KR20050044498A - 여성 생식 기관의 조직공학적 작제 - Google Patents

여성 생식 기관의 조직공학적 작제 Download PDF

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앤소니 엠. 디. 아탈라
제임스 제이. 유
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본 발명은 인공 여성 생식기관을 재건하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 작제물 및 방법은 조직공학 처리된 인공 여성 생식 기관, 예를 들어 자궁, 질, 경관 및 나팔관을 사용하여 여성 생식로의 선천적 기형 및 장애를 개선하는데 사용될 수 있다. 이들 조직공학 처리된 인공 여성 생식기관은 여성 생식 조직, 예를 들어 자궁 상피 세포, 질 상피, 경관 상피 세포 및 나팔관 상피 세포 뿐만 아니라 평활근 세포로부터 유도된 배양된 세포 집단을 관류함으로써 생성시킬 수 있다.

Description

여성 생식 기관의 조직공학적 작제 {CREATION OF TISSUE ENGINEERED FEMALE REPRODUCTIVE ORGANS}
본 발명의 기술 분야는 조직공학, 특히 여성 생식기관의 조직공학적 작제에 관한 것이다. 본 발명은 질, 나팔관, 자궁 및 경관의 조직공학적 작제에 특히 유용하다.
외부 생식기에 악영향을 미쳐 수술요법이 요구되는 여러가지 병적 장애가 존재한다[참조: Hendren, H. W. (1998). Cloacal malformations.In"Campbell's Urology"7th ed., Saunders, Philadelphia, 1991-2001].
남성 생식기 재건술은 조직공학적 적용으로 인한 가장 최근에 보고된 장기간의 임상적 성공 및 요도 재건술의 실체화된 적합성을 초래한다[참조: Atala et al. J Urol. 162 :1148-1151 (1999) ;Chen et al. World J Urol. 18(1) 67-70 (2000)]. 배설강 기형 및 외반증과 같은 장애들도 남성 및 여성 둘 다에 대한 심한 생식기 모호성을 초래할 수 있음에 틀림이 없다. 그러나, 여성 생식기 재건술 및 질 재건술에 관한 정보는 부족한 실정이다.
질, 경관 및 자궁의 선천적 기형은 부인과 환자와 밀접한 관련이 있다. 이들 이상은 사춘기에 흔히 발견된다. 적절한 처치용으로, 의사는 정상적인 발생학 및 성 분화의 완전한 이해를 요구한다. 임상적 경험으로 부인과의사가 이상 해부학적 형상을 이해하는데 도움이 되며, 결함이 있는 각 개인은 완전히 평가되어야 하는데, 그 이유는 생식로 이상이 언제나 어떠한 한정되고 일정한 양상을 따른다고는 할 수 없기 때문이다. 여성 생식기 이상의 예로는 모호한 생식기, 질 및 자궁폐쇄증, 유출로 폐쇄 장애, 경관 폐쇄증, 비뇨생식굴 장애 및 남성화 장애[참조: Edmonds, D. K., ObstetGytzecol Clin North Am 27(1) : 49-62 (2000)]가 포함된다. 생식기 기형은 환자 및 환자 가족을 특히 혼란스럽게 할 수 있는데, 그 이유는 당해 기형이 생식관련성 뿐만 아니라 섬세하고 고무적인 방법으로 검토되고 취급되어야 하는 상당한 심리적 성적 뉘앙스를 갖고 있기 때문이다. 더 심오한 논의는 문헌에 기재되어 있다[참조: Rock JA"Surgery for anomalies of the mullerian ducts. "In : Te Linde'sOperativeGynecology (8th ed). Edited by J Rock, J. Thompson. Philadelphia, Lippincott-Raven, 1997; Edmonds DK : "Sexual development anomalies and their construction: upper and lowertracts."In : Pediatric and Adolescent Gynecology. Edited by J Sanfilippo, D Muram, P Lee, J Dewhurst. Philadelphia, W. B. Saunders, 1994; Jones HW Jr:"Construction of congenital uterovaginal anomalies."In : Female Reproductive Surgery. Edited by J Rock, A Murphy, HW Jones Jr. Baltimore, Williams & Wilkins, 1992].
선천적 및 후천적 자궁 기형, 예를 들어 저형성 또는 무형성 자궁 이상, 종양, 외상 및 중증 염증성 질환은 여성 불임의 주된 원인이 된다. 자궁 재건술용으로 사용할 수 있는 선택사항은 제한된다. 자궁외 조직이 재건술용으로 사용될 경우 임신이 불가능하다. 자궁 조직 대체술이 합성 생물질을 사용하여 실험적으로 시도되어 왔지만, 이들 시도는 아마 자궁의 복잡한 물리적 기능적 특성으로 인해 성공적이지 못해왔다[참조: Jonkman et al. Artif Organs, 10:475-80, 1986].
선천적 여성 생식기 이상 및 배설강 기형, 예를 들어 각(icornuate)/중격 자궁, 중복 자궁, 경관 및 질폐쇄증, 폐쇄 생식로는 또한 광범위한 수술 제작을 필요로 할 수 있다. 수술 시도는 흔히 제한된 양의 사용될 수 있는 본래 조직으로 인한 문제에 직면한다. 현재, 비생식로 조직이 다수의 관련 합병증에도 불구하고, 질작제에 사용된다. 이들은 예를 들면, 메이어-로키탄스티-쿠스터-하우저(Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser) 증상으로 고생하는 환자에서 에스자 질의 작제를 위한 후복막강 세크로펙시의 복식 방법과 같은 처리를 포함한다. 그러나 이러한 작제는 탈출하기 쉽고, 그 결과 질에서의 "폴링 아웃(falling-out)" 현상, 통증, 질분비물 및 성교통증을 유발하고, 복구를 필요로 하게 된다. 예를 들면, 질 및 경관의 무발생이지만, 기능성 자궁내막을 갖는 다른 환자들은 전형적으로 자궁적제술의 전통적인 치료에 이어 후속적으로 새로운 질을 작제한다. 이는 잘 치유되지 않을 수 있는 질 피부이식을 필요로 할 수 있고, 또한 월경장애를 유발할 수 있다.
현재, 여성 생식기관 재건술에 사용되는 여러가지 절차는 비동종 조직 공급원을 사용한다. 그러나, 여성 기관 재건술용 비동종 조직 공급원은 제한된 작용성과 관련된다. 따라서, 여성 생식 및 생식기 조직의 공학과 관련된 분야에서 이들 문제를 검토할 필요가 있다.
따라서, 생식로 기관 및 조직을 형성시키는데 자가 세포를 사용하여 여성 생식기관을 생성시킬 필요가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 조직공학 처리된 인공 여성 생식기관을 사용하여 여성 생식로의 선천적 기형 및 장애를 개선하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이들 조직공학 처리된 인공 여성 생식기관은 생식로 조직 세포, 예를 들어 질 상피, 나팔관 상피 세포, 경관 상피 세포, 자궁 상피 세포 및 평활근 세포로부터 유도된 세포 집단을 배양하여 생성시킬 수 있다. 배양된 세포는 생체적합성 기질 위에 또는 속으로 관류된다. 본 발명의 방법을 사용하여 이로써 제한되지는 않지만 경관, 자궁, 질 및 나팔관을 포함하는 여성 생식기관을 재건할 수 있다.
생체적합성 기질은 여성 생식 세포의 군집, 예를 들어 자궁 상피 세포, 질 상피 세포, 나팔관 상피 세포 및 평활근 세포, 예를 들어 자궁근육층 세포로 관류될 수 있으며, 이들 세포는 각각의 생식로 조직층으로 된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 배양된 여성 생식 세포의 제1 군집을 생체적합성 기질의 한면으로 관류시켜 배양된 여성 생식 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 배양된 여성 생식 세포가 제1 여성 생식 조직층을 생성시킬 때까지 배양된 여성 생식 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고; 배양된 여성 생식 세포의 제1 군집과 상이한 배양된 여성 생식 세포의 제2 군집을 생체적합성 기질의 다른 한면으로 관류시켜 배양된 여성 생식 세포의 제2 군집이 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 배양된 여성 생식 세포가 제1 여성 생식 조직층과 상이한 제2 여성 생식 조직층을 생성시킬 때까지 배양된 여성 생식 세포의 제2군집을 생체적합성 기질에 배양시키고, 이로써 여성 생식기관 작제물을 작제함으로써 인공 여성 생식기관 작제물을 재건하는 방법에 관한 것이다.
인공 여성 생식기관 작제물은 또한 생체적합성 기질의 동일면에 생식로 세포의 제1 및 제2 군집을 배양시킴으로써 작제될 수 있다. 한 실시양태에서, 여성 생식기관 작제물 여성 생식 세포, 예를 들어 질 상피 세포의 한 군집을 사용하여 작제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 여성 생식기관 작제물은 여성 생식 세포, 예를 들어 질 상피 세포 및 평활근 세포의 2개 이상의 상이한 군집을 사용하여 작제될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 여성 생식기관 작제물은 여성 생식 세포의 임의의 수의 상이한 군집, 예를 들어 3개 이상의 군집을 사용하여 작제될 수 있다. 본 발명의 범주내에는 또한 여성 생식 세포의 하나 이상의 군집 및 여성 생식 세포로로부터 유도되지 않은 세포, 예를 들어 방광으로부터 유도된 평활근 세포의 다른 군집으로부터 작제된 여성 생식기관 작제물이 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 배양된 자궁 상피 세포를 생체적합성 기질의 한면으로 관류시켜 자궁 상피 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 자궁 상피 세포가 자궁 상피 조직층, 예를 들어 자궁내막을 생성시킬 때까지 자궁 상피 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고; 배양된 평활근 세포, 예를 들어 자궁근육층 세포의 군집을 생체적합성 기질의 다른 한면으로 관류시켜 자궁근육층 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 자궁근육층 세포가 자궁근육층 조직층을 생성시킬 때까지 자궁근육층 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고, 이로써 인공 자궁 작제물을 작제함으로써 인공 자궁 작제물을 재건하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 생체적합성 기질의 양면에 세포를 시딩함으로써 작제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 세포층을 적층함으로써 작제될 수 있는데, 예를 들어 자궁 상피 세포를 생체적합성 기질의 양면으로 시딩한 다음, 평활근 세포, 예를 들어, 자궁근육 층 세포를 시딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 자궁 상피 세포 및 평활근 세포는 생체적합성 기질에 동시에 시딩될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 배양된 질 상피 세포를 생체분해성 기질의 함면으로 관류시켜 질 상피 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 질 상피 세포가 질 상피 조직층을 생성시킬 때까지 질 상피 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고; 배양된 평활근 세포의 군집을 생체적합성 기질의 다른 면에 관류시켜 평활근 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 평활근 세포가 평활근 조직층을 생성할 때까지 평활근 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고, 이로써 인공 질을 작제함으로써 인공 질을 재건하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인공 질은 생체적합성 기질의 양면에 세포를 시딩함으로써 작제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 인공 질은 세포층을 적층함으로써 작제될 수 있는데, 예를 들어 질 상피 세포를 생체적합성 기질의 양면으로 시딩한 다음, 평활근 세포, 예를 들어 자궁근육 층 세포를 시딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 질 상피 세포 및 평활근 세포는 생체적합성 기질에 동시에 시딩될 수 있다.
생체적합성 기질은 비분해성 또는 생체분해성 물질로 이루어질 수 있다. 생체적합성 기질은 3차원 스캐펄드(scaffold)를 형성할 수 있다. 생체적합성 기질은 또한 탈세포화된 기관 물질로 이루어질 수 있다. 생체적합성 기질에서 증식시킬 경우, 증식 세포가 성장하고 적합하게 분리되어 생체내에서 발견되는 대응물에 유사한 조직을 형성시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 여성 생식계 부분은 인공 여성 생식기관으로 대치된다.
다른 측면에서, 본 발명은 배양된 여성 생식로 세포의 제1 군집을 생체분해성 기질의 한면으로 관류시켜 배양된 여성 생식로 세포가 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 배양된 여성 생식로 세포가 제1 여성 생식 조직층을 생성시킬 때까지 배양된 여성 생식로 세포를 생체적합성 기질에 배양시키고; 배양된 여성 생식로 세포의 제1 군집과 상이한 배양된 여성 생식로 세포의 제2 군집을 생체적합성 기질의 다른 한면으로 관류시켜 배양된 여성 생식로 세포의 제2 군집이 생체적합성 기질에 부착되도록 하고; 배양된 여성 생식로 세포가 제1 여성 생식 조직층과 상이한 제2 여성 생식 조직층을 생성시킬 때까지 배양된 여성 생식로 세포의 제2군집을 생체적합성 기질에 배양시켜 생성된 인공 여성 생식기관을 이식시켜 생식기관 장애가 있는 환자를 치료하고; 생식기관 장애의 조정을 위해 환자를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 인공 여성 생식기관 또는 조직 구조물은 본래 여성 생식기관의 순응도 및 맥관구조를 나타낸다. 한 실시양태에서, 인공 여성 생식기관은 인공 질이다. 다른 실시양태에서, 인공 여성 생식기관은 인공 자궁이다. 다른 실시양태에서, 인공 여성 생식기관은 인공 경관이다. 다른 실시양태에서, 인공 여성 생식기관은 나팔관이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 여성 생식 조직층을 생성하여 여성 생식기관 작제물을 작제하는 배양된 여성 생식로 세포의 하나 이상의 군집으로 관류되는 생체분해성 기질로 이루어진 3차원 스캐펄드를 포함하는 인공 여성 생식기관에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인공 여성 생식기관 작제물은 2개 이상의 상이한 여성 생식 조직층을 생성하는 배양된 여성 생식로 세포의 2개 이상의 상이한 군집을 포함한다. 한 실시양태에서, 2개의 상이한 여성 생식 조직층은 생체분해성 기질의 동일면에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 당해 2개의 상이한 여성 생식 조직층은 생체분해성 기질의 2개의 상이한 면에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 제1 군집 및 제2 세포 집단은 별개의 기질층속으로 또는 그 위로 관류되고 당해 기질은 관류후 합해진다.
다른 측면에서, 여성 생식 세포를 조정하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 여성 생식 세포 집단으로 및 평활근 세포 집단으로 관류된 이식가능한, 생체적합성 기질을 제공하여 여성 생식 세포 집단이 정상 자궁 조직의 순응도와 같은 조직 구조물을 형성하는 평활근 군집에 부착되도록 하고; 인공 여성 생식기관을 시험 화합물의 라이브러리와 접촉시키고; 시험 화합물의 라이브러리로부터 여성 생식 세포를 조정하는 대상 화합물을 분리시키는 것을 포함한다. 당해 화합물은 세포독성, 치료학적일 수 있는 화학적 또는 약학 제제이거나, 배아의 착상에 영향을 미치거나 수축을 조정한다.
도 1은 정상 질 및 이식 6주후의 조직공학 처리된(TE) 질 둘 다의 여러 수준에서의 전기 자극에서의 유발 전위를 나타낸 그래프이고;
도 2A는 전기장 자극에 대한 정상 자궁 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 2B는 카바콜(CA) 및 아트로핀(AT)의 약물 자극에 대한 정상 자궁 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 2C는 페닐에프린(PE) 및 페톨아민(PL)의 약물 자극에 대한 정상 자궁 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 2D는 전기장 자극(100v ;lms)에 대한 세포 시딩된 자궁 이식된 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 2E는 카바콜(CA) 및 아트로핀(AT)의 약물 자극에 대한 세포 시딩된 자궁 이식된 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 2F는 페닐에프린(PE) 및 페톨아민(PL)의 약물 자극에 대한 세포 시딩된 자궁 이식된 조직 반응을 도시한 그래프이고;
도 3A는 이식 1, 3 및 6개월후 자궁 세포 시딩된 작제물의 최대 인장 응력을 나타낸 그래프이고;
도 3B는 이식 1, 3 및 6개월후 자궁 세포 시딩된 작제물의 최대 인장 변형률 을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 여성 생식기관 또는 조직 구조물의 재건, 복구, 증대 또는 대치에 관한 것이다. 본 발명의 실시는 바이오메트릭스상의 세포 시딩, 세포 배양, 세포 확장, 및 조직 대치를 위한 생체내 작제물의 이식을 포함하는 조직공학적 방법을 사용한다.
발명을 더 용이하게 이해할 수 있도록, 특정한 용어를 정의한다:
본원에 사용된 용어 "부착(attach 또는 attaches)"은 3차원 스캐펄드에 직접 접착되는 세포 또는 그 자체가 기타 세포에 부착된 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "생체적합성 기질(biocompatible matrix, biocompatible substrate 또는 중합체 스캐펄드)"은 세포 집단이 침착될 수 있는 대상으로의 이식에 적합한 물질을 의미한다. 생체적합성 기질은 대상에 일단 이식되면 독성 또는 유해한 효과를 유발하지 않는다. 한 실시양태에서, 생체적합성 기질은 대치해야 할 목적하는 기관으로 성형될 수 있는 표면을 갖는 중합체이다. 당해 중합체는 또한 대치해야 할 기관의 일부로 성형될 수 있다. 다른 실시양태에서, 생체적합성 기질은 탈세포화된 구조물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 생체적합성 기질은 생체적합성 기질의 하부구조, 예를 들어폴리글리콜산, 또는 모든 세포상 물질을 제거하여 기관을 탈세포화한 후에 남는 하부구조를 포함하는 3차원 스캐펄드이다. 이러한 복합체 3차원 스캐펄드는 세포가 거기에 부착하고 그위에서 성장할 수 있는 지지 골격을 제공한다. 이어서 배양된 세포 집단이 3차원 스캐펄드상에서 성장할 수 있고, 이는 세포-세포 상호작용에서 요구되는 정확한 세포간 거리를 제공한다. 이는 생체내 천연 기관과 유사한 재건된 기관을 제공한다. 당해 3차원 스캐펄드는 배양된 여성 생식로 세포의 하나 이상의 군집으로 관류되어 이것이 성장하고 발생하여 여성 생식로 조직층을 제공한다. 다른 실시양태에서, 생체적합성 기질은 생체분해성이다. 생체적합성 중합체의 비제한적 예는 이로써 제한되지는 않으나 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 셀룰로스성 에스테르, 불소화 폴리에틸렌, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤족사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리글리콜산, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 재생 셀룰로스, 실리콘, 우레아-포름알데하이드, 및 이의 공중합체 또는 화학적 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로부터 형성될 수 있다. 중합체성 기질은 생체적합성 및 생체분해성 성형된 세팅 물질로 코팅될 수 있다. 한 실시양태에서, 형상 세팅 물질은 액체 공중합체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 공중합체는 폴리-DL-락타이드-공-글리콜라이드이다.
