CN101224313B

CN101224313B - 采用槲皮素交联制备人工生物心脏瓣膜材料的方法

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Publication number: CN101224313B
Application number: CN2008100334986A
Authority: CN
Inventors: 常江; 翟万银
Original assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2028-02-04
Also published as: CN101224313A

Abstract

本发明公开了一种人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，包括交联剂、交联步骤和交联后保存处理。特征在于将采集后的猪心脏瓣膜经及时、妥善处理、清洗干净后，脱去细胞，并充分清洗后，用槲皮素对其交联，提高其力学强度，并进一步消除其抗原性，提高其稳定性。猪脱细胞心脏瓣膜材料采用该制备方法制得的人工生物心脏瓣膜，可以使瓣膜无毒、抗拉强度高、抗酶降解、交联剂和瓣膜本身蛋白质释放极微。猪脱细胞心脏瓣膜材料的这些交联特性，使其在植入体内后，利于人体自身瓣膜间质细胞和血管内皮细胞的移入、增殖、覆盖和长期抗钙化。

Description

采用槲皮素交联制备人工生物心脏瓣膜材料的方法

技术领域

本发明涉及一种人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，属生物医学工程学领域。

背景技术

在世界范围内，心脏瓣膜疾病发病率和致死率很高。美国每年要进行6万例人工心脏瓣膜置换手术，同时大约有2万人直接死于此病[Julie R，BorisAN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution to surgicalreconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.]。临床上人工心脏瓣膜主要采用机械瓣膜和异种生物瓣膜移植治疗。低温贮藏的人异体生物瓣膜也被用于临床，但由于来源不足应用极少。异种生物瓣膜凝血作用弱，患者手术后不需服用抗凝血药物。和机械瓣膜比起来，异种生物瓣膜具有理想的血液动力学，较低的血栓并发症等优点[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissueengineering：a 21st century solution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.]。在尺寸大小和解剖结构等方面，猪的心脏瓣膜与人的心脏瓣膜最为相似，所以猪心脏主动脉瓣膜是制备异种生物瓣膜的主要材料之一[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution tosurgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.]。目前为提高所植入异种生物瓣膜的稳定性和持久性，临床上所用的人工生物心脏瓣膜都用戊二醛交联处理而成。但是戊二醛本身具有细胞毒性，抑制瓣膜宿主内皮化的完成，影响人体正常组织的生长，致使瓣膜工作寿命很短；同时，戊二醛本身的细胞毒性和过分交联，还促使瓣膜钙化，削弱生物瓣膜的机械强度，使其变脆，易碎，大大影响生物瓣膜在体内的工作期限[Schmidt CE and Jennie M.Baier.Acellular vascular tissues：natural biomaterials for tissue repair and tissueengineering.Biomaterials，2000，21(22)，2215-223.]；另外，尽管戊二醛可以杀菌，但不能完全排除受体对异种生物瓣膜的免疫排斥反应。

QCT(3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮)是一种黄酮醇，是人类植物膳食成分中最为常见的类黄酮，在水果和蔬菜中分布最为广泛，纯天然，无毒。在洋葱(约347mg/Kg)、番茄(约203mg/mL)、苹果(约36mg/Kg)、茶叶(约20mg/Kg)和红酒(约11mg/Kg)等中有较高含量[Wach A，Pyrzynska K andBiesaga M.Quercetin content in some food and herbal samples.Food Chemistry，2007，100(2)，699-704.]。许多中草药如槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏等均含此成分[Wach A，Pyrzynska K and Biesaga M.Quercetincontent in some food and herbal samples.Food Chemistry，2007，100(2)，699-704.]。QCT在洋葱中含量较高(284-486mg/Kg)，而且提取分离方法也较简便。QCT在食物中多以苷的形式存在，如芸香苷和金丝桃苷等，经酸水解可得到QCT[Tang X and Cronin DA.The effects of brined onion extracts on lipidoxidation and sensory quality in refrigerated cooked turkey breast rolls duringstorage.Food Chemistry，2007，100(2)，712-718.]。

