CN104888272A - 一种去细胞主动脉瓣支架及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种去细胞主动脉瓣支架及其制备方法和用途。本发明提供了一种去细胞主动脉瓣支架，其经聚乙二醇-聚己内酯处理动物主动脉瓣得到；同时提供了一种去细胞主动脉瓣的制备方法，包括如下步骤：(1)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；以及(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。该去细胞主动脉瓣制备方法条件简单、成本低、去细胞效果好，制备的去细胞瓣膜支架具备天然心脏瓣膜的相关性能；且利用该方法制备得到的去细胞瓣DNA含量大幅降低，减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。

Description

一种去细胞主动脉瓣支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种组织工程心脏瓣膜去细胞支架材料及其制备方法和用途。

背景技术

目前组织工程心脏瓣膜的研究主要是集中在以下几方面：瓣膜支架制备及改性，种子细胞的选择及培养，种子细胞与瓣膜支架材料的相互作用。而瓣膜支架的制备是整个组织工程心脏瓣膜研究的前提，因此制备性能良好的瓣膜支架至关重要。

去细胞基质由于其良好的生物相容性，并可为种子细胞黏附、增殖、分化等提供类似于体内的基质微环境，在组织工程学中得以广泛应用。目前，去细胞的组织工程心脏瓣膜支架大多为动物的去细胞心脏瓣膜和去细胞心包，因其具有良好的生物学和力学性能，且来源广泛，价格低廉，被越来越多的应用于组织工程心脏瓣膜研究。理想的去细胞瓣膜支架应保持瓣膜细胞外基质的完整性、良好的生物相容性、三维立体超微多孔结构，进而为种子细胞和组织生长提供足够的空间条件，这些特点都是合成材料很难模仿的。

应用去细胞瓣膜支架材料构建组织工程心脏瓣膜，瓣膜的去细胞是至关重要的一步。根据去细胞方法性质的不同，可以大体上将其分为物理、化学和酶学方法，在实际的工作过程中，根据需要也可以将不同的去细胞方法或者不同的试剂联合应用，以得到接近理想去细胞瓣膜的效果。目前去细胞常用的物理方法包括快速冻融，声波降解等，化学方法常用试剂有曲拉通、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20等，酶学方法常用酶为低浓度的胰蛋白酶。但目前应用最多的是化学方法中的表面活性剂，阳离子表面活性剂的毒 性最大，其次是阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂最小，但去污能力以非离子表面活性剂最强，其次是阴离子表面活性剂。

目前去细胞技术还不成熟，所有的去细胞方法都会导致瓣膜结构的破坏和表面成分的潜在丢失，在一定程度上加速瓣膜的变性和钙化，并且常用的去细胞试剂都具有一定的毒性，且去细胞时间较长大多需48小时甚至更长，单纯的表面活性剂用于瓣膜及其类似组织去细胞效果往往不理想，很难保证细胞去除完全和同时保证瓣膜及类似组织的细胞外基质的完整性及机械性能不会变化。因此寻求一种试剂用于心脏瓣膜去细胞，对于构建去细胞组织工程心脏瓣膜支架尤为必要。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：现有技术的去细胞方法都会导致瓣膜结构的破坏和表面成分的丢失，一定程度上加速瓣膜的变性和钙化，而且会产生一定的毒性。

为了解决上述问题，需要一种去细胞主动脉瓣支架，使其具备天然心脏瓣膜的相关性能，同时安全无毒。本发明的目的在于提供一种去细胞主动脉瓣支架，使其具备天然心脏瓣膜的相关性能，同时安全无毒，DNA含量大幅降低，极大的减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

一种去细胞主动脉瓣支架，其经聚乙二醇-聚己内酯处理动物的主动脉瓣得到。

优选的，所述的主动脉瓣支架，其通过包含如下步骤的方法制备得到：

(1)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；

以及

(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。

优选的，所述的动物为哺乳动物。

一种去细胞主动脉瓣支架的制备方法，其包含如下步骤：

(1)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；

以及

(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。

优选的，步骤(1)前，首先将所述的动物主动脉瓣置于4℃含抗生素的培养基中培养12～24小时。

优选的，所述的培养基为高糖DMEM培养基，其中抗生素含量为青霉素80U/ml～120U/ml和链霉素80μg/ml～120μg/ml。

优选的，步骤(1)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

优选的，步骤(1)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。 

优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L。

优选的，步骤(1)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中聚乙二醇-聚己内酯的浓度为0.5～2％(w/v)。