본원에 사용된 용어 "탈세포화된 구조물"은 3차원 생물학적 배열물을 의미하는데(예를 들어, 기관 또는 기관의 일부), 이는 전체 세포 및 조직 성분이 제거되고 그 뒤 복합 하부구조가 남는 방법에 의해 생성된다. 기관의 특이화된 조직 구조물은 기관과 관련된 특이 작용을 제공하는 실질이다. 기관의 지지 섬유상 네트워크가 스트로마이다. 대부분의 기관은 특이화된 조직을 지지하는 비특이화된 연결 조직을 포함하는 스트로마 골격을 갖는다. 탈세포화 공정으로 특이화된 조직이 게되고, 그 뒤 결합 조직의 복합 3차원 네트워크가 남게 된다. 결합 조직 하부구조는 주로 콜라겐을 포함한다. 용어 "탈세포화된 구조물"은 세포 및 조직 물질이 제거된 전체 기관을 포함하고자 하는 것이다. 용어 "탈세포화된 구조물"은 또한 세포 및 조직 물질이 제거된 기관 구조물의 일부를 포함하고자 하는 것이다. 탈세포화된 구조물은 상이한 세포 집단이 관류될 수 있는 생체적합성 기질을 제공한다. 탈세포화된 구조물은 경질 또는 반경질일 수 있고, 그의 형상을 변경하는 능력이 있다. 예를 들면, 탈세포화된 자궁은 확장될 수 있지만 출산후 원래 형상으로 회복된다. 탈세포화된 구조물의 예는 이로써 제한되지는 않지만 탈세포화된 자궁, 질, 경관, 난소 및 나팔관을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "여성 생식기관" 및 "여성 생식조직"은 생식과 관련된 모든 기관 또는 조직을 포함시키고자 하는 것이다. 이들은 이로써 제한되지는 않지만 질, 자궁, 난소, 나팔관 및 경관을 포함한다. 본원에서 교체가능하게 사용된 용어 "여성 생식 세포 집단" 및 "여성 생식 세포"는 여성 생식계의 임의의 부분으로 부터 유도된 세포를 의미하는 것이다. 여성 생식계는 여성이 충란(난자)을 생성하고, 성교를 하고, 완전히 발생할 때까지 수정란에 영양을 주고 품어 출산할 수 있게 하는 기관을 포함한다. 여성 생식 세포 집단은 기관, 예를 들어 질, 경관, 자궁, 나팔관 및 난소로부터 유도될 수 있다. 당해 용어는 여성 생식계로부터의 모든 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 의미하고자 사용된다. 사용된 당해 용어는 또한 여성 생식계의 부분으로부터의 단리된 세포 아군집, 예를 들어 단지 질 세포, 상피 세포, 내피 세포의 단일 군집을 의미한다. 단리된 세포 아군집은 기관의 임의의 부분, 예를 들어 자궁내막, 자궁근육층 및 자궁외막[문헌 참조: See Gray's Anatomy : The Anatomical Basis of Medicine and Surgery 38th ed. Churchill Livingstone Eds. H. Gray, L. H. Bannister, M. Berry, P. L. Williams 1996]으로부터 유도될 수 있다. 한 실시양태에서, 단리된 아군집은 세포의 동종 아군집이다. 한 실시양태에서, 여성 생식 세포 집단은 실질적으로 질, 경관, 자궁, 난소 또는 나팔관 상피 세포인 세포 집단을 의미한다. 다른 실시양태에서, 여성 생식 세포 집단은 실질적으로 평활근 세포, 예를 들어 자궁근육층인 세포 집단을 의미한다. 여성 생식계로부터의 세포는 대상으로부터 생검함으로써 유도될 수 있다. 여성 생식계로부터의 세포는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 소아 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 선천적 세포, 핵 이동 및 단위생식(parathenogenesis)으로부터 유도될 수 있다, 세포 분리 기술을 사용하여 건강 세포를 병든 세포로부터 단리할 수 있다. 세포 분리 기술, 예를 들면 FACS를 또한 사용하여 세포의 아군집을 단리하는데 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "질 상피 세포 집단" 또는 "질 상피 세포"는 질 또는 여성 질에 대한 고유 세포로부터 유도된 세포를 의미한다. 질 상피 세포는 자궁내막 세포를 포함시키고자 하는 것이다. 질 상피 세포는 층상 편평세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "자궁 상피 세포 집단" 또는 "자궁 상피 세포"는 경관에 있는 모든 세포를 포함하는 자궁 또는 여성 자궁에 대한 고유 세포로부터 유도된 세포를 의미한다. 자궁 상피 세포는 자궁 내막 세포를 포함시키고자 하는 것이다. 자궁 상피 세포는 섬모 및 비섬모 컬럼상 세포 둘 다일 수 있는 단순 컬럼상 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "경관 상피 세포 집단" 및 "경관 상피 세포"는 여성 경관 또는 여성 자궁 하부에 대한 고유 세포로부터 유도된 세포를 의미한다. 경관 상피 세포는 자궁내막 세포를 포함시키고자 하는 것이다. 경관 상피 세포는 컬럼상 세포 및 층상 상피 세포 둘 다를 포함한다. 경관 상피 세포는 섬모 및 비섬모 컬럼상 세포를 둘 다 포함한다.
본원에 사용된 용어 "나팔관 상피 세포 집단" 및 "나팔관 상피 세포"는 여성 나팔관 또는 여성 나팔관에 대한 고유 세포로부터 유도된 세포를 의미한다. 나팔관 상피 세포 자궁내막 세포를 포함시키고자 하는 것이다. 나팔관 상피 세포섬모 및 비섬모 컬럼상 세포 둘 다일 수 있는 컬럼상 세포를 포함한다.
세포 집단 동종성 내용에서 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 세포의 50%이상이 동일 세포 집단으로부터임을 의미하는 것으로, 예를 들어 질 상피 세포이다. 바람직하게는 세포의 70%가 동일 세포 집단으로부터이다. 더 바람직하게는 세포의 85%가 동일 세포 집단으로부터이고, 훨씬 더 바람직하게는 세포의 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%가 동일 세포 집단으로부터이다.
본원에 사용된 용어 "다층"은 동종의 배양된 세포 집단이 서로에 대해 층상 구조를 이루는 다중 층을 포함하는 배열을 의미한다. "다층"을 제조하는 방법은 표면, 예를 들어 생체적합성 기질에 세포 집단의 한 층을 침착시킨다. 침착된 세포를 성장 배지에서 이들이 발생하고 증식하여 목적하는 표현형 및 형태학을 갖는 세포를 포함하는 제1 단층을 생성시킬 때까지 배양한다. 일단 제1 단층이 목적하는 세포 밀도를 달성하게 되면, 동일 세포 집단의 제2층을 제1층에 침착시킨다. 침착된 세포의 제2층을 제2 세포층 및 제1 세포층 둘 다에 영양분을 공급하는 성장 배지에서 제2층의 세포가 목적하는 세포 밀도로 발생하고 증식하여 목적하는 표현형 및 형태학을 갖는 세포의 제2층을 생성시킬 때까지 배양한다. 동일 세포 집단의 제3층을 당해 이층에 침착시키고, 당해 세포를 이층 및 제3층의 세포 둘 다에 영양분을 공급하는 성장 배지에서 제3층의 세포가 목적하는 세포 밀도로 발생하고 증식하여 목적하는 표현형 및 형태학을 갖는 세포의 삼층을 생성시킬 때까지 배양한다. 동종 세포 집단의 다수 층을 포함하는 다층이 생성될 때까지 당해 방법을 반복한다. 다층의 특징은 생체 내 기관의 실질 조식의 형태학 및 기능 특성과 매우 유 사하다는 것이다. 예를 들면, 평활근 세포 집단을 포함하는 다층은 질 또는 자궁의 평활근 조직, 즉 자궁근육층의 기능 특성을 가질 수 있다는 것이다.
용어 "커플링된"은 서로 접하는 상이한 세포 집단사이에 상호 친밀한 상호작용을 의미한다 이들 상호 작용은 세포-세포 상호 작용, 성장, 발생 및 증식을 포함한다. 조직의 발생, 복구 및 유지와 관련된 세포 행태는 주로 세포와 이들의 미세환경사이의 상호 작용에 의해 조절된다. 이들 상호 작용은 성장 인자, 효소를 결합하는 세포 표면 분자, 및 세포 표현형의 변화를 유발하는 반응을 유도하는 기타 분자에 의해 매개된다. 이들 상호 작용은 또한 새로운 세포의 생성을 유도하는데, 이는 상이한 세포 집단 각각의 기능성과 상이한 독특한 기능성을 갖는 세포상 물질을 생성시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "키메라계면"은 두 개의 상이한 세포 집단 사이에 형성된 경계를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "간질 생체물질"은 두 개의 상이한 세포 집단이 서로 상호 접하는 키메라계면에서의 세포상 물질의 형성을 의미한다. 가장 광범위한 개념으로의 "간질 생체물질"은 상이한 두 개 이상의 세포 집단이 서로 접할 경우에 형성되는 임의의 새로운 세포상 물질의 형성을 포함시키고자 하는 것이다. 새로운 세포상 물질은 기관의 정상 생체내 세포 발생에서 생성되는 세포상 물질의 기능적 상등물과 유사한다. 예를 들면, 인공 질, 나팔관 또는 자궁 재건술에서, 서로 상호 접하는 두 개의 상이한 세포 집단은 평활근 세포 집단, 예를 들어 자궁근육층 및 상피 세포 집단이다. 따라서 이들 두개의 군집에 계면에서 생성된 "간질 생체물질"은 점막하조직의 것과 유사할 것이다. 한 실시양태에서, 생체적합성 기질이 분해되어 점막하조직을 형성한다.
본원에 사용된 용어 "기능적 상등물"은 구조물, 예를 들어, 천연 기관과 동일하거나 유사한 작용을 하는 본 발명에 따른 방법으로 생성된 인공 기관을 의미하며, 예를 들면 인공 질은 생체내 질과 동일한 기능적 특징을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "조정하는 화합물"이란 세포 활성의 변화를 유발하는 화합물을 의미한다. 이러한 변화는 독성일 수 있는데 예를 들면 조기 수축을 유발하여 낙태를 초래하거나, 유익하게는 배아 착상을 증진시킬 수 있다. 당해 변화는 세포 기능을 변경시킬 수 있는데, 예를 들면, 수축, 증식, 세포사를 유도할 수 있다. 조정자는 세포 활성의 변화를 유도하는 표적 유전자 또는 표적 단백질을 포함하는 공정 또는 신호전달 연속단계를 증가, 감소, 상승 또는 저하시킬 수도 있다.
본원에 사용된 "대상"은 면역반응을 도출해 낼 수 있는 임의의 생존 유기체를 의미한다. 용어 대상은 이로써 제한되지는 않지만, 사람, 사람이 아닌 영장류,침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축, 예를 들어 개 및 고양이; 실험실 동물, 예를 들어 마우스, 래트 및 기니픽 등을 포한다. 당해 용어는 특별한 연령이나 성별을 지시하지는 않는다. 따라서, 성인 및 신생 대상, 뿐만 아니라 태아도 포함시키고자 한다.
본 발명은 인공 여성 생식기관을 재건하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 인공 여성 생식기관의 작제는 배양된 여성 생식 세포의 하나 이상의 군집을 생체적합성 기질로 관류하여, 배양된 여성 생식 세포 생체적합성 기질에 부착되어 하나 이상의 여성 생식 조직층을 형성하도록 한다. 배양된 여성 생식 세포의 추가의 군집을 생체적합성 기질에 부착시키고 배양시켜 인공 여성 기관 또는 조직 구조물을 생성시킨다.
I. 해부학
a. 질
질은 층상 편평 상피로 라이닝된 근육관이고 이는 경관 및 음문의 점막과 조직학적으로 유사하며, 이는 신체 외부로 경관(자궁의 하부)을 연결하고 있다. 질 또는 산도는 샘 또는 모낭을 함유하지 않지만, 개별 세포, 움을 함유하고 점액을 생성한다. 점액은 자궁을 세균으로부터 보호하고 또한 충란이 수정될 준비가 되어 있을 경우 정자가 자궁으로 들어가는 것을 돕는다. 표재층은 케라틴화되지 않는다. 어린이의 질과 폐경기후 여성의 질은 그 상피층이 얇고 상처입기 쉽고 여러 감염에 걸리기 쉽다는 점에서 유사하다. 정상 성인 질은 디프테로이데스, 도덜레인 바실러스 및 혐기성 스트렙토코커스를 함유한다. 이러한 균무리는 질 세포의 글리코겐을 락트산으로 전환시키고, 이는 질을 산 pH로 유지시키고 정상 분비를 향상시킨다. 월경기 동안, 질은 주름(ruga)이라고 불리우는 가로주름을 갖는다. 폐경기후, 에스트로겐의 부재하에, 질벽을 얇아지고, 위축되는데 이는 아동기에 볼 수 있는 바와 같이 에스트로겐의 결핍을 반영하는 것이다. 성인 질의 깊이는 12 내지 13 cm로 측정된다.
질 상피는 호르몬 반응성이다. 에스트로겐은 세포의 글리코겐의 축적을 갖는 상피의 증식 및 성숙을 자극한다. 상피내의 글리코겐의 존재는 쉴러 테스트를 근거로 형성한다. 상피에 루골 용액(진한 요오드)을 공급한다. 글리코겐은 요오드와 합해져 어두운 마호가니 갈색을 생성시킨다. 비염색(포지티브 시험)은 이상 상피를 의미하는 것이고, 예를 들어 흉터 조직, 원주상피(샘증) 및 종양 또는 전구 환부이다. 그러나 프로제스토겐은 상피의 성숙을 억제한다.
질은 부분적으로 붕괴된 관상 구조로서 음문의 전정에서 자궁으로 연장된다. 전방 및 후방벽은 축을 제외하고는 서로 접해 있고, 여기서 질은 일명 결막으로 칭해지는 외자궁경부 및 둥근천장형 오목을 둘러싸고 질 및 경관을 분리한다. 후방 결막은 전방보다 더 깊다. 방광 및 요도는 질 전방에 있는 반면, 직장은 그 후방에 있다. 질은 두 개의 주요 공급원, 자궁 및 음부 동맥으로부터 그의 혈액 공급을 유도한다. 내부 음부 동맥은 질에 아래에서 위로 공급된다. 질 동맥을 흔히 자궁 동맥으로부터의 분지이고 자궁 동맥 그 자체가 질의 윗부분에 공급된다.
성인 여성의 자궁근육층은 자발적으로 주기적인 수축을 겪는다. 난소제거된자의 자궁은 주기적인 수축성을 상실한다. 자궁근육층의 비대는 에스트로겐 농도가 높을 경우 일어나고, 자궁 비대는 폐경기후에 일어난다. 자궁내막은 일반적으로에스트로겐 및 프로게스테론 농도를 반영한다. 에스트로겐은 자궁내막 및 그의 혈관통로 증식을 유발시킨다. 프로게스테론은 증식성에서 분비성 자궁내막으로 형질전환되고, 샘 및 버팀질 특성을 가져 가능한 착상을 촉진시킨다. 자궁내막 생검으로 더 상세한 난소 호르몬 생성을 해석할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 실시예 1-3에 실연된 바와 같이 인공 질을 작제할 수 있다. 인공 질은 정상 질의 기능적 상등물이다. 인공 질은 정상 질의 세포 구조, 기능 및 생리를 포함한다. 인공 질은 생체적합성 기질을 제공하고, 생체적합성 기질위에 또는 속으로 제1 세포 집단을 관류하고, 여기서 제1 세포 집단은 실직적으로 질 상피 세포 집단이고, 제1 세포 집단과 상이한 세포 유형의 제2 세포 집단을 관류하고, 예를 들어 평활근 세포를 생체적합성 기질위에 또는 속으로 관류하고; 세포 집단을 생체적합성 기질내에서 배양시킴으로써 생성시킬 수 있다.
b. 경관
경관은 자궁의 아래 부분이다. 경관은 층상 편평 상피로 덮여진 섬유근육상 기관이다. 경관의 포티오(portio)질은 질 결막에서 일어나서 경관내막관 입구에서 외부 경관 협부에서 끝난다. 이러한 편평원주 연결은 편평 세포 암종의 가장 흔한 부위이다. 경관내막관은 원주상피에 의해 라이닝되고, 유사한 상피로 라이닝된 만상샘이 섬유근육상 스트로마에서 발견된다. 이러한 샘은 폐쇄될 경우, 경관 표면상에 나보트 낭포를 형성할 수 있다. 미분만부 경관협부는 둥글지만 분만으로 수평적으로 편평한 오리피스로 변화하게 된다. 경관은 여성의 생식기 악성종양의 두 번째로 흔한 부위이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 인공 경관을 작제할 수 있다. 인공 경관은 정상 경관의 기능적 상등물이다. 인공 경관은 정상 질의 세포 구조, 기능 및 생리를 포함한다. 인공 경관은 생체적합성 기질을 제공하고, 생체적합성 기질위에 또는 속으로 제1 세포 집단을 관류하고, 여기서 제1 세포 집단은 실직적으로 경관 상피 세포 집단이고, 제1 세포 집단과 상이한 세포 유형의 제2 세포 집단을 관류하고, 예를 들어 평활근 세포를 생체적합성 기질위에 또는 속으로 관류하고; 세포 집단을 생체적합성 기질내에서 배양시킴으로써 생성시킬 수 있다.
c. 나팔관
나팔관은 자궁의 측 경계의 윗부분으로부터 시작되고 둥근 인대의 부착부 상부이고 개방되어 있다. 말초 말단, 주름모양돌기가 복강으로 개방되어 있고 근위 말단은 자궁강으로 개방된다. 나팔관은 하부 원주 상피의 단일층에 의해 라이닝되고 일부는 섬모이며, 분지 또는 잘게갈라진 패턴으로 배열된다. 이 구조는 간질, 협부, 팽대부, 및 주름모양돌기 부분으로 나뉘어진다. 그 벽은 얇으며 넓은 인대의 상부 경계내에 복막인 하나의 외층 및 두 개의 근육층을 갖는다.
나팔관 상피는 또한 주기적인 변형, 성숙 및 퇴행 변화를 통해 난소 호르몬 변화를 반영한다. 나팔관 근육조직은 나팔관 이송을 돕는 것으로 여겨지는 고유 연동 운동을 갖는다. 특정의 관 세포의 섬모 작용은 또한 이송에 관여할 수 있응 것이다. 에스트로겐은 이들 활성에 영향을 주는 것으로 보인다.
나팔관은 자궁 양쪽 상부에 부착되어 있고 약 10 cm 길이이다. 나팔관은 좁고, 난소에서 자궁으로 이동하는 난자를 위한 통로로서 역할을 하는 근육관이다. 매달 배란기에 성숙란이 난소에서 방출된다. 자궁과 말단에서의 경계 주름인 주름모양돌기가 충란을 나팔관으로 이끈다. 각각의 나팔관은 충란을 앞으로 추진시키기 위해 주기적으로 움직이는 섬모라 칭해지는 수많은 작은 털에 의해 라이닝된다. 정자에 의한 충란의 착상인 수태는 통상 나팔관에서 일어난다. 이어서 수정란은 자궁으로 이동하고 여기서 자궁벽에 착상한다. 나팔관은 또한 다른 기능을 수행하는데, 예를 들면 그의 공동에서 충란 및 초기 배아에 영양을 공급한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 인공 나팔관을 작제할 수 있다. 인공 나팔관은 정상 나팔관의 기능적 상등물이다. 인공 나팔관은 정상 나팔관의 세포 구조, 기능 및 생리를 포함한다. 인공 나팔관은 생체적합성 기질을 제공하고, 생체적합성 기질위에 또는 속으로 제1 세포 집단을 관류하고, 여기서 제1 세포 집단은 실직적으로 나팔관 상피 세포 집단이고, 제1 세포 집단과 상이한 세포 유형의 제2 세포 집단을 관류하고, 예를 들어 평활근 세포를 생체적합성 기질위에 또는 속으로 관류하고; 세포 집단을 생체적합성 기질내에서 배양시킴으로써 생성시킬 수 있다.
d. 난소
정상 난소는 2x3x3 cm의 백색의 아몬드형 구조로서 넓은 인대의 후방 표면 및 나팔관의 하부에 위치한다. 난소는 여성 생식 세포인 난자(충란 세포)를 생성하고, 호르몬을 생성시킨다. 신경, 림프관 및 혈관이 넓은 인대인 문에 부착 시점에서 난소로 들어간다. 난소의 측면 지지는 깔대기골반 인대에 의해 제공되고 이것이 골반 측벽으로 연장되고, 내측 지지는 자궁-난소 인대에 의해 자궁까지이다. 난소는 난소는 피질 및 수질을 갖는다. 종자 상피, 입방세포의 단일층은 밀집 섬유 조직인 백색막을 커버한다. 난포는 난소 피질에서 기원하며 기본 배아 보체로 이루어진다; 어떠한 새로운 난포도 출생후 형성되지 않는다. 난소의 수질 부분에는 혈관, 림프관, 신경 및 결합 조직이 있으며 볼프체 전구체의 잔유물을 함유한다. 난소는 내분비 및 발생 기관이다. 소포곁 과립층 세포는 에스트로겐을 생성하고, 배란후, 황체 형성 프로게스틴을 생성한다. 안드로겐은 기질 세포, 특히 문에 의해 생성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 인공 난소를 작제할수 있다. 인공 난소는 정상 난소의 기능적 상등물이다. 인공 난소는 정상 난소의 세포구조, 기능 및 생리를 포함한다.
e. 자궁
자궁은 샘 점막에 의해 라이닝된 여성 생식로이고, 이는 특이화된 혈관신생을 갖는다. 당해 중공의 배모양의 기관은 방광과 직장 사이에 개재된 골반강에 위치한다. 임신하지 않은 여성에서 자궁의 길이는 약 8 cm이고 중량은 30 내지 100 g이다. 나팔관 및 경관관은 자궁강에 의해 통신하며, 이는 자궁내막에 의해 라이닝된다. 팽창된 상부 부분은 체(body 또는 corpus)로서 칭해진다. 당해 체는 상당히 근육질이라 성장하는 아기를 보유하도록 팽창할 수 있다. 수란관 둘 다가 자궁에 연결하는 지점의 부리쪽 영역은 종종 기저로서 칭해진다. 자궁기저는 그 하부 전방부만 제외하고는 복막으로 커버되고, 방광은 하부 자궁 분절과 접해있으며 복막이 반영되고, 측면에서는 넓은 인대의 폴드가 부착된다. 기저 아래 제한된 부분은 협부로서 칭해지고, 그 아래 목이라고 칭해지는 실린더형 부분이 있다. 내부에서 외부로의 당해 기관층은 점막(자궁내막), 근층(자궁근육층) 및 장막(자궁외막)이다. 혈청 에스트라디올 및 프로게스테론의 변동은 순차적 구조사 주기 변화를 거치는 모든 세층을 유발시킨다. 자궁은 넓은 인대의 기점에 측면에 위치한 섬유근육 조직층 및 골반내근막을 축합함으로써 지지된다. 둥근 인대는 측면에서 지지하고 자궁방광의 폴드는 전방부를 지지한다.