QCT广泛存在于各种食物中，成为重要的营养成分，具有抗氧化、清除自由基、抗癌和保护心血管等功效，且QCT安全无毒性[Hollman PCH and KatanMB.Dietary Flavonoids：Intake，Health Effects and bioavailability.Food andChemical Toxicology，1999，37(9-10)，937-942.]。许多物理化学致癌因素均能使机体组织产生自由基，自由基易富集于脂质的细胞膜周围，当达到一定浓度时，会引起脂质过氧化，并可直接作用于嘌呤和嘧啶使细胞DNA解链断裂，从而诱发癌变。QCT是有效的自由基清除剂和抗氧化剂，因而也具有抗癌作用。实验表明黄酮类化合物对超氧阴离子(O₂ ^-)、羟自由基(·OH)和单线态氧(¹O₂)均有良好的清除作用，并且对细胞膜脂类的过氧化过程具有阻断作用。研究表明QCT在体内和体外均具有抑制肿瘤生长的功效，坚持吃富含QCT的食物有益于预防和控制一些类型的癌症，因而QCT还是潜在的抗癌药物[Tan W，LinL，Li M，Zhang Y，Tong Y，Xiao D and Ding J.QCT，a dietary-derived flavonoid，possesses antiangiogenic potential.European Journal of Pharmacology，2003，459(2-3)，255-262.Garcia-Closas R，Gonzalez CA，Agudo A and Riboli E.Intake ofspecifc carotenoids and favonoids and the risk of gastric cancer in Spain.Cancercauses control，1999，10(1)，71-75.]。QCT具有降血压、保护心肌缺血再灌注损伤以及抗凝血等作用[Hollman PCH and Katan MB.Dietary Flavonoids：Intake，Health Effects and bioavailability.Food and Chemical Toxicology，1999，37(9-10)，937-942.]。QCT二硫酸酯二钠可强烈抑制凝血酶诱导的猪血小板肌动蛋白聚集，因而对血栓栓塞性疾病有广泛的应用价值。QCT在高胆固醇模型大鼠体内，抑制脂质过氧化，有降低血脂胆固醇、扩张冠状动脉的作用[Tan W，Lin L，Li M，Zhang Y，Tong Y，Xiao D and Ding J.QCT，a dietary-derivedflavonoid，possesses antiangiogenic potential.European Journal of Pharmacology，2003，459(2-3)，255-262；Frankel EN，German JB，Kinsella JE，Parks E andKanner J.Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolicsubstances in red wine.The Lancet，1993，341(8834)，454-457；Zhao X，Gu Z，Attele AS and Yuan C.Effects of QCT on the release of endothelin，prostacyclinand tissue plasminogen activator from human endothelial cells in culture.Journalof Ethnopharmacology，1999，67，279-285.]。Zhai等[Zhai W，Chang J，Lin K，Wang J，Zhao Q，Sun X.Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrixby procyanidins.Biomaterials，2006，27(7)：3684-3690.]2006年发现，同样存在于蔬菜、水果中与QCT仅在4位少1个O原子(羰基O)的天然产物原花青素，可以交联猪脱细胞心脏瓣膜，并具有较高的力学性能、较好的稳定性。为此本发明拟采用QCT作为天然交联剂，交联异种生物瓣膜，从而制备出力学性能高、稳定性好、无毒的理想的生物瓣膜材料。[Sung HW，Chang Y，Chiu CT，Chen CN and Liang HC.Mechanical properties of a porcine aortic valve fixedwith a naturally occurring crosslinking agent.Biomaterials，1999，20(19)，1759-1772.]