优选的，步骤(1)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中聚乙二醇-聚己内酯的浓度为1％(w/v)。

优选的，步骤(1)中，所述的主动脉瓣在所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中，于常温～37℃、50～100rpm振荡处理12～36小时。

优选的，步骤(1)中，所述的主动脉瓣在所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中振荡处理的温度为37℃。

优选的，步骤(2)中，所述的缓冲液包含0.1mg/ml～0.3mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ和10μg/ml～30μg/ml核糖核酸酶A。

优选的，步骤(2)中，所述的主动脉瓣在所述的核酸酶缓冲液中，于常温～37℃、50～100rpm振荡处理2～4小时。

优选的，步骤(2)中，所述的主动脉瓣在所述的核酸酶缓冲液中振荡处理的温度为37℃。

优选的，所述的制备方法还包括如下步骤：将步骤(1)得到的主动脉瓣置于缓冲液中，于常温～37℃、50～100rpm振荡清洗12～36小时。

优选的，步骤(1)得到的主动脉瓣置于缓冲液中振荡清洗的温度为37℃。

优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

优选的，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.03～0.08mol/L。

一种去细胞主动脉瓣支架，其由上述所述的制备方法制备得到。

优选的，所述的主动脉瓣支架在制备组织工程心脏瓣膜材料中的应用。

优选的，所述的聚乙二醇-聚己内酯的分子量为4000～6000，其中聚乙二醇链段的分子量为2000～3000。

优选的，所述的聚乙二醇-聚己内酯通过包括如下步骤的方法制备得到：

在氮气环境下，以聚乙二醇和ε-己内酯为原料，以辛酸亚锡为催化剂，90～100℃加热得到聚乙二醇-聚己内酯。

优选的，所述的聚乙二醇和ε-己内酯加热反应24～36小时。

本发明所用到的聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)可以自合成，也可以从市面上购买得到。

聚乙二醇-聚己内酯属于非离子型表面活性剂，可降解、无毒，去污能力强，价格低廉，且其构成部分PEG和PCL均已被美国FDA组织批准在人体内使用。

本发明应用PEG-PCL低渗液对猪主动脉瓣进行去细胞处理，再经高渗、核酸酶处理，从而制备出去细胞完全的瓣膜支架材料。

本发明中的PEG-PCL为非离子表面活性剂，去污能力强，无毒可降解，且降解产物无毒，不污染环境。PEG-PCL聚合物中PEG链段以重复的乙二醇为基础结构，具有一定的表面活性，并且具有高度亲水性、无毒、无抗原性和免疫原性及良好组织相容性等优点。组织应用PEG-PCL浸泡，在去细胞的同时又能有效保护细胞外基质蛋白成分，减轻植入体内后的免疫排斥反应。PEG与疏水性PCL链段结合后的共聚物PEG-PCL作为非离子表面活性剂，在医药、食品等领域得到广泛应用。PCL和PEG均已被美国FDA组织批准在人体内使用，且PEG-PCL是经国际认证无毒害，具有良好的生物降解性和相容性。

本发明所制备的去细胞主动脉瓣支架材料，经生物学性能和力学性能评价，其中生物学性能检测包括苏木素-伊红(HE)染色、MASSON染色，扫 描电子显微镜观察瓣膜去细胞情况，测定瓣膜DNA含量、含水量、胶原蛋白含量、弹性蛋白含量，细胞毒性以及瓣膜溶血实验；力学性能测试包括最大拉伸强度、断裂强度、断裂伸长率和弹性模量的测定。实验证实，本发明制备的去细胞主动脉瓣支架具备良好的生物学性能和力学性能，达到本发明的目的。

本发明所取得的有益效果：

(1)本发明首次应用可降解无毒的表面活性剂PEG-PCL作为去细胞试剂，并成功地对猪主动脉瓣进行去细胞处理，细胞去除完全，去细胞细胞外基质超微结构保留完全且具备良好的生物相容性和力学性能，此为构建组织工程心脏瓣膜支架材料提供了一种新的去细胞方法。

(2)本发明中的非离子表面活性剂PEG-PCL作为一种去细胞试剂，与目前常用的去细胞试剂(曲拉通、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、胰酶等)相比，该试剂无毒无刺激性，可降解且降解产物无毒，去细胞方法简单易行，便于去细胞支架材料的批量生产，并且该去细胞溶液便于消毒。PEG-PCL可自行合成，合成方法简单，市场上亦有成品出售，价格低廉。