자궁내막은 5mm 두께이고 호르몬 주기에 따라 변한다. 당해 층은 관 자궁샘을 형성하도록 합입시킨 분비성 단순 원주 상피에 의해 라이닝된다. 특정의 섬모 원주세포는 또한 상피 일부로서 발견될 수 있다. 자궁내막은 상부층 작용성을 포함하여 이는 각 월경 도중에 떨어진다. 표재 자궁내막에서 대형 모세혈관층에 영양을 공급하는 공급코일 또는 나선형 동맥은 두 층다의 혈관신생을 공급한다. 샘 및 관 상피가 서로 연속상에 있고 형태학적으로 광선 및 전자 스펙트로스코피에 의해 유사한 것으로 보이지만[참조:Davies et al. Am. J. Anat. 137 (4): 423-445 (1973); Davies et al. Am. J.Agnat. 142 (3): 335-365 (1975)], 이들은 호르몬 자극에 대해 상이하게 반응한다.
자궁 상피는 무활동 및 증식성 아군집을 포함하며, 이는 에스트로겐 및 프로게스테론에 차등적인 증식 반응을 나타낸다[참조: Conti et al.Endocifzology 114 (2): 345-351 (1984)]. 에스트로겐을 투여하면 무활동 샘 세포를 세포 주기로 보충시키고 관 세포 상실을 감소시킨다. 프로게스테론은 샘 및 루멘에서 세포 주기 길이를 단축시킴으로써 증식율을 유도한다[참조: Nawaz et al. Am. J. Pathol. 127(1): 51-59 (1987)].
자궁내막 기질은 중간엽과 유사한데 이는 큰 타원핵을 갖는 성상 세포를 함유한다. 탈락막 형질전환으로 인해, 기질 세포는 착상에서 역할을 하며 낭배 영양을 통한 임신의 유지, 내분비(프롤락틴), 및 배아 보호의 역할을 하는 것으로 여겨진다. 자궁의 자궁근육층은 네 층을 포함한다. 당해 층은 상당한 결합 조직으로 산재된 복잡한 상호연결 무리로 인해 명확히 구분되지 않는다. 네 층은 용이하게 인식가능하다. 층 점막하조직은 세로형 섬유로 점막하조직 아래 얇은 층을 함유한다. 층 혈관은 스폰지 외관을 제공하는 수많은 혈관을 함유하며, 섬유는 원형이고 경사져 있다. 층 상부혈관은 가늘고 세로형 근육층으로 이루어진다. 복막은 편평 세포의 단일층으로 이루어지고, 이는 나팔관 및 자궁을 둘러싼다. 당해 박층은 또한 신경 및 혈관의 집으로써 작용한다. 복막 부분은 자궁을 둘러싸고 골반벽 쪽으로 연장되는데, 자궁외막으로 칭해진다[참조: Baez and Atala, "Uterus" In : Methods of Tissue Engineering. Academic Press 2002 (1189-1194)].
동맥혈은 질, 자궁, 나팔관 및 난소에 공급되고 네쌍의 동맥을 통한다: 난소 동맥, 자궁 동맥, 질 동맥 및 내부 음부 동맥. 자궁, 경관 및 상부 질은 방광 뒤에 있고, 이는 방광자궁 폴드에 의해 자궁으로부터 분리된다. 이러한 복막 폴드아래, 방광이 경관 및 상부 질에 원형 조직에 의해 연결된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 실시예 5 및 6에 실연되 바와 같이 인공 자궁을 작제할 수 있다. 인공 자궁은 정상 자궁의 기능적 상등물이다. 인공 자궁은 정상 자궁의 세포 구조, 기능 및 생리를 포함한다. 인공 자궁은 생체적합성 기질을 제공하고, 생체적합성 기질위에 또는 속으로 제1 세포 집단을 관류하고, 여기서 제1 세포 집단은 실직적으로 나팔관 상피 세포 집단이고, 제1 세포 집단과 상이한 세포 유형의 제2 세포 집단을 관류하고, 예를 들어 평활근 세포를 생체적합성 기질위에 또는 속으로 관류하고; 세포 집단을 생체적합성 기질내에서 배양시킴으로써 생성시킬 수 있다.
(f) 여성 생식계의 기능
생식 연령의 여성은 약 한 달 주기로 반복하여 호르몬 활성의 주기를 경험한다. 매 주기에서 여성의 신체는 잠재적인 임신을 준비한다. 용어 월경은 자궁 내층이 주기적으로 흘러나오는 것을 의미한다. 평균 월경 주기는 약 28일이고 난포기, 배란기 (배란) 및 황체기에서 일어난다. 이들은 월경 주기와 관련 네개의 주요 호르몬인 세포 또는 기관의 활성을 자극하거나 조정하는 화학물, 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 에스트로겐 및 프로게스테론이 있다.
제1단계, 난포기는 월경 주기 첫날에 시작되는데 이는 월경 주기가 시작되는 날이다. 이 시기에, 난포 자극 호르몬(FSH) 및 황체형성 호르몬(LH)이 뇌의 기저에 있는 뇌하수체에 의해 방출된다. 이들 호르몬은 혈액내에서 난소로 이동한다. 따라서, 호르몬은 충란 약 15 내지 20개의 성장을 자극하고 각각은 난포로서이다. 난포는 작고, 액상으로 가득한 낭포이고 이는 충란의 성장과 영양공급에 관련되는 지지 세포를 보유한다. FSH 및 LH는 또한 난포가 에스트로겐 생성을 증가시키도록 한다.
본래 월경주기를 통해 에스트로겐 농도가 상승함에 따라, 뇌하수체는 FSH를 덜 생산한다. 호르몬 균형을 맞추어 신체는 성숙을 완료하는 난포의 수를 제한할 수 있다. 난포기가 진행됨에 따라서, 하나의 난소에 하나의 난포가 우세하며 성숙을 계속한다. 이러한 우세 난포는 그룹내의 다른 난포 모두를 억제하고, 이는 성장 및 재발생을 정지시킨다. 발생 난포는 에스트로겐을 포함하는 그 자체 호르몬을 생성한다.
제2 단계인 배란기 또는 배란은 월경 주기의 중간 지점이고, 일반적으로는 여성의 다음 월경주기 시작 약 2주 전이다. 이 기간 동안에, 에스트로겐의 상승이 뇌하수체로부터의 LH의 쇄도를 유발시킨다. 이는 우세 난포가 그위 충란을 난소로부터 방출하는 것의 원인이 된다. 배란이라고 칭해지는 충란이 방출됨에 따라서, 나팔관(주름모양 돌기) 말단에 손가락 모양의 추진에 의해 포획된다. 당해 주름모양 돌기가 충란을 관내로 밀어넣는다. 이 시긴 동안에, 여성의 경관 점액에 증가가 있으며, 이는 남성의 정자(남성 생식 세포)를 받고 영양 공급을 할 준비를 한다. 점액은 또한 정자가 경관관으로 움직이는 것을 돕는다.
제3 단계인 황체기는 배란 후 바로 시작된다. 일단 충란을 방출한 후, 빈 난포는 황체(따라서 황체기)라고 칭해지는 새로운 구조물로 발생한다. 황체는 에스트로겐 및 프로게스테론을 분비한다. 프로게스테론은 수정란을 착상시키는데 필요한 풍부한 내층을 갖도록 준비한다. 충란이 남성의 정자에 의해 수정된 경우, 수정란(배아)는 나팔관을 통해 자궁내 착상되고 임신이 되는 것이다. 충란이 수정되지 않은 경우, 이는 자궁으로 통과한다 임신을 지지할 필요없이 자궁 내층이 파손되어 떨어지고, 다음 월경 주기가 시작된다.
II. 생체적합성 기질
발명의 한 측면에서, 인공 여성 기관은 지지 구조물, 예를 들어 중합체 구조물, 생체적합성 기질 또는 탈세포화된 기관의 도움하에 있다.
a. 중합체 구조
A 생체적합성 기질은 생물학적 기능에 독성이나 유해 효과가 없는 물질을 의미한다. 생체분해성이란 환자의 체내에서 흡수되거나 분해될 수 있는 물질을 의미한다. 생체분해성 구조물을 형성하는 물질의 대표적인 예는 천연 또는 합성 중합체, 예를 들면 콜라겐, 폴리(알파 에스테르), 예를 들어 폴리(락테이트 산), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리오르토에스테르 및 다중무수물 및 이의 공중합체이고 이는 조절된 속도로 가수분해로 분해되고 재흡수된다. 이들 물질은 생체분해성, 취급성, 크기 및 배열의 최대 조절을 제공한다. 바람직한 생체분해성 중합체 물질은 폴리글리콜산 및 폴리갈락틴인데, 이는 흡수성 합성 봉합재로 개발된다. 폴리글리콜산 및 폴리갈락틴 섬유는 제조자에 의해 공급되는 바와 같이 사용할 수 있다. 다른 생체분해성 물질은 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 셀룰로스성 에스테르, 불소화 폴리에틸렌, 페놀성 중합체, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤족사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴플루오라이드, 재생 셀룰로스, 실리콘, 우레아-포름알데하이드 또는 이들 물질의 공중합체 또는 물리적 블렌드이다. 당해 물질은 적합한 항균제에 함침하고 착색 첨가제에 의해 착색시켜 가시성을 개선시켜 수술 절차에 도움이 되도록 할 수 있다.
특정의 실시양태에서, 세포를 중합체로의 부착은 중합체를 화합물들, 예를 들어, 지저막 성분, 한천, 아가로스, 젤라틴, 아라비아 고무, 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 유형 I, II, III, IV 및 V, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사이노글리칸, 이의 혼합물, 및 세포 배양 분야의 당업자에게 공지된 생물학적 기질 분자에 유사한 특성을 갖는 친수성 및 펩티드 부착 물질로 피복함으로써 향상된다. 모든 중합체는 후속 성장 및 증식으로 세포를 적합하게 지지할 수 있게 하기에 필수적인 기계적 및 생화학적 변수를 충족해야만 한다. 영양분, 성장 인자, 분화 또는 탈분화의 유도 인자, 분비 산물, 면역조정자, 염증 억제제, 퇴행 인자, 림프관 네트워크 또는 신경 섬유의 성장을 향상시키거나 가능케하는 생물학적 할성 화합물을 포함하는 인자를 기질 또는 기질과 결합한 경우로 혼입할 수 있다. 유사하게, 펩타이드 RGD (Arg-Gly-Asp)를 함유하는 중합체가 기질 형성용으로 합성될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 폴리글락틴 및 폴리글리콜산이다. 폴리글락틴은 흡수성 합성 봉합재로 개발되었는데, 90:10 글리콜라이드와 락타이드의 공중합체로서 비크릴(Vicryl) 편직 흡수성 봉합사로서 제조된다(참조: Ethicon Co. , Somerville, N. J. ) (Craig P. H. , Williams J. A. , Davis K. W. , et al.: A Biological Comparison of Polyglactin 910 and Polyglycolic acid Synthetic Absorbable Sutures. Surg.141 ;1010, (1975)). 폴리글락틴 및 폴리글리콜산 섬유는 제조업자로부터 공급된 바와 같이 사용될 수 있다. 생체적합성 중합체는 방법들, 예를 들면 용매 캐스팅, 압축 성형, 봉합, 필라멘트 인취, 메싱, 리칭, 위빙 및 피복을 사용하여 성형할 수 있다. 용매 캐스팅에서, 적합한 용매중의 하나 이상의 중합체 용액, 예를 들어 메틸렌 클로라이드가 브랜칭 패턴 릴리프 구조물로서 캐스팅된다. 용매 증발 후, 박층을 수득한다. 압축 성형에서, 중합체를 적합한 패턴으로 인치당 30,000 파운드까지의 압력하에 가압한다. 필라멘트 인취는 용융 중합체로부터의 인취를 포함하고 메싱은 섬유를 압축하여 펠트 유사 물질로 함으로써 메시를 성형하는 것을 포함한다. 리칭에서, 두 물질을 함유하는 용액을 기질의 최종 형태에 인접한 형태로 분산시키고; 이어서 용매를 사용하여 성분 중 하나를 용해제거하여 공극 형성을 유발한다[문헌 참조: Mikos, US 5,514,378, 본원에 참조문헌으로 인용함]. 핵형성화에서, 기질 형태로의 박층을 방사선 분열 생성물에 노출시키는데 이는 방사선 손상된 물질의 트랙을 생성한다. 한 실시양태에서, 생체적합성 기질은 섬유로 이루어진 생체분해성 중합체 메시일 수 있다.
폴리카보네이트 쉬이트(sheet)는 산 또는 염기로 에칭할 수 있는데 방사선 손상된 물질의 트랙을 공극으로 전환시킨다. 마지막으로, 레이저를 사용하여 성형하고 균일한 공극 크기를 갖는 기질 구조를 형성하도록 다수의 물질을 통해 개별적 구멍을 연소시킨다. 피복은 중합체 구조물을 예를 들어 액화 공중합체(폴리-D, L-락타이드 코-글리콜라이드(PLGA, 50: 50) 80 mg/ml 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름중에서 (5% w/v) )로 피복하거나 침투시켜 그의 기계적 특성을 변화시키는 것을 의미한다. 피복을 목적하는 특성이 달성될 때까지 일층 또는 다중층일 수 있다. 이들 성형 기술은 조합되어 사용될 수 있는데, 예를 들면 중합체 기질이 위빙되고 압축되고 함께 접착될 수 있다.
상이한 방법으로 성형된 추가의 상이한 중합체 물질을 함께 결합하여 복합 형상을 형성시킬 수 있다. 복합 형상은 적층 구조물일 수 있다. 예를 들면 중합체 매트릭스는 동일하거나 상이한 조성물의 하나 이상의 중합체 매트릭스에 부착되어 다층 인공 질 구조물을 형성시킬 수 있다. 부착은 어떠한 적합한 방법으로도 수행될 수 있는데, 예를 들면 액체 중합체, 스테이플링, 봉합 또는 이들 방법의 조합이다. 또한, 중합체 매트릭스는 고체 블럭으로서 형성시킬 수 있고 레이저 또는 기타 표준 기술에 의해 목적하는 최종 형태로 성형된다. 레이저 성형은 레이저를 사용한 물질의 제거 공정을 의미한다.
중합체를 인장 강도 및 응력과 같은 기계적 특성에 의해 특성화될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리글리콜산 (PGA)은 생체물질로서 사용된다. PGA를 조직공학에서 널리 사용된다, PGA 스캐펄드는 여러가지 3차원 구조로 용이하게 조작할 수 있고 세포의 지지 및 수송의 탁월한 방법을 제공한다[참조: Christenson L, Mikos AG, Gibbons DF, et al: Biomaterials for tissue engineering: summary. Tissue Eng. 3(1) : 71-73; discussion 73-76, 1997]. 실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 질 상피 및 평활근 세포늘 PGA 작제물에 성공적으로 함께 배양하였다. 실시예 5 및 6은 PGA를 사용하여 인공 자궁을 작제할 수 있음을 설명하는 것이다.
생체적합성 기질을 인자들, 예를 들어 혈관신생, 시토킨, 세포외 기질 성분 및 기타 생체활성 물질 또는 약물로, 이식 전, 생체적합성 기질이 배양된 세포로 피복되기 전 또는 후에 처리하여 이식후 새로운 조직의 형성을 촉지하고 이식 치유를 촉진시킬 수 있다. 약물을 포함하는 인자들은 생체적합성 기질로 혼입될 수 있거나 생체적합성 기질과 함께 제공될 수 있다. 성장 인자 및 기타 첨가제(예를 들어 표피 성장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 표피-유사 성장 인자(HBGF), 피브로블라스트 성장 인자(FGF), 시토킨, 유전자, 단백질 등)를 이러한 성장 인자(있다면)의 특정양을 초과하는 양으로 가할 수 있는데 이는 가해진 세포를 사용할 경우, 중합체 기질에 세포 시딩에 의해 생성될 것이다. 이러한 첨가제는 바람직하게는 새로운 질 조직 형성과 같은 새로운 여성 기관의 형성을 촉진시키기에 충분한 양으로 제공된다. 기타 유용한 첨가제는 항세균제 및 항진균제를 포함하여 감염 억제에 의한 치유를 촉진시킨다.
하나의 바람직한 지지 기질은 일단 세포 지지 기질이 이식되면 단거리를 통한 영양분의 확산에 의해 세포 생존을 가능케 할 수 있는 가교 필라멘트를 포함한다.
생체적합성 기질을 작제하여 조절된 공극 구조를 갖도록 할 수 있고 이는 영양분이 배양 배지로부터 침착 세포 집단에 이르게 할 수 있는 구조지만, 배양 세포가 공극을 통해 이동하지 못하도록 한다. 시험관내에서 세포 부착 및 세포 생존율은 주사 전자 마이크로스코피, 조직학 및 정량적 평가법과 방사선동위원소를 사용하여 평가할 수 있다.
생체적합성 기질을 임의의 목적하는 배열로 성형하여 목적하는 수의 전반적인 시스템, 기하학 또는 공간 제한을 충족시킬 수 있다. 예를 들면, 여성 생식기관 작제에서, 기질을 기관의 전체 또는 부분의 차원과 형상, 예를 들어 질 또는 자궁에 일치하도록 성형한다. 생체적합성 기질을 상이한 크기로 성형하여 상이한 크기의 환자의 질 또는 자궁에 일치하도록 성형한다. 중합체 기질은 또한 환자의 특별한 필요에 따라서 성형하는데, 예를 들면 장애자의 경우, 그는 상이한 복강 공간을 가질 수 있을 것이고 따라서 질 또는 자궁을 그 공간에 적합하도록 재건할 필요가 있을 것이다.
다른 실시양태에서, 생체적합성 기질은 나팔관과 같은 신체에서 적층 구조물 치료에 사용된다. 이들 적용에서, 중합체 기질을 중공관으로써 성형할 수 있다.
b. 탈세포화된 구조물
생체구조물, 예를 들어 전 기관 또는 기관의 일부가 전체 세포 또는 조직 성분을 기관으로부터 제거함으로써 탈세포화될 수 있다. 한 실시양태에서, 탈세포화된 여성 생식기관 또는 조직, 예를 들어 질, 자궁, 나팔관 및 경관이 본 발명에서 사용될 수 있다. 탈세포화 공정은 일련의 순서적 추출이다. 이러한 추출 공정의 하나의 주요 특성은 생체구조물의 복잡한 하부구조를 교란시키거나 파괴할 수 있는 거친 추출법은 피해야 한다는 것이다. 제1단계는 세포 파편의 제거 및 세포막 가용화를 포함한다. 이에 이어서 핵 세포질 성분을 핵 성분으로 가용화시킨다.
바람직하게는, 생체구조물, 예를 들어 기관은 온화한 기계 파열 방법을 사용하여 기관을 둘러싼 세포막 및 세포 파편을 제거함으로써 탈세포화된다. 이러한 온화한 기계적 파열 방법은 세포막을 파열시키기에 충부하여야 한다. 그러나, 탈세포화 고정은 생체구조물의 복잡한 하부구조를 손상시키거나 교란시켜서는 안된다. 온화한 기계적 파열 방법은 기관 또는 조직의 표면을 스크래핑, 기관 또는 조직을 긴탕, 기관 또는 조직을 적합한 용적의 유체, 예를 들어 증류수에서 진동시키는 것을 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 온화한 기계적 파열 방법은 적합한 용적의 증류수에서 세포막이 파열되고 세포 파편이 기관으로부터 게거될 때까지 기관 또는 조직을 교반하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 기관 또는 조직을 저장조건에 노출시켜 혈액 세포가 세포 기질을 유지하면서 용출하도록 한다.
세포막이 게거된 후, 생체구조물의 핵 및 세포질 성분을 제거한다. 이는 하부구조를 파열시키지 않고 세포 및 핵 성분을 가용화시킴으로써 수행될 수 있다. 비이온성 세정제 또는 계면활성제의 예를 이로써 제한되지는 않지만, 트리톤 시리즈(구입원: Rohm and Haas of Philadelphia, Pa.)를 포함하는데, Triton X-100, TritonN-101, TritonX-114, Triton X-405, Triton X-705, 및 Triton DF-16을 포함하는 다수의 판매자들에게서 입수용이하고; 트윈 시리즈, 예를 들어 모노라우레이(Tween 20), 모노팔미테이트(Tween 40), 모노올레에이트(Tween80), 및 폴리옥세틸렌-23-라우릴 에테르 (Brij. 35), 폴리옥시에틸렌 에테르W-1 (Polyox),등, 나트륨 콜레이트, 데옥시콜레이트, CHAPS, 사포닌, n-데실 베타-D- 글루코푸ㅏ라노사이드, n-헵틸 베타-D 글루코피라노사이드, n-옥틸 알파-D-글루코피라노시나스 및 Nonidet P-40가 포함된다.
당업자는 전술한 분류에 속하는 화합물에 대한 기재를 이해할 것이고 판매상으로 입수 용이할 수 있으며 문헌에 기술되어 있다[참조:"Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents", McCutcheon's, Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co. , Glen Rock, N. J. , U. S. A. and Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem. R. , Hoechst Celanese Corp.,1987]. 한 바람직한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤 시리즈, 바람직하게는 Triton X-100이다.
비이온성 계면활성제 농도는 탈세포화되는 생체구조물 유형에 따라 변할 수 있다. 예를 들면 섬세한 조직의 경우, 예를 들어 혈관에서는 계면활성제 농도는 감소되어야 한다. 비이온성 계면활성제의 바람직한 범위는 약 0.001 내지 약 2.0% (w/v)이다. 더 바람직하게는, 약 0.05 내지 약 1.0% (w/v)이다. 더욱더 바람직하게는 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.8% (w/v)이다. 이들 범주의 바람직한 농도는 약 0.001 내지 약 0.2% (w/v)이고 특히 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.1% (w/v)이다.
