JP2023515554A - グリカンのシアリル化のための酵素 - Google Patents
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Abstract
本明細書に記載されるものは、融合タンパク質、例えば、ST6Gal1又はB4GalT1の酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質、並びにそれらを産生するための方法、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞である。また、免疫グロブリンG(IgG)抗体をシアル化する(sialyating)方法も本明細書に記載される。
Description
(優先権の主張)
本出願は、2020年2月25日に出願された米国仮出願第62/981,293号及び2020年5月19日に出願された米国仮出願第63/026,927号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年2月25日に出願された米国仮出願第62/981,293号及び2020年5月19日に出願された米国仮出願第63/026,927号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
本開示は、融合タンパク質、例えば、ST6Gal1又はB4GalT1の酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質、並びにそれらを産生するための方法、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。また、免疫グロブリンG(immunoglobulin G、IgG)抗体をシアル化する(sialyating)方法も本明細書に記載される。
本開示は、融合タンパク質、例えば、ST6Gal1又はB4GalT1の酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質、並びにそれらを産生するための方法、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。また、免疫グロブリンG(immunoglobulin G、IgG)抗体をシアル化する(sialyating)方法も本明細書に記載される。
ヒトドナーのプールされた血漿(例えば、少なくとも1,000人のドナーからプールされた血漿)から調製される、静脈内免疫グロブリン(Intravenous immunoglobulin、IVIg)は、様々な炎症性障害を治療するために使用される。しかしながら、IVIg調製物は、可変有効性、臨床的リスク、高いコスト、及び有限の供給などの明白な制限を有する。異なるIVIg調製物は、臨床的に交換可能な製品として頻繁に扱われるが、選択された臨床用途において忍容性及び活性に影響を及ぼし得る製品調製物の有意差が存在することが周知である。現在の最大投与計画では、多くの場合、部分的及び不十分な持続的応答のみが得られている。加えて、大量のIVIg治療に関連する長い注入時間(4~6時間)は、注入センターにおいて多大なリソースを消費し、利便性及び生活の質などの患者によって報告される転帰に悪影響を及ぼしている。
Fcドメインシアリル化の重要な抗炎症性役割の識別は、より強力な免疫グロブリン療法を開発する機会を提示している。市販のIVIg調製は、一般に、存在する抗体のFcドメイン上で低レベルのシアリル化を示す。具体的には、それらは、Fc領域上の分枝グリカンの低レベルのジシアリル化を示す。
Washburn et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA112:E1297-E1306(2015))は、高度なテトラ-Fc-シアリル化IVIgを生成するための制御されたシアリル化プロセスについて記載し、このプロセスが一貫した強化された抗炎症活性を伴う生成物をもたらすことを示した。
本明細書に記載されるものは、非常に高いレベルのFcシアリル化を有する免疫グロブリンG(IgG)を調製するための方法である。本明細書に記載される方法は、Fcドメイン上の分岐グリカンの70%超が両方の分岐上(すなわち、α1,3分岐上及びα1,6分岐上)でシアリル化される、高シアリル化IgG(hsIgG)を提供することができる。HsIgGは、IgG1抗体が最も一般的であり、その後にIgG2が続く、IgG抗体サブタイプの多様な混合物を含有する。出発物質が何百又は何千人ものドナーからプールされたIgG抗体であるため、抗体の多様性は非常に高い。hsIgGを調製するために使用されるIgG抗体は、例えば、プールされたヒト血漿(例えば、少なくとも1,000~30,000人のドナーからプールされた血漿)から得られることができる。代替的に、市販のIVIgを含むIVIgが、hsIgGを調製するために使用されることができる。HsIgGは、IVIgよりもFc領域上の分岐グリカン上ではるかに高いレベルのシアル酸を有する。これは、構造及び活性の両方においてIVIgとは異なる組成物をもたらす。HsIgGは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2014/179601号又はWashburn et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 112:E1297-E1306(2015))に記載されるように調製されることができる。
本明細書に記載されるものは、hsIgGを調製するための改良された方法である。
高シアリル化IgGでは、Fc領域上の分岐グリカンの少なくとも60%(例えば、100%までを含む、65%、70%、75%、80%、82%、85%、87%、90%、92%、94%、95%、97%、98%)は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して(すなわち、α1,3分岐及びα1,6アームの両方の上で)ジシアリル化される。いくつかの実施形態では、Fc領域上の分枝グリカンの50%未満(例えば、40%、30%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%未満)は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介してモノシアリル化される(例えば、α1,3アーム上のみ又はα1,6アーム上のみでシアリル化される)。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、血漿、例えば、ヒト血漿に由来する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、圧倒的にIgGポリペプチド(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4、若しくはそれらの混合物)であるが、微量の他の免疫グロブリンサブクラスを含有する、微量の他のものが存在し得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例えば、抗体は、重(heavy、H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略される)と、軽(light、L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略される)とを含むことができる。別の例では、抗体は、2つの重(H)鎖可変領域と、2つの軽(L)鎖可変領域をと含む。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、及びdAb断片)、並びに完全抗体、例えば、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型のインタクトな免疫グロブリン(並びにそのサブタイプ)を包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ又はラムダ型のものであり得る。
本明細書で使用される場合、「定常領域」という用語は、抗体の1つ若しくは2つ以上の定常領域免疫グロブリンドメインに対応するか、又はそれに由来するポリペプチドを指す。定常領域は、以下の免疫グロブリンドメインのうちのいずれか又は全て、すなわち、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン(IgA、IgD、IgG、IgE、又はIgMに由来する)、及びCH4ドメイン(IgE又はIgMに由来する)を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「Fc領域」という用語は、2つの「Fcポリペプチド」のダイマーを指し、各「Fcポリペプチド」は、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、「Fc領域」は、1つ若しくは2つ以上のジスルフィド結合、化学リンカー、又はペプチドリンカーによって結合された2つのFcポリペプチドを含む。「Fcポリペプチド」は、IgA、IgD、及びIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにIgE及びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、また、これらのドメインに対する可撓性ヒンジN末端の一部又は全てを含み得る。IgGの場合、「Fcポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインCガンマ2(Cγ2)及びCガンマ3(Cγ3)、並びにCガンマ1(Cγ1)とCγ2との間のヒンジの下部を含む。Fcポリペプチドの境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fcポリペプチドは、通常、T223又はC226又はP230から開始してそのカルボキシル末端までの残基を含むように規定され、この番号付けは、Kabat et al.(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Services,Springfield,VA)におけるEUインデックスに従う。IgAの場合、Fcポリペプチドでは、免疫グロブリンドメインCアルファ2(Cα2)及びCアルファ3(Cα3)、並びにCアルファ1(Cα1)とCα2との間のヒンジの下部を含む。Fc領域は、合成、組換え、又はIVIgなどの天然源から生成され得る。
本明細書で使用するとき、「グリカン」は、糖であり、少なくとも3つの糖などの糖残基のモノマー又はポリマーであり得、直鎖状又は分枝状であり得る。「グリカン」は、天然糖残基(例えば、グルコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど)及び/又は修飾糖(例えば、2’-フルオロリボース、2’-デオキシリボース、ホスホマンノース、6’スルホN-アセチルグルコサミンなど)を含み得る。用語「グリカン」は、糖残基のホモ及びヘテロポリマーを含む。用語「グリカン」はまた、複合糖質の(例えば、ポリペプチド、糖脂質、プロテオグリカンなどの)グリカン成分も包含する。この用語は、開裂された又はそうでなければ複合糖質から放出されたグリカンを含む遊離グリカンも包含する。
本明細書で使用するとき、用語「糖タンパク質」は、1つ又は2つ以上の糖部分(すなわち、グリカン)に共有結合したペプチド骨格を含有するタンパク質を指す。糖部分は、単糖類、二糖類、オリゴ糖、及び/又は多糖類の形態であってもよい。糖部分は、単一の非分岐鎖の糖残基を含み得るか、又は1つ若しくは2つ以上の分枝鎖を含み得る。糖タンパク質は、O-結合糖部分及び/又はN-結合糖部分を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「IVIg」は、少なくとも1,000人のヒトドナーの血漿から抽出された4つ全てのIgGサブグループを含む、プールされた多価IgGの調製物である。IVIgは、免疫不全患者のための血漿タンパク質置換療法として承認されている。IVIg Fcグリカンシアリル化のレベルは、IVIg調製間で変化するが、一般に20%未満である。ジシアリル化のレベルは概ねはるかに低い。本明細書で使用される場合、「IVIgに由来する」という用語は、IVIgの操作から生じるポリペプチドを指す。例えば、IVIgから精製されたポリペプチド(例えば、シアリル化IgGのために濃縮された、又は修飾IVIg(例えば、酵素的にシアリル化されたIVIg IgG)である。
本明細書で使用するとき、「FcポリペプチドのN-グリコシル化部位」は、グリカンがN-結合されるFcポリペプチド内のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、Fc領域は、Fcポリペプチドのダイマーを含有し、Fc領域は、各Fcポリペプチド上に1つの2つのN-グリコシル化部位を含む。
本明細書で使用するとき、「分枝状グリカンのパーセント(%)」は、存在するグリカンの総モルに対するグリカンXのモル数を指し、Xは、対象とするグリカンを表す。
用語「薬学的に有効な量」又は「治療上有効な量」は、本明細書に記載される障害又は状態を有する患者の治療に有効な量(例えば、用量)を指す。本明細書では、「薬学的に有効な量」は、単独で又は他の治療薬と組み合わせて一回服用されるか、又は任意の投与量若しくは経路で摂取されるかのいずれかで、所望の治療効果を与える量として解釈され得ることも理解されたい。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、製剤又は製品及び使用説明書を含有するキットに含まれ得る。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、一般に、最終的な所定レベルのシアリル化が達成され、プロセス不純物を含まない組成物を指す。そのため、「医薬製剤」及び「医薬製品」は、ST6Galシアリルトランスフェラーゼ及び/又はシアル酸供与体(例えば、シチジン5’-モノホスホン-N-アセチルノイラミン酸)又はその副産物(例えば、シチジン5’一リン酸)を実質的に含まない。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、一般に、組換えの場合、糖タンパク質が産生された細胞(例えば、小胞体又は細胞質タンパク質及びRNA)を実質的に含まない。
「精製される」(又は「単離される」)は、天然環境に存在する他の成分から除去又は分離されるポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。例えば、単離ポリペプチドは、産生された細胞の他の成分(例えば、小胞体又は細胞質タンパク質及びRNA)から分離されたものである。単離されたポリヌクレオチドは、他の核成分(例えば、ヒストン)及び/又は上流若しくは下流核酸から分離されるものである。単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、示されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの天然環境中に存在する他の成分を60%、又は少なくとも75%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%含まなくてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「シアリル化」は、末端シアル酸を有するグリカンを指す。「モノシアリル化」という用語は、例えば、α1,3アーム又はα1,6アーム上に、1つの末端シアル酸を有する分枝グリカンを指す。用語「ジシアリル化」は、2つのアーム、例えば、α1,3アーム及びα1,6アームの両方の上に、末端シアル酸を有する分枝グリカンを指す。
本明細書で提供されるものは、N末端シグナル配列と、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1(ST6Gal1)の酵素的に活性な部分とを含む、融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4を含む。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4からなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、親和性タグを更に含む。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase、GST)、マルトース結合タンパク質(maltose-binding protein、MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ST6Gal1の酵素的に活性な部分のN末端側に向かって位置する。
いくつかの実施形態では、N末端シグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヘキサヒスチジンタグを更に含む。いくつかの実施形態では、ヘキサヒスチジンタグは、N末端シグナル配列とST6Gal1の酵素的に活性な部分との間にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号6からなる。
また、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び好ましくはベクターで安定的に形質転換された宿主細胞も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus、CMV)プロモーターである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓(human embryonic kidney、HEK)細胞又はその誘導体派生物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK誘導体HEK293である。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で本明細書に記載される宿主細胞を培養することと、培地から融合タンパク質を単離することとを含む、ポリペプチドを産生するための方法も本明細書で提供される。
また、N末端シグナル配列と、ヒトβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT1)の酵素的に活性な部分とを含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43を含む。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43からなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、親和性タグを更に含む。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、B4GalT1の酵素的に活性な部分のC末端側に向かって位置する。
いくつかの実施形態では、N末端シグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、セプタヒスチジンタグを更に含む。いくつかの実施形態では、セプタヒスチジンタグは、C末端である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号45からなる。
また、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び好ましくはベクターで安定的に形質転換された宿主細胞も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK誘導体HEK293である。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で本明細書に記載される宿主細胞を培養することと、培地から融合タンパク質を単離することとを含む、ポリペプチドを産生するための方法も本明細書で提供される。
また、a)IgG抗体を含む組成物を提供することと、
b)UDP-Gal及びCMP-NANAの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1及び配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
