CN115006595B - 一种复合型高性能脱细胞角膜与其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合型高性能脱细胞角膜与其制备方法及用途。本发明主要解决角膜材料组织诱导再生活性低、抗降解性差、制备成本高的问题，另外本发明的复合型高性能脱细胞角膜可引导受体角膜基质细胞和神经纤维再生，抑制血管长入，无明显免疫反应；可耐受100mmHg以上的眼内压，无房水渗漏，能够维持中心视区透明和长期稳定性；术后矫正视力不低于0.6(无除角膜病之外其他疾病者)。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域。涉及一种复合型高性能脱细胞角膜与其制备方法及用途。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
申请号CN202011372933.5中，将轻度脱细胞角膜片放入交联溶液中进行交联保护，再次脱细胞得到再生活性角膜材料，主要解决脱细胞角膜基质作为植入体构建角膜前板层后会出现的角膜透明度降低和植片溶解等问题。但仍未解决角膜伤口愈合慢的问题，且仍存在一定的免疫原性。申请号CN202011371559.7在CN202011372933.5的基础上增加了糖胺聚糖改性步骤，可以缩短角膜伤口愈合时间，并进一步提高角膜植片抗降解能力，并且保持了较高的透明度。但生物活性仍有进步的空间。另外，上述技术方案试剂用量较大可能会造成浪费，没有考虑成本问题，不易产业化推广。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种复合型高性能脱细胞角膜与其制备方法及用途。本发明主要解决材料组织诱导再生活性低、抗降解性差、制备成本高的问题，另外本发明的复合型高性能脱细胞角膜可引导受体角膜基质细胞和神经纤维再生，抑制血管长入，无明显免疫反应；可耐受100mmHg以上的眼内压，无房水渗漏，能够维持中心视区透明和长期稳定性；术后矫正视力不低于0.6(无除角膜病之外其他疾病者)。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种复合型高性能脱细胞角膜的制备方法，包括如下步骤：
将新鲜动物或人眼球的角膜片依次进行原料筛选、低渗溶胀、预脱细胞、洗除脱细胞剂、仿生复合、后续多次彻底脱细胞、去抗原、去内毒素、洗除净残留试剂、保存液封存、灭菌处理，得到复合型高性能脱细胞角膜。
进一步的，所述低渗溶胀为将角膜片置于2-20倍膜重的低渗液中溶胀10-60min。通过溶胀，使角膜表面的微孔尺寸变大，提高了试剂处理效率。
进一步的，所述初步轻度脱细胞为将角膜片依次置于2-20倍重的脱细胞剂溶液内，室温下15-90r/min摇床摇动0-2h，测pH值，换用5-20倍PBS洗三次，每次15分钟。
进一步的，所述脱细胞剂溶液为0.1％-2％w/v的十二烷基硫酸钠、TritonX-100，EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种。
进一步的，所述仿生复合为添加天然蛋白和糖胺聚糖在交联剂的条件下进行交联。
进一步的，所述天然蛋白包括胶原、丝素、明胶、角蛋白、球蛋白中的一种或多种。
进一步的，所述糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素或硫酸角质素中的一种或多种，
进一步的，所述交联剂包括甲醛、戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或多种。
进一步的，所述仿生复合的具体方法为：将角膜片加入2-20倍重的含天然蛋白的溶液，摇荡反应后测pH值；加入1倍重水溶解的糖胺聚糖，摇荡反应测pH值；分2次各加pH值为5-6的MES溶液0.5mL，间隔15分钟，测pH值；加入2-20倍重交联剂溶液(pH值为5-6)反应0-2h，测pH值；用5-10倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值。
其中，每次测pH值，当pH为5-7时，为合格。