밀집 세포질성 필라멘트 네트워크, 세포간 복합체 및 첨단 미세세포 구조를 포함하는 세포 골격 성분은 알칼리 용액, 에를 들어 수산화암모늄을 사용하여 가용화시킬 수 있다. 암모늄 염 또는 이의 유도체로 이루어진 기타 알칼리 용액을 또한 사용하여 세포 골격 성분을 가용화할 수 있다. 기타 적합한 암모늄 용액은 황산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 수산화암모늄을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 수산화암모늄이 사용된다. 한 실시양태에서, 온화한 염기는 수산화물 또는 비수산화물 염기이다. 비수산화물 염기의 비제한적 예는 암모늄 또는 나트륨 염, 또는 이의 유도체, 아세테이트, 벤조에이트, 프로피오네이트 및 페녹사이드를 포함한다. 수산화물 염기의 비제한적 예는 수산화암모늄, 트리메틸암모늄 하이드록사이드, 트리에탄올암모늄 하이드록사이드, 모노에탄올아민암모늄 하이드록사이드 및 벤질암모늄 하이드록사이드를 포함한다.
알칼리 용액, 예를 들어 수산화 암모늄의 농도는 탈세포화된 생체구조물 에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어 섬세한 조직의 경우, 예를 들어 나팔관의 경우, 그 농도가 감소할 것이다. 바람직한 농도는 약 0.001 내지 약 2.0% (w/v). 더 바람직하게는 약 0.005 내지 약 0.1% (w/v)이다. 더더욱 바람직하게는 약 0.01% (w/v)내지 약 0.08% (w/v).
탈세포화된 기관을 당분야에 공지된 어떠한 방법으로 탈수시킬 수 있는데, 예를 들어 베이킹, 동결건조이다. 탈세포화된 기관은 탈수동안 성분 위에 탑재될 수 있다.
탈세포화된, 탈수된 구조물을 적합한 온도에서 사용해 필요한 적합한 온도로 저장할 수 있다. 탈세포화된 구조물은 적합한 완충액 또는 세포 배양 배지에서 평형화될 수 있다. 적합한 완충액은 이로써 제한되지는 않지만 인산염완충액염수, p(PBS), 염수, MOPS, HEPES, 한스 균등 염 용액 등을 포함하다. 적합한 세포 배양 배지는 이로써 제한되지는 않지만, RPMI 1640, 피셔, 이스코브, 맥코이, 둘벡코 매질 등이다.
III. 세포 배양
조직 공학은 문제가 있는 국부 조직이 존재하는 과제가 되는 경우를 위한 용액을 제공할 수 있다. 원형적으로 정상인 자가 유도된 세포로부터 실험실에서 미리 작제한 기관의 성공적인 작제는 정상 기능 발생을 초래할 수 있다. 실시예 2 및 3에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 생체내에서 배양된 질 세포를 사용하여 생체내에서 재건된 생존 가능한 질 조직을 작제할 수 있는 것을 입증하였다.
본 발명은 여성 기관 재건술을 위한 조성물 및 방법을 기재한다. 일반적으로 본 발명은 두 개 이상의 상이한 세포 집단을 포함하는 다층 기관을 특징으로 한다. 기관 작제물은 제1 세포 집단으로부터 유도된 배양된 제1 세포 집단, 및 제1 세포 집단과는 상이한 제2 세포 집단으로부터 유도된 배양된 제2 세포 집단을 포함하며, 여기서 제2 세포 집단이 제1 군집에 키메라계면에 의해 커플링되어 천연 생물학적 구조물의 기능적 상등물인 작제물을 생성한다.
본 발명은 또한 기관의 형태로 생체적합성 기질을 사용하여 인공 여성 장기를 제조하는 방법에 관한 것인데, 당해 방법은 생체적합성 기질의 한 영역에 제1 배양된 세포 집단으로부터 유도된 세포의 제1 배양된 군집을 작제하고, 여기서 제1 배양된 세포 집단은 생체적합성 기질에 부착되어 있고; 제1 세포 집단과 상이한 제2 세포 집단으로 유도된 제2 세포 집단을 작제하고, 여기서 제2 세포 집단은 키메라계면에 의해 제1 군집에 커플링되어 인공 여성 기관 작제물을 생성한다.
(a) 세포 수확
용이하게 재생할 수 있는 풍부한 조직 공급원의 입수 용이성이 동물 모델 및 조직 공학이 관여되는 임의의 실험실 고안의 성공에 절실한 부분이다. 재건된 인공 여성 생식기관은 동종이형일 수 있으며, 여기서 세포 집단은 대상 자체의 조직으로부터 유도된다. 예를 들어, 질 상피세포는 대상 질로부터 유도되고 생체내에서 배양된다.
재건된 인공 여성 생식기관은 또한 이종일 수 있고, 여기서 세포 집단이 대상과 상이한 포유동물 종으로부터 유도된다. 예를 들면, 상이한 세포는 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 카우, 말, 돼지, 염소 및 양과 같은 포유 동물의 기관으로 부터 유도될 수 있다.
이러한 기관은 적합한 생검 또는 부검시 수득될 수 있다. 시체 기관을 사용하여 내피 세포 및 요소를 제공할 수 있다. 단리된 세포는 바람직하게는 대상의 생검으로부터 수득된 자가 세포이다. 예를 들면, 팔, 아래팔 또는 다리로부터의 골격 근육의 생검, 또는 피하주사된 소량의 리도카인으로 국소마취로 처리하고 배양액에서 영역으로부터의 평활근은 배양액에서 팽창시킨다. 생검은 생검침을 사용하여 수득할 수 있는데 급속한 작용침이 그 절차를 신속하고 단순하게 한다. 이어서 근육 또는 평활근의 작은 생검 코어를 팽창시키고 실시예에 기재된 바와 가티 배양한다. 동일종으로부터의 상대적 또는 기타 공여자로부터의 세포는 또한 적합한 면역억제와 함께 사용될 수 있다
자궁내막 세포 자궁 생검 또는 표본 적제술로부터 수득될 수 있다. 생검을 수송 배지 DMEM/F-12 (듈베코 변형된 이들 배지와 햄스 F-12 영양 배지)에 즉시 옮겨야 한다. 직경 2 cm 초과의 생검을 이 배지에 3일 동안 4 ℃에서 가시적으로 유지시킨다. 실시예 부분에서, 뉴질랜드 백색 래빗은 조직의 수확중에 우수한 노출을 가능케하는 단순한 중심선 횡복막 방법을 사용하여 수확될 수 있는 탁월한 질 조직 공급원인 것으로 나타났다. 래빗의 질은 충분한 크기 및 둘레이어서 각 절차에서 탁월한 조직 수율을 가능케한다. 수확된 견본을 멸균 배양 배지중에서 실험실로 이송하고, 여기서 개별적인 조직층 분리 공정이 개시된다.
(b) 세포 단리 및 배양
세포의 단리 및 배양 방법은 본원에 참조문헌으로 인용한 문헌[Methods for the isolation and culture of cells are discussedby Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed. , A. R. Liss,Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp.107B126 and Fauza et al. (1998) J. Ped. Surg. 33,7-12]에 논의되어 있다. 세포는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 단리시킬 수 있다. 예를 들어 조직 또는 기관을 기계적으로 분리하고/하거나 소화 효소 및/또는 킬레이트제로 처리하는데 이는 이웃 세포사이의 결합력을 약화시켜 조직이 예측될 수 있는 절단 없이도 개별 세포의 현탁액으로 분산가능하도록 한다. 효소적 해리는 조직을 민싱하고 민싱된 조직을 단독 또는 합하여 임의의 수의 소화 효소로 처리함으로써 달성될 수 있다. 이들은 이로써 제한되지는 않지만, 트립신, 키모트립신 콜라게나제, 엘라스타제 및/또는 히알루로니다제, DNase, 프로나제 및 디스파제를 포함한다. 기계적 파열은 또한 다수의 방법으로 달성될 수 있는데 이로써 제한되지는 않지만 기관 표면의 스크랩핑, 그라인더의 사용, 블렌더, 시브, 균질화제, 가압 셀 또는 인소네이터등을 예시할 수 있다. 조직 분해 기술의 참조용으로는 문헌[Freshney,(1987), Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed. , A. R. Liss,Inc., New York, Ch. 9, pp. 107- 126]이 있다.
바람직한 세포 유형은 이로써 제한되지는 않지만 자궁 상피 세포, 자궁근육층 세포, 질 상피 세포, 경관 상피 세포, 나팔관 상피 세포, 자궁 상피 세포,난소 상피 세포 및 평활근 세포가 포함된다. 바람직한 실시양태에서 사람 질 상피 세포 및 평활근 세포가 단리된다. 다른 실시양태에서, 사람 경관 상피 세포 및 평활근 세포가 단리된다. 다른 실시양태에서, 사람 나팔관 상피 세포 및 평활근 세포가 단리된다. 다른 실시양태에서, 사람난소 상피 세포 및 평활근 세포가 단리된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 사람 자궁 상피 세포 및 자궁근육층 세포가 단리된다.
일단 조직이 개별 세포의 현탁액으로 환원되면, 현탁액은 아군집으로 분획화되고 이로부터 세포 요소가 수득될 수 있다. 이는 또한 세포 분리를 위한 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있고 이로써 제한되지는 않지만, 특이 세포 유형의 클로닝 및 선택, 목적하지 않는 세포의 선택적 파괴(네거티브 선택), 혼합 군집의 분화 세포 피응집성을 기본으로한 분리, 동결 해동 과정, 혼합 군집의 분화 부착 특성, 여과, 통상 및 구역 원심분리, 원심분리성 현탁분리(역류 원심분리), 단위 중력 분리, 항류 분배, 전기영동 및 형광성-활성화된 세포 분리를 포함한다[참조예: Freshney, (1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d., A.R. Liss, Inc., New York, Ch. 11 and 12, pp. 137-168]. 예를 들어, 내피세포는 형광성 활성 세포 분리에 위해 풍부해질 수 있다.
(c) 세포 팽창
단리된 세포를 시험관내에서 배양시켜 3차원 스캐펄드로의 주입에 사용가능한 세포수를 증가시킬 수 있다. 동종이형 세포, 바람직하게는 자가 세포의 사용이 조직 거부 예방차원에서 바람직하다. 그러나, 재건된 인공 기관의 이식후 면역학적 반응이 대상에서 일어날 경우, 대상은 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린 또는 FK506으로 처리하여 거부의 가능성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서 키메라세포 또는 트렌스제닉 동물로부터의 세포가 3차원 스캐펄드로 관류될 수 있다.
단리된 세포를 유전 물질로 피복하기 전에 형질감염시킬 수 있다. 유용한 유전 물질은 예를 들면 숙주에서 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있는 유전자 서열일 수 있다. 예를 들면, 클래스 I 및 클래스 II 조직적합성 항원과 같은 세포 표면 항원의 발현을 억제할 수 있다. 이는 이식된 세포가 숙주에 의해 거부 기회가 감소될 수 있게 해 준다. 또한 형질감염은 유전자 전달에 사용될 수 있다. 질 상피 세포를 3차원 스캐펄드로 주입하기 전에 특히 유전자로 형질전환시킬 수 있다. 인공 재건 기관은 숙주의 장기 생존을 위해 요구되는 유전 정보 또는 재건된 인공 기관의 정보를 함유할 수 있다.
생체적합성 매트릭스에서 성장된 여성 생식로 세포를 유전공학적으로, 이식에 유익한 유전자 생성물을 제조할 수 있는데, 예를 들면 소염 인자, 예를 들어 안티-GM-CSF, 안티-TNT, 안티-IL-1 및 안티 IL-2이다. 또는, 내피세포를 염증을 촉진시키는 본래 유전자 생성물의 "넉 아웃" 으로 유전 공학적으로 발현시킬 수 있는데, 예를 들면 GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2 또는 MHC의 "넉 아웃" 발현으로 거부의 위험을 저하시킨다. 또한, 내피 세포를 유전자 요법에 사용하여 조직 이식의 결과를 보조하거나 개선시키도록 환자의 유전자 활성 수준을 조정하는데 유전공학적으로 사용할 수 있다.
레트로바이러스 벡터, 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 세포의 유전공학적 방법 또는 당업자에게 공지된 기타 방법이 사용될 수 있다. 이들은 세포내에 핵산 분자를 이송하고 발현하는 발현 벡터를 사용함을 포함한다[참조: Geoddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)].
벡터 DNA는 통상의 형질전환 또는 형질감염 방법으로 원핵 또는 진핵 세포로 도입된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 적합한 방법은 문헌[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989), and other laboratory textbooks]에 기재되어 있다.
3차원 스캐펄드에서의 세포 성장은 3차원 스캐펄드에 단백질(예; 콜라겐, 탄성 섬유, 망섬유) 당단백질, 당아미노글리칸(예; 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 등), 세포상 기질 및/또는 기타 물질을 가하거나 피복함으로써 향상시킬 수 있다.
여성 생식로 세포의 관류 또는 층화후에, 3차원 스캐펄드는 적합한 영양 배지에 항온처리해야 한다. 다수의 시판용 배지[예를 들어 RPMI 1640, 피셔, 이스코브, 맥코이, 듈베코 배지 등]이 사용에 적합할 수 있다. 배양배지는 또한 주기적으로 변화시켜 사용된 배지를 제거하고 방출된 세포를 탈군집화하고 새로운 배지를 가해야 한다. 여성 생식로 세포를 여성 생식로 조직이 발생되는 단계로 성장시켜야 하는 것이 중요하다.
성장 인자 및 조절 인자를 배지에 가하여 배양물내의 증식, 세포 성숙 및 분화를 향상, 변경 또는 조정할 수 있다. 배양물내의 세포 성장 및 활성은 여러가지 성장 인자, 예를 들어 인슐린, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜러니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 내피성장인자, 헤파틱 에리트로포이에틱 인자(헤파토포이에틴) 및 간 세포 성장 인자에 의해 영향받을 수 있다. 증식 및/또는 분화를 조정하는 다른 인자는 프로그타글라딘, 인터루킨 및 천연 칼론을 포함한다.
본 발명에 따라서 생체적합성 기질에서 성장한 세포는 다층에서 자라고, 생체내에서 발견되는 생리 조건과 유사한 세포 기질을 형성한다. 여성 생식 조직의 하나이상의 층을 갖는 3차원 스캐펄드는 세포의 상이한 유형의 증식 및 다수의 다른 상이한 조직의 형성을 지지할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나의 세포 집단이 내피세포 집단일 수 있다. 혈관신생은 새로운 혈관 발생과정이고 예를 들어 배란, 월경, 태반 발행과 같은 여성의 생식 주기에 중요한 역할을 한다. 내피 세포 집단을 사용하여 혈관신행을 자극할 수 있다.
인공 재건된 여성 생식기관을 생체내에서 이식 또는 착상에 사용할 경우 여성 생식세포, 예를 들어 질 상피 세포 및 평활근 세포를 이식을 받고자하는 개인으로부터 얻는 것이 바람직할 것이다. 이러한 방법은 마찬가지로 이식 및/또는 이식편의 면역학적 거부 대 숙주 질환이 있는 겅우에 특히 유리할 수 있다.
일단 생체적합성 기질로 관류되면, 여성 생식 세포는 기질상에서 증식하고 발생하여 여성 생식 세포층을 형성시킨다 시험관내 배양중에, 여성 생식 세포는 발생하고 분화하여 여성 생식 조직층을 생성하고 이것이 다른 세포 성장을 지지할 수 있고 생체내에서 유사 구조를 갖는 형태학의 구조물을 생성한다. 생성된 여성 생식 조직의 생리는 정상 여성 생식 조직의 것과 유사하다. 예를 들면, 인공 여성 기관은 호르몬에 반응한다.
사춘기에, 시상하부는 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)의 방출을 증가시킨다. 이어서 뇌하수체 전엽은 고나트로핀, 난포 자극 호르몬 (FSH) 및 황체형성 호르몬(LH)을 생성하는데, 이는 GnRH 및 난소 호르몬 에스트로겐 및 프로게스테론에 의해 조절된다. FSH는 난포의 발생을 자극한다. LH 상승은 배란의 원인이 된다. 이들 고나트로판은 성호르몬인 에스트로겐 및 프로게스틴 생성을 자극한다. 생식샘자극호르문 및 난소 호르몬의 상호작용은 생식 주기를 조절한다. 황체 형성 호르몬(LH)의 갑작스런 증가는 성숙 난포가 충란을 방출하게 한다. 난자의 발생에 이어서, 파손된 난소 난포가 황체로 발생하고, 이어서 에스트로겐과 프로게스테론을 분비한다. 이들 난소 호르몬은 자궁내막 내층을 유지하는데 중요하고 여기서 주모니배가 그 자체를 이식한다. 한 실시양태에서, 인공 여성 생식기관은 호르몬에 반응할 수 있는 인공 자궁이다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 성 호르몬인, 예를 들어 에스트로겐과 프로게스테론에 반응하고 이를 생성한다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 호르몬 조절된 주기가 가능할 수 있는데, 예를 들어 자궁이 수정된 배아를 수용할 준비를 하고 있는 경우 자궁내막 내층을 만들고 제거한다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 주머니배 착상을 가능케하고 성장하는 태아를 지지할 수 있다. 인공 자궁은 자가 대상에게 이식될 수 있다. 예를 들면 세포를 동일 대상으로부터 배양하고 여기에 인공 여성 기관을 이식한다. 다른 실시양태에서, 인공 자궁은 동종 대상 체외에서 태아의 성장을 지지하는데 사용할 수 있다.
따라서, 인공 자궁은 생체내에서 성장 태아를 지지할 수 있다. 또는 인공 자궁은 이종 대상에게 이식될 수도 있다
다른 실시양태에서, 인공 질은 호르몬 및 정상 질에 유사한 감각 자극에 반응한다. 인공 질의 세포는 점액을 생성할 수 있다. 인공 질은 호르몬 반응성이 상피이다. 에스트로겐는 질 상피의 증식 및 성숙을 자극하는 반면, 프로게스테론은 상피의 성숙을 억제한다. 인공 질은 수축할 수 있다
다른 실시양태에서, 인공 나팔관은 정상 나팔관의 생리와 유사하다. 인공 나팔관은 호르몬에 반응하고 연동운동을 한다. 인공 나팔관은 난소로부터 자궁으로 난자를 이송할 수 있고 정자에 의한 난자의 수정 부위일 수 있다.
배지에서, 생체내에서 발견되는 세포 미세환경을 배지에 재생성시키는 것은 중요한테 그 이유는 특이 여성 생식기관이 재건되기 때문이다. 여성 생식 세포가 생체내에서 사용전에 성장하는 정도는 여성 생식기관이 재건되는 유형에 따라 달라 질 것이다.
한 실시양태에서, 3차원 스캐펄드는 배양된 여성 생식로, 예를 들어 질 상피 세포를 관류하기 전에 예를 들면 콜라겐으로 예비처리될 수 있는데 이들 여성 생식로의 3차원 스캐펄드의 부착력을 향상시키기 위해서이다. 다른 실시양태에서, 영양성분, 성장 인자, 시토킨, 세포외 기질 성분, 분화 유도자, 분비 생성물, 면역조정자, 세포상 네트워크나 신경섬유의 성장을 향상시키거나 가능케하는 생물학적 활성 화합물로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 인자를 스캐펄드 또는 여성 생식 세포에 가할 수 있다.
배양된 여성 생식로 세포를 생체적합성 기질에 3차원 스캐펄드에 국부적으로 위치한 침을 사용하여 관류하거나 스캐펄드에 층상화한다. 여성 생식로 세포는 이들을 3차원 스캐펄드속에 넣거나 그 위에 놓기 전에 시험관내에서 배양함으로써 목적하는 밀도로 확장될 수 있다, 실시예 2 및 3은 본 발명을 사용하여 생체내에서 재건된 질 조직을 작제하는 방법을 실연한다.
실시예 5 및 6은 본 발명을 사용하여 생체내에서 재건된 자궁을 작제하는 방법을 실연한다. 배양된 상피 및 평활근 세로 유형은 정상 표현형 발현을 유지하고 조직 대치에 적용될 만한 큰 저장형 세포로 전파된다. 세포 시딩된 중합체 스캐펄드는 표현형과 기능성이 천연 질과 자궁에 유사한 혈관신생 질 및 자궁 조직을 형성한다. 본 발명을 사용하여 혈관신생 인공 질, 자궁, 나팔관 및 경관 조직을 임상적 적용에 사용할 수 있다.
(d) 조직공학적 및 세포 배양
당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 조직을 가공하고 배양할 수 있다. 바람직한 양태에서, 에틸렌디아멘테트라아세트산(EDTA)를 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)로 수회 세척한다. 표본을 미세절개 과정을 개시할때까지 배양 배지의 세정된 저장고에 위치시킬 수 있다.