b)UDP-Gal及びCMP-NANAの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1及び配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
また、a)IgG抗体を含む組成物を提供することと、b)UDP-Galの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1にIgG抗体を曝露し、それによって、ガラクトシル化IgGを含む組成物を産生することと、c)CMP-NANAの存在下で、配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分にガラクトシル化IgG抗体を含む組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ガラクトシル化IgG抗体を含む組成物は、ステップ(c)の前に精製されない。
いくつかの実施形態では、方法は、組成物のうちの1つ又は2つ以上をCMP-NANAで補充することを更に含む。
いくつかの実施形態では、IgG抗体の混合物は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、sIgGを含む組成物中の抗体のFc領域上の分岐グリカンの少なくとも60%は、ジシアリル化される。
いくつかの実施形態では、sIgGを含む組成物中の抗体のFc領域上の分岐グリカンの50%未満は、モノシアリル化される。
本明細書で提供されるものは、アズロシジンシグナル配列と、配列番号4からなるヒトST6シアリルトランスフェラーゼの一部とを含む、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子で安定的に形質転換されたヒト胎児腎臓(HEK)細胞である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、アザリシジンシグナル配列と配列番号4からなるヒトST6シアリルトランスフェラーゼの一部との間に位置する、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、HHHHHHHHHH(配列番号17)、HHHHHM(配列番号18)、HHHHHHM(配列番号19)、HHHHHHM(配列番号20)、HHHHHHHHM(配列番号21)、HHHHHHHHHM(配列番号22)、及びHHHHHHHHHHM(配列番号23)から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号4に対するヒトST6シアリルトランスフェラーゼアミノ末端を欠いている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号4を含むが、配列番号4に対するヒトST6シアリルトランスフェラーゼアミノ末端を欠いている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターである。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中でHEK細胞を培養することと、培地から配列番号3を含むポリペプチドを単離することとを含む、配列番号3を含むポリペプチドを調製するための方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、単離されたポリペプチドを少なくとも95%w/wに精製することを更に含む。
また、配列番号3又は配列番号6を含むポリペプチドも本明細書で提供される。
特に定義されない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。本発明で使用するための方法及び材料が本明細書に記載され、当該技術分野において既知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定を意図したものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。不一致である場合、定義を含め本明細書が適用される。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
抗体は、それらの重鎖の定常領域内及びFab内の保存位置でグリコシル化される。例えば、Fcドメイン内で、ヒトIgG抗体は、CH2ドメインのAsn297に単一のN-結合グリコシル化部位を有する。各抗体アイソタイプは、定常領域において異なる様々なN-結合炭水化物構造を有する。ヒトIgGについては、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を伴うGlcNAc2Man3からなる。個々のIgG間の変動は、末端GlcNAcの一方若しくは両方におけるガラクトース及び/又はガラクトース-シアル酸の結合、又は第3のGlcNAcアーム(バイセクトGlcNAc)の結合を介して生じ得る。
本開示は、(例えば、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を伴う)分枝グリカンの両方の上でシアリル化される特定のレベルの分枝グリカンを有する、Fc領域を有する免疫グロブリン(例えば、ヒトIgG)を調製するための方法を部分的に包含する。レベルは、個々のFc領域上で(例えば、Fc領域内の分枝グリカンのα1,3アーム、α1,6アーム、若しくはその両方の上でシアリル化される分枝グリカンの数)、又はポリペプチドの調製物の全体的な組成上で(例えば、ポリペプチドの調製物中のFc領域内の分枝グリカンのα1,3アーム、α1,6アーム、若しくはその両方の上でシアリル化される分枝グリカンの数若しくは割合)測定されることができる。
高シアリル化IgGを調製するために使用され得る天然由来ポリペプチドとしては、例えば、ヒト血清中のIgG(1,000人を超えるドナーからプールされた特定のヒト血清)、静脈内免疫グロブリン(IVIg)、及びIVIgに由来するポリペプチド(例えば、IVIgから精製されたポリペプチド(例えば、シアリル化IgGのために濃縮された)又は修飾IVIg(例えば、酵素的にシアリル化されたIVIg IgG)が挙げられる。
N-結合オリゴ糖鎖は、小胞体の内腔内のタンパク質に添加される。具体的には、初期オリゴ糖(典型的には14糖)を、Asn-X-Ser/Thrの標的コンセンサス配列内に含有されるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に添加し、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸であってもよい。この初期オリゴ糖の構造は、殆どの真核生物に共通であり、3つのグルコース、9つのマンノース、及び2つのN-アセチルグルコサミン残基を含有する。この初期オリゴ糖鎖は、小胞体中の特定のグリコシダーゼ酵素によりトリミングすることができ、2つのN-アセチルグルコサミン及び3つのマンノース残基からなる短い分枝状コアオリゴ糖を得ることができる。分岐のうちの1つは、図1に示されるように、当該技術分野では「α1,3アーム」と称され、第2の分岐は、「α1,6アーム」と称される。
N-グリカンは、「高マンノース型」、「ハイブリッド型」、及び「複合型」と呼ばれる3つの別個の群に細分化することができ、共通の五糖コア(Man(α1,6)-(Man(α1,3))-Man(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn)は全ての3つの群で生じる。
IVIgに存在するより一般的なFcグリカンは、図2に示される。
追加的に又は代替的に、N-アセチルグルコサミンの1つ又は2つ以上の単糖単位をコアマンノースサブユニットに添加して、「複合グリカン」を形成してもよい。ガラクトースをN-アセチルグルコサミンサブユニットに添加して、かつ、ガラクトースサブユニットにシアル酸サブユニットを添加して、シアル酸、ガラクトース、又はN-アセチルグルコサミン残基のいずれかが末端となる鎖をもたらし得る。更に、フコース残基を、コアオリゴ糖のN-アセチルグルコサミン残基に添加してもよい。これらの添加の各々は、特定のグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される。
「ハイブリッドグリカン」は、高マンノース及び複合グリカンの両方の特徴を含む。例えば、ハイブリッドグリカンの1つの分岐は、主に又は排他的にマンノース残基を含んでもよく、別の分岐は、N-アセチルグルコサミン、シアル酸、ガラクトース糖及び/又はフコース糖を含んでもよい。
シアル酸は、複素環構造を有する9-炭素単糖のファミリーである。これらは、環に結合したカルボン酸基を介した負電荷、並びにN-アセチル基及びN-グリコリル基を含む他の化学的装飾を有する。哺乳類発現系で産生されるポリペプチドに見出される2つの主な種類のシアル残基は、N-アセチル-ノイラミン酸(N-acetyl-neuraminic acid、NeuAc)及びN-グリコリルノイラミン酸(N-glycolylneuraminic acid、NeuGc)である。これらは、通常、N-及びO-結合グリカンの両方の非還元末端でガラクトース(Gal)残基に結合した末端構造として生じる。これらのシアル基についてのグリコシド結合構成は、α2,3又はα2,6のいずれかであり得る。
Fc領域は、保存されたN-結合グリコシル化部位でグリコシル化される。例えば、IgG抗体の各重鎖は、CH2ドメインのAsn297に単一のN-結合グリコシル化部位を有する。IgA抗体は、CH2及びCH3ドメイン内にN-結合グリコシル化部位を有し、IgE抗体は、CH3ドメイン内にN-結合グリコシル化部位を有し、IgM抗体は、CH1、CH2、CH3、及びCH4内にN-結合グリコシル化部位を有する。
各抗体アイソタイプは、定常領域において異なる様々なN-結合炭水化物構造を有する。例えば、IgGは、C1q及びFcγRのための結合部位も含有する、Fc領域の各Fcポリペプチド中のCH2ドメインのAsn297に単一のN-結合二分岐炭水化物を有する。ヒトIgGについては、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を伴うGlcNAc2Man3からなる。個々のIgG間の変動は、一方若しくは両方の末端GlcNAcにおけるガラクトース及び/又はガラクトース-シアル酸の付着を介して、又は第3のGlcNAcアーム(バイセクトGlcNAc)の付着を介して生じ得る。
免疫グロブリン、例えば、IgG抗体は、ガラクトシル化ステップ、続いてシアリル化ステップを実行することによってシアリル化されることができる。β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4GalT)は、ウリジン5’-ジホスホセグラクトース([[(2)R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキサピリミジン-1-イル)-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メトキシ-ヒドロキシホスホリル][(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]水素リン酸塩、UDP-Gal)からGlcNAcにガラクトースをβ-1,4-結合として移動させる、II型ゴルジ膜結合糖タンパク質である。アルファ-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1(ST6)は、シチジン5’-モノホスホ-Nアセチルノイラミン酸(((2R,4S,5R,6R)-5-アセトアミド-2-[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1-イル)-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メトキシ-ヒドロキシホスホリル]オキシ-4-ヒドロキシ-6-(1,2,3-トリヒドロキシプロピル)オキサン-2-カルボン酸、CMP-NANA又はCMP-シアル酸)からGalにシアル酸をα-2,6結合として移動させる、II型ゴルジ膜結合糖タンパク質である。概略的に、反応は、図3に示されるように進む。
糖タンパク質のグリカンは、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して評価されることができる。例えば、グリカン組成物のシアリル化(例えば、α1,3アーム上及び/又はα1,6アーム上でシアリル化される分岐グリカンのレベル)は、国際公開第2014/179601号に記載される方法を使用して特性評価されることができる。
本明細書に記載の方法によって調製されたhsIgG組成物のいくつかの実施形態では、Fcドメイン上の分岐グリカンの少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、又は90%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。加えて、いくつかの実施形態では、Fabドメイン上の分岐グリカンの少なくとも40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、又は85%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。全体的に、いくつかの実施形態では、分岐グリカンの少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、又は90%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。
酵素
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)、例えば、ヒトB4GalT、例えば、ヒトB4Galt1、並びにβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトB4GalT、例えばヒトB4Galt1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。B4Galt1は、ドナー基質UDP-ガラクトースに対して排他的な特異性を有すると思われるII型膜結合糖タンパク質を各々コードする、7つのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(β4GalT)遺伝子のうちの1つであり、類似アクセプター糖:GlcNAc、Glc、及びXylに対するβ1,4結合における全ての移入ガラクトースである。B4Galt1は、単糖又は糖タンパク質炭水化物鎖の非還元末端のいずれかであるN-アセチルグルコサミン残基にガラクトースを付加する。B4GalT1は、別名GGTB2である。B4GALT1の4つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物(NCBI遺伝子ID2683)が、表1に記載される。
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)、例えば、ヒトB4GalT、例えば、ヒトB4Galt1、並びにβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトB4GalT、例えばヒトB4Galt1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。B4Galt1は、ドナー基質UDP-ガラクトースに対して排他的な特異性を有すると思われるII型膜結合糖タンパク質を各々コードする、7つのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(β4GalT)遺伝子のうちの1つであり、類似アクセプター糖:GlcNAc、Glc、及びXylに対するβ1,4結合における全ての移入ガラクトースである。B4Galt1は、単糖又は糖タンパク質炭水化物鎖の非還元末端のいずれかであるN-アセチルグルコサミン残基にガラクトースを付加する。B4GalT1は、別名GGTB2である。B4GALT1の4つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物(NCBI遺伝子ID2683)が、表1に記載される。
B4GalT1の可溶性形態は、タンパク質分解処理によって膜形態に由来する。切断部位は、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)の77~78位にある。
いくつかの実施形態では、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)のアミノ酸113、130、172、243、250、262、310、343、又は355に対応する、B4GalT1のアミノ酸のうちの1つ又は2つ以上は、(配列番号37)と比較して保存される。
例えば、B4GalT1の酵素的に活性な部分が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)、又は配列番号37のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム2(配列番号38)、又は配列番号38のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム3(配列番号39)、又は配列番号39のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム4(配列番号40)、又は配列番号40のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号41を含まない。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号42を含まない。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号41、又は膜貫通ドメイン、例えば、配列番号42を含まない。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、管腔ドメイン、例えば、配列番号43、又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントの全て又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号37又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントのアミノ酸109~398を含む。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号37、又は配列番号37のオルソログ、変異体、若しくはバリアントからなる。
B4GalT1の好適な機能部分は、配列番号43と少なくとも80%(85%、90%、95%、98%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなることができる。
ST6Gal1、例えば、ヒトST6Gal1、並びにST6Gal1の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトST6Gal1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。ST6GAL1、β-ガラクトシドα-2、6-シアリルトランスフェラーゼ1は、CMP-シアル酸からアシアロフェツイン及びアシアロ-a1-酸糖タンパク質などの糖タンパク質上のGalβ1→4GlcNAc構造にシアル酸を移動させる。ST6Gal1は、ST6N又はSIAT1とも呼ばれる。ST6GAL1(NCBI遺伝子ID6480)の2つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物が、表1に記載される。
ST6Gal1の可溶性形態は、タンパク質分解処理によって膜形態に由来する。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1アイソフォームa(配列番号28)のアミノ酸142、149、161、184、189、212、233、335、353、354、364、365、369、370、376、又は406に対応する、ST6Gal1のアミノ酸のうちの1つ又は2つ以上が、配列番号28と比較して保存される。
