜置于pH值为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中,于4~45℃中恒温浸泡1min~72h;用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;对干燥后的羊膜进行灭菌。
其中,使用无菌PBS冲洗清理后的新鲜羊膜如图1,按本发明方法经原花青素处理过的羊膜如图2。图1中未处理的羊膜为白色透明状,图2中处理后的羊膜材料为橙红色透明状。
实施例2
取新鲜胎盘,并剥离羊膜,按本发明方法进行处理:使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍;将羊膜裁剪成形状、大小相似的2份;其中一份不进行处理,另一份按本发明方法进行处理:清洗后的羊膜置于pH值为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中,于4~45℃中恒温浸泡1min~72h;用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;对干燥后的羊膜进行灭菌。
测定未处理羊膜和处理后的羊膜材料的透光率,透光率测试方法参照国家标准(GB T 2410-2008透明塑料透光率和雾度的测定),具体为:将待测样品置于测试光通道处,以空气(无加载样品)调节仪器零点,于波长430nm处,测定其透光率。同一样品多次测量,并做误差分析。结果如图3。
由图3可得,处理后的羊膜材料与未处理的羊膜透光率无明显差异。
实施例3
取新鲜胎盘,并剥离羊膜,按本发明方法进行处理:使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍;将羊膜裁剪成形状、大小相似的2份;其中一份不进行处理,另一份按本发明方法进行处理:清洗后的羊膜置于pH值为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中,于4~45℃中恒温浸泡1min~72h;用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;对干燥后的羊膜进行灭菌。
测定未处理羊膜和处理后的羊膜材料的降解率,降解的测试方法为:将样品分别置于一定量的无菌PBS中(为抑制细菌,降解液中添加适量双抗),于37℃下在预定时间取出、称量剩余质量,做数据统计。结果如图4。
由图4可得,处理后的羊膜材料降解速率变慢,显著低于未处理的羊膜,13天后仍有原有质量的70%以上。
实施例4
取新鲜胎盘,并剥离羊膜,使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍。将羊膜裁剪成形状、大小相似的3份;其中一份不进行处理,其余两份分别置于5mg/mL原花青素的不同pH值(pH=6、pH=7.4)的交联缓冲溶液中,于4~45℃中恒温浸泡1min~72h;用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;对干燥后的羊膜进行灭菌。
将各羊膜材料进行表面成纤维细胞增殖实验,具体为:将样品平铺于24孔培养板中,少量培养基浸润。将细胞计数的定量的细胞悬液体均匀滴加至材料表面。约半小时后,待细胞粘附,加入培养基,完全浸润材料。预定时间后,采用CCK-8试剂盒计数细胞增殖情况。结果如图5。
由图5可得,使用pH=7.4的交联缓冲液处理羊膜,所得羊膜材料的细胞活性更强。
实施例5
取新鲜胎盘,并剥离羊膜,使用无菌缓冲溶液清理表面残留的血液及污渍。将羊膜裁剪成形状、大小相似的5份;分别置于含有不同浓度原花青素(0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的交联缓冲溶液中,于4~45℃中恒温浸泡1min~72h;用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;对干燥后的羊膜进行灭菌。
测定各羊膜材料的力学强度,参考国家标准GB/T 1040,具体为:将待测样品裁剪一致尺寸(10mm×150mm),加载到拉伸试验机后,以5mm/min速度拉伸,每个样品平行测试多次,得到结果进行计算。结果如图6。
由图6可得,随着原花青素浓度增加,羊膜材料的韧性更佳,当原花青素浓度为5mg/mL时趋于最佳。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种羊膜材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取羊膜,使用无菌缓冲溶液清理羊膜表面残留的血液及污渍;
(2)将步骤(1)清洗后的羊膜置于pH值为6.9~7.4,含有质量百分比为0.5~5%的原花青素的交联缓冲溶液中进行交联;
(3)用清洗缓冲液淋洗处理后的羊膜;
(4)将淋洗后的羊膜裁剪为所属尺寸后进行冷冻干燥处理;
(5)对干燥后的羊膜进行灭菌。
2.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,所述羊膜经健康人胎盘或动物胎盘剥离得到;所述胎盘为新鲜胎盘或经冷冻保藏后室温解冻后的胎盘,所述动物包括猪或牛。
3.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述无菌缓冲液为PBS缓冲溶液。
4.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述交联缓冲溶液含有质量百分比为0.5%的原花青素。
5.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述交联缓冲溶液的pH值为7.4。
6.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,步骤(2)中交联步骤为:4~45℃中恒温浸泡1min~72h。
7.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述清洗缓冲液为无菌PBS溶液,或含有青霉素、链霉素、两性霉素中至少一种的无菌PBS溶液。
8.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)的冷冻干燥过程为:温度为-40~0℃,气压为0.0001bar~800bar,处理10min~120h。
9.如权利要求1所述羊膜材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)的灭菌处理为辐照灭菌;辐照源为高能电子加速器,辐照量为10~30kGy。
10.如权利要求1~9任一项所述方法制得的羊膜材料。
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