发明内容

本发明的目的，在于提供一种纯天然的、日常食物中存在的、无毒的并具有一定生理保护功效的、全新的交联制备方法，其特征在于采用猪主动脉脱细胞心脏瓣膜材料，经槲皮素交联制备人工生物心脏瓣膜制造所需的瓣膜材料。

本发明通过上述全新交联剂对猪主动脉脱细胞心脏瓣膜的交联实现。与常规戊二醛交联结果相比，本发明制备的瓣膜材料不仅能降低所交联瓣膜的毒性，而且可保持瓣膜的天然形态、柔软性，提高瓣膜的力学强度、稳定性，并有抑制瓣膜钙化的潜在能力。

本发明所述的一种人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于采用猪主动脉脱细胞心脏瓣膜材料，经槲皮素交联制备而成。其具体步骤为：

(1)新宰杀的猪主动脉心脏瓣膜作为交联对象，用1-6℃平衡盐缓冲液D-Hanks液作为储存运输液，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片，使用D-Hanks液清洗干净；

(2)用脱细胞溶液1-40℃下0-240rpm(转/分钟)转速摇动脱除瓣膜细胞12-96小时，清洗干净；使用DNA和RNA酶液37℃下120rpm转速摇动消化12-96小时，脱去细胞核，再次清洗干净；

(3)用超纯水配制的D-Hanks液，将脱细胞的心脏瓣膜材料在10-40℃下、120rpm转速摇动清洗瓣膜细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸等大分子12-96小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液充分清洗干净；

(4)完全脱细胞的心脏瓣膜材料浸入槲皮素溶液中交联；槲皮素用无水乙醇溶液或二甲亚砜溶液溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成浓度为0.1-10mg/mL槲皮素溶液；心脏瓣膜材料在槲皮素溶液中10-40℃下、60-240rpm摇动交联1-96小时。交联结束后，取出瓣膜材料，用D-Hanks液充分清洗干净；

(5)将交联后的脱细胞心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中作后处理，15-40天后即可得到本发明的瓣膜材料，并将所制得的瓣膜材料保存于D-Hanks液中备用。

所述的D-Hanks溶液，即无Ca²⁺、无Mg²⁺离子的磷酸缓冲液配方组成如表1所示。

所述的槲皮素(QCT)由中国医药集团上海化学试剂公司提供。

表1

成分	用量(g/L)
		KClKH₂PO₄NaClNaHCO₃Na₂HPO₄·7H2O	0.440.068.000.350.09

所述的脱细胞液有A、B两种，其组成配方及脱细胞方法是：

其中，脱细胞液A液为以下三种溶液配方中的任意一种：

配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA)。

配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基醚(4-(1，1，3，3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol，商品名TritonX-100)、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。

配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。

脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶(RNase)和0.2mg/ml的脱氧核酸酶(DNase)混合液。

用任一种A液37℃下持续摇动处理48小时，或4℃下处理72小时，初步脱去细胞。再用B液相同条件下进一步脱去细胞残余物。

所述的脱除瓣膜细胞的方法为下述三种中的任一种：(A)1-4℃下不摇动脱除24-96小时；(B)常温25±5℃下60-240rpm转速摇动脱除24-96小时；(C)或37±2℃下60-240rpm转速摇动脱除24-96小时摇动脱除；其中，方法A中脱除时间为48-120小时；方法B中摇动转速为120rpm，摇动脱除24-96小时；方法C中摇动转速为120rpm，摇动脱除24-72小时；

所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法是指用电阻率为18.2MΩ超纯水配制的D-Hanks液，充分清洗脱细胞心脏瓣膜材料的细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸等大分子；

所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法的环境条件是：37℃、120rpm转速摇动清洗24-120小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液清洗3次；

所述的交联剂槲皮素溶液的配制方法为：按1000mg槲皮素/10ml乙醇的比例，先用少量乙醇将槲皮素溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成所需的浓度为0.1-10mg/mL槲皮素溶液；

所述的交联的温度为25-42℃，交联摇动速度为60-240rpm；交联时间为24-72小时；

所述的交联后处理是将交联后的完全脱细胞的心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中30天；

本发明所制备的猪脱细胞心脏瓣膜材料的储存方法是：将所制备的瓣膜材料保存于1-6℃的D-Hanks液中。

对制备的人工生物心脏瓣膜材料进行了形态学观察、力学性能以及稳定性测试。

(1)形态学观察

将脱细胞的猪心脏瓣膜通过扫描电子显微镜(SEM)观察。将样品浸泡在浓度为2.5％的戊二醛的D-Hanks溶液中4个小时。此后用PBS溶液洗三次，然后依次浸泡在一系列浓度的乙醇溶液中(乙醇的体积份数分别为30％，50％，70％，90％，95％，100％)，每个浓度10分钟，使之脱水。接着将样品浸入体积分数为50％的六甲基二硅胺烷(HMS)-乙醇溶液中干燥10分钟，然后放入纯的六甲基二硅胺烷(HMDS)中干燥10分钟，最后放入干燥器中干燥过夜。在观察之前，将干燥的样品喷上金粉。另外，交联的脱细胞猪心脏瓣膜洗净放在干净的蓝色纸卷筒纸上，使用数码照相机拍照。