また、例えば、ST6Gal1の酵素的に活性な部分も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酵素は、ST6Gal1アイソフォームa(配列番号28)、又は配列番号28のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、STG6Gal1アイソフォームb(配列番号29)、又は配列番号29のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号34を含まない。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号35を含まない。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号34、又は膜貫通ドメイン、例えば、配列番号35を含まない。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、管腔ドメイン、例えば、配列番号36、又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントの全て又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号28(配列番号4)又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントのアミノ酸87~406を含む。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4、又は配列番号4のオルソログ、変異体、若しくはバリアントからなる。
ST6Gal1の好適な機能部分は、配列番号3若しくは配列番号4と少なくとも80%(85%、90%、95%、98%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなることができる。
バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素は、例示的な配列(例えば、本明細書で提供されるような)のアミノ酸配列と少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、又は100%同一であり、例えば、保存的変異と置換された、例えば、本明細書に記載の変異を含むか、又はそれに加えて、例えば、例示的な配列の残基の最大1%、2%、5%、10%、15%、又は20%までの差を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親、例えば、β-ガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性又はβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の所望の活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素は、例示的な配列(例えば、本明細書で提供されるような)のアミノ酸配列と少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、又は100%同一であり、例えば、保存的変異と置換された、例えば、本明細書に記載の変異を含むか、又はそれに加えて、例えば、例示的な配列の残基の最大1%、2%、5%、10%、15%、又は20%までの差を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親、例えば、β-ガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性又はβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の所望の活性を保持する。
2つの核酸配列の同一性率を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される(例えば、ギャップが、最適な整列のために第1及び第2のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入されることができ、非相同配列は、比較目的のために無視されることができる)。比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも80%であり、いくつかの実施形態では、少なくとも90%又は100%である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアヌクレオチドが、比較される。第1の配列内の位置が第2の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置で同一である(本明細書で使用される場合、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と同等である)。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列を最適にアライメントするために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列が共有している同一の位置の数の関数である。
対象ポリペプチド又は核酸配列(すなわち、クエリ)と第2のポリペプチド又は核酸配列(すなわち、標的)との間の同一性率は、例えば、Smith Waterman Alignment(Smith,T.F.and M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-7)、GeneMatcher Plus(商標)に組み込まれた「BestFit」(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics,482-489(1981))、Schwarz and Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhof,M.O.,Ed,pp 353-358、BLASTプログラム(Basic Local Alignment Search Tool、(Altschul,S.F.,W.Gish,et al.(1990)J Mol Biol 215:403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野内である様々な方法で決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたって最大整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。一般に、標的タンパク質又は核酸については、比較の長さは、標的の全長までを含む、任意の長さ(例えば、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%)であり得る。本開示の目的のために、同一性率は、クエリ配列の全長に対するものである。
本開示の目的のために、配列の比較及び2つの配列間の同一性率の決定は、12のギャップペナルティ、4のギャップ伸長ペナルティ、及び5のフレームシフトギャップペナルティとともにBlossum 62スコアリングマトリックスを使用して、達成されることができる。
保存的置換は、典型的には、以下の群を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。
融合タンパク質
また、本明細書に記載される酵素又はその一部を含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
また、本明細書に記載される酵素又はその一部を含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
一実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、約15~約20アミノ酸、例えば、約15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、n領域及びc領域が両側に配置された疎水性コア領域(h領域)を含む。いくつかの実施形態では、c領域は、シグナルペプチダーゼコンセンサス切断部位を含む。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端シグナル配列である。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、血清アルブミンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、血清アルブミンシグナル配列は、MKWVTFISLLFLFSSAYS(配列番号46)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫グロブリン重鎖シグナル配列である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖シグナル配列は、MDWTWRVFCLLAVTPGAHP(配列番号47)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫グロブリン軽鎖シグナル配列である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖シグナル配列は、MDWTWRVFCLLAVTPGAHP(配列番号48)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、シスタチンSシグナル配列である。いくつかの実施形態では、シスタチン-Sシグナル配列は、MARPLCTLLLLMATLAGALA(配列番号49)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、IgKappaシグナル配列である。いくつかの実施形態では、IgKappaシグナル配列は、MDMRAPAGIFGFLLVLFPGYRS(配列番号50)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、トリプソニゲン2シグナル配列である。いくつかの実施形態では、トリプソニゲン2シグナル配列は、MRSLVFVLLIGAAFA(配列番号51)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、カリウムチャネル遮断シグナル配列である。いくつかの実施形態では、カリウムチャネル遮断配列は、MSRLFVFILIALFLSAIIDVMS(配列番号52)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アルファコノトキシンIp1.3シグナル配列である。いくつかの実施形態では、アルファコノトキシンIp1.3シグナル配列は、MGMRMMFIMFMLVVLATTVVS(配列番号53)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、α-ガラクトシダーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、α-ガラクトシダーゼシグナル配列は、MRAFLFLTACISLPGVFG(配列番号54)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、セルラーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、セルラーゼシグナル配列は、MKFQSTLLLAAAAGSALA(配列番号55)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン-1シグナル配列である。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン-1シグナル配列は、MASSLYSFLLALSIVYIFVAPTHS(配列番号56)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酸キチナーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、酸キチナーゼシグナル配列は、MKTHYSSAILPILTLFVFLSINPSHG(配列番号57)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、K28プレプロトキシンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、K28プレプロトキシンシグナル配列は、MESVSSLFNIFSTIMVNYKSLVLALLSVSNLKYARG(配列番号58)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、キラー毒素ジゴシン前駆体シグナル配列である。いくつかの実施形態では、キラー毒素ジゴシン前駆体シグナル配列は、MKAAQILTASIVSLLPIYTSA(配列番号59)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、コレラ毒素シグナル配列である。いくつかの実施形態では、コレラ毒素シグナル配列は、MIKLKFGVFFTVLLSSAYA(配列番号60)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ヒト成長ホルモンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、ヒト成長ホルモンシグナル配列は、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(配列番号61)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、1つ又は2つ以上の親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Strep-Tag(登録商標)、例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ(例えば、AviTag(商標))、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、酵素又はその一部のN末端側に向かって位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、N末端である。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、酵素又はその一部のC末端側に向かって位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、C末端である。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、ヘキサヒスチジンタグ(例えば、HHHHHH(配列番号13))である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号43、配列番号44、若しくは配列番号45を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号3若しくは配列番号5を含むか、又はそれからなる。
発現系
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましくあり得る。これは、様々な方法で実施されることができる。例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸は、複製及び/又は発現のための原核細胞又は真核細胞への形質転換のために、中間ベクターにクローニングされることができる。中間ベクターは、典型的には、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵又は操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、若しくは昆虫ベクターである。酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞若しくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングされることができる。
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましくあり得る。これは、様々な方法で実施されることができる。例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸は、複製及び/又は発現のための原核細胞又は真核細胞への形質転換のために、中間ベクターにクローニングされることができる。中間ベクターは、典型的には、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵又は操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、若しくは昆虫ベクターである。酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞若しくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングされることができる。
発現を得るために、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。好適な細菌及び真核生物プロモーターは、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001)、Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)、及びCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,2010)に記載されている。操作されたタンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp.、及びSalmonellaで利用可能である(Palva et al.,1983,Gene 22:229-235)。そのような発現系のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、また、市販されている。
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、強力な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現及び精製に使用される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、EF-1α(EF1A)、伸長因子1α短(EFS)、CMVエンハンサーニワトリβ-アクチンプロモーター及びウサギβ-グロビンスプライスアクセプター部位(CAG)、ハイブリッドCBA(CBh)、脾臓フォーカス形成ウイルス(spleen focus-forming virus、SFFV)、マウス幹細胞ウイルス(murine stem cell virus、MSCV)、シミアンウイルス40(simian virus 40、SV40)、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1(mouse phosphoglycerate kinase 1、mPGK)、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ1(human phosphoglycerate kinase 1、hPGK)、及びユビキチンC(ubiquitin C、UBC)プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、原核生物又は真核生物のいずれかである、宿主細胞内の核酸の発現のために必要とされる全ての追加の要素を含有する、転写ユニット又は発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーターと、例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結のために必要とされる、任意のシグナルとを含有する。カセットの追加の要素は、例えば、エンハンサー、及び異種のスプライスされたイントロンシグナルを含み得る。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element、WPRE)を含む。例えば、Zufferey et al.,「Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element Enhances Expression of Transgenes Delivered by Retroviral Vectors」,Journal of Virology 73(4):2886-92(1999)を参照されたい。
遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、酵素及び/又は融合タンパク質の意図された使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。
標準的なトランスフェクション法が、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母、又は昆虫細胞株を産生するために使用され、それらは次いで、標準的技法を使用して精製される(例えば、Colley et al.,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990)を参照されたい)。真核及び原核細胞の形質転換は、標準的技法に従って実施される(例えば、Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349-351、Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al.,eds,1983を参照されたい)。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための既知の手順のうちのいずれかが、使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、エピソーム及び統合の両方であるプラスミドベクター、並びにクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のうちのいずれかの使用が含まれる(例えば、上記のSambrook et al.を参照されたい)。使用される特定の遺伝子操作手順は、酵素及び/又は融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を正常に導入することが可能であることのみが必要である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、安定的に形質転換される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非低酸素条件下で成長する。
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質は、宿主細胞ベースの発現系、合成生物学プラットフォーム、又は無細胞タンパク質産生プラットフォームなどの当該技術分野で既知の任意のタンパク質産生系によって産生されることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質産生系は、グリコシル化、例えば、N-グリコシル化タンパク質、ジスルフィド結合形成、及びチロシンリン酸化のうちの1つ又は2つ以上を含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾が可能である。例えば、Boh and Ng,「Impact of Host Cell Line Choice on Glycan Profile」,Critical Reviews in Biotechnology 38(6):851-67(2018)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary、CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney、BHK)細胞、NS0骨髄腫細胞、Sp2/0ハイブリドーママウス細胞、ヒト胎児腎臓細胞(HEK)、HT-1080ヒト細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞、BHK-21細胞、マウスNS0骨髄腫細胞、Sp2/0ハイブリドーマ細胞、及びそれらの誘導体から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、HEK、PER.C6、CEVECの膜細胞産生(CEVEC’s amniocyte production、CAP)、AGE1.HM、HKB-11、HT-1080細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓細胞(HEK、ATCC(登録商標)CRL-1573(商標))又はその誘導体である。
いくつかの実施形態では、HEK細胞は、SV40 T抗原の温度感受性対立遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、エチルメタンスルホネート(ethymethanesulfonate、EMS)変異誘発後にリシン毒素に対して耐性であり、例えば、MGAT1遺伝子によってコードされる、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI活性を欠いている。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、主に、Man5GlcNAc2 N-グリカンで糖タンパク質を修飾する。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、tetRリプレッサーを発現し、テトラサイクリン誘導性タンパク質発現を可能にする。
いくつかの実施形態では、HEK誘導体は、HEK293、HEK293T(293tsA1609neo、ATCC(登録商標)CRL-3216(商標))、HEK293T/17(ATCC(登録商標)CRL-11268(商標))、HEK293T/17 SF(ATCC(登録商標)ACS-4500(商標))、HEK293S、HEK293SG、HEK293FTM、HEK293SGGD、HEK293FTM、HEK293E、及びHKB-11からなる群から選択される。
Kightlinger et al.,「Synthetic Glycobiology:Parts,Systems,and Applications」,ACS Synth.Biol.9:1534-62(2020)に記載されるものなどの合成生物学プラットフォームもまた、本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を産生するために好適である。
また、ベクター及び細胞を含む細胞、並びに、例えば、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載のタンパク質及び核酸を含むキットも本明細書で提供される。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例に更に記載される。
実施例1:高シアリル化IgGの調製
全体的な分岐グリカンの60%超がジシアリル化されるIgGは、以下のように調製されることができる。
全体的な分岐グリカンの60%超がジシアリル化されるIgGは、以下のように調製されることができる。
簡潔に述べると、IgG抗体の混合物が、β1,4ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4-GalT)及びα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6-Gal1)酵素を使用して逐次酵素反応に曝露される。B4-GalTは、ST6-Gal1の付加の前に反応から除去される必要はなく、生成物の部分的又は完全な精製は、酵素反応の合間に必要とされない。
ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は、ガラクトース残基を既存のアスパラギン結合グリカンに選択的に付加する。結果として生じるガラクトシル化グリカンは、シアル酸残基を選択的に付加して、付着したアスパラギン結合グリカン構造にキャップ形成する、シアル酸転移酵素への基質としての役割を果たす。したがって、全体的なシアリル化反応は、2つの糖ヌクレオチド(ウリジン5’-ジホスホガラクトース(UDPGal)及びシチジン-5’-モノホスホロ-N-アセチルノイラミン酸(CMP-NANA))を採用した。後者は、周期的に補充され、モノシアリル化生成物に対してジシアリル化生成物を増加させる。反応は、共因子塩化マンガンを含む。
IVIg及び反応生成物から始まるそのような反応のIgG-Fcグリカンプロファイルの代表的な例が、図4に示される。図4では、左に、IgGをhsIgGに変換するための酵素的シアリル化反応の概略図があり、右に、出発IVIg及びhsIgGのIgG Fcグリカンプロファイルがある。この研究では、異なるIgGサブクラスのグリカンプロファイルは、グリコペプチド質量分析を介して導出される。異なるIgGサブクラスのための糖ペプチドを定量化するために使用されるペプチド配列は、IgG1=EEQYNSTYR(配列番号7)、IgG2/3 EEQFNSTFR(配列番号8)、IgG3/4 EEQYNSTFR(配列番号9)、及びEEQFNSTYR(配列番号10)であった。
グリカンデータは、IgGサブクラス当たりに示される。IgG3及びIgG4サブクラスからのグリカンは、別々に定量化することができない。示されるように、IVIgについては、全ての非シアリル化グリカンの合計は80%超であり、全てのシアリル化グリカンの合計は<20%である。反応生成物について、全ての非シアリル化グリカンの合計は<20%であり、全てのシアリル化グリカンの合計は80%よりも多い。グリコプロファイルに列挙されている異なるグリカンの命名法は、N結合グリカンのOxford表記を使用する。
実施例2:代替的なシアリル化条件
例えば、50mMのBIS-TRIS(pH6.9)中でhsIgGを作成するためのガラクトシル化及びシアリル化のための代替的な好適な反応条件は、以下のように、IgG抗体(例えば、プールされたIgG抗体、プールされた免疫グロブリン、又はIVIg)のガラクトシル化を含む:7.4mMのMnCl2、38μmolのUDP-Gal/g IgG抗体、及び37℃で16~24時間のインキュベーション、続いて、7.4mMのMnCl2におけるシアリル化を伴う7.5単位のB4GalT/g IgG抗体、220μmolのCMP-NANA/g IgG抗体(2回、すなわち、反応開始時に1回及び9~10時間後に再度添加される)、37℃で30~33時間のインキュベーションを伴う15単位のST6-Gal1/g IgG抗体。反応は、ST6-Gal1及びCMP-NANAをガラクトシル化反応に添加することによって実行されることができる。代替的に、反応物の全てが開始時に組み合わせられることができ、CMP-NANAが補充されることができる。
例えば、50mMのBIS-TRIS(pH6.9)中でhsIgGを作成するためのガラクトシル化及びシアリル化のための代替的な好適な反応条件は、以下のように、IgG抗体(例えば、プールされたIgG抗体、プールされた免疫グロブリン、又はIVIg)のガラクトシル化を含む:7.4mMのMnCl2、38μmolのUDP-Gal/g IgG抗体、及び37℃で16~24時間のインキュベーション、続いて、7.4mMのMnCl2におけるシアリル化を伴う7.5単位のB4GalT/g IgG抗体、220μmolのCMP-NANA/g IgG抗体(2回、すなわち、反応開始時に1回及び9~10時間後に再度添加される)、37℃で30~33時間のインキュベーションを伴う15単位のST6-Gal1/g IgG抗体。反応は、ST6-Gal1及びCMP-NANAをガラクトシル化反応に添加することによって実行されることができる。代替的に、反応物の全てが開始時に組み合わせられることができ、CMP-NANAが補充されることができる。
実施例3:ST6Galの産生
ST6Galの酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質は、HEK細胞における高レベル発現及び精製の容易性のために設計された。配列番号6は、ヒトST6Gal(配列番号4)の一部、6HISタグ、アズロシジン由来のシグナル配列(MTRLTVLALL AGLLASSRAGSSPLLD(配列番号31)、19 aaは、下線付けされた信号である)、及びクローニングプロセスから生じるアミノ酸を含む、未成熟融合タンパク質である。配列番号3は、分泌型であり、配列番号5は、6HISタグ及びST6GalT部分を含む。
ST6Galの酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質は、HEK細胞における高レベル発現及び精製の容易性のために設計された。配列番号6は、ヒトST6Gal(配列番号4)の一部、6HISタグ、アズロシジン由来のシグナル配列(MTRLTVLALL AGLLASSRAGSSPLLD(配列番号31)、19 aaは、下線付けされた信号である)、及びクローニングプロセスから生じるアミノ酸を含む、未成熟融合タンパク質である。配列番号3は、分泌型であり、配列番号5は、6HISタグ及びST6GalT部分を含む。
HEK293細胞(Expi293F(登録商標)細胞、Life Technologies)は、CMVプロモーターの制御下で配列番号6を有するポリペプチドを発現するベクターで安定的にトランスフェクトされた。ST6GalT融合タンパク質を産生するために、安定的にトランスフェクトされ、クローン的に選択された細胞が、計数され、0日目に0.4E6細胞/mLの細胞密度で播種され、37℃、5%CO2、130~150rpmで成長させられた。4日目に、10%グルコース/培地の供給が、細胞に添加された。成長が、毎日監視された。7日目に、細胞上清が採取され、0.45ミクロンフィルター、次いで、0.2ミクロンフィルターを通して滅菌濾過された。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と関連して記載されてきたが、前述の説明は本発明の範囲を例示したものであって、発明の範囲を限定することを意図したものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されると理解される。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明はその詳細な説明と関連して記載されてきたが、前述の説明は本発明の範囲を例示したものであって、発明の範囲を限定することを意図したものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されると理解される。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
(優先権の主張)
本出願は、2020年2月25日に出願された米国仮出願第62/981,293号及び2020年5月19日に出願された米国仮出願第63/026,927号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年2月25日に出願された米国仮出願第62/981,293号及び2020年5月19日に出願された米国仮出願第63/026,927号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記ASCIIコピーは、2021年4月5日に作成され、名称は14131-0227WO1_SL.txtであり、サイズは54,833バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記ASCIIコピーは、2021年4月5日に作成され、名称は14131-0227WO1_SL.txtであり、サイズは54,833バイトである。
(発明の分野)
本開示は、融合タンパク質、例えば、ST6Gal1又はB4GalT1の酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質、並びにそれらを産生するための方法、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。また、免疫グロブリンG(immunoglobulin G、IgG)抗体をシアル化する(sialyating)方法も本明細書に記載される。
本開示は、融合タンパク質、例えば、ST6Gal1又はB4GalT1の酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質、並びにそれらを産生するための方法、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。また、免疫グロブリンG(immunoglobulin G、IgG)抗体をシアル化する(sialyating)方法も本明細書に記載される。
ヒトドナーのプールされた血漿(例えば、少なくとも1,000人のドナーからプールされた血漿)から調製される、静脈内免疫グロブリン(Intravenous immunoglobulin、IVIg)は、様々な炎症性障害を治療するために使用される。しかしながら、IVIg調製物は、可変有効性、臨床的リスク、高いコスト、及び有限の供給などの明白な制限を有する。異なるIVIg調製物は、臨床的に交換可能な製品として頻繁に扱われるが、選択された臨床用途において忍容性及び活性に影響を及ぼし得る製品調製物の有意差が存在することが周知である。現在の最大投与計画では、多くの場合、部分的及び不十分な持続的応答のみが得られている。加えて、大量のIVIg治療に関連する長い注入時間(4~6時間)は、注入センターにおいて多大なリソースを消費し、利便性及び生活の質などの患者によって報告される転帰に悪影響を及ぼしている。
Fcドメインシアリル化の重要な抗炎症性役割の識別は、より強力な免疫グロブリン療法を開発する機会を提示している。市販のIVIg調製は、一般に、存在する抗体のFcドメイン上で低レベルのシアリル化を示す。具体的には、それらは、Fc領域上の分枝グリカンの低レベルのジシアリル化を示す。
Washburn et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 112:E1297-E1306(2015))は、高度なテトラ-Fc-シアリル化IVIgを生成するための制御されたシアリル化プロセスについて記載し、このプロセスが一貫した強化された抗炎症活性を伴う生成物をもたらすことを示した。
本明細書に記載されるものは、非常に高いレベルのFcシアリル化を有する免疫グロブリンG(IgG)を調製するための方法である。本明細書に記載される方法は、Fcドメイン上の分岐グリカンの70%超が両方の分岐上(すなわち、α1,3分岐上及びα1,6分岐上)でシアリル化される、高シアリル化IgG(hsIgG)を提供することができる。HsIgGは、IgG1抗体が最も一般的であり、その後にIgG2が続く、IgG抗体サブタイプの多様な混合物を含有する。出発物質が何百又は何千人ものドナーからプールされたIgG抗体であるため、抗体の多様性は非常に高い。hsIgGを調製するために使用されるIgG抗体は、例えば、プールされたヒト血漿(例えば、少なくとも1,000~30,000人のドナーからプールされた血漿)から得られることができる。代替的に、市販のIVIgを含むIVIgが、hsIgGを調製するために使用されることができる。HsIgGは、IVIgよりもFc領域上の分岐グリカン上ではるかに高いレベルのシアル酸を有する。これは、構造及び活性の両方においてIVIgとは異なる組成物をもたらす。HsIgGは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2014/179601号又はWashburn et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 112:E1297-E1306(2015))に記載されるように調製されることができる。
本明細書に記載されるものは、hsIgGを調製するための改良された方法である。