(3)本发明所制备去细胞瓣的DNA含量与新鲜正常瓣膜相比大幅降低(P＜0.05)，说明本发明的去细胞方法能将瓣膜的免疫原性大幅降低，可减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。

(4)应用本发明中的非离子表面活性剂PEG-PCL作为去细胞试剂，可解决目前常用去细胞试剂毒性残留问题，应用PEG-PCL作为去细胞试剂在生物支架材料的构建中具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例一的共聚物PEG-PCL的红外光谱图。

图2为实施例一的共聚物PEG-PCL的核磁共振氢谱图。

图3A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣HE染色图，图3B为实验组去细胞主动脉瓣HE染色图。

图4A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣MASSON染色图，图4B为实验组去细胞主动脉瓣MASSON染色图。

图5A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣扫描电子显微镜图，图5B为实验组去细胞主动脉瓣扫描电子显微镜图。

图6A为实施例一拉力试验机沿圆周方向示意图，图6B为沿径向方向，图6C为拉力试验机夹钳装置图。

图7为实施例二所述瓣膜的HE染色图。

图8为实施例二所述瓣膜的MASSON染色图。

图9为实施例三所述瓣膜的HE染色图。

图10为实施例三所述瓣膜的MASSON染色图。

图11为对比例所述瓣膜的HE染色图。

图12为对比例所述瓣膜的MASSON染色图。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种去细胞主动脉瓣支架及其制备方法，应用无毒的非离子表面活性剂，对动物主动脉瓣进行去细胞处理，制备具有良好生物学性能和力学性能的主动脉瓣支架仿生材料，为构建组织工程心脏瓣膜支架提供一种新的去细胞方法。该去细胞方法条件简单、成本低、去细胞效果好，制备的去细胞瓣膜支架具备天然心脏瓣膜的相关性能，且制备的去细胞瓣DNA含量大幅降低，减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。

具体而言，本发明提供了一种去细胞主动脉瓣支架，其经聚乙二醇-聚己内酯处理动物主动脉瓣得到。

本发明同时提供了一种主动脉瓣支架的制备方法，其包含如下步骤：

(1)将动物主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；

以及

(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液处理。

下面通过实施例和对比例对本发明作进一步的说明，但并不限制本发明的内容。本发明实施例和对比例中所用到的主动脉瓣是从猪体内获取的，但是本领域的人员应该注意的是，本发明并不仅仅局限于猪，其他哺乳动物(如牛、羊等)的瓣膜或心包也可实现本发明的技术效果。

其中实施例和对比例中，所用到试剂和仪器信息如下：

1.试剂

甲氧基聚乙二醇(PEG)购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号202509；

ε-己内酯(ε-CL)购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号704067；

辛酸亚锡购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号S3252；

三羟甲基氨基甲烷(TRIS)购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号252859；

甲苯、二氯甲烷、乙醚等其他试剂购于西陇化工股份有限公司；

青霉素、链霉素购于华北制药股份有限公司；

头孢唑林钠购于山东瑞阳制药有限公司；

庆大霉素、二性霉素购于河南天方药业有限公司；

脱氧核糖核酸酶I购于美国Sigma-Aldrich公司；

核糖核酸酶A购于美国Sigma-Aldrich公司；

动物组织基因组DNA提取试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；

胶原蛋白ELISA试剂盒购于美国RapidBio公司；

弹性蛋白ELISA试剂盒购于美国RapidBio公司；

苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；

MASSON染色试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司；

高糖DMEM培养基(改良Eagle’s细胞培养液)购于美国Hyclone公司；

RPMI 1640培养基购于美国Hyclone公司；

胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司；

磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)购于北京全式金生物技术有限公司；

TransDetect^TM Cell Counting Kit购于北京全式金生物技术有限公司；

人脐静脉内皮细胞购于ATCC。

2.仪器

扫描电子显微镜：型号Quanta200F，美国FEI公司出售； 

生物核酸蛋白测定仪：型号BioPhotometer Plus，德国Eppendrof出售；

恒温振荡器：型号SHA-BA，常州朗越仪器制造有限公司出售；

冷冻干燥机：型号FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司出售；

拉力试验机：型号HD-B609BS电脑伺服式拉力试验机，海达国际仪器有限公司出售；

傅立叶红外光谱仪：型号Nicolet 5700，美国热电尼高力公司出售；

核磁共振谱仪：型号AVANCEⅢ600MHz，瑞士布鲁克出售；

电子天平：型号BSA124S，赛多利斯科学仪器有限公司出售；

多功能酶标仪：型号VARIOSKAN，美国赛默飞世尔科技公司出售。

实施例一

1.溶液配制

(1)高渗TRIS缓冲液(0.05mol/L)：准确称取TRIS(MW121.14)0.6057g加入一定量三蒸水，用盐酸调节pH＝8.0，用三蒸水定容至100ml，对配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(2)低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)：对配制的高渗TRIS缓冲液(0.05mol/L)用三蒸水稀释5倍即得低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)，对配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(3)1％(w/v)PEG-PCL去细胞液：称取1g PEG-PCL，溶于100ml低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)中，充分溶解即得1％(w/v)PEG-PCL去细胞液。