다양한 시판되는 배양 배지는 상피 및 평활근 세포 성장을 위해 유용하다. 바람직한 양태에서, 10% 태아 소 혈청(DMEM/FBS)이 보충된 듈베코 변형 이글 배지를 평활근 세포용으로 사용하고 질 상피 세포(각질형성 세포)는 소 전립선 추출물 및 상피 성장 인자(K-SFM)이 보충된 케라티노사이트에 특이적인 무혈청 배지에서 배양한다.
효소 분해 및 기계적 용해를 기본으로하는 방법을 포함하는 여러 기술을 사용하여 상피 세포, 예를 들어, 자궁내막 세포의 분리 및 배양을 성취할 수 있다[참조: Watson et al. J. Reprod. Fertil. 101(2):415-20(1994); Akoum et al. J. Reprod. Med. 41(8):551-561(1996); Barberini et al. Cell Tissue Res. 190(2):207-222(1978); Bentin-Ley et al. J. Reprod. Fertil. 101(2):327-332(1994)]. 세포가 실질적으로 단일 세포 집단인 균일한 세포 집단을 생성할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상피 및 평활근 세포는 별도로 성장시키고 각각의 세포 유형의 분리는 절편체 방법 또는 효소적 분해로 이루어진 2개의 방법중 하나를 포함한다. 당해 방법에 대한 기재는 본원에 참조로서 전반적으로 인용되는 하기의 문헌에서 발견할 수 있다: Williams et al. Methods Mol. Biol. 5:139-149(1989); Baez, C.E. and Atala, A."Uterus" In : Methods of Tissue Engineering. Academic Press 1189-1194(2002); De Filippo, R.E. and Atala, A. "Epithelial Cell Culture: Vaginal Cell Reconstruction. " In: Methods of Tissue Engineering. Academic Press 273-275(2002).
한 양태에서, 절편체 방법을 사용하여 세포를 분리한다. 절편체 방법은 루프 확대하에 멸균 기구로 미세절개하여 개시하여 상피 및 혈근층을 분리한다. 한 양태에서, 질을 평평 절편으로 탈관시켜 절개를 용이하게 한다. 소분획의 조직을 각각 배양 접시상에 놓고 이들을 건조시키고 표면에 부착시킨다. 조직 단편들을 충분한 콜로니의 선조체 세포가 조직 섬으로부터 발육할때까지(이것은 보통 약 5지 7일 소요한다) 공기중 37℃에서 및 방해받지 않은 5% CO2에서 적당한 배지로 배양한다. 절편체를 약간의 흡입으로 제거할 수 있고 세포를 스케줄된 배지를 대체하여 유지시킨다.
또 다른 양태에서, 효소 분해를 사용하여 세포를 분리한다. 배양된 암컷 생식기 세포는 세포 공급원으로서 작용하는 적당한 기관 또는 조직을 붕괴시켜 용이하게 분리할 수 있다. 이것은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 성취할 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 기관은 기계적으로 및/또는 분해 효소로 처리하고/하거나 인접한 세포 사이의 연결을 약화시켜 조직이 감지할만한 세포 파괴 없이 각각의 세포 현탁액으로 분산될 수 있게 하는 킬레이팅 제제로 처리하여 분리될 수 있다. 효소적 분해는 조직을 절단하고 절단된 조직을 다수의 분해 효소 단독 또는 배합물로 처리하여 성취할 수 있다. 이들은 트립신, 키모트립신, 콜라겐아제, 엘라스타제 및/또는 하이알루로니다제, DNase, 프로나제 및 디스파제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기계적 붕괴는 또한, 몇몇 거론될 수 있는 분쇄기, 혼합기, 체, 파쇄기, 가압 셀, 또는 절단기의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 방법에 의해 성취될 수 있다[참조: Freshney, (1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, Ch. 9, pp. 107-126].
한 양태에서, 효소 분해 방법은 상피 세포의 가공 및 배양을 위해 적용되었다. 때때로 상피 세포의 배양조건이 까다로운 성질은 대량으로의 성장을 어렵게 한다. 그러나, 증대된 콜로니 크기의 성공은 효소적 분해가 가능하게 하였다. 바람직한 양태에서, 콜라렌아제 IV형 및 디스파제, 중성 프로테아제의 분말 형태를 배합하고 K-SFM으로 현탁시킨다. 당해 콜라겐아제 배지 용액을 이어서 여과하여 확실히 멸균시킨다. 질, 자궁, 경부 또는 나팔관 표본을 여러 큰 조각으로 절단하고 효소 용액에 침지시키고 왕성하게 진탕시킨다. 약간의 피펫 흡입과 함께 세포 유체 현탁액을 또 다른 멸균 튜브로 이동시키고 저회전으로 원심분리한다. 최종적으로 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 배지에 현탁시키고 배양 접시에 분배한다.
(e) 세포 확장
당해 기술 분야에 널리 공지된 세포 확장의 방법을 사용할 수 있다. 한 양태에서, 세포의 계대는 먼저 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS-EDTA로 세척하여 수행한다. 당해 세포를 트립신 EDTA 용액으로 항온처리하고 세포 분리가 관찰될때까지 현미경하에 모니터한다. 약한 피펫 흡입을 사용하여 세포 트립신 용액을 혈청 함유 배지를 함유한 멸균 튜브로 이동시켜 트립신을 불활성화시킨다. 세포를 저회전으로 원심분리한다. 세포 펠렛을 미리 결정된 용적으로 신선한 배지로 재현탁시키고 확장을 위해 여러 배양 접시중에 균등하게 분주한다.
IV. 세포 특징
조직을 각각의 세포 현탁액으로 감소시킨 후, 현탁액을 암컷 생식기 세포가 수득될 수 있는 서브집단으로 분획할 수 있다. 각각의 세포 집단이 실질적으로 동일한 세포, 예를 들어, 질 상피 세포 집단을 포함하는 균일한 세포 집단을 수득할 수 있다. 이것은 또한 특정 세포 유형의 클로닝 및 선별, 원치 않는 세포의 선택적 파괴(네가티브 선택), 혼성 집단에서 차등 세포 응집력을 기초한 분리, 동결 해동 과정, 혼합 집단에서 차등 부착 성질, 여과, 통상적이고 국부적인 원심분리, 원심분리 용출(역류 원심분리), 유니트 중력 분리, 역류 분배, 전기영동 및 형광 활성화된 세포 분류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 분리를 위한 표준 기술을 사용하여 성취할 수 있다[참조: Freshney,(1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, Ch.11 and 12, pp. 137B168]. 예를 들어, 평활근 세포는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 집적될 수 있고 상피 세포는 평활근 세포 수거를 위해 감소될 수 있다.
특이적 차등 마커를 사용하여 세포의 특징을 밝힐 수 있다. 자궁내막 상피 마커는 케라틴 중간체 필라멘트, 세포질내 글리코겐, 프로게스테론 수용체 및 에스트로겐 수용체를 포함한다[참조: Centola et al. In Vitro 20(6):451-4612(1984); Cooke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(7): 2109-2113(1986); Johnson et al. Biol. Reprod. 61(5): 1324-1330(1999); Kirl et al. 14(8): 651-662(1978); Merviel et al. Biol. Cell. 53(3): 636-646(1995); Osteen et al. Fertil. Steril. 52(6):965-972(1989); Schatz et al. Biol. Reprod. 62(3): 691-697(200)]. 사이토케라틴 중간체 필라멘트(Bongo et al. Hum. Reprod. 3(6):705-713(1988); Classen-Linke et al. Cell Tissue Res. 287(1)171-185(1997); Gerschenson et al. Pathol. Res. Pract. 174(3):285-296(1982)]가 가장 일반적으로 특징의 분석을 위해 사용된다.
바람직한 양태에서, 세포의 특징은 세포 특이적 항체를 사용하여 밝힐 수 있다. 이것은 세포를 챔버 슬라이드상에 전달하고 배양하고 4% 완충 포름알데하이드로 고정하고 가공하여 수행될 수 있다. 당해 세포는 세포 표면에 적용된 항원 특이적 1차 항체에 노출될 수 있다. 세포 특이적 항체의 비제한적인 예는 광범위하게 반응하는 항-사이토케라틴 및 항평활근 α-액틴 항체이다. 네가티브 대조군은 1차 항체 대신 혈성으로 처리할 수 있다. 포지티브 대조군은 항원 노출된 세포로 이루어진다. 인산 완충된 식염수로 세척한 후에, 챔버 슬라이드를 비오티닐화된 2차 항체로 항온처리하고 다시 세척한다. 퍼옥시다제 시약을 첨가할 수 있고 기질 첨가 즉시, 항체 침적 부위는 갈색 침전물로서 가시화된다. 대비 염색은 길의 헤모톡실린으로 수행할 수 있다.
당해 기술 분야에 널리 공지된 임의의 유형의 분자적 특징을 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 목적하는 영역에 항체를 적용하여 분자학적 수준에서 세포의 특징을 밝힐 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체 α-액틴, 미오신 및 사이토케라틴 AE1/AE3을 사용하여 시험관내에서 배양된 세포와 대조군의 단백질 발현을 비교하여 상피 및 평활근 세포주의 유지를 확인할 수 있다. 세포를 냉 용해 완충액중에서 파쇄시킬 수 있고 가용성 단백질 상등액을 수거한다. 당해 기술 분야에 공지된 단백질 정량 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이오래드 DC 단백질 분석 키트를 단백질 샘플의 정량을 위해 사용할 수 있다. 동등한 농도의 단백질을 로딩할 수 있고 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 탐침한다. 퍼옥사이드-접합된 항-마우스 2차 항체를 복합체화하고 증진된 화학발광 시스템을 사용하여 검출한다. 폴리머라제 연쇄 반응을 또한 동시에 세포 유형의 추가의 정성분석을 위해 수행할 수 있다.
V. 다층
a. 탈세포화된 구조상의 다층 형성
한 양태에서, 상이한 배양된 세포 집단을 사용하여 생체적합성 매트릭스 또는 탈세포화된 구조, 예를 들어, 탈세포화된 기관 또는 기관의 일부상에서 상이한 다층을 생성시킬 수 있다. 제1 균일한 세포 현탁액을 탈세포화된 기관의 3차원 하부 구조의 국부 위치내에 함침되는 바늘을 사용하여 탈세포화된 구조에 관류시킨다. 관류된 세포는 하부구조의 3차원 간질사이에 분포하고 성장하여 하부구조를 봉쇄하는 세포 층을 생성시킨다. 제1 균일한 세포 현탁액의 관류 후에, 탈세포화된 기관을, 세포가 발육하고 증식하여 탈세포화된 기관의 하부구조에 부착된 제1 집단된 배양된 세포의 단층을 생성할때까지 37℃에서 배양 배지에서 배양한다. 일단 단층이 확립되면, 제1 균일한 세포 현탁액을 단층상에 탈세포화된 구조에 다시 관류시킨다. 세포가 발육하고 증식하여 제1 단층상에 세포의 제2 단층을 생성하여 2층을 생성할때까지 탈세포화된 기관을 배양한다. 제1 균일한 세포 집단의 다층이 생성될때까지 당해 과정을 반복한다.
제1 다층은 생체내 기관의 등가의 실질 조직의 기능적 특징 및 형태와 유사하다. 예를 들어, 탈세포화된 자궁과 함께, 제1 세포 집단은 평활근 세포 집단이다. 평활근 세포 현탁액을, 자궁, 질, 나팔관 또는 경관의 평활근 조직(즉, 자궁근육층)과 유사한 기능적 특성을 갖는, 평활근 조직의 다층이 형성될때까지 자궁, 질, 나팔관 또는 경관에 관류시킨다.
제1 다층을 형성한 후, 제2 다층을, 제1 세포 집단과 상이한 제2 배양된 세포 집단을 사용하여 형성한다. 제2 균일한 세포 집단의 세포 현탁액을 탈세포화된 기관내 제1 다층상에 관류시킨다. 관류된 세포는 제1 다층을 따라 분포하고 탈세포화된 기관은 제2 세포 집단의 세포가 제1 단층으로 발육하고 증식할때까지 배양한다. 제1 단층이 확립된 즉시, 제2 균일한 세포 집단을 다시 제1 단층에 대한 탈세포화된 구조에 관류시킨다. 탈세포화된 기관은 세포가 발육하고 증식하여 제1 단층상에 제2 단층을 생성하여 2층을 형성할때까지 배양한다. 당해 과정은 제2 균일한 세포 집단의 제2 다층이 생성될때까지 반복한다.
제2 다층은 생체내 기관의 등가의 실질 조직의 기능적 및 형태학적 특성과 유사하다. 예를 들어, 자궁, 질, 나팔관 또는 경관에 대한 제2 다층은 자궁, 질, 나팔관 또는 경관의 상피 조직(즉, 점막)의 형태학적 및 기능적 특성과 유사한 상피 다층이다.
당업자는, 다수의 이종성 다층이 생성되어 인공 암컷 생식 기관을 형성할 수 있음을 인지할 것이다. 각각의 다층은 다중층의 균일한 세포 집단을 포함하지만 다층의 세포 집단은 상이하다. 한 양태에서, 인공 기관은 약 5개 이상의 다층을 포함한다. 또 다른 양태에서, 인공 기관은 약 4개 이상의 다층을 포함한다. 또 다른 양태에서, 인공기관은 약 3개 이상의 다층을 포함한다. 바람직한 양태에서, 인공 기관은 2개 이상의 다층을 포함한다.
2개 이상의 이종성 다층이 서로 상호 접촉하게 되는 키메라계면이 생성된다. 이것은 다층 세포 사이에 일어나는 상호작용을 방해하지 않을 수 있다. 상이한 세포 집단간의 광범위한 상호작용은 각각의 다층과 상이한 간질 생물질을 생성한다. 2개의 상이한 세포 집단간의 상호작용은 생체적합성 기재(예를 들어, 중합체)와 같은 구조 차단벽에 의해 방해받지 않고 키메라계면에서의 세포는 보다 천연의 형태 및 배향과 유사하다. 생체내 기관의 미소환경에 보다 순응하는 키메라계면에 미소환경을 제공함에 의해 키메라계면의 세포는 보다 천연적으로 발육하고 정상적인 분열 및 분화를 촉진하는 성장 인자 및 기타 단백질을 생성한다. 이것은 특유의 생물학적 및 기능적 성질을 제공하여 생체내에서 발견되는 것들과 보다 상당히 유사한 인공 조직을 제조하는 간질 생물질의 생성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 인공 자궁, 질, 나팔관 또는 경관의 평활근 다층 및 상피 다층의 상호작용은 시험관내 자궁, 질, 나팔관 및 경관의 점막하와 유사한 세포 층을 생성시키는 키메라계면을 생성시킨다. 점막하는, 점막하가 완전히 발육되는 경우 평활근 세포로의 혈액 공급을 제공한다는 점에서 평활근 세포 및 상피 세포의 것들과 독특한 기능적 특성을 제공한다.
당업자는, 상이한 세포 집단을 포함하는 2개 이상의 이종성 다층이 상호작용하는 경우 생성되는 임의의 간질 생물질이 본 발명의 범위내에 있음을 인지할 것이다. 생성된 상이한 간질 생물질은 이종성 다층내 세포 유형에 의존할 것이다.
한 양태에서, 추가의 콜라겐 층은 탈세포화된 구조의 내면에 첨가되어 문헌[참조: 국제 PCT 공개 번호 제WO95/22301호, 이의 내용은 전반적으로 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 바와 같은 평활근 표면을 생성할 수 있다. 당해 평활근 콜라겐 층은 성장 및 발육을 촉진시키는 세포 부착을 촉진한다. 국제 PCT 공개 번호 제WO95/22301호에 기재된 바와 같이, 당해 평활근 콜라겐 층은 산 추출된 섬유 또는 비섬유 콜라겐(주로 I형 콜라겐이지만 또한 콜라겐 II형, 콜라겐 IV형 또는 둘다를 포함할 수 있다)으로부터 제조될 수 있다. 사용되는 콜라겐은 임의의 수의 포유동물 공급원, 전형적으로, 돼지 및 소 피부 및 건으로부터 유래할 수 있다. 콜라겐은 바람직하게 산 추출에 의해 가공되어 섬유 분산액 또는 고순도의 겔이 수득되었다. 콜라겐은 아세트산, 시트르산 또는 포름산과 같은 약산을 사용하여 콜라겐 공급원으로부터 산 추출될 수 있다. 일단 용액으로 추출되는 즉시, 콜라겐은 NaCl을 사용하여 염 침전될 수 있고 원심분리 또는 여과와 같은 표준 기술을 사용하여 회수될 수 있다. 산 추출된 콜라겐에 대한 세부사항은 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 켐프(Kemp)등에게 허여된 미국 특허 제5,106,949호에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 추가의 콜라겐 층은 이종성 다층 사이에 첨가되어 이종성 다층의 세포 상이에 성장 및 발육을 촉진시킬 수 있다. 여전히 또 다른 양태에서, 영양물, 성장 인자, 사이토킨, 세포외 매트릭스 성분, 분화 유도인자 또는 분비, 면역조절의 생성물, 세포 네트워크 또는 신경 섬유의 성장을 증진시키거나 허용하는 생물학적 활성 화합물과 같은 인자가 이종성 다층사이에 첨가될 수 있다.
b. 중합체 기재상에 다층의 형성
또 다른 양태에서, 상이한 배양된 세포 집단을 사용하여 중합체의 한면상에 이종성 다층을 생성시킬 수 있다. 적합한 중합체의 예는, 콜라겐, 폴리(알파 에스테르)[예를 들어, 폴리(락테이트)산), 폴리(글리콜산), 폴리오르토에스테르 및 폴리언하이드라이드 및 이들의 공중합체), 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 셀룰로스 에스테르, 불소화된 폴리에틸렌, 페놀산, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤족사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌, 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 재생된 셀룰로스, 우레아-포름알데하이드 또는 이들 물질의 공중합체 또는 물리적 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 양태에서, 생체적합성 기재의 한 측면을 사용하여 제1 균일한 세포 집단의 다층을 생성한다. 이것은 생체적합성 기재의 한 측면을 제1 균일한 세포 집단, 예를 들어, 평활근 세포의 현탁액으로 피복시켜 수행한다. 제1 균일한 세포 현탁액은 세포가 발육하고 증식하여 단층을 생성할때까지 배양 배지에서 배양하고 단층의 세포는 생체적합성 기재에 부착된다. 단층이 확립되는 즉시, 제1 균일한 세포 현탁액은 제1 단층상에 침적하고 세포는 이들이 발육하고 증식하여 제1 단층상의 세포의 제2 단층을 생성하여 2층을 생성할때까지 배양한다. 당해 과정은, 제1 균일한 세포 집단의 다중층을 포함하는 다층이 생성될때까지 반복한다. 제1 다층은 생체내 기관의 조직과 유사한 형태적 및 기능적 특징을 갖는다.
제1 다층이 확립된 후, 제2 균일한 세포 집단을 포함하는 제2 다층이 제1 다층상에 생성(예를 들어, 상피 세포 집단)된다. 이것은 2개의 상이한 세포 집단 사이의 키메라계면을 생성시킨다. 제2 다층은, 제2 균일한 세포 집단의 세포 현탁액이 제1 다층상에 침적됨에 의해 생성된다. 제2 균일한 세포 집단의 세포는 이들이 발육하고 증식하여 제1 단층을 생성할때까지 배양한다. 제1 단층이 확립되는 즉시, 제2 균일한 세포 현탁액은 제1 단층상에 침적되고 세포는 이들이 발육하고 증식하여 제1 단층상에 세포의 제2 단층을 생성하여 2층을 생성할때까지 배양한다. 당해 과정은, 제2 균일한 세포 집단의 다중층을 포함하는 제2 다층이 생성될때까지 반복한다. 제2 다층은 생체내 기관, 예를 들어, 점막의 실질 조직과 유사한 형태학적 및 기능적 특징을 갖는다. 간질 생물질은 상기된 바와 같이, 2개의 상이한 세포 집단 사이의 키메라계면에서 생성된다.
한 양태에서, 평활근 세포, 예를 들어, 자궁근육 세포를 다층을 형성하는 생체적합성 매트릭스의 한 측면상에 관류시키고 암컷 재생 내피 세포, 예를 들어, 자궁내막 세포는 제2 다층을 형성하는 생체적합성 매트릭스의 반대 측면상에 관류시킨다. 생체적합성 매트릭스는 점막하를 형성한다. 생체적합성 매트릭스는 생분해될 수 있어 2개의 세포 집단이 키메라계면을 형성할 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명은 고유 생체 기관과 매우 근사하게 유사한 다세포 조직을 갖는 인공 기관을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 세포 조직은 이종성 다층을 포함한다. 인공 암컷 생식 기관의 각각의 다층은 다중층의 균일한 세포 집단을 포함하여 천연 기관의 동일 조직의 고유 생체내 층과 유사한 세포 형태 및 기능적 특징을 갖는 조직 구조를 생성한다.