高シアリル化IgGでは、Fc領域上の分岐グリカンの少なくとも60%(例えば、100%までを含む、65%、70%、75%、80%、82%、85%、87%、90%、92%、94%、95%、97%、98%)は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して(すなわち、α1,3分岐及びα1,6アームの両方の上で)ジシアリル化される。いくつかの実施形態では、Fc領域上の分枝グリカンの50%未満(例えば、40%、30%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%未満)は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介してモノシアリル化される(例えば、α1,3アーム上のみ又はα1,6アーム上のみでシアリル化される)。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、血漿、例えば、ヒト血漿に由来する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、圧倒的にIgGポリペプチド(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4、若しくはそれらの混合物)であるが、微量の他の免疫グロブリンサブクラスを含有する、微量の他のものが存在し得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例えば、抗体は、重(heavy、H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略される)と、軽(light、L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略される)とを含むことができる。別の例では、抗体は、2つの重(H)鎖可変領域と、2つの軽(L)鎖可変領域をと含む。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、及びdAb断片)、並びに完全抗体、例えば、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型のインタクトな免疫グロブリン(並びにそのサブタイプ)を包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ又はラムダ型のものであり得る。
本明細書で使用される場合、「定常領域」という用語は、抗体の1つ若しくは2つ以上の定常領域免疫グロブリンドメインに対応するか、又はそれに由来するポリペプチドを指す。定常領域は、以下の免疫グロブリンドメインのうちのいずれか又は全て、すなわち、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン(IgA、IgD、IgG、IgE、又はIgMに由来する)、及びCH4ドメイン(IgE又はIgMに由来する)を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「Fc領域」という用語は、2つの「Fcポリペプチド」のダイマーを指し、各「Fcポリペプチド」は、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、「Fc領域」は、1つ若しくは2つ以上のジスルフィド結合、化学リンカー、又はペプチドリンカーによって結合された2つのFcポリペプチドを含む。「Fcポリペプチド」は、IgA、IgD、及びIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにIgE及びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、また、これらのドメインに対する可撓性ヒンジN末端の一部又は全てを含み得る。IgGの場合、「Fcポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインCガンマ2(Cγ2)及びCガンマ3(Cγ3)、並びにCガンマ1(Cγ1)とCγ2との間のヒンジの下部を含む。Fcポリペプチドの境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fcポリペプチドは、通常、T223又はC226又はP230から開始してそのカルボキシル末端までの残基を含むように規定され、この番号付けは、Kabat et al.(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Services,Springfield,VA)におけるEUインデックスに従う。IgAの場合、Fcポリペプチドでは、免疫グロブリンドメインCアルファ2(Cα2)及びCアルファ3(Cα3)、並びにCアルファ1(Cα1)とCα2との間のヒンジの下部を含む。Fc領域は、合成、組換え、又はIVIgなどの天然源から生成され得る。
本明細書で使用するとき、「グリカン」は、糖であり、少なくとも3つの糖などの糖残基のモノマー又はポリマーであり得、直鎖状又は分枝状であり得る。「グリカン」は、天然糖残基(例えば、グルコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど)及び/又は修飾糖(例えば、2’-フルオロリボース、2’-デオキシリボース、ホスホマンノース、6’スルホN-アセチルグルコサミンなど)を含み得る。用語「グリカン」は、糖残基のホモ及びヘテロポリマーを含む。用語「グリカン」はまた、複合糖質の(例えば、ポリペプチド、糖脂質、プロテオグリカンなどの)グリカン成分も包含する。この用語は、開裂された又はそうでなければ複合糖質から放出されたグリカンを含む遊離グリカンも包含する。
本明細書で使用するとき、用語「糖タンパク質」は、1つ又は2つ以上の糖部分(すなわち、グリカン)に共有結合したペプチド骨格を含有するタンパク質を指す。糖部分は、単糖類、二糖類、オリゴ糖、及び/又は多糖類の形態であってもよい。糖部分は、単一の非分岐鎖の糖残基を含み得るか、又は1つ若しくは2つ以上の分枝鎖を含み得る。糖タンパク質は、O-結合糖部分及び/又はN-結合糖部分を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「IVIg」は、少なくとも1,000人のヒトドナーの血漿から抽出された4つ全てのIgGサブグループを含む、プールされた多価IgGの調製物である。IVIgは、免疫不全患者のための血漿タンパク質置換療法として承認されている。IVIg Fcグリカンシアリル化のレベルは、IVIg調製間で変化するが、一般に20%未満である。ジシアリル化のレベルは概ねはるかに低い。本明細書で使用される場合、「IVIgに由来する」という用語は、IVIgの操作から生じるポリペプチドを指す。例えば、IVIgから精製されたポリペプチド(例えば、シアリル化IgGのために濃縮された、又は修飾IVIg(例えば、酵素的にシアリル化されたIVIg IgG)である。
本明細書で使用するとき、「FcポリペプチドのN-グリコシル化部位」は、グリカンがN-結合されるFcポリペプチド内のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、Fc領域は、Fcポリペプチドのダイマーを含有し、Fc領域は、各Fcポリペプチド上に1つの2つのN-グリコシル化部位を含む。
本明細書で使用するとき、「分枝状グリカンのパーセント(%)」は、存在するグリカンの総モルに対するグリカンXのモル数を指し、Xは、対象とするグリカンを表す。
用語「薬学的に有効な量」又は「治療上有効な量」は、本明細書に記載される障害又は状態を有する患者の治療に有効な量(例えば、用量)を指す。本明細書では、「薬学的に有効な量」は、単独で又は他の治療薬と組み合わせて一回服用されるか、又は任意の投与量若しくは経路で摂取されるかのいずれかで、所望の治療効果を与える量として解釈され得ることも理解されたい。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、製剤又は製品及び使用説明書を含有するキットに含まれ得る。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、一般に、最終的な所定レベルのシアリル化が達成され、プロセス不純物を含まない組成物を指す。そのため、「医薬製剤」及び「医薬製品」は、ST6Galシアリルトランスフェラーゼ及び/又はシアル酸供与体(例えば、シチジン5’-モノホスホン-N-アセチルノイラミン酸)又はその副産物(例えば、シチジン5’一リン酸)を実質的に含まない。
「医薬製剤」及び「医薬製品」は、一般に、組換えの場合、糖タンパク質が産生された細胞(例えば、小胞体又は細胞質タンパク質及びRNA)を実質的に含まない。
「精製される」(又は「単離される」)は、天然環境に存在する他の成分から除去又は分離されるポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。例えば、単離ポリペプチドは、産生された細胞の他の成分(例えば、小胞体又は細胞質タンパク質及びRNA)から分離されたものである。単離されたポリヌクレオチドは、他の核成分(例えば、ヒストン)及び/又は上流若しくは下流核酸から分離されるものである。単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、示されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの天然環境中に存在する他の成分を60%、又は少なくとも75%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%含まなくてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「シアリル化」は、末端シアル酸を有するグリカンを指す。「モノシアリル化」という用語は、例えば、α1,3アーム又はα1,6アーム上に、1つの末端シアル酸を有する分枝グリカンを指す。用語「ジシアリル化」は、2つのアーム、例えば、α1,3アーム及びα1,6アームの両方の上に、末端シアル酸を有する分枝グリカンを指す。
本明細書で提供されるものは、N末端シグナル配列と、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1(ST6Gal1)の酵素的に活性な部分とを含む、融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4を含む。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4からなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、親和性タグを更に含む。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase、GST)、マルトース結合タンパク質(maltose-binding protein、MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ST6Gal1の酵素的に活性な部分のN末端側に向かって位置する。
いくつかの実施形態では、N末端シグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヘキサヒスチジンタグ(配列番号13)を更に含む。いくつかの実施形態では、ヘキサヒスチジンタグ(配列番号13)は、N末端シグナル配列とST6Gal1の酵素的に活性な部分との間にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号6からなる。
また、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び好ましくはベクターで安定的に形質転換された宿主細胞も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus、CMV)プロモーターである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓(human embryonic kidney、HEK)細胞又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK誘導体HEK293である。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で本明細書に記載される宿主細胞を培養することと、培地から融合タンパク質を単離することとを含む、ポリペプチドを産生するための方法も本明細書で提供される。
また、N末端シグナル配列と、ヒトβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT1)の酵素的に活性な部分とを含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43を含む。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43からなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、親和性タグを更に含む。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、B4GalT1の酵素的に活性な部分のC末端側に向かって位置する。
いくつかの実施形態では、N末端シグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号43を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、セプタヒスチジンタグ(配列番号14)を更に含む。いくつかの実施形態では、セプタヒスチジンタグ(配列番号14)は、C末端である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号45からなる。
また、融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び好ましくはベクターで安定的に形質転換された宿主細胞も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK誘導体HEK293である。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で本明細書に記載される宿主細胞を培養することと、培地から融合タンパク質を単離することとを含む、ポリペプチドを産生するための方法も本明細書で提供される。
また、a)IgG抗体を含む組成物を提供することと、
b)UDP-Gal及びCMP-NANAの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1及び配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
b)UDP-Gal及びCMP-NANAの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1及び配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
また、a)IgG抗体を含む組成物を提供することと、b)UDP-Galの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1にIgG抗体を曝露し、それによって、ガラクトシル化IgGを含む組成物を産生することと、c)CMP-NANAの存在下で、配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分にガラクトシル化IgG抗体を含む組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、免疫グロブリンG(IgG)をシアル化する(sialyating)ための方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ガラクトシル化IgG抗体を含む組成物は、ステップ(c)の前に精製されない。
いくつかの実施形態では、方法は、組成物のうちの1つ又は2つ以上をCMP-NANAで補充することを更に含む。
いくつかの実施形態では、IgG抗体の混合物は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、sIgGを含む組成物中の抗体のFc領域上の分岐グリカンの少なくとも60%は、ジシアリル化される。
いくつかの実施形態では、sIgGを含む組成物中の抗体のFc領域上の分岐グリカンの50%未満は、モノシアリル化される。
本明細書で提供されるものは、アズロシジンシグナル配列と、配列番号4からなるヒトST6シアリルトランスフェラーゼの一部とを含む、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子で安定的に形質転換されたヒト胎児腎臓(HEK)細胞である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、アザリシジンシグナル配列と配列番号4からなるヒトST6シアリルトランスフェラーゼの一部との間に位置する、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、HHHHHHHHHH(配列番号17)、HHHHHM(配列番号18)、HHHHHHM(配列番号19)、HHHHHHM(配列番号20)、HHHHHHHHM(配列番号21、HHHHHHHHHM(配列番号22)、及びHHHHHHHHHHM(配列番号23)から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号4に対するヒトST6シアリルトランスフェラーゼアミノ末端を欠いている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号4を含むが、配列番号4に対するヒトST6シアリルトランスフェラーゼアミノ末端を欠いている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターである。
また、融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中でHEK細胞を培養することと、培地から配列番号3を含むポリペプチドを単離することとを含む、配列番号3を含むポリペプチドを調製するための方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、単離されたポリペプチドを少なくとも95%w/wに精製することを更に含む。
また、配列番号3又は配列番号6を含むポリペプチドも本明細書で提供される。
特に定義されない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。本発明で使用するための方法及び材料が本明細書に記載され、当該技術分野において既知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定を意図したものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。不一致である場合、定義を含め本明細書が適用される。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
抗体は、それらの重鎖の定常領域内及びFab内の保存位置でグリコシル化される。例えば、Fcドメイン内で、ヒトIgG抗体は、CH2ドメインのAsn297に単一のN-結合グリコシル化部位を有する。各抗体アイソタイプは、定常領域において異なる様々なN-結合炭水化物構造を有する。ヒトIgGについては、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を伴うGlcNAc2Man3からなる。個々のIgG間の変動は、末端GlcNAcの一方若しくは両方におけるガラクトース及び/又はガラクトース-シアル酸の結合、又は第3のGlcNAcアーム(バイセクトGlcNAc)の結合を介して生じ得る。
本開示は、(例えば、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を伴う)分枝グリカンの両方の上でシアリル化される特定のレベルの分枝グリカンを有する、Fc領域を有する免疫グロブリン(例えば、ヒトIgG)を調製するための方法を部分的に包含する。レベルは、個々のFc領域上で(例えば、Fc領域内の分枝グリカンのα1,3アーム、α1,6アーム、若しくはその両方の上でシアリル化される分枝グリカンの数)、又はポリペプチドの調製物の全体的な組成上で(例えば、ポリペプチドの調製物中のFc領域内の分枝グリカンのα1,3アーム、α1,6アーム、若しくはその両方の上でシアリル化される分枝グリカンの数若しくは割合)測定されることができる。