2.聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)的合成及表征 

2.1聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)的合成

本实施例所用亲水性的PEG-PCL为自合成，其合成过程如下：

(1)分别称取经干燥处理的2g PEG和1.0674mlε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，以20微升辛酸亚锡为催化剂，加入10ml甲苯作为反应溶剂，反复抽真空充氮气5次，使反应在氮气环境中进行。

(2)在90℃油浴中加热且磁力搅拌下，开环聚合合成PEG-PCL。经24小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到PEG-PCL粗产物。

(3)90℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入2ml二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后用40ml乙醚对其进行沉淀，4℃静置，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。

(4)将白色沉淀物再次溶于2ml二氯甲烷，然后用40ml乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于真空干燥器干燥后封口并于-20℃保存，备用。

2.2聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)的表征

(1)红外光谱表征 

以溴化钾为分散剂，将合成的共聚物于室温干燥条件下研磨成粉末，取样品压片，于400-4000cm^-1扫描，测定其红外吸收光谱。

(2)核磁共振氢谱表征

将合成的共聚物溶于氘代三氯甲烷中，以四甲基硅烷作为内标物，进行 ¹H-NMR光谱(400MHz)表征。

其表征结果如下：

共聚物PEG-PCL的红外光谱结果见图1，其中3443cm^-1处为PCL链段末端-OH的伸缩振动峰，1729cm^-1为PCL链段C＝O的伸缩振动峰，1110cm^-1处为PEG链段C-O-C的伸缩振动峰，2800-3000cm^-1处为亚甲基C-H键的伸缩振动峰，证实合成的共聚物由PEG链段和PCL链段组成。

共聚物PEG-PCL的核磁共振氢谱见图2，可见PEG-PCL中PCL段亚甲基的质子峰(δ＝1.38、1.65、2.31和4.06ppm)以及PEG段亚甲基的质子峰(主要为δ＝3.64ppm)，比较弱的4.23ppm峰与PEG和PCL连接处的-OCH₂CH₂O-有关，表明合成的产物是PEG-PCL共聚物，其中PCL链段的平均分子量可由PCL链段中δ2.31ppm和PEG链段中δ3.64ppm处质子峰的积分计算，从而估计所合成PEG-PCL共聚物的平均分子量为5000。

3.去细胞主动脉瓣的制备及验证

3.1去细胞主动脉瓣的制备

(1)猪主动脉瓣的获取

在屠宰场于清洁条件下获取猪(江西程明食品有限公司养殖)心脏，用4℃生理盐水冲洗心脏以去除血污，暴露主动脉根部，以常规方法剪断附近的心肌、腱索等，并取出含瓣叶的主动脉根部，4℃生理盐水反复冲洗，置于含抗生素(头孢唑林钠1g/L，庆大霉素0.4g/L，二性霉素B 0.5g/L)的4℃生理盐水中并带回实验室。

在实验室超净台环境下裁剪主动脉瓣叶，再给予4℃磷酸盐缓冲液(pH7.4)反复冲洗，置于含抗生素(青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml))的4℃高糖DMEM培养基中培养12小时。

将处理得到的猪主动脉瓣进行去细胞处理。

(2)主动脉瓣去细胞处理

将上述获取的新鲜正常猪主动脉瓣随机分成两组，分别作为对照组和实验组，每组分别设有6片瓣膜(n＝6)。

其中对照组为新鲜正常主动脉瓣，将对照组的主动脉瓣置于无菌磷酸盐缓冲液中，于37℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡，每24小时更换磷酸盐缓冲液(pH 7.4)；实验组主动脉瓣置于1％(w/v)PEG-PCL去细胞液中，于37℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡24小时。

将实验组主动脉瓣置于高渗TRIS缓冲液(0.05mol/L)中，于37℃、75rpm恒温振荡器上持续清洗24小时。

再用含核酸酶(脱氧核糖核酸酶I 0.2mg/ml、核糖核酸酶A 20μg/ml)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)处理实验组主动脉瓣，于37℃、75rpm恒温振荡器上振荡2小时，以除去残余的DNA、RNA片段。