(2)力学性能：最大抗张强度的测定

测试未交联的、QCT和戊二醛交联的猪心脏瓣膜以及5mg/mL QCT交联的猪心脏瓣膜保存在D-Hanks溶液中不同时间的最大抗张强度。样品张力测试的准备工作：将要测试的瓣膜沿胶原纤维的方向剪成宽约4mm，长约25mm的长条。每组6个样品，经SHIMADZU材料力学测试仪在2mm/min的拉伸速率下测试张力[Zhai W，Chang J，Lin K，Wang J，Zhao Q，Sun X.Crosslinking ofdecellularized porcine heart valve matrix by procyanidins.Biomaterials，2006，27(7)：3684-3690；Sung HW，Chang Y，Chiu CT，Chen CN and Liang HC.Mechanical properties of a porcine aortic valve fixed with a naturally occurringcrosslinking agent.Biomaterials，1999，20(19)，1759-1772.]。最大抗张强度的数值可从图中直接读出。

(3)稳定性测试

1.体外酶降解

交联的脱细胞猪心脏瓣膜可以在体外抗酶的降解作用，降解能力越强，交联材料降解率越低。体外酶降解的测试采用[Zhai W，Chang J，Lin K，Wang J，Zhao Q，Sun X.Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrix byprocyanidins.Biomaterials，2006，27(7)：3684-3690.]报道的方法：在测定了样品的最初质量(W₀)之后，将样品浸在1.8mg/mL胶原酶II的D-Hanks溶液中(酶活力单位1000U/mL，pH7.4)在37℃、持续温和摇动(60rpm)的条件下持续降解1，2或24小时。在各时间点加入50微升10mmol/L EDTA终止降解，剩余样品干燥至恒重，再次测量质量(Wt)。降解率或质量损失百分率可以通过下式计算：

ΔW％＝(W₀-Wt)/W₀×100

式中W₀表示每个样品的初始质量，Wt表示相应的每个样品酶降解后的质量。

2.缓释液中交联材料释放QCT的浓度测定

将QCT交联瓣膜保存在D-Hanks溶液中不同的时间，选择不同的时间点取样，根据[Zhai W，Chang J，Lin K，Wang J，Zhao Q，Sun X.Crosslinking ofdecellularized porcine heart valve matrix by procyanidins.Biomaterials，2006，27(7)：3684-3690.]介绍的方法测定浸泡液中QCT的浓度，也即不同时间点交联后瓣膜释放QCT的浓度。QCT浓度的测试方法简要介绍如下：0.01mol/L的氯化铝溶液，加入乙酸钾调节pH 4.0(±0.02)，加入1mL QCT溶液，混合均匀，在430nm波长处使用分光光度计测量吸光度。另用纯QCT稀释成系列浓度，用相同方法测定吸光度，制作标准曲线，以此来确定待测溶液中QCT的浓度。

3.缓释液中交联材料释放的蛋白质浓度的测试

将未交联的以及6.25mg/mL戊二醛和5mg/mL QCT交联的脱细胞猪心脏瓣膜保存在D-Hanks溶液中不同的时间，选择不同的时间点取样，根据考马斯亮蓝微量法测定缓释液中蛋白质的浓度。具体方法简要如下：由0.15mol/L的氯化钠配制的标准蛋白质溶液，加入1mL考马斯亮蓝试剂，混合均匀，1小时内在595nm波长处使用分光光度计测量吸光度，制作标准曲线。再将不同时间点所取的不同材料的浸泡液样本，用同样方法测定吸光度，对照准曲线，以此确定溶液中蛋白质的浓度。将18天内所释放的蛋白质的量相加，统计作图。