进一步的，所述后续多次彻底脱细胞具体为：将角膜片转入2-20倍的含0.2-2％的脱细胞剂溶液内，室温下15-90r/min摇床摇动5-20h，换液1-3次，再摇动5-20h。
进一步的，所述去抗原溶液为0.05-2％过氧乙酸。
进一步的，所述去内毒素溶液为氢氧化钠-乙醇溶液，其中，氢氧化钠质量浓度为0.05-1％，乙醇质量浓度为0.2-0.8％。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的制备方法制备的复合型高性能脱细胞角膜，角膜片厚度为100-600μm，直径为3-12mm。
本发明制备的复合型高性能脱细胞角膜具有透明度高、力学性能好、良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合等优点，可引导受体角膜基质细胞和神经纤维再生，抑制血管长入，无明显免疫反应；可耐受100mmHg以上的眼内压，无房水渗漏，能够维持中心视区透明和长期稳定性；术后矫正视力不低于0.6(无除角膜病之外其他疾病者)。
本发明的第三个方面，提供了上述的复合型高性能脱细胞角膜在治疗用药无效的已穿孔的真菌或细菌感染性、外伤性角膜炎患者，单孢病毒性角膜患者和角膜移植高危排斥患者；角膜缘干细胞失代偿患者；未累及全层的真菌性角膜溃疡患者等，且经系统用药治疗两周以上无效或临床医生认为有手术指征。接种内皮细胞行穿透性角膜移植术，或联合合成材料用于单孢病毒性角膜患者(其独特设计和技术排除了角膜内皮功能的需求，还能够达到植入人体后快速复明的效果)和角膜移植高危排斥患者(合成材料不受角膜缘干细胞失代偿的影响)；接种角膜缘干细胞移植避免角膜结膜化、新生血管长入、反复性角膜上皮糜烂等角膜缘功能失代偿的发生；用于真菌或细菌感染性角膜溃疡的早、中期前板层移植中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明在脱细胞角膜材料上补充天然蛋白和糖胺聚糖交联，糖胺聚糖交联可既减少后续多次彻底脱细胞过程中脱细胞剂对角膜胶原纤维的破坏，且提高材料的抗降解性能，同时赋予其促进伤口愈合功能，提高了其组织诱导活性；天然蛋白的加入进一步提高交联程度，提高糖胺聚糖的结合量，从而进一步增强促伤口愈合的能力；交联程度的提高会增强材料的抗降解能力和力学性能；天然蛋白本身是生物活性物质，有良好的生物相容性。
(2)本发明的多次脱细胞技术与仿生复合改性关键技术，制备出的复合型高性能脱细胞角膜具有良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合，同时保持了较高的透明度和力学强度，是角膜材料制备技术的重大突破。通过去抗原处理降低免疫原性，通过去内毒素降低细胞毒性，提高生物相容性。
(3)本发明的复合型高性能脱细胞角膜可引导受体角膜基质细胞和神经纤维再生，抑制血管长入，无明显免疫反应；可耐受100mmHg以上的眼内压，无房水渗漏，能够维持中心视区透明和长期稳定性；术后矫正视力不低于0.6(无除角膜病之外其他疾病者)。
(4)本发明还提供了所述复合型高性能脱细胞角膜在作为角膜基质替代物中的应用，主要用于用药无效的已穿孔的真菌或细菌感染性、外伤性角膜炎患者，单孢病毒性角膜患者和角膜移植高危排斥患者；角膜缘干细胞失代偿患者；未累及全层的真菌性角膜溃疡患者等，且经系统用药治疗两周以上无效或临床医生认为有手术指征。接种内皮细胞行穿透性角膜移植术，或联合合成材料用于单孢病毒性角膜患者(其独特设计和技术排除了角膜内皮功能的需求，还能够达到植入人体后快速复明的效果)和角膜移植高危排斥患者(合成材料不受角膜缘干细胞失代偿的影响)；接种角膜缘干细胞移植避免角膜结膜化、新生血管长入、反复性角膜上皮糜烂等角膜缘功能失代偿的发生；用于真菌或细菌感染性角膜溃疡的早、中期前板层移植。
(5)本发明工艺较简单灵活，产品重现性好，成本低，易实现产业化推广和应用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
一种复合型高性能脱细胞角膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)选料：购买外观形态相近的新鲜猪眼球放于甘油中保存带回备用。