最后将实验组主动脉瓣置于无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中清洗3次，每次5分钟。

上述无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液中均含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

将制备好的去细胞瓣膜进行下一步相关实验，以证实去细胞效果。

3.2去细胞主动脉瓣支架的生物学及力学性能验证

(1)瓣膜苏木素-伊红(HE)染色、MASSON染色

将对照组和实验组瓣膜分别用4％多聚甲醛固定24小时后，用石蜡进行包埋，按照5μm的厚度进行切片，然后按照HE、MASSON染色试剂盒操作说明，进行HE、MASSON染色，最后在光学显微镜下观察和评价实验组与对照组瓣膜的细胞及细胞碎片残留、瓣膜结构、纤维走形等情况。

(2)瓣膜扫描电子显微镜观察

对照组和实验组瓣膜经3％戊二醛4℃固定24小时，采用系列浓度梯度 的乙醇(75％乙醇-85％乙醇-95％乙醇-100％乙醇)进行脱水，CO₂临界点干燥，离子溅射喷金后，于场发射扫描电镜下观察对照组和实验组瓣膜的形态和结构的完整性。

(3)瓣膜DNA含量的测定 

参考动物组织基因组DNA提取试剂盒的相应说明，称取对照组和实验组瓣膜组织，于1.5毫升EP管中碾碎后，置于56℃水浴振荡下裂解3小时。然后按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作说明，使用试剂盒中的试剂提取DNA。最后于生物核酸蛋白测定仪测定DNA的具体含量，并进行统计学分析。

(4)瓣膜含水量的测定

取各组瓣膜(每组6片)，用滤纸尽量吸干瓣膜表面的水分，准确称量后置冻干管中(记为m₀)，在冷冻干燥机-56℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，之后准确称量冻干后的各组瓣膜质量(记为m₁)。用以下公式计算各瓣膜组含水量：

各瓣膜组含水量(％)＝(m₀-m₁)/m₀×100％

(5)瓣膜胶原蛋白含量的测定

称取对照组和实验组瓣膜组织，用液氮迅速冷冻，于碎冰上融化后加入磷酸盐缓冲液，充分匀浆，再将其于4℃、2500r/min，离心20min，收集上清液，按照猪胶原蛋白ELISA试剂盒的相应操作，测定胶原蛋白含量。

(6)瓣膜弹性蛋白含量的测定

称取对照组和实验组瓣膜组织，用液氮迅速冷冻，于碎冰上融化后加入磷酸盐缓冲液，充分匀浆，再将其于4℃、2500r/min，离心20min，收集上清液，按照猪弹性蛋白ELISA试剂盒的相应操作，测定弹性蛋白含量。

(7)瓣膜细胞毒性实验

根据GB/T 16886.5-2003标准，对照组和实验组的主动脉瓣毒性由脐静脉内皮细胞的相对增值率来评价，并进行统计学分析。

用添加10％胎牛血清的RPMI 1640的细胞培养基在37℃、5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中培养人脐静脉内皮细胞。各组瓣膜浸提液的制备：将各组瓣膜(酒精消毒)按1cm×1cm大小放入含l0mL细胞培养液的试管中，在37℃无菌条件下孵育24小时，经孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌。

将对数生长期的人脐静脉内皮细胞制备成密度为5×10³/ml的细胞悬液，参照TransDetect^TM Cell Counting Kit说明书，在96孔细胞培养板上每孔种植100μl上述细胞，每个实验条件设置6个复孔，将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内预培养，待细胞贴壁良好后(12-24小时)，各实验组每孔分别加入对应的瓣膜浸提液10ul，对照组每孔加入10ul细胞培养液，置于上述培养环境中继续培养24小时后，小心向每孔加入11μl CCK溶液，再将培养板在培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光度值。计算细胞相对增值率(RGR)：RGR(％)＝实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值。

(8)瓣膜溶血实验 

根据GB/T 16886.4-2003标准评价瓣膜的血液相容性，分别测定对照组和实验组的主动脉瓣的血液相容性，并进行统计学分析。

先将各瓣膜组的瓣膜(1cm×1cm)放入含10ml磷酸盐缓冲液的离心管中并在37℃下平衡1小时，再将稀释的兔血(8ml血液用10ml磷酸盐缓冲液稀释)0.2ml加入试管中，继续在37℃下孵育1小时，分别以三蒸水作为阳性对照，磷酸盐缓冲液作为阴性对照，然后将离心管以1500rpm离心10min，取上清液，并在波长545nm处测定其吸光度值。溶血率(HR)通过下列公式计算：