상이한 다층 사이의 키메라계면은 상이한 세포 집단사이의 천연 미소환경을 모방하는 미소환경을 제공한다. 당업자는 세포 형태가 세포 분열 및 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 인지할 것이다[참조: Darnell et al. Molecular Cell Biology(1986) published by Scientific American Books]. 본 발명의 방법에 의해 생성된 보다 천연의 미소환경은 이종성 다층의 세포간의 상호, 역학적, 방해받지 않은 세포-세포 상호작용을 허용한다. 이들 방해받지 않는 상호작용은 세포 접지면에서 세포가 보다 천연의 세포 및 형태학적 배위를 개시할 수 있다. 키메라계면에서 보다 천연의 세포 발육은 세포가 정상적인 분열 및 분화를 촉진하는 단백질을 생산할 수 있도록 한다.
V. 생체내 이식
암컷 재생 인공 기관의 이식은 당해 기술분야에서 인지된 방법에 따라 수행할 수 있다[참조: Fauza et al.(1998) J. Ped. Surg. 33:7-12]. 예를 들어, 인공 암컷 기관은 질내로, 골반으로, 수술적으로 또는 상치골 영역, 복부 또는 직장을 통해 이식될 수 있다.
한 양태에서, 인공 자궁은 나팔관 및 질로 봉합된다. 나팔관은 상부 구석에 자궁으로 도입되고 하부의 좁은 부분, 경관은 질내로 도입한다. 정상적인 자궁은 약간 정배향이고 요도 방광 뒤에 있다. 바람직한 양태에서, 천연 자궁의 각 말단에서 소 절편은 인공 자궁이 천연 자궁의 남아있는 부분에 봉합될 수 있도록 그대로 방치한다. 한 양태에서, 천연 자궁의 10% 이상이 각 측면에 유지되어 인공 자궁은 남아있는 천연 자궁 구조에 봉합될 수 있다. 또 다른 양태에서, 인공 자궁은 자궁천골 인대에 봉합되어 경관은 측면부에 부착되고 질 및 자궁의 세포축 사이의 90°각이 유지된다.
또 다른 양태에서, 인공 질은 자궁으로 봉합한다. 또 다른 양태에서, 인공 질은 후반 골반 벽에서 경부로 연장하는 기본 또는 횡단 경부 인대에 봉합된다. 기본 인대로의 봉합은 경부 및 질의 원개의 중선 위치를 안정화시킨다.
또 다른 양태에서, 인공 나팔관은 자궁 및 난소로 봉합된다. 인공 나팔관은 자궁의 꼬리 말단으로 한 측면상에 봉합되고 또 다른 측면에서 난소 근처에 봉합된다.
또 다른 양태에서, 인공 난소는 자궁으로 봉합된다. 또 다른 양태에서, 인공 난소는 자궁의 광범위한 인대의 후반 복강 층으로 부착하는 복강 인대, 난소간막에 봉합된다.
VI. 인공 암컷 생식 기관의 용도
본 발명의 인공 암컷 생식 기관은 다양한 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 제구성된 인공 암컷 생식 기관은 대상체에 이식될 수 있다. 본 발명에 따른 이식체를 사용하여 기존의 조직을 대체하고 증대시켜 선천성 질 이상증 및 배설 기형을 앓는 대상체를 치료할 수 있다. 예를 들어, 부재 또는 일방 부재의 난소 구조, 부재의 나팔관 및 질 폐쇄와 같은 이상증을 앓는 대상체는 본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있다. 추가로, 암을 앓는 대상체는 이들의 기관이 전이를 방해하기 위해 대체되도록 선택할 수 있다. 대상체는 이어서 이상증의 개선을 위해 모니터될 수 있다.
본 발명의 방법 및 구성은 다양한 또 다른 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 자궁적출술은 현재 섬유종, 자궁내막증 또는 만성 골반 통증, 출혈 문제, 자궁탈 뿐만 아니라 자궁암, 난소암 또는 경부암을 포함하는 다양한 장애의 치료를 위해 사용된다. 자궁을 수술적으로 제거하는 자궁적출술은 2가지 유형으로 일어날 수 있다: 자궁 및 경부가 제거되는 총(완전한) 또는 자궁이 제거되는 반면 경부가 잔류하는 총 이하(경부 초과). 몇몇 경우에, 난소 또는 나팔관은 또한 제거된다, 한 양태에서, 인공 암컷 기관, 조직 또는 이의 절편은 제거된 기관을 대체하기 위해 환자에게 이식될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 불임을 감소시킬 수 있다. 암컷의 불임은 다낭성 난소 증후군(PCOS), 다낭성 난소, 난자생성불능, 무배란, 자궁내막증, 나팔관의 차단, 자궁의 상처 및 충분한 양 또는 충분한 질의 경부 점막을 생성 능력 부재를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 상이한 문제점에 의해 유발될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 호르몬 수준을 조절할 수 있다. FSH(난포 자극 호르몬)는 암컷의 배란을 자극할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상처 받은 암컷 생식 기관은 기능성 인공 기관으로 대체될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 생체적합성 매트릭스를 제공하고 제1 세포 집단을 또는 생체적합성 매트릭스상에 관류시킴을 포함하는 대상체의 불임을 감소시키는 방법을 제공하고, 이때 제1 세포 집단은 실질적으로 자궁 상피 세포 집단이고 제1 세포 집단과 상이한 세포 유형의 제2 세포 집단을 관류시키고 생체적합성 매트릭스에서 세포 집단을 배양하여 인공 자궁이 형성되고 인공 자궁내 수정된 난자를 침적시키고 대상체내 인공 자궁을 이식함으로써 대상체내 인공 자궁을 생성시킴으로써 인공 자궁은 침적된 수정된 난자의 성장을 지지한다.
자궁 외부에 자궁 내막 조직의 존재, 즉 자궁내막증은 난소 또는 나팔관이 관여하는 경우, 특히 암컷의 불임의 원인일 수 있다. 이러한 불임은 난자가 자궁으로 들어가는 것을 방해하는 나팔관을 형성하고 차단할 수 있는 상처 조직으로 인한 것일 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 암컷 생식 조직, 기관 또는 이의 절편을 재성장시키고 수정능력을 회복한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 예를 들어, 인공 나팔관을 제조하기 위해 사용될 수 있어 대상체는 효과적으로 배란할 수 있다. 또 다른 양태에서, 인공 자궁을 제조하여 태아 성장을 지지할 수 있다. 한 양태에서, 수정된 난자는 시험관내 또는 생체내에서 인공 나팔관으로 이식할 수 있다.
여전히 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 배아의 시험관내 배양을 개선시킬 수 있다. 시험관내 수정 배양 조건이 불완전하기 때문에 단지 약 20 내지 40%의 사람 배아가 배양 5일 후 포배기배아 단계로 진행한다. 현재, 포배기배아로의 진행 기회를 증가시키기 위해, 배아를 시험관내 배양물에서 배양한지 약 2 내지 3일 후 자궁으로 전달된다. 그러나, 천연 생체내 조건하에서 2 내지 3일된 배아는 정상적으로 자궁이 아닌 나팔관에서 발견된다. 본 발명은 현재 시험관내 배양 조건에 대한 또 다른 대용을 제공할 수 있다.
한 양태에서, 배아는 시험관내 또는 생체내에서 인공 나팔관으로 이식될 수 있다. 배아는 이어서 인공 나팔관에서 추가의 성숙후 자궁으로 이식될 수 있다. 천연적으로, 배아는 배란한지 약 80시간 후에 나팔관으로부터 자궁으로 이동한다. 약 3일 후, 하기의 포배기배아가 형성되고 부화하고 자궁으로의 이식이 일어난다. 수정후 5 내지 7일동안 발육된 배아인 포배기배아는 2개의 상이한 세포 유형, 중공을 갖고 막 분화하기 시작한다. 트로펙토덤으로 불리우는 표면 세포는 태반이 되고 내부 세포 매쓰로 불리우는 내부 세포는 태아가된다. 6일째 말기에, 포배기배아는 이의 외부 쉘로부터 부화하기 시작해야만하고 이는 조나 펠루시다로 불리운다. 부화한지 24시간 이내에 자궁으로 이식하기 시작해야만 한다. 본 발명은 포배기배아가 자궁내 이식전에 발육되도록 한다. 또 다른 양태에서, 천연적으로 착상이 일어나 생체내 인공 자궁으로 포배기배아를 이식할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 대상체내 인공 나팔관을 구성하여 관 연결을 역전시킬 수 있다. 나팔관 부분은 포메로이 과정에서 제거된다. 당해 과정은 질 출산 후 세사레안 절편 또는 즉시 후 파르툼 기간에서 수행한다. 라파로스코픽 튜브 연결은 각각의 나팔관의 절편을 마비시키거나 나팔관에 클립을 한다거나 소환을 관의 특정 부분 주위에 부가함에 의해 수행될 수 있다. 일반적인 결과는 관이 차단됨으로써 난자 및 정자의 정상적인 운송을 방해한다는 것이다. 당해 과정의 가역성은 재구성을 위해 유용한 나팔관의 길이에 의존한다. 인공 나팔관 또는 이의 절편은 남아있는 나팔관에 봉합될 수 있어 이의 정상적인 기능이 회복되고 대상체는 임신할 수 있다.
재구성된 인공 암컷 생식 기관을 시험관내에서 사용하여 약제, 화학제, 성장/조절 인자의 효과, 세포 독성 및/또는 치료 효과에 대해 다양한 화합물을 검색할 수 있다. 배양물은 시험관내에서 유지할 수 있고 시험될 화합물에 노출될 수 있다. 세포독성 화합물의 활성은 배양중의 세포를 손상시키거나 사멸시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 이것은 생존 염색 기술에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 세포독성 화합물은 낙태 방법으로서 유용할 수 있다. 성장/조절 인자의 효과는 매트릭스의 세포 함량을 분석하고, 예를 들어, 세포 계수 및 차등 세포 계수에 의해 평가될 수 있다. 이것은 유형 특이적 세포 항원을 정의하는 항체를 사용하는 면역세포화학적 기술의 용도를 포함하는 표전 세포학적 및/또는 조직학적 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 재구성된 인공 암컷 생식 기관에서 배양된 정상적인 세포에 대한 다양한 약제의 효과를 평가할 수 있다.
한 양태에서, 재구성된 인공 암컷 생식 기관을 생체내 또는 시험관내에서 사용하여 평활근 세포를 조절하는 다양한 화합물을 검색할 수 있다. 평활근의 수축은 파라크린 자극을 통해, 평활근 인접하게 방출되는 물질을 통해 또는 혈액을 순환하는 호르몬(예를 들어, 출산동안에 자궁 수축을 자극하는 옥시토신)을 통해 일어날 수 있다. 평활근 세포가 자극을 위한 운동 뉴우런을 요구하지 않고 운동 뉴런에 의해 방출되는 신경전달제(예를 들어, 노르아드레날린 및 산화질소)는 평활근을 자극하거나 이완시킬 수 있다. 따라서, 다양한 화합물은 평활근 세포 수축에 대해 특정 효과를 가질 수 있다. 한 양태에서, 수축을 유도하는 화합물을 검색할 수 있다. 당해 화합물은 출산을 자극하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 재구성된 인공 암컷 재생 기관은 이식의 결과 및/또는 유전자 치료법에 사용하기 위한 것을 원조하거나 개선시키기 위해 유전자 및 유전자 생성물을 도입하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양된 인공 암컷 생식 세포는 가공되어 유전자 생성물을 발현할 수 있다. 세포를 가공하여 일시적으로 및/또는 유도성 조절하에 또는 인공 암컷 생식 세포(예를 들어, 질 상피 세포)로 부착된 키메릭 융합 단백질로서 발현할 수 있고 예를 들어, 수용체 또는 수용체형 분자의 세포내 및/또는 막관통 도메인으로 이루어진 키메릭 분자는 세포외 도메인으로서 유전자 생성물과 융합된다. 또 다른 양태에서, 암컷 생식 세포는 유전학적으로 가공되어 환자의 결핍된 유전자를 발현하거나 치료학적 효과를 발휘할 것이다. 암컷 생식 세포로 처리된 목적하는 유전자는 치료될 질환에 관한 것이다. 예를 들어, 질 장애, 배양된 질 상피 세포를 가공하여 질 장애를 개선시키는 유전자 생성물을 발현할 수 있다.
암컷 생식 세포, 예를 들어, 질 상피 세포는 질 상피 세포를 전환시키는데 사용되는 목적하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 사용하여 가공될 수 있다. 3차원 골격 및 질 조직 층은 활성 유전자 생성물을 발현하고 당해 생성물이 부족한 개인에게 이식할 수 있다. 예를 들어, 다양한 유형의 암컷 생식 이상증의 증상을 예방하거나 개선시키는 유전자는 질환 조건하에서 발현이하이거나 하향 조절될 수 있다. 유전자 활성의 수준은 존재하는 유전자 생성물의 수준을 증가시키거나 3차원 골격 및 질 상피 세포에 존재하는 활성 유전자 생성물의 수준을 증가시킴에 의해 증가될 수 있다. 활성 표적 유전자 생성물을 발현하는 3차원 배양물은 이어서 당해 생성물이 부족한 환자에게 이식할 수 있다.
유전학적으로 처리된 암컷 재생 조직을 함유하는 3차원 배양은 이어서 대상체에 이식시켜 질환의 증상이 개선될수 있도록 한다. 유전자 발현은 비유도성(즉, 항상성) 또는 유도성 프모토터의 조절하에 있을 수 있다. 유전자 발현의 수준 및 조절된 유전자의 유형은 개인 환자에게 따른 치료 증상에 의존하여 조절될 수 있다.
본 발명의 기타 양태는 본원에 기재된 본 발명의 명세서 및 시행을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 모든 미국 특허 및 기타 참조문헌은 참조에 의해 특별히 인용된 이유가 무엇이든지 간에 주지한다. 명세서 및 실시예는 하기의 청구항에 지적된 발명의 실제 범위 및 취지하에 단지 예시적인 것으로 사료되어야만 한다.
실험실에서 표현형적으로 정상인 자가 유래된 세포 기원의 사전 구성된 기관의 성공적인 제조는 정상적인 기능을 발현시킬 수 있다. 하기의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 세포, 바람직하게는 자가 세포를 수득할 수 있고 이들을 시험관내에서 증식시키고 이어서 이들을 재구성, 복구, 증대 또는 대체를 요구하는 부위로 생체내 이식시킬 수 있음을 설명한다. 재구성되고, 생존성 질, 나팔관 및 자궁을 생체내에서 생성시키는 본 발명은 하기 실시예에서 입증된다. 하기의 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
실시예 1: 인공 질을 제조하기 위한 재료 및 방법
(i) 조직 수거 및 세포 배양
뉴질랜드 화이트 래빗을 질 조직의 공급원으로서 사용한다. 당해 동물을 근육내 케타민(25mg/kg), 크실라진(2 mg/kg) 및 아세프로마진(0.75mg/kg)으로 마취시킨다. 하부 복부를 포비돈-요오드(베타딘) 용액을 사용하여 멸균 방식으로 제조한다.
질 조직(1cm2) 및 나팔관 조직은 생검동안에 노출이 우수하게 하는 단순한 중심선 경복부 방법을 통해 수거한다. 회수된 조직은 수회 세척하고 근육 및 상피 조직은 미세 절개 또는 효소적 분해에 의해 분리한다.
평활근 세포는 이식편 방법을 사용하여 추출한다. 여러 근육 스트립은 루프 확대하에 조직의 혈청 근육 층으로부터 주의깊게 절개한다. 이들 조각은 각각 배양 접시상에 놓고 이어서 대기 및 5% CO2의 37℃에서 10% 태아 소 혈청(FBS, Life Technologies, Rockville, Maryland)이 보충된 듈베코 변형 이글 배지(DMEM, Mediatech Inc, Herndon, Virgina)를 사용하여 배양하고 충분한 세포의 콜로니가 조직 섬으로부터 성장할때까지 방해받지 않은 상태로 방치한다. 약한 흡입으로 이식편을 제거하고 예정된 24 내지 48시간 마다 배지를 갈아주어 세포를 유지한다.
상피 세포는 콜라겐아제 IV형(Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, New Jersey) 및 디스파제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind)를 사용하는 효소적 분해에 의해 질 및 나팔관 표본으로부터 분리할 수 있다. 조직을 효소 용액내에 침지시키고 37℃에서 30분동안 왕성하게 진탕시킨다. 약한 피펫 흡입을 사용하여, 세포/유체 현탁액을 5분동안 저회전으로 원심분리한다. 상등액을 각질형성 무혈청 배지(K-SFM, Life Technologies, Rockville, Maryland)에 현탁시키고 배양 접시에 분주하고 24시간 내지 48시간 마다 배지를 교환해주면서 K-SFM으로 유지한다. 각각의 세포 유형을 약 50개의 15cm 폴리스티렌 배양 접시에 증식시켜 상피 세포에 대해 목적하는 세포 밀도 10 x 106 세포/cc를 성취하고 평활근 세포에 대해서는 목적하는 세포 밀도 20 x 106 세포/cc를 성취한다.
(ii) 시험관내 세포 성상 조직학 및 면역조직화학
질 또는 나팔관 상피 및 평활근 세포를 챔버 슬라이드에 시딩하고 4% 완충 포름알데하이드로 고정시키고 적정 콜로니 수가 배양내에 확립된 후에 처리한다. 광범위하게 반응하는 사이토케라틴(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind) 및 평활근 알파 액틴 항체(Novocastra, Newcastle, UK)를 사용하여 각각 상피 및 평활근 세포 표현형을 확인한다. 이들 세포를 1차 항체 대신 차단 용액으로 항온처리한 네가티브 대조군과 비교한다. 인산 완충 식염수로 세척한 후, 세포를 비오티닐화된 2차 항체로 항온처리하고 퍼옥시다제 시약과 함께 발육시키기 전에 세척한다. 길 헤마톡실린(Gill's hematoxylin)을 사용하여 대비 염색시킨다.
(iii) 세포 시딩 및 생체내 이식
(a) 하기의 프로토콜은 실시예 2에 따른다. 폴리글리콜산(PGA) 골격은 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)의 50:50 공중합체로 피복한다. 골격을 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균시키고 세포를 시딩하기 24시간 전에 배지에 미리 습윤시킨다. 질 상피 및 평활근 세포를 각각 10 x 106 세포/cc 및 20 x 106 세포/cc의 농도로 파상적인 방식으로 60개의 골격의 반대 측면상에 시딩한다. 세포를 24 내지 48시간동안 5% CO2와 함께 37℃에서 배양한다. 60개가 세포로 시딩되고 20개가 시딩되지 않은 80개의 골격을 마우스의 피하내로 이식한다. 진정제로서 마우스에 케타민(25mg/kg) 및 크실라진(5mg/kg) 둘 다를 투여함에 이어서 진통 및 항생제 처방을 위해 수술후 부프레넥스(0.1mg/kg) 및 세팔로스포린을 투여한다. 마우스 각각에 시딩된 3개의 골격 및 시딩되지 않은 1개의 골격을 이식한다. 이식한지 1, 4 및 6주 후에 동물을 희생시킨다.
(b) 실시예 3에서, 하기의 프로토콜에 따른다. 폴리글리콜산(PGA)(Albany International, Mansfield, MA) 골격을 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)의 50:50의 공중합체로 피복한다. 이들 골격은 세포 시딩하기 전에 예비 성형하고 평형하게 한다. 질 상피 및 평활근 세포 둘다를 각각 10 x 106 세포/cc 및 20 x 106 세포/cc의 농도에서 생물반응기 시스템내에 역학적으로 시딩한다. 세포를 래빗에 이식하기 7일전에 5% CO2와 함께 37℃에서 동시 배양한다. 6마리의 동물을 시딩되지 않은 골격으로 이식하고 9마리의 동물을 시딩된 골격으로 이식한다. 래빗에 진정제로서 케타민(25mg/kg) 및 크실라진(5mg/kg)을 투여함에 이어서 진통 및 항생제 처방을 위해 수술 후 부프레넥스(0.1mg/kg) 및 세팔로스포린을 투여한다. 이식한지 1, 4, 및 6개월 후에 동물을 희생시킨다.
(iv) 시딩된 골격의 면역세포화학적 및 조직학적 분석
포르말린 고정된 파라핀 봉입된 조직의 5㎛의 절편을 헤마톡실린-에오신 및 마손 트리크롬으로 처리하고 염색시킨다. 상피 세포 층을, 광범위하게 반응하는 모노클로날 항-판사이토케라틴 AE1/AE3을 사용하여 동정한다. 평활근 섬유를 모노클로날 α평활근 액틴 항체로 표지시킨다. 아비딘-비오틴 검출 시스템을 사용하여 면역표지를 수행하고 절편을 헤마톡실린으로 대비 염색시킨다. 정상적인 질 조직의 절편은 또한 비교를 위한 포지티브 대조군으로서 염색시킨다.
(v) 분자학적 분석
모노클로날 항체 α-액틴 및 사이토케라틴 AE1/AE3을 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 대조군으로 작용하는 천연 질 조직과 재구성된 질 구조 사이에 단백질 발현을 비교하여 상피 및 평활근 세포 표현형의 불변을 확인한다. 조직을 냉각 용해 완충액중에서 파쇄하고 가용성 단백질 상등액을 수거한다. 바이로래드 DC 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 샘플을 정량한다. 동일한 농도의 단백질을 로딩하고 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고 1차 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 탐지한다. 실시예 2에서, 퍼옥사이드 접합된 항 마우스 2차 항체는 EHL와 복합체를 형성하고 검출된다.