附图说明

图1为猪心脏瓣膜完全脱细胞并清洗干净之后，由细胞外基质组成的多孔结构瓣膜材料的扫描电镜照片。

图2为脱细胞未经交联的猪心脏瓣膜、经6.25mg/mL戊二醛交联的、以及经1，2.5，5，10mg/mL QCT交联的猪心脏瓣膜的光学照片(图2中1为脱细胞未交联的猪心脏瓣膜。2-6分别为6.25mg/mL戊二醛，1mg/mL QCT，2.5mg/mL QCT，5mg/mL QCT，10mg/mL QCT交联的脱细胞猪心脏瓣膜)。

图3为本发明所用特殊天然交联剂槲皮素所交联的脱细胞瓣膜(浓度为1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml到10mg/ml)与传统交联剂戊二醛(6.25mg/ml)交联的脱细胞瓣膜和未交联的脱细胞瓣膜的最大抗拉强度比较。图中QCT1，QCT2.5，QCT5和QCT10分别为1，2.5，5and 10mg/ml QCT交联，“*”表示p＜0.05，组间有显著差异。

图4为本发明所用特殊天然交联剂槲皮素以5mg/ml浓度交联的脱细胞瓣膜浸泡于D-Hanks液中保存不同时间后的最大抗张强度变化。

图5为本发明所用特殊天然交联剂槲皮素以不同浓度(1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)交联的脱细胞瓣膜和传统交联剂戊二醛交联的脱细胞瓣膜(6.25mg/ml)、以及不交联的脱细胞瓣膜在不同时间(1、2和24小时)的抗胶原酶降解后的相对质量损失比较图(A：未交联的脱细胞瓣膜；B：6.25mg/mL戊二醛交联的脱细胞瓣膜；C-F分别为：1，2.5，5，10mg/mL QCT交联的脱细胞瓣膜)。

图6为本发明所用特殊天然交联剂槲皮素(5mg/mL)交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡33天时，交联剂槲皮素释放过程。图中右上角是槲皮素吸光度-浓度标准曲线(线性关系为y＝0.0383x+0.0105，R²＝0.9946)。在最初的5天D-Hanks溶液每天换一次，之后是每2-3天换一次。

图7为本发明所用特殊天然交联剂槲皮素(5mg/mL)交联的脱细胞瓣膜与6.25mg/mL戊二醛未交联猪心脏瓣膜保存于D-Hanks溶液中18天后可溶性蛋白质释放总量比较图。图中插入图是蛋白质吸光度-浓度标准曲线(线性关系为Y＝0.0129x+0.026，R²＝0.9826)。

图8为本发明所使用的交联剂槲皮素对人血管内皮细胞株ECV304的增殖潜力抑制实验结果。图中“*”表示p＜0.05，组间有显著差异。

图9为本发明所用槲皮素按每片瓣膜加10ml的比例加入0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml槲皮素的含乙醇的D-Hanks特制溶液，20℃下、以240rpm的摇动速度，交联96的脱细胞瓣膜(图中1-5分别表示0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml槲皮素交联的脱细胞瓣膜)。

具体实施方式

通过下面具体实施例介绍，以进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步，但本发明决非仅局限于实施例。