HR＝(AS-AN)/(AP-AN)

式中AS、AN、AP分别代表各瓣膜组、阴性对照组、阳性对照组上清液的吸光度值。

(9)瓣膜力学性能测试

各瓣膜组的相关力学性能由电脑伺服式拉力试验机沿圆周和径向方向测得，如图6所示，各组瓣膜沿圆周方向(见图6A)剪成15×5mm的条形，沿径向方向(见图6B)剪成10×5mm的条形，游标卡尺测量瓣膜厚度后固定在拉力试验机夹钳之间。最后以10毫米/分钟的速度进行拉伸试验，直至瓣膜断裂。各瓣膜延圆周和径向的最大拉伸强度、断裂强度、断裂伸长率和弹性模量由电脑伺服式拉力试验机输出。本实验分别从圆周和径向2个方向对比去细胞组瓣膜与正常瓣膜是否有统计学差异，从而评价去细胞瓣膜的力学性能。

本实验瓣膜的分组采用随机分组方式，通过生物学性能测试和力学性能测试验证其去细胞效果。生物学性能检测包括苏木素-伊红(HE)染色、 MASSON染色，扫描电子显微镜观察瓣膜去细胞情况，测定瓣膜DNA含量、含水量、胶原蛋白含量、弹性蛋白含量，细胞毒性以及瓣膜溶血实验；力学性能测试包括最大拉伸强度、断裂强度、断裂伸长率和弹性模量的测定。实验结果以平均值±标准差表示，对照组与实验组的统计差异采用单因素方差分析，当P＜0.05提示实验结果具有统计学差异。

其表征结果如下：

(1)瓣膜苏木素-伊红(HE)染色、MASSON染色

对照组和实验组HE染色和MASSON染色结果见图3和图4。从对照组和实验组的染色情况可以看出，实验组瓣膜去细胞完全，未见内皮细胞和瓣膜间质细胞，瓣膜纤维呈疏松状、波浪状排列，保持相对完整，见图3B和图4B。

(2)瓣膜扫描电子显微镜观察

对照组与实验组主动脉瓣扫描电子显微镜见图5。各瓣膜组按照扫描电子显微镜标准制样，在场发射扫面电镜下观察各瓣膜组去细胞情况。瓣膜镜下结果显示实验组主动脉瓣去细胞后胶原纤维呈疏松多孔条索状，排列整齐，未见细胞结构，见图5B。

(3)瓣膜DNA含量的测定 

测定结果表明对照组主动脉瓣DNA含量为336.938±9.329ng/mg，经去细胞处理的实验组主动脉瓣DNA含量为4.998±0.115ng/mg，统计学分析具有显著的差异(P＜0.05)，证实本发明的去细胞方法能将主动脉瓣上的细胞基本去除完全，与染色效果一致。

(4)瓣膜含水量的测定

测定结果表明，对照组主动脉瓣的含水量为91.34±0.4％，实验组主动脉瓣的含水量为88.51±0.29％，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

(5)瓣膜胶原蛋白含量的测定

猪胶原蛋白ELISA试剂盒测定结果表明，对照组主动脉瓣的胶原蛋白含量为5.311±0.828％，实验组主动脉瓣的胶原蛋白含量为5.221±0.514％，统计学分析未见明显的差异(P＞0.05)。

(6)瓣膜弹性蛋白含量的测定

猪弹性蛋白ELISA试剂盒测定结果表明，对照组主动脉瓣的弹性蛋白含 量为0.326±0.044ng/mg，实验组主动脉瓣的弹性蛋白含量为0.169±0.049ng/mg，统计学分析具有差异(P＜0.05)。

(7)瓣膜细胞毒性实验

对照组主动脉瓣的相对增值率为97.42±3.41％，细胞毒性级别为1级，而实验组主动脉瓣的相对增值率为101.05±2.16％，细胞毒性级别为0级，各组相对增值率在统计学分析中未见明显的差异(P＞0.05)。由此证实，本发明所制备的去细胞主动脉瓣对细胞无毒性作用。

(8)瓣膜溶血实验 

对照组主动脉瓣的溶血率为0.5±0.001％，实验组主动脉瓣的溶血率为0.1±0.002％，统计学分析具有显著的差异(P＜0.05)，证实本发明的去细胞方法血液相容性良好。