(vi) 기관 욕조 연구
천연 및 조직공학적 질의 세포 스트립을 기관 욕조 분석과 비교한다. 스트립을 4-0 실크 봉합선으로 한 끝을 조직 지지체 고리에 부착하고 다른 끝을 동일 크기의 전력 변환기(Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA)에 부착시킨다. 표본을, 버블링 챔버에 의해 공급되는 95% O2, 5% CO2로 평형화된 티로드 용액 50ml을 함유하는 고립된 욕조내에 탑재하고 37℃에서 유지한다. 다양한 전기 및 화학적 자극에 노출된 조직 각각의 스트립에 대한 피크 수축을 기록한다. 변환기 시그날을 판독기에 입력한다. 전기장 자극을 위해, 2개의 10mm 직경 환 백금 이리듐 전극을 그래스 S48 자극기(AstroMed, Inc., Warick, RI)와 함께 사용한다. 조직을 20 m뉴톤(2.0gm)의 전부하 장력하에 탑재하여 60분의 평형화 기간 말기에 약 8m뉴톤(0.8gm)의 휴지기 장력을 수득한다.
자극 사이의 휴지기 간격이 3분인 연속 필드 자극을 적용하고(20, 40 및 60Hz; 100볼트, 1msec 지속 제곱 펄스) 활성 장력을 측정한다. 신경전달제 수용체의 발현 및 기능을 확인하기 위해, 특이적 자율 효능제(카바콜 및 페닐레프린)를 사용한다.
실시예 2: 조직공학적 질의 제조
선천성 질 이상증 및 배설강 기형은 광범위한 수술 재건을 요구할 수 있다. 수술은 제한된 양의 천연 조직이 유용하기 때문에 난국에 봉착한다. 다수의 연합된 합병증이 발생하지만 현재 비-재생 관 조직이 질 재건을 위해 사용된다. 자가 질 조직이 바람직할 수 있다. 당해 실시예는 생체내 질 조직의 가공을 위한 질 상피 및 평활근 세포의 용도를 기재한다.
암컷 래빗의 질 상피(VE) 세포 및 평활근 세포(SMC)는 배양으로 성장하고 확장한다. 2개의 세포 유형의 특징은 면역세포화학적으로 밝힌다. 질 상피 세포 및 평활근 세포는 각각, 폴리글리콜산(PGA)의 중합체상에 10 x 106 세포/cm3 및 20 x 106 세포/cm3으로 시딩한다. 세포 시딩된 골격을 누드 마우스의 피하내에 이식한다. 동물을 이식한지 1, 4, 및 6주후에 희생시킨다. 면역세포화학적 및 조직화학적 분석은 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 평활근 특이적 알파-액틴 항체로 수행하여 재구성된 조직 표현형을 확인한다. 웨스턴 블롯 분석 및 전기장 자극 연구를 또한 수행하여 분자학적 및 기능적 수준 모두에서 조직공학적 구조물의 특징을 추가로 밝힌다.
당해 결과는 질 상피 및 평활근 세포 둘다가 면역세포화학적으로 포지티브하게 동정되고 생체내 모든 배양 단계에서 유지되어 중합체 매트릭스상에 시딩하기 전에 상피 및 평활근 표현형 둘다가 보존되어 있음을 입증한다. 질 상피 세포는 항-판사이토케라틴 AE1/AE3로 동정하고 평활근 세포는 누드 마우스에서 모든 배양 단계에서 α-평활근 액틴 항체에 대해 포지티브하에 염색된다.
전체적으로, 회수된 중합체 골격은 조사 및 짜임새에 있어서 정상적인 조직의 외형과 유사하다. 조직학적으로 회수된 골격은 이식한지 1주 후 다층 조직 스트립을 입증하고 이것은 질 상피 및 평활근 세포 유형 모두에 대해 6주 이상동안 계속 명백한 층으로 점진적으로 구조화됨을 입증한다. 질 상피 및 평활근 세포의 헤마톡실린 및 에오신 염색(100 x)은 생체내 이식되고 정상적인 질 조직 세포의 6주에 회수한 골격에 시딩한다. 질 상피 세포의 완전한 전이 세포층의 존재는 모든 이식체에서 광범위하게 반응하는 항-판토사이토케라틴 AE1/AE3로 면역세포화학적으로 확인된다. 질 상피 세포는 사이토케라틴 AE1/AE3(200 x)에 대해 포지티브하게 염색된다. 평활근 세포는 α평활근 액틴 특이적 항체(200x)에 대해 포지티브하게 염색되고 시간 경과에 따른 구조화된 근육 번들의 수가 증가하였음을 입증한다. 침투 천연 혈관 형성이 또한 명백하다. 대조군에는 조직 형성된다는 증거가 없다. 동일한 1차 항체는 웨스턴 블롯 분석에 사용되어 세포로 시딩된 조직공학적 골격에서 정상적으로 분화된 상피 및 평활근 세포의 존재를 확인시킨다. 세포 시딩된 골격의 웨스턴 블롯은 이식한지 1, 4 및 6주후에 사이토케라틴 AE1/AE3 및 α평활근 액틴에 대한 단백질 밴드를 입증한다. 상응하는 단백질 밴드는 대조군과 비교하는 경우 모든 시점에서 상피 및 평활근 세포 모두가 모든 재구성된 조직 구조임을 나타낸다.
수축 반응은 전기적으로 자극되는 경우의 조직공학적 구조물에서 관찰된다. 도 1은 이식한지 6주후에 정상적이고 조직공학적 질에 대한 다양한 수준의 전기 자극에서 전위차가 재현됨을 입증한다. 반응의 유사한 증폭은, 100V 및 20Hz, 40Hz 및 60Hz의 주파수로 3초의 지속적인 자극에서 조직공학적 구조물과 정상적인 질 조직 사이에서 관찰된다. 초기 재현된 반응이 조직공학적 질 조직과 정상적인 질 조직 사이에서 유사하지만 조직공학적 구조물에서 회수 단계는 기준선에 도달하는데 정상적인 조직(1.5초) 보다 길다(평균 = 7초). 어떠한 유도된 반응은 카바콜 또는 페닐레프린을 사용한 화학적 자극에 대해 조직공학적 구조물에서 관찰되지 않는다.
질 세포는 PGA의 중합체 골격상으로 시딩하기 전에 시험관내에서 매우 큰 수의 콜로니로 용이하게 증식한다. 상피 및 평활근 둘다의 세포 유형은 각각 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 α-액틴 평활근 항체를 사용한 면역세포화학적 염색에 의해 확인되는 바와 같이 모든 단계의 배양에서 이들 각각의 표현형의 발현을 유지한다. 시험관내에서 용이한 복제 능력 및 정상적인 표현형에 침해 없이 큰 세포 수로의 복제 능력은 조직의 성공적인 가공을 위해 바람직한 특징이다.
질 상피 및 평활근 세포는 성공적으로 PGA 구조물상에서 동시 배양한다. 생체내 이식되는 경우, 질 세포는 면역화학적 및 웨스턴 블롯 분석 둘다에 의해, 상피 또는 평활근으로서의 표현형으로, 성공적으로 동정될 수 있다. 더욱이, 조직공학적 구조물은 상피 및 평활근 성분 둘다에 대해 정상적인 전이 층 쪽으로 시간 경과에 따라 점진적으로 구조적으로 구성됨을 입증한다. 이들 발견은 질 상피 및 평활근 세포가 장기간동안 생체내에서 복제하고 생존할 수 있고 정상적인 구조 배향으로 구성될 수 있음을 의미한다.
기능적으로, 조직공학적 질 구조물은 일련의 전기 충격으로 자극되는 경우 천연 질 조직에서 관찰되는 것과 유사한 수축력을 발생시킬 수 있다. 이것은 세포 분극화를 허용되는 온전한 구조 막 시스템을 갖고 수축력으로 전환되는 세포내 양이온이 방출됨을 의미한다. 천연 및 처리된 질 조직 사이의 회복 단계에서 차이가 나타난다. 무스카린 또는 아드레날린 효능제를 사용한 화학적 자극에 대한 응답은 없다. 이들 발견은 신경전달제 수용체 복합체가 실험에 포함되는 시간(가장 긴 시점에서 단지 6주)동안 완전히 발달하지 못함을 의미한다. 이들 발견은, 전기 자극에 대한 반응이 4주후에 나타나지만 화학적 자극 계수는 조직 발육 3개월 후 때까지 나타나지 않는 방광 및 요도와 같은 기타 조직에서 나타나는 기능적 프로필과 일관성이 있다.
데이타는 질 상피 세포 및 평활근 세포가 용이하게 시험관내에서 배양되고 성장할 수 있음을 보여준다. 세포 시딩된 중합체 골격은 정상적인 질 조직과 유사한 표현형 및 기능적 성질을 갖는 생체내 혈관 형성된 질 조직을 형성할 수 있다. 당해 연구는 질 상피 세포 및 평활근 세포가 생체내에서 질 조직으로 재구성되는 본 발명의 용도를 입증한다. 당해 기술은 임상 적용을 위해 질 조직의 가공을 성취하기 위해 추구될 수 있다.
실시예 3: 조직공학적 구조물을 사용한 대형 동물에서 완전한 질 대체
하기의 연구는 질 상피 및 평활근 세포가 장기간동안 래빗의 생체내에서 복제할 수 있고 생존할 수 있고 외형적으로 정상적인 구조 배향 쪽으로 자가 구성할 수 있어 천연 질 조직에서 나타나는 것과 유사한 수축력을 생산할 수 있음을 입증한다.
암컷 래빗의 자가 질 상피(VE) 세포 및 평활근 세포(SMC)는 배양중에 성장하고 증대된다. 양 세포 유형은 중합체에 시딩하기 전에 면역세포화학적으로 확인된다. 동시 배양된 VE 및 SMC는 역학적으로 5 x 106 세포/cm3의 농도에서 폴리글리콜산(PGA)의 중합체상에 시딩한다. 총 15마리의 동물을 당해 실험을 위해 사용한다. 세포 시딩된 골격은 9마리의 동물중에서 완전한 질 대체를 위해 사용되는 반면에 시딩되지 않은 구조물은 대조군으로서 6마리의 동물에서 대체를 위해 사용된다. 질조영상을 이식한지 1, 3 및 6개월 후에 수행한다. 동물은 또한 분석을 위해 1, 3 및 6개월에 희생시킨다. 면역세포화학적 및 조직화학적 분석은 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 평활근 특이적 α-액틴 항체를 사용하여 수행하여 재구성된 조직 표현형을 확인한다. 웨스턴 블롯 분석 및 전기장 자극 연구를 또한 수행하여 분자학적 및 기능적 수준 둘다에서 조직공학적 구조물의 특징을 추가로 밝힌다. 수축력 및 신경전달 수용체의 존재는 기관 욕조 연구로 확인한다. 형광성 세포 막 표지(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 사용하여 생체내 세포 생존력을 확인한다.
이식 후, 모든 시딩되지 않은 이식편은 1개월 시점에 붕괴되거나 구속된다. 시딩되지 않은 중합체의 연속 질조영상은 구속력이 존재함을 입증한다. 대조적으로, 연속 질조영상은 시딩된 관모양의 중합체로 이식된 동물에서 어떠한 구속에 대한 징후 없이 넓은 질 구경을 유지함을 확인한다. 총체적으로, 회수된 시딩된 골격은 조사시 정상적인 외형의 조직과 유사하고 구조물에서 어떠한 섬유증에 대한 증거가 없다.
조직학적으로, 시간 경과에 따라 세포 구성이 증가하면서 근육 세포 섬유 번들에 의해 둘려싸인 전이 세포 층이 세포 시딩된 구조물상에서 관찰된다. 회수된 골격은 이식 후 1개월 시점까지 다층 조직 스트립을 입증하고 이것은 계속해서 시간 경과에 따라 질 상피 및 평활근 세포 둘다에 대해 명백한 층으로 점진적으로 구성됨을 입증한다. 세포 생존력 및 구성은 또한 세포막 표지 기술을 사용하여 확인한다. 질 상피 세포의 완전한 전이 세포 층의 존재는 모든 이식편에서 광범위하게 반응하는 항-판사이토케라틴 AE1/AE3을 사용하여 면역세포화학적으로 확인한다. α-액틴 특이적 항체에 대해 포지티브하게 염색되는 평활근 세포에서도 동일하게 관찰되고 시간 경과에 따라 구성된 근육 번들의 수가 증가함을 입증한다. 유사한 염색 패턴 및 강도는 재구성된 구조가 정상적인 질 조직의 포지티브 대조군과 비교되는 경우 관찰된다. 침투 천연 혈관 형성이 또한 나타난다. 동일한 1차 항체는 웨스턴 블롯 분석에 사용하여 세포로 시딩된 조직공학적 골격에서 정상적으로 분화된 상피 및 평활근 세포의 존재를 확인한다. 상응하는 단백질 밴드는 대조군과 비교되는 경우 모든 시점(1, 3 및 6개월)에서 모든 재구성된 조직 구조물에 대해 상피 및 평활근 세포 둘다에서 나타난다. 대조적으로, 불충분한 구성되지 않은 근육 섬유 번들 및 큰 면적의 섬유증을 갖는 전이 세포 층은 시딩되지 않은 구조물상에 존재한다.
특이적 효능제(카바콜 및 페닐레프린)를 사용하여 가공되고 정상적인 요도 벽에서 무스카린 및 아드레날린 수용체의 존재를 기능적으로 확인한다. 카바콜(10-6M) 및 페닐레프린(10-3M)의 첨가는 가공되고 정상적인 질 스트립에서 정량적으로 동일한 수축을 유발한다. 조직공학적 질 조직은 신경전달제 기작을 통해 수축력을 생성할 수 있는 것으로 입증되었다. 기능적 전기화학적 반응은 조직공학적 구조물 전기장 자극 및 기관 욕조 연구에서 관찰된다. 전기장 자극은 정상적인 질과 비교하는 경우, 조직공학적 구조물에서의 수축에 있어서 유사한 반응을 입증한다.
당해 연구에서, 질 세포는 시험관내에서 성공적으로 배양되고 생체내 재구성된 생존 조직을 생성시키기 위해 사용된다. 질 세포는 PGA의 중합체 골격 상으로 시딩하기 전에 매우 큰 콜로니 수로 시험관내에서 용이하게 증식한다. 상피 및 평활근의 양 세포 유형은 각각 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 α-액틴 평활근 항체를 사용한 면역세포화학적 염색에 의해 확인되는 바와 같이 배양의 모든 단계에서 이들 각각의 표현형의 발현을 유지한다. 용이하게 시험관내에서 복제하는 능력 및 정상적인 표현형에 대한 침해 없이 큰 세포 수로의 복제 능력은 조직의 성공적인 가공을 위해 바람직한 특징이다.
질 상피 및 평활근 세포는 PGA 구조물상에서 성공적으로 동시 배양한다. 생체내에서 이식되는 경우, 질 세포는 상피 또는 평활근으로서 면역세포화학적 및 웨스턴 블롯 분석 둘다에 의해 표현형적으로 성공적으로 동정될 수 있다. 더욱이, 조직공학적 구조물은 시간 경과에 따라 상피 및 평활근 서운에 대한 명백한 전이 층쪽으로의 공간 배향을 입증한다. 이들 발견은 질 상피 및 평활근 세포가 장기간동안 생체내에서 복제하고 생존할 수 있고 외형적으로 정상적인 구조 배향쪽으로 자가 구성될 수 있음을 의미한다.
기능적으로, 조직공학적 질 구조물은 일련의 전기 충격으로 자극되는 경우 천연 질 조직에서 관찰되는 것과 유사한 수축력을 생성할 수 있다. 이것은 세포 탈분극화를 허용하는 온전한 구조 막 시스템 및 수축력으로 전환되는 세포내 양이온이 방출됨을 의미한다. 또한 무스카린 또는 아드레날린 효능제 둘다에 의한 화학적 자극에 대한 반응이 있다. 이것은 신경전달제 수용체 경로가 생성됨을 의미한다. 이들 발견은, 조직 발육 몇주 후에 전기 및 화학적 자극 계수 둘다에 대한 반응이 나타나는 방광 및 요도와 같은 기타 조직에서 관찰되는 기능적 프로필과 일관성이 있다[참조: Chen et al. World J Urol. 18(1):67-70, (2000); Oberpenning et al. Nature Biotech. 17:2(1999)].
당해 연구는 VE 및 SMC가 실험실에서 총 질 대체를 위해 대형 중합체 구조물상에서 재구성될 수 있음을 입증한다. 당해 기술은 장래에 요구되는 광범위한 선천적 재구성이 낮은 환자에게 임상적 잇점을 가질 수 있다.
실시예 4: 조직공학적 나팔관의 제조
당해 실시예는 생체내에서 나팔관의 가공을 위한 나팔관 상피 및 평활근 세포의 용도를 기술한다.
암컷 래빗의 나팔관 상피 세포 및 평활근 세포는 배양에서 성장하고 증대될 수 있다. 양 세포 유형의 특징은 면역세포화학적으로 밝힐 수 있다. 나팔관 상피 세포 및 평활근 세포는 각각, 약 10 x 106 세포/cm3 및 20 x 106 세포/cm 3로 폴리글리콜산(PGA)의 중합체상에 시딩될 수 있다. 세포 시딩된 골격은 누드 마우스의 피하내로 이식될 수 있고 누드 마우스는 이식한지 1, 4 및 6주 후에 희생시킬 수 있다. 면역세포화학적 및 조직화학적 분석은 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 평활근 특이적 α-액틴 항체로 수행하여 재구성된 조직 표현형을 확인할 수 있다. 웨스턴 블롯 분석 및 전기장 자극 연구를 또한 수행하여 분자학적 및 기능적 수준 둘다에서 조직공학적 작제물의 특징을 추가로 밝힐 수 있다.
당해 실시예는 나팔관 상피 세포 및 평활근 세포가 시험관내에서 배양되고 증대될 수 있음을 입증한다. 세포 시딩된 중합체 골격은 정상적인 나팔관 조직과 유사한 표현형 및 기능적 성질을 갖는 생체내 혈관형성된 나팔관 조직을 형성할 수 있다.
실시예 5: 인공 자궁을 제조하기 위한 재료 및 방법
(i) 세포 수거 및 배양
무게가 3.5 내지 4.0kg인 12마리의 뉴질랜드 화이트 래빗을, 케타민(25mg/kg) 및 크실라진(5mg/kg)을 근육내 주사하여 마취시키고 이소플루란(1 내지 3%)으로 유지한다. 자궁 뿔의 노출 후, 자궁의 1 x 1cm 절편을 각각의 동물로부터 절개한다. 점막 조직을, 배양기를 40분동안 진탕시키면서 37℃에서 0.1% 콜라겐아제 IV형(Worthington, Lakewood, NJ)으로 분해시킨다. 이어서, 점막 조직을 세정하고 세포를 F-12(Gibco, Grand Island, NY) 및 EGF(5ng/ml), 소 뇌하수체 추출물(40ng/ml) 및 10% 태아 소 혈청이 보충된 듈베코 변형 이글 배지(Mediatech, Herndon, VA; F-12/DMEM, v/v 1:1)로 이루어진 배양 배지의 6웰 배양 접시상에 분주한다[참조: Gemini, Woodland, CA)(Baez, C.E., Atala, A.: Uterus. In: Methods of Tissue Engineering.Edited by A. Atala and R.P.Lanza. Boston: Academic Press, pp. 1189-1194, 2002);(Mulholland et al. Changes in proteins sythesized by rabbit endometrial epithelial cells following primary culture. Cell tissue Res, 252:123, 1988);(Vigano et al.: Culture of human endometrial cells: a new simple technique to completely separate epithelial glands.Acta Obstet Gynecol Scand, 72:87, 1993); (Bongso et al.: Establishment of human endometrial cell cultures. Hym Repro, 3: 705, 1988)].
조직 표본을 멸균 조건하에 절개하고 상피 및 근육 층을 분리한다. 근육 조직은 날카로운 가위로 2mm3 미만의 크기를 갖는 단편으로 절단하고 배양 플레이트상에 놓는다. 10% FBS가 보충된 DMEM으로 이루어진 근육 세포 배양 배지는 약간 첨가하고 배양물을 5% CO2의 습윤화된 배양기에 융합될 때까지 놓아둔다[참조: Merviel et al.: Normal human endometrial cells in culture: characterization and immortalization of epithelial and stromal cells by SV 40 large T antigen. Biol Cell, 84:187, 1995);(Osteen et al.: Development of a method to isolate and culture highly purified population of stromal and epithelial cells from human endometrial biopsy specimens. Fertil Steril, 52: 965, 1989)]. 배지를 3일마다 갈아주고 세포를 0.5% 트립신으로 계대 배양한다[Sigma, St. Louis, MO]. 상피 및 평활근 세포 둘다는 충분한 세포가 유용할때까지 별도로 증식시킨다.