实施例1

用1-6℃的平衡的盐缓冲液D-Hanks液作为储存运输液，从屠宰场取来新鲜的猪主动脉心脏瓣膜，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片，使用D-Hanks液清洗干净。之后，按前述方法制备好脱细胞猪心脏主动脉瓣膜，脱洗干净，得到如图1结构和外形的脱细胞瓣膜材料。然后以每片瓣膜加2ml的比例加入5mg/ml槲皮素的含乙醇的D-Hanks特制溶液浸泡，37℃下120rpm摇动交联48小时。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下120rpm摇动清洗48小时，重复清洗3次。所得生物瓣瓣膜材料作上述性能评价。图2中2为6.25mg/ml戊二醛交联的脱细胞瓣膜，与未交联脱细胞瓣膜(图中1)一样松弛，无法维持瓣膜外形。而图中3、4、5和6为本发明所用交联剂槲皮素以1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml浓度交联的脱细胞瓣膜，交联后能维持瓣膜原来外形，柔润而不皱缩。图3显示5mg/ml槲皮素交联的脱细胞瓣膜最大抗拉强度为14.8MPa，优于戊二醛交联的脱细胞瓣膜(11.2MPa)，也优于不交联的脱细胞瓣膜(8.8MPa)。图4显示5mg/ml槲皮素交联后的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡33天时，其各时间点的最大抗张强度能与刚交联后的基本持平，没有减小。表明本发明所用交联剂槲皮素对脱细胞瓣膜交联的力学稳定性维持良好。图5显示本发明以1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml浓度的槲皮素交联的脱细胞瓣膜和戊二醛交联的脱细胞瓣膜，均有较强的抗酶解能力，其中5mg/ml槲皮素交联的脱细胞瓣膜酶解24小时后只降解了26.87％，与戊二醛交联的脱细胞瓣膜降解率(23.01％)接近。相对于不交联的脱细胞瓣膜，两种交联剂交联的脱细胞瓣膜的降解率都很低，表明脱细胞瓣膜的组成分子分别被槲皮素和戊二醛交联修饰，该结果也同时说明槲皮素具有良好的交联效果。图6显示槲皮素交联的脱细胞瓣膜在缓冲溶液中，交联剂槲皮素释放缓慢，释放量基本在16μg/ml以下，至第33天，已在3μg/ml以下，没有暴释。这也可能是交联后力学强度稳定性良好的原因。图7显示本发明所用5mg/mL天然交联剂槲皮素交联的脱细胞瓣膜与未交联猪心脏瓣膜于D-Hanks溶液中保存18天后，蛋白质释放量分别为23.6μg/片瓣膜和10.7μg/片瓣膜，表明5mg/mL天然交联剂槲皮素交联能有效地抑制蛋白质溶解释放。图8显示本发明所使用的交联剂槲皮素在浓度为10μg/ml以下时对人血管内皮细胞株ECV304的增殖潜力没有抑制，在浓度大于10μg/ml时细胞OD值小于对照组，表现有毒性；而戊二醛直到浓度为0.001μg/ml时才对瓣膜间质细胞的增殖潜力没有抑制，浓度为0.01μg/ml时已有明显抑制，在浓度大于0.01μg/ml时细胞OD值小于对照组，表现有毒性。该结果显示槲皮素对瓣膜间质细胞的增殖潜力抑制较戊二醛小10000倍(10/0.001)。对照图6，脱细胞瓣膜交联后的残余交联剂槲皮素在D-Hanks液中的每天释放量均在槲皮素对人血管内皮细胞株ECV304的毒性范围以下，无任何毒性。

实施例2

按发明内容中所述的方法制备脱细胞猪心脏主动脉瓣膜并清洗干净后，以每片瓣膜加2ml的比例加入2.5mg/ml槲皮素的含乙醇的D-Hanks特制溶液实施例1方法交联，所得交联后生物瓣膜材料同样能维持瓣膜原来外形、柔润而不皱缩。图3显示2.5mg/ml槲皮素交联的脱细胞瓣膜最大抗拉强度为13.9MPa。图5显示2.5mg/ml槲皮素交联的脱细胞瓣膜酶解24小时后，只有28.5％被降解。表明该浓度槲皮素同样对脱细胞瓣膜具有交联作用，并具有良好的力学性能和抗酶解稳定性。