高シアリル化IgGを調製するために使用され得る天然由来ポリペプチドとしては、例えば、ヒト血清中のIgG(1,000人を超えるドナーからプールされた特定のヒト血清)、静脈内免疫グロブリン(IVIg)、及びIVIgに由来するポリペプチド(例えば、IVIgから精製されたポリペプチド(例えば、シアリル化IgGのために濃縮された)又は修飾IVIg(例えば、酵素的にシアリル化されたIVIg IgG)が挙げられる。
N-結合オリゴ糖鎖は、小胞体の内腔内のタンパク質に添加される。具体的には、初期オリゴ糖(典型的には14糖)を、Asn-X-Ser/Thrの標的コンセンサス配列内に含有されるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に添加し、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸であってもよい。この初期オリゴ糖の構造は、殆どの真核生物に共通であり、3つのグルコース、9つのマンノース、及び2つのN-アセチルグルコサミン残基を含有する。この初期オリゴ糖鎖は、小胞体中の特定のグリコシダーゼ酵素によりトリミングすることができ、2つのN-アセチルグルコサミン及び3つのマンノース残基からなる短い分枝状コアオリゴ糖を得ることができる。分岐のうちの1つは、図1に示されるように、当該技術分野では「α1,3アーム」と称され、第2の分岐は、「α1,6アーム」と称される。
N-グリカンは、「高マンノース型」、「ハイブリッド型」、及び「複合型」と呼ばれる3つの別個の群に細分化することができ、共通の五糖コア(Man(α1,6)-(Man(α1,3))-Man(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn)は全ての3つの群で生じる。
IVIgに存在するより一般的なFcグリカンは、図2に示される。
追加的に又は代替的に、N-アセチルグルコサミンの1つ又は2つ以上の単糖単位をコアマンノースサブユニットに添加して、「複合グリカン」を形成してもよい。ガラクトースをN-アセチルグルコサミンサブユニットに添加して、かつ、ガラクトースサブユニットにシアル酸サブユニットを添加して、シアル酸、ガラクトース、又はN-アセチルグルコサミン残基のいずれかが末端となる鎖をもたらし得る。更に、フコース残基を、コアオリゴ糖のN-アセチルグルコサミン残基に添加してもよい。これらの添加の各々は、特定のグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される。
「ハイブリッドグリカン」は、高マンノース及び複合グリカンの両方の特徴を含む。例えば、ハイブリッドグリカンの1つの分岐は、主に又は排他的にマンノース残基を含んでもよく、別の分岐は、N-アセチルグルコサミン、シアル酸、ガラクトース糖及び/又はフコース糖を含んでもよい。
シアル酸は、複素環構造を有する9-炭素単糖のファミリーである。これらは、環に結合したカルボン酸基を介した負電荷、並びにN-アセチル基及びN-グリコリル基を含む他の化学的装飾を有する。哺乳類発現系で産生されるポリペプチドに見出される2つの主な種類のシアル残基は、N-アセチル-ノイラミン酸(N-acetyl-neuraminic acid、NeuAc)及びN-グリコリルノイラミン酸(N-glycolylneuraminic acid、NeuGc)である。これらは、通常、N-及びO-結合グリカンの両方の非還元末端でガラクトース(Gal)残基に結合した末端構造として生じる。これらのシアル基についてのグリコシド結合構成は、α2,3又はα2,6のいずれかであり得る。
Fc領域は、保存されたN-結合グリコシル化部位でグリコシル化される。例えば、IgG抗体の各重鎖は、CH2ドメインのAsn297に単一のN-結合グリコシル化部位を有する。IgA抗体は、CH2及びCH3ドメイン内にN-結合グリコシル化部位を有し、IgE抗体は、CH3ドメイン内にN-結合グリコシル化部位を有し、IgM抗体は、CH1、CH2、CH3、及びCH4内にN-結合グリコシル化部位を有する。
各抗体アイソタイプは、定常領域において異なる様々なN-結合炭水化物構造を有する。例えば、IgGは、C1q及びFcγRのための結合部位も含有する、Fc領域の各Fcポリペプチド中のCH2ドメインのAsn297に単一のN-結合二分岐炭水化物を有する。ヒトIgGについては、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を伴うGlcNAc2Man3からなる。個々のIgG間の変動は、一方若しくは両方の末端GlcNAcにおけるガラクトース及び/又はガラクトース-シアル酸の付着を介して、又は第3のGlcNAcアーム(バイセクトGlcNAc)の付着を介して生じ得る。
免疫グロブリン、例えば、IgG抗体は、ガラクトシル化ステップ、続いてシアリル化ステップを実行することによってシアリル化されることができる。β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4GalT)は、ウリジン5’-ジホスホセグラクトース([[(2)R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキサピリミジン-1-イル)-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メトキシ-ヒドロキシホスホリル][(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]水素リン酸塩、UDP-Gal)からGlcNAcにガラクトースをβ-1,4-結合として移動させる、II型ゴルジ膜結合糖タンパク質である。アルファ-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1(ST6)は、シチジン5’-モノホスホ-Nアセチルノイラミン酸(((2R,4S,5R,6R)-5-アセトアミド-2-[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1-イル)-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メトキシ-ヒドロキシホスホリル]オキシ-4-ヒドロキシ-6-(1,2,3-トリヒドロキシプロピル)オキサン-2-カルボン酸、CMP-NANA又はCMP-シアル酸)からGalにシアル酸をα-2,6結合として移動させる、II型ゴルジ膜結合糖タンパク質である。概略的に、反応は、図3に示されるように進む。
糖タンパク質のグリカンは、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して評価されることができる。例えば、グリカン組成物のシアリル化(例えば、α1,3アーム上及び/又はα1,6アーム上でシアリル化される分岐グリカンのレベル)は、国際公開第2014/179601号に記載される方法を使用して特性評価されることができる。
本明細書に記載の方法によって調製されたhsIgG組成物のいくつかの実施形態では、Fcドメイン上の分岐グリカンの少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、又は90%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。加えて、いくつかの実施形態では、Fabドメイン上の分岐グリカンの少なくとも40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、又は85%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。全体的に、いくつかの実施形態では、分岐グリカンの少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、又は90%は、NeuAc-α2,6-Gal末端結合を介して接続されるα1,3アーム及びα1,6アームの両方の上にシアル酸を有する。
酵素
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)、例えば、ヒトB4GalT、例えば、ヒトB4Galt1、並びにβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトB4GalT、例えばヒトB4Galt1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。B4Galt1は、ドナー基質UDP-ガラクトースに対して排他的な特異性を有すると思われるII型膜結合糖タンパク質を各々コードする、7つのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(β4GalT)遺伝子のうちの1つであり、類似アクセプター糖:GlcNAc、Glc、及びXylに対するβ1,4結合における全ての移入ガラクトースである。B4Galt1は、単糖又は糖タンパク質炭水化物鎖の非還元末端のいずれかであるN-アセチルグルコサミン残基にガラクトースを付加する。B4GalT1は、別名GGTB2である。B4GALT1の4つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物(NCBI遺伝子ID2683)が、表1に記載される。
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)、例えば、ヒトB4GalT、例えば、ヒトB4Galt1、並びにβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT)の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトB4GalT、例えばヒトB4Galt1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。B4Galt1は、ドナー基質UDP-ガラクトースに対して排他的な特異性を有すると思われるII型膜結合糖タンパク質を各々コードする、7つのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(β4GalT)遺伝子のうちの1つであり、類似アクセプター糖:GlcNAc、Glc、及びXylに対するβ1,4結合における全ての移入ガラクトースである。B4Galt1は、単糖又は糖タンパク質炭水化物鎖の非還元末端のいずれかであるN-アセチルグルコサミン残基にガラクトースを付加する。B4GalT1は、別名GGTB2である。B4GALT1の4つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物(NCBI遺伝子ID2683)が、表1に記載される。
B4GalT1の可溶性形態は、タンパク質分解処理によって膜形態に由来する。切断部位は、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)の77~78位にある。
いくつかの実施形態では、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)のアミノ酸113、130、172、243、250、262、310、343、又は355に対応する、B4GalT1のアミノ酸のうちの1つ又は2つ以上は、(配列番号37)と比較して保存される。
例えば、B4GalT1の酵素的に活性な部分が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム1(配列番号37)、又は配列番号37のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム2(配列番号38)、又は配列番号38のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム3(配列番号39)、又は配列番号39のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、B4GALT1アイソフォーム4(配列番号40)、又は配列番号40のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号41を含まない。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号42を含まない。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号41、又は膜貫通ドメイン、例えば、配列番号42を含まない。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、管腔ドメイン、例えば、配列番号63、又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントの全て又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号37又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントのアミノ酸109~398を含む。いくつかの実施形態では、B4GalT1の酵素的に活性な部分は、配列番号37、又は配列番号37のオルソログ、変異体、若しくはバリアントからなる。
B4GalT1の好適な機能部分は、配列番号43と少なくとも80%(85%、90%、95%、98%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなることができる。
ST6Gal1、例えば、ヒトST6Gal1、並びにST6Gal1の酵素的に活性な部分を含む、そのオルソログ、変異体、及びバリアント、例えば、ヒトST6Gal1、並びにそのオルソログ、変異体、及びバリアント、並びに同物質を含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために好適である。ST6GAL1、β-ガラクトシドα-2、6-シアリルトランスフェラーゼ1は、CMP-シアル酸からアシアロフェツイン及びアシアロ-a1-酸糖タンパク質などの糖タンパク質上のGalβ1→4GlcNAc構造にシアル酸を移動させる。ST6Gal1は、ST6N又はSIAT1とも呼ばれる。ST6GAL1(NCBI遺伝子ID6480)の2つのアイソフォームをコードする4つの代替転写物が、表1に記載される。
ST6Gal1の可溶性形態は、タンパク質分解処理によって膜形態に由来する。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1アイソフォームa(配列番号28)のアミノ酸142、149、161、184、189、212、233、335、353、354、364、365、369、370、376、又は406に対応する、ST6Gal1のアミノ酸のうちの1つ又は2つ以上は、配列番号28と比較して保存される。
また、例えば、ST6Gal1の酵素的に活性な部分も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酵素は、ST6Gal1アイソフォームa(配列番号28)、又は配列番号28のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。いくつかの実施形態では、酵素は、STG6Gal1アイソフォームb(配列番号29)、又は配列番号29のオルソログ、変異体、若しくはバリアントの酵素的に活性な部分である。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号34を含まない。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号35を含まない。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、細胞質ドメイン、例えば、配列番号34、又は膜貫通ドメイン、例えば、配列番号35を含まない。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、管腔ドメイン、例えば、配列番号36、又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントの全て又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号28(配列番号4)又はそのオルソログ、変異体、若しくはバリアントのアミノ酸87~406を含む。いくつかの実施形態では、ST6Gal1の酵素的に活性な部分は、配列番号4、又は配列番号4のオルソログ、変異体、若しくはバリアントからなる。
ST6Gal1の好適な機能部分は、配列番号3若しくは配列番号4と少なくとも80%(85%、90%、95%、98%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなることができる。
バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素は、例示的な配列(例えば、本明細書で提供されるような)のアミノ酸配列と少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、又は100%同一であり、例えば、保存的変異と置換された、例えば、本明細書に記載の変異を含むか、又はそれに加えて、例えば、例示的な配列の残基の最大1%、2%、5%、10%、15%、又は20%までの差を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親、例えば、β-ガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性又はβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の所望の活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素は、例示的な配列(例えば、本明細書で提供されるような)のアミノ酸配列と少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、又は100%同一であり、例えば、保存的変異と置換された、例えば、本明細書に記載の変異を含むか、又はそれに加えて、例えば、例示的な配列の残基の最大1%、2%、5%、10%、15%、又は20%までの差を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親、例えば、β-ガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性又はβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の所望の活性を保持する。
2つの核酸配列の同一性率を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される(例えば、ギャップが、最適な整列のために第1及び第2のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入されることができ、非相同配列は、比較目的のために無視されることができる)。比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも80%であり、いくつかの実施形態では、少なくとも90%又は100%である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアヌクレオチドが、比較される。第1の配列内の位置が第2の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置で同一である(本明細書で使用される場合、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と同等である)。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列を最適にアライメントするために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列が共有している同一の位置の数の関数である。