(2)取样：用剪刀沿角膜缘后2cm剪下角膜，在称量纸和垫片上用环钻从中央钻取，注意用力方向垂直均匀，取下的角膜称重、置于新甘油中保存1-4h再称重、备用。
(3)分组：取出角膜片放在称量纸上在恒温恒湿条件下静置10分钟，测定其重量和透明度，挑选最接近的分5组，以每组重量作为以后用料基准。(此步骤以角膜重量作为以下各种试剂的用料基准，可大幅度降低成本)。
(4)低渗溶胀：将各组角膜片置于2倍膜重的低渗液中溶胀10-60min。(此步骤通过溶胀，使角膜表面的微孔尺寸变大，提高了试剂处理效率)。
(5)预脱细胞：将各组角膜片依次置于2倍重的含1％的脱氧胆酸钠-0.08％原钒酸钠混合溶液内，室温下60r/min摇床摇动1h，测pH值，换用5倍PBS洗三次，每次15分钟。
(6)仿生复合：将各组角膜片加入2倍重的含1％明胶的溶液，摇荡反应15分钟测pH值；加入1倍水溶解的1-5％肝素，摇荡反应15分钟测pH值；分2次各加pH值为5的MES溶液0.5mL，间隔15分钟，测pH值。(天然蛋白的加入可提高交联程度，提高糖胺聚糖的结合量，从而增强促伤口愈合的能力；交联程度的提高会增强材料的抗降解能力和力学性能；天然蛋白本身是生物活性物质，有良好的生物相容性)。
(7)交联保护：加入2倍含0.5％EDC和0.3％NHS的MES溶液(pH值为5.6)反应0.5h，测pH值；用5倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值。
(8)脱细胞：将角膜片转入2倍的含0.2％的脱细胞剂溶液内，室温下60r/min摇床摇动5h，记录温度。换液1次，再摇动5h。
(9)去抗原：将角膜片转入膜重2倍的0.1％过氧乙酸溶液中，以60r/min摇动0.5h，测pH值；换液1次，再摇动0.5h，测pH值。用5倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值。
(10)去内毒素：将角膜片转入膜重2倍的0.05％NaOH/0.4％乙醇溶液中浸泡0.2h，测pH值。
(11)清洗：将角膜转入2倍的PBS中，室温下60r/min摇床摇动15-60min。换液重复5次。
(12)保存：转入装有甘油的离心管中，用封口膜密封，做好标记。
(13)10kGy的钴-60辐照或电子束灭菌。
实施例2
一种复合型高性能脱细胞角膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)选料：购买外观形态相近的新鲜猪眼球放于甘油中保存带回备用。
(2)取样：用剪刀沿角膜缘后2cm剪下角膜，在称量纸和垫片上用环钻从中央钻取，注意用力方向垂直均匀，取下的角膜称重、置于新甘油中保存1-4h再称重、备用。
(3)分组：取出角膜片放在称量纸上在恒温恒湿条件下静置60分钟，测定其重量和透明度，挑选最接近的分6组，以每组重量作为以后用料基准。(此步骤以角膜重量作为以下各种试剂的用料基准，可大幅度降低成本)。
(4)低渗溶胀：将各组角膜片置于20倍膜重的低渗液中溶胀60min。(此步骤通过溶胀，使角膜表面的微孔尺寸变大，提高了试剂处理效率)。
(5)预脱细胞：将各组角膜片依次置于20倍重的脱细胞剂溶液内，室温下90r/min摇床摇动2h，测pH值，换用20倍PBS洗三次，每次15分钟。
(6)仿生复合：将各组角膜片加入20倍重的含5％丝素的溶液，摇荡反应60分钟测pH值；加入1倍水溶解的5％透明质酸，摇荡反应60分钟测pH值；分2次各加pH值为5.6的MES溶液0.5mL，间隔15分钟，测pH值。
(7)交联保护：加入20倍戊二醛溶液反应2h，测pH值；用10倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值。
(8)脱细胞：将角膜片转入20倍的含2％的脱细胞剂溶液内，室温下90r/min摇床摇动20h，记录温度。换液3次，再摇动20h。
(9)去抗原：将角膜片转入膜重10倍的2％过氧乙酸中，以210r/min摇动2h，测pH值；换液1次，再摇动2h，测pH值。用10倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值。