(9)瓣膜力学性能测试

1)最大拉伸强度测定：

由电脑伺服式拉力试验机输出最大拉伸强度为：

圆周方向：实验组4.88±0.58MPa，对照组5.16±0.55MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

径向方向：实验组0.84±0.13MPa，对照组0.69±0.17MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

2)断裂强度测定。

由电脑伺服式拉力试验机输出断裂强度为：

圆周方向：实验组3.31±0.56MPa，对照组3.61±0.32MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

径向方向：实验组0.49±0.08MPa，对照组0.47±0.23MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

3)断裂伸长率测定

由电脑伺服式拉力试验机输出断裂伸长率为：

圆周方向：实验组67.60±13.58％，对照组52.13±11.69％，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

径向方向：实验组48.56±12.88％，对照组44.11±25.35％，统计学分析未 见明显差异(P＞0.05)。

4)弹性模量测定 

由电脑伺服式拉力试验机输出弹性模量为：

圆周方向：实验组16.17±3.23MPa，对照组20.46±3.27MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

径向方向：实验组3.70±1.17MPa，对照组3.46±1.67MPa，统计学分析未见明显差异(P＞0.05)。

从各组瓣膜HE染色、MASSON染色和扫描电子显微镜可得出，该去细胞方法可将瓣膜上的细胞去除完全，且保留瓣膜超微结构的完整性；去细胞瓣DNA含量与新鲜正常瓣膜相比大幅降低，说明该去细胞方法能将瓣膜的免疫原性大幅降低，可减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应；去细胞瓣胶原蛋白含量与新鲜正常瓣膜相比无差异，但弹性蛋白含量降低，目前常用的去细胞试剂也会造成弹性蛋白含量的降低；瓣膜细胞毒性实验和溶血实验，在一定程度上均提示该方法的生物相容性良好；各组瓣膜力学性能测试结果显示，本发明所制备的去细胞主动脉瓣力学性能良好，本发明的去细胞方法对主动脉瓣细胞外基质的力学性能基本无明显影响，保留新鲜正常主动脉瓣的相关力学性能。

实施例二

图7和图8是实施例二的附图，其中图7为实施例二所述瓣膜的HE染色图；图8为实施例二所述瓣膜的MASSON染色图。

实施例二与实施例一的不同之处在于：

1.溶液配制如下：

(1)高渗TRIS缓冲液(0.08mol/L)：准确称取TRIS(MW121.14)0.9691g加入一定量三蒸水，用盐酸调节pH＝8.0，用三蒸水定容至100ml，将配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(2)低渗TRIS缓冲液(0.02mol/L)：将配制的高渗TRIS缓冲液(0.08mol/L)用三蒸水稀释4倍即得低渗TRIS缓冲液(0.02mol/L)，将配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(3)2％PEG-PCL去细胞液：称取2g PEG-PCL，溶于100ml低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)中，充分溶解即得2％(w/v)PEG-PCL去细胞液。

2.去细胞主动脉瓣制备

裁剪好的主动脉瓣叶给予4℃磷酸盐缓冲液(pH 7.4)反复冲洗，置于含抗生素(青霉素(80U/ml)和链霉素(80μg/ml))的4℃高糖DMEM培养基中培养24小时。

主动脉瓣置于2％(w/v)PEG-PCL去细胞液中，于37℃、50rpm恒温振荡器上持续振荡36小时。

将主动脉瓣置于高渗TRIS缓冲液(0.08mol/L)中，于37℃、50rpm恒温振荡器上持续清洗36小时。

再用含核酸酶(脱氧核糖核酸酶I 0.3mg/ml、核糖核酸酶A 30μg/ml)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)处理主动脉瓣，于37℃、50rpm恒温振荡器上振荡4小时，以除去残余的DNA、RNA片段。

最后将主动脉瓣置于无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中清洗5次，每次3分钟。

其实验结果如下：

HE染色图(见图7)和MASSON染色图(见图8)表明，实施例二制备得到的主动瓣膜，其纤维呈波浪状，虽然有部分纤维出现断裂，但瓣膜结构相对完整，且细胞去除完全，而且具备良好的生物相容性和力学性能。

实施例三

图9和图10是实施例三的附图，其中图9为实施例三所述瓣膜的HE染色图；图10为实施例三所述瓣膜的MASSON染色图。

实施例三与实施例一的不同之处在于：

1.溶液配制如下：

(1)高渗TRIS缓冲液(0.03mol/L)：准确称取TRIS(MW121.14)0.3634g加入一定量三蒸水，用盐酸调节pH＝8.0，用三蒸水定容至100ml，将配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(2)低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)：配制的高渗TRIS缓冲液(0.03mol/L) 用三蒸水稀释3倍即得低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)，将配好的缓冲液经高压灭菌处理。