(ii) 중합체 골격
6cm x 3cm 크기의 폴리글리콜산의 부직포(PGA, 58mg/cc의 벌크 밀도, Albany International, Mansfield, MA)를 자궁 형태의 주형에 5-0 흡수가능한 봉합선으로 배열한다. 생분해성 중합체 메쉬는 섬유내 거리가 100 내지 200㎛이고 공극율이 95%인 15㎛의 섬유로 구성된다. 구조물을 클로로포름중의 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드(PLGA, 50:50; Sigma Chemical, St. Louis, Missouri)로 피복하여 강직성을 증가시키고 이의 주변 구조를 유지한다. 이어서 용매를 증발시키고 골격을 2일동안 진공하에 방치한다. 골격을 에티렌 옥사이드로 멸균시킨다.
(iii) 세포 시딩
1차 자궁 평활근 및 상피 세포를 관 형태의 중합체에 단계적인 방식으로 시딩한다. 평활근 세포는 처음에 60 x 106 세포/ml의 농도로 시딩한다. 세포는 10% FBS가 보충된 DMEM을 사용하여 습윤화된 배양기에서 3일동안 성장시킨다. 배지를 24시간마다 갈아주어 영양분이 충분히 공급될 수 있도록 한다. 이어서, 상피 세포를 60 x 106 세포/ml의 농도로 시딩한다. 시딩된 세포를 이식하기 48시간 전에 추가로 배양한다.
(iv) 수술 및 수술 후 평가
마취하에, 중앙선 하부 복부를 절개하고 이전에 자궁 생검되었던 12마리의 암컷 래빗의 자궁뿔 둘다를 노출시킨다(Millbrook farms, Concord, Massachusetts). 각각의 한방향 자궁뿔의 원주 직경의 약 80%를 절재하여 얇은 세로의 스트립을 제조한다. 절개된 자궁뿔을 자가 세포 시딩된 구조물로 대체한다. 구조물 및 천연 난소 및 질 사이를 6-0 비크릴 봉합선을 사용하여 소장 테두리를 통해 문합한다. 비흡수성 마크 봉합선은 장래 동정을 위한 각각의 문합 부위에 위치시킨다. 세포 및 모조 없이 중합체는 대조군으로서 사용되는 동물(그룹당 n=3)에 적용한다. 모든 구조물은 오멘툼으로 덮는다. 자궁난관조영술은 수술한지 1, 3 및 6개월후에 수행하여 이식된 구조물의 구조적 통합성을 동정한다. 동물을 수술한지 1, 3 및 6개월 후에 희생시킨다(시점당 n = 3).
(v) 조직학적 및 면역세포화학적 분석
회수된 자궁 조직 표본을 포르말린으로 고정시키고 파라핀 봉입하고 절개한다음 조직학적으로 헤마톡실린 및 에오신 및 마손의 트리크롬으로 염색시킨다. 면역세포화학적 분석은 특이적 항체를 사용하여 챔버 슬라이드 및 회수된 표본상에서 성장한 배양된 세포상에서 수행한다. 자궁 평활근 세포는 모노클로날 항-α 형활근 특이적 액틴(Dako, Carpinteria, CA)으로 표지시키고 자궁 상피 세포는 판사이토케라틴 AE1/AE3(Dako, Carpinteria, CA)으로 표지시키고 에스트로겐 수용체 기능한 에스트로겐 수용체 β항체(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)로 분석한다[참조: Monje et al. Subcellular distribution of native estrogen receptor alpha and beta isoforms in rabbit uterus and ovary. J Cell Biochem, 82:467, 2001]. 면역표지는 액틴-비오틴 검출 시스템(Vector laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 수행한다. 절편을 길 헤마톡실린으로 대비 염색시킨다.
(vi) 웨스턴 블롯 분석
새롭게 수득된 자궁 조직 샘플을 파쇄하고 1 x 인산 완충 식염수, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 10㎍/ml의 아프로티닌 및 10㎍/ml의 류펩틴을 함유하는 용해 완충액을 사용한 통상적인 단백질 추출 방법에 의해 단백질을 제조한다. 불용성 물질을 4℃에서 20분동안 14,000rpm에서 원심분리하여 제거한다. 단백질 농도는 바이오-래드 단백질 분석 키트를 사용하여 결정한다. 동일한(20㎍) 양의 각각의 샘플을 2 x 샘플 완충액(0.125M 트리스-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-머캅토에탄올, 20% 글리세롤 및 0.004% 브로모페놀 블루)으로 희석(1:1 용적)시킨다. 샘플을 5분동안 비등시키고 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩한다. 전기영동 후, 단백질을 다공성 일련의 반 무수 전달 단위체(Pharmacia Biotech, Inc)를 사용하여 폴리비닐리딘 디플루오리드 막으로 이동시킨다. 막을 1시간동안 3% BSA(4.5g BSA, 300㎕ 10% NaAzide, 150ml 1 x TBS/T)으로 차단하고 이어서 4℃에서 밤새 1:1000으로 희석된 마우스 항 사람 AE1/AE3, α-액틴 및 에스트로겐 수용체 1차 항체중에서 항온처리한다. 이어서 막을 실온에서 1시간동안 2차 항체 접합체로 처리한다. 면역블롯을 ECL 키트(Amersham Life Sciences Inc., Illinois)로 처리하고 1 내지 10분동안 방사선 필름에 노출시킨다. 필름을 X-Omat 기계에서 현상시킨다.
(vii) 기관 욕조 연구
변형된 크렙스 용액(NaCl 134mmol, KCl 3.4mmol, CaCl2 2.8mmol, 인산칼륨 모노염기성 1.3mmol, NaHCO3 16mmol, MgSO4 0.6mmol 및 글루코스 7.7mmol)을 조직 욕조 연구를 위해 사용한다[참조: Piechota et al.: In vitro functional properties of the rat bladder regenerated by the bladder acellular matrix graft. J Urol, 159:1717, 1998]. 당해 용액을 모든 실험동안에 95% O2/5% CO2를 일정하게 버블링하여 pH를 7.4로 유지시킨다. 50ml 이중 챔버 쿠아이어트(Quite) 욕조(Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA)를 작동 챔버로서 사용한다. 연속적인 가스 기류는 외부 가열 회로(Immersion Circulation, model 1112, VWR Scientific Product, West Chester, PA)에 의해 37℃로 가온된 크렙스 용액의 순환을 유도한다.
조직 수축을 위해, 자궁 조직 스트립(동물당 n=3)을 백금 이리듐 전극(20mm로 격리된 10mm 직경)과 함께 수직의 L형 조직 지지체로 조직 욕조에 침지시킨다. 동일 크기의 전력 대체 변환기(Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA)를 2개의 5-0 편복 실크 봉합선을 사용하여 또 다른 측면에 연결한다. 그래스 48 전기 자극기(Grass Technique, West Warwick, RI)는 전기장 자극(EFS)의 공급원이다. 변환기 시그날을 챠트 판독기(Econo-1325, Biorad, Hercules, CA)에 전달한다. 2.0gm 전부하를 각각의 실험 개시 전에 적용한다. 각각의 실험 개시 전에 30분 이상동안 스트립을 평형화시킨다. 전기장 자극 연구를 위해, 100볼트; 1.0ms 펄스 지속; 초당 5, 10, 20, 40, 50 펄스(pps) 주파수를 각각의 자극 사이의 2분 간격으로 사용한다. 약리학적 자극을 위해, 무스카린 수용체 효능제(카바콜, 1 x 10-4) 및 길항제(아트로핀, 1 x 10-4M) 및 아드레날린 수용체 효능제(페니에프린, 1 x 10-4M) 및 길항제(펜톨아민, 1 x 10-4M)을 사용하여 조사한다. 스트립의 무게는 각각의 수축력 시험 후에 측정한다. 수축 강도는 조직의 100mg당 그램 힘(g/100mg)으로서 표현한다. 기관 욕조 연구는 가공되고 정상적인 대조군 자궁 조직상에서 수행한다.
(viii) 생기작 성질
직각의 조직 스트립(20mm x 4.5mm x 1.5mm)을 정상적인 자궁으로부터 수득하고 처리된 자궁 이식체 및 골격을 세포 없이 이식한다(샘플당 n=5). 조직 스트립을 세로 방향으로 초당 0.05mm의 속도로 연장함에 의해 장력 시험(Instron model 5544, MA, USA)을 수행한다[참조: Dahms et al.:Composition and biomechanical properties of the bladder acellular matrix graft: comparative analysis in rat, pig and human. Br J Urol, 82:411, 1998]. 각각의 표본에 대한 스트레스/긴장 곡선을 작성하고 최대 장력 강도 및 긴장 힘(MPa)을 결정한다. 궁극적 간도에 응답하여 결정되는 최대 장력 긴장은 초기 길이 대 연장된 대체 비율로서 계산한다. 통계 분석은 탈쌍된 스튜던트 t-시험(InStaTM, Graphpad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하여 수행한다. 0.05 미만의 값은 통계적으로 유의적인 것으로 사료된다.
실시예 6: 자가 세포를 사용한 조직공학적 자궁의 생성
본 연구는 자궁 조직이 자궁 상피 및 평활근 세포, 예를 들어, 생체내에서 자궁근층 세포를 사용하여 형성될 수 있음을 입증한다. 재료 및 방법은 실시예 5에 기재되어 있다.
(i) 세포 배양
래빗 자궁 상피 및 자궁근층 세포를 배양물에서 확실하게 성장시키고 증대시킨다. 현미경적으로, 상피 및 평활근 세포는 각각 전형적인 코블 석 외형 및 연장된 간질형 외형을 입증한다. 각각의 세포 유형은 각각 판사이토케라틴 AE1/AE3, 에스트로겐 수용체 β 및 평활근 특이적 α-액틴 항체를 사용하여 표현형적으로 확인한다. 상응하는 항체를 사용하는 자궁 세포에 대한 웨스턴 블롯 분석은 세포 단백질 발현을 확인시킨다.
(ii) 총체적 조사
모든 동물을 임의의 부작용이 없는 예비 결정된 시점때까지 생존시킨다. 천연 및 이식된 조직 사이의 전이 영역을 나타내는 표시 봉합선은 모든 회수된 자궁 조직 이식체에서 가시적이다. 총체적으로, 세포 시딩된 자궁 이식체는 모든 시점에서, 각각 1, 개월, 3개월 및 6개월에서 명백한 자궁뿔을 입증한다. 모든 세포 시딩된 이식체는 광범위하게 특징적인 내강을 입증한다. 처리된 자궁 이식체의 내부 내강은 정상적인 자궁 점막으로부터 명백하게 구분될 수 없는 점막 표면을 보여준다. 세포 없이 이식된 중합체 매트릭스의 내강은 1개월 시점에 붕괴하고 이식편을 축소시켜 3개월 및 6개월 시점에 섬유증이 증가한다.
(iii) 방사선 사진 연구
세포 시딩된 구조물의 자궁난관조영술은 모든 시점에서 특징적인 관형 자궁 구조가 완전히 팽창할 수 있음을 보여준다. 1개월 및 6개월 시점에 세포 시딩된 이식체의 자궁난관조영술은 샴 작동된 동물과 유사하다. 비시딩된 구조물은 수술한지 1개월 후에 자궁의 중선 절편에 현저한 협착증이 나타나고 내강은 6개월 시점에서 입증되는 바와 같이 시간 경과에 따라 완전히 붕괴한다.
(iv) 조직학적 및 면역세포화학적 분석
세포로 시딩되고 1개월 시점에 회수된 자궁 이식체는 박층의 상피 세포를 보여준다. 해체된 평활근 세포 섬유 및 분해되지 않은 중합체가 회수된 조직내에서 관찰된다. 점막하 및 근육층에 의해 둘려싸인 자궁내막 세포 라인으로 이루어진 형태학적으로 정상인 자궁조직은 3개월 시점에 검출된다. 평활근 섬유가 구성되고 배열되어 근육 조직 번들을 형성하고 균일한 층의 자궁 상피 세포는 모든 경우에서 관찰된다. 중합체 섬유는 3개월 시점에 완전히 분해된다. 각각의 세포 유형은 평활근 α-액틴, 판사이토케라틴 AE1/AE3 및 에스트로겐 수용체 β에 대한 특이적 항체를 사용하여 면역세포화학적으로 확인된다[(Vigano et al.: Acta Obstet Gynecol Scand, 72:87, 1993);(Bongso et al.: Hum Repro, 3:705, 1988);(Merviel et al. Biol Cell, 84:187, 1995)].
세포 없이 자궁 이식체는 수술한지 1개월 후 막대한 양의 섬유아세포의 침적 및 광범위하게 모여든 염증 세포를 보여준다. 판사이토케라틴 AE1/AE3 항체로 포지티브하게 염색된 분산된 상피 섬 및 해체된 평활근 α-액틴 포지티브 세포를 동정한다. 3개월 및 6개월 시점에, 세포 없이 이식체는 내강 상피 층과 함께 풍부한 연결 조직 형성을 입증하지만 단지 빈약한 해체된 근섬유를 갖는다. 회수된 자궁 이식체는 적절한 세포 구성을 입증한다. 세포 표현형은 α-액틴 및 사이토케라틴 AE1/AE3 항체로 면역염색함에 의해 확인한다.
(v)웨스턴 블롯 분석
정상 자궁 조직 및 세포 시딩된 이식체 기원의 단백질 분획은 유사하게 발현된 40-60 kDa 사이토케라틴 AE1/AE3 및 42kDa 평활근 α-액틴이 존재함을 입증한다. 중합체 고유 이식체에서 사이토케라틴 AE1/AE3 및 α-액틴의 발현이 감소되었음이 확인된다. 50kDa 에스트로겐 수용체 β의 발현은 세포 시딩된 이식체 및 정상적인 자궁 조직에서 검출되었지만 당해 단백질은 중합체 고유 이식체에서는 최소로 발현되었다.
(VI) 기관 욕조 연구
기관 욕조 연구는 도 2에 나타낸다. 조직공학적 스트립은 이식이 전기장 또는 약리학적 자극에 대해 응답을 유발하지 않은지 1개월 후에 회수한다. 3개월 및 6개월 시점에 세포 시딩된 이식체로부터의 조직 스트립은 전기장 자극에 대해 수축 반응을 나타낸다(도 2D). 6개월 시점에서 세포 시딩된 자궁 이식체의 수축 정도는 정상 자궁 조직의 약 70%이다. 최대 수축 강도의 범위는 3.7 내지 8.7g/100mg으로 다양하다. 대부분의 처리된 조직 스트립은 40 내지 50Hz에서 최대 수축력에 도달한다. 세포 시딩된 이식체는 정상적인 자궁 조직 보다 기준선까지의 이완이 보다 느리다. 전기장 자극에 대한 정상 자궁 조직 반응은 도 2A에 나타내고 약리학적 자극(카바콜(CA), 아트로핀(AT), 페닐레프린(PE) 및 펜톨라민(PL))에 대한 반응은 도 2B 및 C에 나타낸다. 무스카린 및 아드레날린 수용체 효능제에 대한 약리학적 반응은 또한 회수 후 3개월 및 6개월 시점의 처리된 자궁 조직에서 관찰된다(도 2E 및 F).
(vii) 생기작 성질
세포 시딩된 자궁 조직의 스트레스/긴장 성질은 이식후 6개월 시점에서 정상 대조군과 유사하다. 3개월 및 6개월 시점에서 세포 시딩된 자궁 조직(□) 및 골격 고유 대조군(△) 이식체(0.25 및 0.23 대 0.15 MPa) 사이에서 최대 장력 스트레스에 있어서 상당한 차이가 주지된다(도 3A). 세포 시딩된 이식체(□) 및 골격 고유 대조군(△)에 대한 평균 최대 긴장은 6개월 시점에 상당한 차이(68% 대 38%)가 있다(도 3B).
(viii) 개요
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, 자궁 상피 및 근육 세포를 수거하고 성장시키고 증대시키고 자궁 조직 대체용 예비 성형된 중합체 골격으로 시딩한다. 이식된 자궁 세포는 생존하고 재구성할 수 있고 공간적으로 배향된 다층 자궁 조직 구조를 형성할 수 있다. 세포는 전체 연구 기간동안에 이들의 표현형의 특징을 보유한다. 자궁 세포는 면역세포화학적으로 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되는 바와 같이 에스트로겐 수용체를 갖고 있고 이것은 에스트로겐 호르몬에 응답하는 이들의 능력을 지적한다.
본 연구에 사용되는 중합체 골격은 세포 전달 비히클로서 사용되고 이것은 성숙한 조직이 형성될때까지 이의 구조적 통합성을 유지한다. 세포를 예비 성형된 자궁형 중합체 골격으로 시딩하고 당해 골격은 이식 후 3개월 시점에 분해되도록 디자인된다.
세포로 시딩된 처리된 자궁 작제물은 자궁난관조영술 및 전체 조사에 의해 입증되는 바와 같이 구조적으로 완전한 자궁 조직임을 입증한다. 세포 부재의 모든 이식체는 방해가 발생할때까지 진행되는 초기에 구속하에 형성된다. 이들 발견은 세포 부재의 단독의 골격이 정상적인 자궁 조직 재생을 위해 불충분함을 지적한다.
당해 연구에서 생성된 자궁 조직은 상피 배열된 내강으로 이루어지고 간질 및 근육 층에 의해 둘려싸여진 천연 자궁 조직에 존재하는 것들과 유사한 해부학적 및 조직학적 특징을 입증한다. 항-판사이토케라틴 AE1/AE3 및 항 평활근 α-액틴을 사용한 면역세포화학적 및 웨스턴 블롯 분석은 상피 및 근육 표현형 및 발현을 동정하였다. 추가로, 에스트로겐 수용체 β 발현은 처리된 자궁 조직내에서 확인되었다[참조: Cooke et al.: Restoration of normal morphology and estrogen responsiveness in culture vaginal and uterine epithelia transplanted with stroma. Proc Natl Acad Sci USA, 83: 2109, 1986; (Bowen et al. Characterization of a polarized porcine uterine epithelial model system. Biol Reprod, 55:613, 1996);(Classen-Linke et al.: Establishment of human endometrial cell culture system and characterization of its polarized hormone responsive epithelial cells. Cell Tissue Res, 287:171, 1997);(Glasser et al. Receptivity is a polarity dependent special function of hormonally regulated uterine epithelial cells. Microsc Res Tech, 25:106, 1993)]
처리된 자궁 조직의 물리적 성질은 정상적인 천연 조직과 유사하다. 처리된 자궁 조직은 적당한 조직 내성 및 순응을 소유한다. 수축력은 자궁 조직 기능에 대한 가장 중요한 지표중 하나 이다. 본 연구에서, 처리된 자궁 조직은 전기장 자극 및 약리학적 제제에 응답하여 큰 정도의 수축 및 이완을 입증한다.
본 연구는 생분해성 중합체 및 자가 세포를 사용한 본 발명의 방법이 자궁 생성을 위해 성공적으로 사용될 수 있음을 입증한다. 본 발명은 자궁 재구성을 위한 조직을 필요로하는 환자에게 사용될 수 있다.
등가
당업자는 통상적인 실험을 사용하여 상기된 양태를 기초로 본 발명의 추가의 특징 및 잇점을 인지하거나 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히, 첨부된 청구항에 의해 지적된 바를 제외하고는 입증된 것과 기재된 것에 의해 제한되지 않는다.
모든 간행물 및 참조문헌은 본원에서 명백하게 이의 전반적인 내용이 참조로서 인용된다.

Claims (8)

  1. 이식가능한 생체적합성 기질, 및 두 개 이상의 상이한 세포 집단을 포함하며, 이들이 생체적합성 기질위에 또는 속에 침착하여 배양되어 여성 생식기관 또는 조직을 형성하고, 상기 두 개 이상의 상이한 세포 집단은 여성 생식 세포 집단을 포함하는, 여성 생식 기관 또는 조직 구조물 재건을 위한 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 세포 집단이 실질적으로 동종의 여성 생식 상피 세포 집단을 포함함을 특징으로 하는 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 제2 세포 집단이 실질적으로 동종의 평활근 세포 집단을 포함함을 특징으로 하는 작제물.
  4. 제1항에 있어서, 여성 생식 기관 또는 조직 구조물이 질, 자궁, 나팔관 및 경관임을 특징으로 하는 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 생체적합성 기질이 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 셀룰로스성 에스테르, 불소화 폴리에틸렌, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드,폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤족사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리글리콜산, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드,폴리설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴플루오라이드, 재생 셀룰로스, 실리콘, 우레아-포름알데하이드, 이의 공중합체 및 물리적 블렌드로 이루어진 그룹으로 선택된 하나 이상의 중합체 물질로부터 형성됨을 특징으로 하는 작제물.
  6. 제1항에 있어서, 생체적합성 기질이 탈세포화된 구조물을 포함함을 특징으로 하는 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 생체적합성 기질이 폴리글리콜산 중합체를 포함함을 특징으로 하는 작제물.
  8. 제1항에 있어서, 여성 생식 기관 또는 조직 구조물이 기질 표면에 침착된 여성 생식 상피 세포 및 기질의 다른 표면에 침착된 평활근 세포를 갖는 여성 생식 기관임을 특징으로 하는 작제물.
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