対象ポリペプチド又は核酸配列(すなわち、クエリ)と第2のポリペプチド又は核酸配列(すなわち、標的)との間の同一性率は、例えば、Smith Waterman Alignment(Smith,T.F.and M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-7)、GeneMatcher Plus(商標)に組み込まれた「BestFit」(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics,482-489(1981))、Schwarz and Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhof,M.O.,Ed,pp 353-358、BLASTプログラム(Basic Local Alignment Search Tool、(Altschul,S.F.,W.Gish,et al.(1990)J Mol Biol 215:403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野内である様々な方法で決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたって最大整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。一般に、標的タンパク質又は核酸については、比較の長さは、標的の全長までを含む、任意の長さ(例えば、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%)であり得る。本開示の目的のために、同一性率は、クエリ配列の全長に対するものである。
本開示の目的のために、配列の比較及び2つの配列間の同一性率の決定は、12のギャップペナルティ、4のギャップ伸長ペナルティ、及び5のフレームシフトギャップペナルティとともにBlossum 62スコアリングマトリックスを使用して、達成されることができる。
保存的置換は、典型的には、以下の群を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。
融合タンパク質
また、本明細書に記載される酵素又はその一部を含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
また、本明細書に記載される酵素又はその一部を含む、融合タンパク質も本明細書で提供される。
一実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、約15~約20アミノ酸、例えば、約15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、n領域及びc領域が両側に配置された疎水性コア領域(h領域)を含む。いくつかの実施形態では、c領域は、シグナルペプチダーゼコンセンサス切断部位を含む。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、N末端シグナル配列である。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アズロシジンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、アズロシジンシグナル配列は、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、血清アルブミンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、血清アルブミンシグナル配列は、MKWVTFISLLFLFSSAYS(配列番号46)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫グロブリン重鎖シグナル配列である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖シグナル配列は、MDWTWRVFCLLAVTPGAHP(配列番号47)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫グロブリン軽鎖シグナル配列である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖シグナル配列は、MDWTWRVFCLLAVTPGAHP(配列番号48)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、シスタチンSシグナル配列である。いくつかの実施形態では、シスタチン-Sシグナル配列は、MARPLCTLLLLMATLAGALA(配列番号49)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、IgKappaシグナル配列である。いくつかの実施形態では、IgKappaシグナル配列は、MDMRAPAGIFGFLLVLFPGYRS(配列番号50)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、トリプソニゲン2シグナル配列である。いくつかの実施形態では、トリプソニゲン2シグナル配列は、MRSLVFVLLIGAAFA(配列番号51)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、カリウムチャネル遮断シグナル配列である。いくつかの実施形態では、カリウムチャネル遮断配列は、MSRLFVFILIALFLSAIIDVMS(配列番号52)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アルファコノトキシンIp1.3シグナル配列である。いくつかの実施形態では、アルファコノトキシンIp1.3シグナル配列は、MGMRMMFIMFMLVVLATTVVS(配列番号53)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、α-ガラクトシダーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、α-ガラクトシダーゼシグナル配列は、MRAFLFLTACISLPGVFG(配列番号54)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、セルラーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、セルラーゼシグナル配列は、MKFQSTLLLAAAAGSALA(配列番号55)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン-1シグナル配列である。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン-1シグナル配列は、MASSLYSFLLALSIVYIFVAPTHS(配列番号56)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酸キチナーゼシグナル配列である。いくつかの実施形態では、酸キチナーゼシグナル配列は、MKTHYSSAILPILTLFVFLSINPSHG(配列番号57)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、K28プレプロトキシンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、K28プレプロトキシンシグナル配列は、MESVSSLFNIFSTIMVNYKSLVLALLSVSNLKYARG(配列番号58)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、キラー毒素ジゴシン前駆体シグナル配列である。いくつかの実施形態では、キラー毒素ジゴシン前駆体シグナル配列は、MKAAQILTASIVSLLPIYTSA(配列番号59)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、コレラ毒素シグナル配列である。いくつかの実施形態では、コレラ毒素シグナル配列は、MIKLKFGVFFTVLLSSAYA(配列番号60)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ヒト成長ホルモンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、ヒト成長ホルモンシグナル配列は、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(配列番号61)を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、1つ又は2つ以上の親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Strep-tag(登録商標)、例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ(例えば、AviTag(商標))、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、酵素又はその一部のN末端側に向かって位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、N末端である。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、酵素又はその一部のC末端側に向かって位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、C末端である。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、ヘキサヒスチジンタグ(例えば、HHHHHH(配列番号13))である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号43、配列番号44、若しくは配列番号45を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号3若しくは配列番号5を含むか、又はそれからなる。
発現系
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましくあり得る。これは、様々な方法で実施されることができる。例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸は、複製及び/又は発現のための原核細胞又は真核細胞への形質転換のために、中間ベクターにクローニングされることができる。中間ベクターは、典型的には、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵又は操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、若しくは昆虫ベクターである。酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞若しくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングされることができる。
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましくあり得る。これは、様々な方法で実施されることができる。例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸は、複製及び/又は発現のための原核細胞又は真核細胞への形質転換のために、中間ベクターにクローニングされることができる。中間ベクターは、典型的には、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵又は操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、若しくは昆虫ベクターである。酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞若しくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングされることができる。
発現を得るために、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。好適な細菌及び真核生物プロモーターは、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001)、Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)、及びCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,2010)に記載されている。操作されたタンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp.、及びSalmonellaで利用可能である(Palva et al.,1983,Gene 22:229-235)。そのような発現系のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、また、市販されている。
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、強力な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現及び精製に使用される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、EF-1α(EF1A)、伸長因子1α短(EFS)、CMVエンハンサーニワトリβ-アクチンプロモーター(CAG)及びウサギβ-グロビンスプライスアクセプター部位(CAG)、ハイブリッドCBA(CBh)、脾臓フォーカス形成ウイルス(spleen focus-forming virus、SFFV)、マウス幹細胞ウイルス(murine stem cell virus、MSCV)、シミアンウイルス40(simian virus 40、SV40)、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1(mouse phosphoglycerate kinase 1、mPGK)、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ1(human phosphoglycerate kinase 1、hPGK)、及びユビキチンC(ubiquitin C、UBC)プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、原核生物又は真核生物のいずれかである、宿主細胞内の核酸の発現のために必要とされる全ての追加の要素を含有する、転写ユニット又は発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、酵素及び/又は融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーターと、例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結のために必要とされる、任意のシグナルとを含有する。カセットの追加の要素は、例えば、エンハンサー、及び異種のスプライスされたイントロンシグナルを含み得る。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element、WPRE)を含む。例えば、Zufferey et al.,「Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element Enhances Expression of Transgenes Delivered by Retroviral Vectors」,Journal of Virology 73(4):2886-92(1999)を参照されたい。
遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、酵素及び/又は融合タンパク質の意図された使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。
標準的なトランスフェクション法が、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母、又は昆虫細胞株を産生するために使用され、それらは次いで、標準的技法を使用して精製される(例えば、Colley et al.,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990)を参照されたい)。真核及び原核細胞の形質転換は、標準的技法に従って実施される(例えば、Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349-351、Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al.,eds,1983を参照されたい)。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための既知の手順のうちのいずれかが、使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、エピソーム及び統合の両方であるプラスミドベクター、並びにクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のうちのいずれかの使用が含まれる(例えば、上記のSambrook et al.を参照されたい)。使用される特定の遺伝子操作手順は、酵素及び/又は融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を正常に導入することが可能であることのみが必要である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、安定的に形質転換される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非低酸素条件下で成長する。
本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質は、宿主細胞ベースの発現系、合成生物学プラットフォーム、又は無細胞タンパク質産生プラットフォームなどの当該技術分野で既知の任意のタンパク質産生系によって産生されることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質産生系は、グリコシル化、例えば、N-グリコシル化タンパク質、ジスルフィド結合形成、及びチロシンリン酸化のうちの1つ又は2つ以上を含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾が可能である。例えば、Boh and Ng,「Impact of Host Cell Line Choice on Glycan Profile」,Critical Reviews in Biotechnology 38(6):851-67(2018)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary、CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney、BHK)細胞、NS0骨髄腫細胞、Sp2/0ハイブリドーママウス細胞、ヒト胎児腎臓細胞(HEK)、HT-1080ヒト細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞、BHK-21細胞、マウスNS0骨髄腫細胞、Sp2/0ハイブリドーマ細胞、及びそれらの誘導体から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、HEK、PER.C6、CEVECの膜細胞産生(CEVEC’s amniocyte production、CAP)、AGE1.HM、HKB-11、HT-1080細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓細胞(HEK、ATCC(登録商標)CRL-1573(商標))又はその誘導体である。
いくつかの実施形態では、HEK細胞は、SV40T抗原の温度感受性対立遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、エチルメタンスルホネート(ethymethanesulfonate、EMS)変異誘発後にリシン毒素に対して耐性であり、例えば、MGAT1遺伝子によってコードされる、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI活性を欠いている。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、主に、Man5GlcNAc2 N-グリカンで糖タンパク質を修飾する。いくつかの実施形態では、HEK細胞は、tetRリプレッサーを発現し、テトラサイクリン誘導性タンパク質発現を可能にする。