实施例3

按实施例1方法从屠宰场取来新鲜的猪主动脉心脏瓣膜并清洗干净。用D-Hanks溶液清洗三次之后，用脱细胞溶液4℃下60rpm转速摇动脱除瓣膜细胞96小时。用D-Hanks液将脱细胞的心脏瓣膜材料在21℃(常温)下、120rpm转速摇动清洗瓣膜细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸等大分子96小时。以每片瓣膜加20ml的比例加入0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml槲皮素的含乙醇的D-Hanks特制溶液，20℃下、以240rpm的摇动速度，交联96小时。以每片瓣膜加20ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，常温下120rpm清洗10分钟。这样所制得的本发明的人工生物瓣膜材料，作前述性能评价，其最大抗拉强度分别为10.4MPa、12.5MPa、14.4MPa、14.9MPa和15.7MPa，酶降解率为29.2％、27.6％、25.5％、24.2％、23.8％，残余交联剂2在D-Hanks溶液中的释放浓度在对人血管内皮细胞株ECV304的毒性范围以下，无任何毒性，而且基本在10天内释放完毕。图9中瓣膜1至5分别代表0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml槲皮素交联的生物瓣膜材料，显示交联完成后不皱缩，能保持原有外形，稳定性良好，可在4℃下D-Hanks溶液长期保存。

Claims

1.一种人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于采用猪主动脉脱细胞心脏瓣膜材料，经脱细胞和槲皮素交联制备而成，其具体步骤为：

(2)在1-40℃下用脱细胞溶液不摇动，或以60-240转/分钟的转速摇动，脱除瓣膜细胞12-96小时，清洗干净；使用DNA和RNA酶液37℃下120rpm转速摇动消化12-96小时，脱去细胞核，再次清洗干净；所述的脱细胞溶液有A、B两种，先用A液初步脱除瓣细胞，再用B液在相同条件下进一步脱除瓣细胞残余物；

(3)用超纯水配制的D-Hanks液，将脱细胞的心脏瓣膜材料在10-40℃下、120转/分钟的转速摇动清洗瓣膜细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸大分子12-96小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液充分清洗干净；

(4)将步骤3所得到的脱细胞的心脏瓣膜材料浸入槲皮素溶液中交联；槲皮素用无水乙醇溶液或二甲亚砜溶液溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成浓度为0.1-10mg/mL槲皮素溶液；心脏瓣膜材料在槲皮素溶液中10-40℃下、60-240rpm摇动交联1-96小时，交联结束后，取出瓣膜材料，用D-Hanks液充分清洗干净；

(5)将交联后的脱细胞心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中作后处理，15-40天后即可得到本发明的瓣膜材料，并将所制得的瓣膜材料保存于D-Hanks液中备用；

所述的D-Hanks液是无Ca、Mg离子的磷酸缓冲液，其配方是将0.4g KCl，0.06g KH₂PO₄，8.00g NaCl，0.35g NaHCO₃和0.09g Na₂HPO₄·7H₂O溶解于1L超纯水中而制成；

所述的脱细胞溶液有A液为以下三种溶液配方中的任意一种：

配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠；

配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基醚、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA；

配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA；

脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脱氧核酸酶混合液，

用任一种A液37℃下持续摇动处理48小时，或4℃下处理72小时，初步脱去细胞，再用B液相同条件下进一步脱去细胞残余物。

2.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的脱除瓣膜细胞的方法为下述三种中的任一种：(A)1-4℃下不摇动脱除24-96小时；(B)常温25±5℃下60-240转/分钟的转速摇动脱除24-96小时；或(C)37±2℃下60-240转/分钟的转速摇动脱除24-96小时摇动脱除。

3.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法A中脱除时间为48-96小时。

4.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法B中摇动转速为120转/分钟，摇动脱除24-96小时。

5.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法C中摇动转速为120转/分钟，摇动脱除24-72小时。

6.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法是指用电阻率为18.2M Ω超纯水配制的D-Hanks液，充分清洗脱细胞心脏瓣膜材料的细胞残渣、碎片及游离的蛋白质或核酸大分子。

7.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法的环境条件是：37℃、120rpm转速摇动清洗24-120小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液清洗3次。

8.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的交联剂槲皮素溶液的配制方法为：按1000mg槲皮素/10ml乙醇的比例，先用少量乙醇将槲皮素溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成所需的浓度为0.1-10mg/mL槲皮素溶液。

9.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的交联的温度为25-42℃，交联摇动速度为60-240rpm；交联时间为24-72小时。

10.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的交联后处理是将交联后的完全脱细胞的心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中30天；所制备的瓣膜材料保存于1-6℃的D-Hanks液中。