(3)0.5％PEG-PCL去细胞液：称取0.5g PEG-PCL，溶于100ml低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)中，充分溶解即得0.5％(w/v)PEG-PCL去细胞液。

2.去细胞主动脉瓣制备

裁剪好的主动脉瓣叶给予4℃磷酸盐缓冲液(pH 7.4)反复冲洗，置于含抗生素(青霉素(120U/ml)和链霉素(120μg/ml))的4℃高糖DMEM培养基中培养18小时。

将主动脉瓣置于0.5％(w/v)PEG-PCL去细胞液中，于37℃、100rpm恒温振荡器上持续振荡12小时。

将主动脉瓣置于高渗TRIS缓冲液(0.08mol/L)中，于37℃、100rpm恒温振荡器上持续清洗12小时。

再用含核酸酶(脱氧核糖核酸酶I 0.1mg/ml、核糖核酸酶A 10μg/ml)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)处理主动脉瓣，于37℃、100rpm恒温振荡器上振荡3小时，以除去残余的DNA、RNA片段。

最后将实验组主动脉瓣置于无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中清洗4次，每次4分钟。

其实验结果如下：

HE染色图(见图9)和MASSON染色图(见图10)表明，实施例三制备得到的主动瓣膜，虽留有稍许细胞轮廓，但瓣膜的结构完整，而且具备良好的生物相容性和力学性能。

对比例

图11和图12是对比例的附图，其中图11为对比例所述瓣膜的HE染色图；图12为对比例所述瓣膜的MASSON染色图。

对比例与实施例一的不同之处在于：

对比例所用到的聚乙二醇-聚己内酯的浓度为5％，其溶液配制如下：

5％PEG-PCL去细胞液：称取5gPEG-PCL，溶于100ml低渗TRIS缓冲液(0.01mol/L)中，充分溶解即得5％(w/v)PEG-PCL去细胞液。

主动脉瓣置于5％(w/v)PEG-PCL去细胞液中，于37℃、50rpm恒温振荡器上持续振荡8小时。

其实验结果如下：

HE染色图(见图11)和MASSON染色图(见图12)表明，由对比例制备得到的瓣膜细胞去除完全，未见有细胞残留，但是瓣膜的结构不完整，大部分纤维已经断裂且走形紊乱。

从实施例和对比例的相关数据可以看出，通过本发明制备得到的去细胞主动脉瓣支架，其细胞去除相对完全，细胞外基质的超微结构保留相对完全而且具备良好的生物相容性和力学性能，尤其是在聚乙二醇-聚己内酯的浓度为1％(w/v)的时候，制备得到的主动脉瓣支架去细胞完全，且瓣膜结构完整，各项性能良好，由本发明制备得到的去细胞主动脉瓣支架将在组织工程心脏瓣膜领域发挥重要的意义。

Claims (11)

1.一种去细胞主动脉瓣支架，其经聚乙二醇-聚己内酯处理动物的主动脉瓣得到。

2.根据权利要求1所述的主动脉瓣支架，其特征在于，其通过包含如下步骤的方法制备得到：

(1)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；

以及

(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。

3.权利要求1或2所述的主动脉瓣支架的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；

以及

(2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中聚乙二醇-聚己内酯的浓度为0.5～2％(w/v)，优选为1％。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的主动脉瓣在所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中，于常温～37℃、50～100rpm振荡处理12～36小时。

6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的缓冲液包含0.1mg/ml～0.3mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ和10μg/ml～30μg/ml核糖核酸酶A。

7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的主动脉瓣在所述的核酸酶缓冲液中，于常温～37℃、50～100rpm振荡处理2～4小时。

8.一种去细胞主动脉瓣支架，其特征在于，由权利要求3-7任一项所述的制备方法制备得到。

9.根据权利要求1或2或8所述的主动脉瓣支架，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚己内酯的分子量为4000～6000，其中聚乙二醇链段的分子量为2000～3000。

10.根据权利要求9所述的主动脉瓣支架，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚己内酯通过包括如下步骤的方法制备得到：

在氮气环境下，以聚乙二醇和ε-己内酯为原料，以辛酸亚锡为催化剂，90～100℃加热得到聚乙二醇-聚己内酯。

11.权利要求1或2或8所述的主动脉瓣支架在制备组织工程心脏瓣膜材料中的应用。