いくつかの実施形態では、HEK誘導体は、HEK293、HEK293T(293tsA1609neo、ATCC(登録商標)CRL-3216(商標))、HEK293T/17(ATCC(登録商標)CRL-11268(商標))、HEK293T/17 SF(ATCC(登録商標)ACS-4500(商標))、HEK293S、HEK293SG、HEK293FTM、HEK293SGGD、HEK293FTM、HEK293E、及びHKB-11からなる群から選択される。
Kightlinger et al.,「Synthetic Glycobiology:Parts,Systems,and Applications」,ACS Synth.Biol.9:1534-62(2020)に記載されるものなどの合成生物学プラットフォームもまた、本明細書に記載の酵素及び/又は融合タンパク質を産生するために好適である。
また、ベクター及び細胞を含む細胞、並びに、例えば、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載のタンパク質及び核酸を含むキットも本明細書で提供される。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例に更に記載される。
実施例1:高シアリル化IgGの調製
全体的な分岐グリカンの60%超がジシアリル化されるIgGは、以下のように調製されることができる。
全体的な分岐グリカンの60%超がジシアリル化されるIgGは、以下のように調製されることができる。
簡潔に述べると、IgG抗体の混合物が、β1,4ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4-GalT)及びα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6-Gal1)酵素を使用して逐次酵素反応に曝露される。B4-GalTは、ST6-Gal1の付加の前に反応から除去される必要はなく、生成物の部分的又は完全な精製は、酵素反応の合間に必要とされない。
ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は、ガラクトース残基を既存のアスパラギン結合グリカンに選択的に付加する。結果として生じるガラクトシル化グリカンは、シアル酸残基を選択的に付加して、付着したアスパラギン結合グリカン構造にキャップ形成する、シアル酸転移酵素への基質としての役割を果たす。したがって、全体的なシアリル化反応は、2つの糖ヌクレオチド(ウリジン5’-ジホスホガラクトース(UDPGal)及びシチジン-5’-モノホスホロ-N-アセチルノイラミン酸(CMP-NANA))を採用した。後者は、周期的に補充され、モノシアリル化生成物に対してジシアリル化生成物を増加させる。反応は、共因子塩化マンガンを含む。
IVIg及び反応生成物から始まるそのような反応のIgG-Fcグリカンプロファイルの代表的な例が、図4に示される。図4では、左に、IgGをhsIgGに変換するための酵素的シアリル化反応の概略図があり、右に、出発IVIg及びhsIgGのIgG Fcグリカンプロファイルがある。この研究では、異なるIgGサブクラスのグリカンプロファイルは、グリコペプチド質量分析を介して導出される。異なるIgGサブクラスのための糖ペプチドを定量化するために使用されるペプチド配列は、IgG1=EEQYNSTYR(配列番号7)、IgG2/3 EEQFNSTFR(配列番号8)、IgG3/4 EEQYNSTFR(配列番号9)、及びEEQFNSTYR(配列番号10)であった。
グリカンデータは、IgGサブクラス当たりに示される。IgG3及びIgG4サブクラスからのグリカンは、別々に定量化することができない。示されるように、IVIgについては、全ての非シアリル化グリカンの合計は80%超であり、全てのシアリル化グリカンの合計は<20%である。反応生成物について、全ての非シアリル化グリカンの合計は<20%であり、全てのシアリル化グリカンの合計は80%よりも多い。グリコプロファイルに列挙されている異なるグリカンの命名法は、N結合グリカンのOxford表記を使用する。
実施例2:代替的なシアリル化条件
例えば、50mMのBIS-TRIS(pH6.9)中でhsIgGを作成するためのガラクトシル化及びシアリル化のための代替的な好適な反応条件は、以下のように、IgG抗体(例えば、プールされたIgG抗体、プールされた免疫グロブリン、又はIVIg)のガラクトシル化を含む:7.4mMのMnCl2、38μmolのUDP-Gal/g IgG抗体、及び37℃で16~24時間のインキュベーション、続いて、7.4mMのMnCl2におけるシアリル化を伴う7.5単位のB4GalT/g IgG抗体、220μmolのCMP-NANA/g IgG抗体(2回、すなわち、反応開始時に1回及び9~10時間後に再度添加される)、37℃で30~33時間のインキュベーションを伴う15単位のST6-Gal1/g IgG抗体。反応は、ST6-Gal1及びCMP-NANAをガラクトシル化反応に添加することによって実行されることができる。代替的に、反応物の全てが開始時に組み合わせられることができ、CMP-NANAが補充されることができる。
例えば、50mMのBIS-TRIS(pH6.9)中でhsIgGを作成するためのガラクトシル化及びシアリル化のための代替的な好適な反応条件は、以下のように、IgG抗体(例えば、プールされたIgG抗体、プールされた免疫グロブリン、又はIVIg)のガラクトシル化を含む:7.4mMのMnCl2、38μmolのUDP-Gal/g IgG抗体、及び37℃で16~24時間のインキュベーション、続いて、7.4mMのMnCl2におけるシアリル化を伴う7.5単位のB4GalT/g IgG抗体、220μmolのCMP-NANA/g IgG抗体(2回、すなわち、反応開始時に1回及び9~10時間後に再度添加される)、37℃で30~33時間のインキュベーションを伴う15単位のST6-Gal1/g IgG抗体。反応は、ST6-Gal1及びCMP-NANAをガラクトシル化反応に添加することによって実行されることができる。代替的に、反応物の全てが開始時に組み合わせられることができ、CMP-NANAが補充されることができる。
実施例3:ST6Galの産生
ST6Galの酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質は、HEK細胞における高レベル発現及び精製の容易性のために設計された。配列番号6は、ヒトST6Gal(配列番号4)の一部、6HISタグ(配列番号13)、アズロシジン由来のシグナル配列(MTRLTVLALL AGLLASSRAGSSPLLD(配列番号62)、19 aaは、下線付けされた信号である)、及びクローニングプロセスから生じるアミノ酸を含む、未成熟融合タンパク質である。配列番号3は、分泌型であり、配列番号5は、6HISタグ(配列番号13)及びST6GalT部分を含む。
ST6Galの酵素的に活性な部分を含む融合タンパク質は、HEK細胞における高レベル発現及び精製の容易性のために設計された。配列番号6は、ヒトST6Gal(配列番号4)の一部、6HISタグ(配列番号13)、アズロシジン由来のシグナル配列(MTRLTVLALL AGLLASSRAGSSPLLD(配列番号62)、19 aaは、下線付けされた信号である)、及びクローニングプロセスから生じるアミノ酸を含む、未成熟融合タンパク質である。配列番号3は、分泌型であり、配列番号5は、6HISタグ(配列番号13)及びST6GalT部分を含む。
HEK293細胞(Expi293F(登録商標)細胞、Life Technologies)は、CMVプロモーターの制御下で配列番号6を有するポリペプチドを発現するベクターで安定的にトランスフェクトされた。ST6GalT融合タンパク質を産生するために、安定的にトランスフェクトされ、クローン的に選択された細胞が、計数され、0日目に0.4E6細胞/mLの細胞密度で播種され、37℃、5%CO2、130~150rpmで成長させられた。4日目に、10%グルコース/培地の供給が、細胞に添加された。成長が、毎日監視された。7日目に、細胞上清が採取され、0.45ミクロンフィルター、次いで、0.2ミクロンフィルターを通して滅菌濾過された。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と関連して記載されてきたが、前述の説明は本発明の範囲を例示したものであって、発明の範囲を限定することを意図したものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されると理解される。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明はその詳細な説明と関連して記載されてきたが、前述の説明は本発明の範囲を例示したものであって、発明の範囲を限定することを意図したものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されると理解される。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (51)
- 融合タンパク質であって、
N末端シグナル配列と、
ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1(ST6Gal1)の酵素的に活性な部分と、を含む、融合タンパク質。 - 前記ST6Gal1の酵素的に活性な部分が、配列番号4を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ST6Gal1の酵素的に活性な部分が、配列番号4からなる、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記シグナル配列が、N末端アズロシジンシグナル配列である、請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記アズロシジンシグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記アズロシジンシグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 親和性タグを更に含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記親和性タグが、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリヒスチジンタグが、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記親和性タグが、前記ST6Gal1の酵素的に活性な部分のN末端側に向かって位置する、請求項7~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記N末端シグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、前記ST6Gal1の酵素的に活性な部分が、配列番号4を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヘキサヒスチジンタグを更に含む、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 前記ヘキサヒスチジンタグが、前記N末端シグナル配列と前記ST6Gal1の酵素的に活性な部分との間にある、請求項12に記載の融合タンパク質。
- 配列番号6からなる、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 請求項15に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 前記融合タンパク質をコードする前記核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む、請求項16に記載のベクター。
- 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである、請求項16に記載のベクター。
- 請求項16に記載のベクターで安定的に形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞が、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞又はその誘導体である、請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、HEK誘導体HEK293である、請求項20に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを産生するための方法であって、
前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で請求項19~21のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、
前記培地から前記融合タンパク質を単離することと、を含む、方法。 - 融合タンパク質であって、
N末端シグナル配列と、
ヒトβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(B4GalT1)の酵素的に活性な部分と、を含む、融合タンパク質。 - 前記B4GalT1の酵素的に活性な部分が、配列番号43を含む、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記B4GalT1の酵素的に活性な部分が、配列番号43からなる、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記シグナル配列が、N末端アズロシジンシグナル配列である、請求項23~25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記アズロシジンシグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含む、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記アズロシジンシグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)からなる、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 親和性タグを更に含む、請求項23~28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記親和性タグが、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ(例えば、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(配列番号31))、FLAGタグ(例えば、DYKDDDDK(配列番号32))、ビオチンタグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項29に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリヒスチジンタグが、HHHH(配列番号11)、HHHHH(配列番号12)、HHHHHH(配列番号13)、HHHHHHH(配列番号14)、HHHHHHHH(配列番号15)、HHHHHHHHH(配列番号16)、及びHHHHHHHHHH(配列番号17)からなる群から選択される、請求項30に記載の融合タンパク質。
- 前記親和性タグが、前記B4GalT1の酵素的に活性な部分のC末端側に向かって位置する、請求項23~31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記N末端シグナル配列が、MTRLTVLALLAGLLASSRA(配列番号30)を含み、前記B4GalT1の酵素的に活性な部分が、配列番号43を含む、請求項23に記載の融合タンパク質。
- セプタヒスチジンタグを更に含む、請求項33に記載の融合タンパク質。
- 前記セプタヒスチジンタグが、C末端である、請求項34に記載の融合タンパク質。
- 配列番号45からなる、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 請求項23~36のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 請求項37に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 前記融合タンパク質をコードする前記核酸に動作可能に連結されたプロモーターを更に含む、請求項38に記載のベクター。
- 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである、請求項39に記載のベクター。
- 請求項16に記載のベクターで安定的に形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞が、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞又はその誘導体である、請求項41に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、HEK誘導体HEK293である、請求項42に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを産生するための方法であって、
前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、培地中で請求項41~43のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、
前記培地から前記融合タンパク質を単離することと、を含む、方法。 - 免疫グロブリンG(IgG)抗体をシアル化する(sialyating)ための方法であって、
a)IgG抗体を含む組成物を提供すること、
b)UDP-Gal及びCMP-NANAの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1及び配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に前記組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、方法。 - 免疫グロブリンG(IgG)抗体をシアル化する(sialyating)ための方法であって、
a)IgG抗体を含む組成物を提供することと、
b)UDP-Galの存在下で、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1に前記IgG抗体を曝露し、それによって、ガラクトシル化IgG抗体を含む組成物を産生することと、
c)CMP-NANAの存在下で、配列番号4を含むST6Gal1の酵素的に活性な部分に前記ガラクトシル化IgG抗体を含む組成物を曝露し、それによって、シアル化(sialyated)IgG(sIgG)を含む組成物を産生することと、を含む、方法。 - 前記ガラクトシル化IgG抗体を含む組成物が、ステップ(c)の前に精製されない、請求項46に記載の方法。
- 前記組成物のうちの1つ又は2つ以上をCMP-NANAで補充することを更に含む、請求項45~47のいずれか一項に記載の方法。
- IgG抗体の混合物が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項45~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sIgGを含む組成物中の前記抗体のFc領域上の分岐グリカンの少なくとも60%が、ジシアリル化される、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記sIgGを含む組成物中の前記抗体のFc領域上の分岐グリカンの50%未満が、モノシアリル化される、請求項45又は46に記載の方法。
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