(10)去内毒素：将角膜片转入膜重10倍的0.05％NaOH/0.4％乙醇溶液中浸泡1h，测pH值。
(11)清洗：将角膜转入10倍的PBS中，室温下90r/min摇床摇动60min。换液重复20次。
(12)保存：转入装有甘油的离心管中，用封口膜密封，做好标记。
(13)60kGy的钴-60辐照或电子束灭菌。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (8)
1.一种复合型高性能脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将新鲜动物或人眼球的角膜片依次进行原料筛选、低渗溶胀、预脱细胞、洗除脱细胞剂、仿生复合、后续多次彻底脱细胞、去抗原、去内毒素、洗除净残留试剂、保存液封存、灭菌处理，得到复合型高性能脱细胞角膜；所述仿生复合为添加天然蛋白和糖胺聚糖进行交联；
所述仿生复合的具体方法为：将角膜片加入2-20倍重的含天然蛋白的溶液，摇荡反应后测pH值；加入1倍水溶解的糖胺聚糖，摇荡反应测pH值；分2次各加pH值为5-6的MES溶液0.5mL，间隔15分钟，测pH值；加入2-20倍重pH值为5-6的交联剂溶液反应0-2h，所述交联剂溶液反应时间大于0，测pH值；用5-10倍PBS漂洗3次，每次15分钟，测pH值；其中，每次测pH值，当pH为5-7时，为合格；
其中，所述天然蛋白包括胶原、丝素、明胶、角蛋白、球蛋白中的一种或多种；
所述糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素或硫酸角质素中的一种或多种；所述交联剂包括甲醛、戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或多种；
所述低渗溶胀为将角膜片置于2-20倍膜重的低渗液中溶胀10-60min。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述预脱细胞为将角膜片依次置于2-20倍重的脱细胞剂溶液内，室温下15-90r/min摇床摇动0-2h，所述摇床摇动时间大于0，测pH值，换用5-20倍PBS洗三次，每次15分钟。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述脱细胞剂溶液为0.1%-2%w/v的十二烷基硫酸钠、TritonX-100、EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述后续多次彻底脱细胞具体为：将角膜片转入2-20倍的含0.2-2%的脱细胞剂溶液内，室温下15-90r/min摇床摇动5-20h，换液1-3次，再摇动5-20h。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述去抗原溶液为0.05-2%过氧乙酸；
所述去内毒素溶液为氢氧化钠-乙醇溶液，其中，氢氧化钠质量浓度为0.05-1%，乙醇质量浓度为0.2-0.8%。
6.一种权利要求1-5任一所述的制备方法制备的复合型高性能脱细胞角膜，其特征在于，所述复合型高性能脱细胞角膜厚度为100-600μm，直径为3-12mm。
7.一种权利要求6所述的复合型高性能脱细胞角膜在制备角膜基质替代物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于用药无效的已穿孔的真菌或细菌感染性、外伤性角膜炎患者，单孢病毒性角膜患者和角膜移植高危排斥患者；角膜缘干细胞失代偿患者；未累及全层的真菌性角膜溃疡患者，且经系统用药治疗两周以上无效或临床医生认为有手术指征；接种内皮细胞行穿透性角膜移植术，或联合合成材料用于单孢病毒性角膜患者和角膜移植高危排斥患者；接种角膜缘干细胞移植避免角膜结膜化、新生血管长入、反复性角膜上皮糜烂角膜缘功能失代偿的发生；用于真菌或细菌感染性角膜溃疡的早、中期前板层移植。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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