CN112074537A - 具有经调节的聚糖谱的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组表达的迪诺舒单抗分子和调节迪诺舒单抗分子的聚糖谱的方法。

Description

具有经调节的聚糖谱的抗体
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年5月1日提交的美国临时申请号62/665,045的权益，将其通过引用以其全部内容并入本文。
技术领域
本发明涉及重组表达的抗体和调节此类抗体的聚糖谱的方法。
背景技术
糖蛋白的聚糖部分的结构和组成可影响治疗性蛋白质的安全性和功效，包括其免疫原性、溶解度和半衰期。哺乳动物细胞培养物中产生的蛋白质可含有不同水平的高甘露糖糖型，例如甘露糖5(Man-5)、甘露糖6(Man-6)、甘露糖7(Man-7)、甘露糖8(Man-8)和甘露糖9(Man-9)。具有高甘露糖含量的抗体已经引起人们的兴趣，因为具有Man-5聚糖和Man-7、8或9聚糖的抗体显示出治疗活性和清除率方面的差异。例如，用几夫碱(kifunensine)处理产生的高甘露糖抗体显示出更高的ADCC活性和对FCγRIIIA的更大亲和力(Zhou等人，(2008),Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]99(3):652-665)。类似地，Yu等人，据报道，Man-5和Man-8/9糖型似乎具有增加的ADCC活性，降低的CDC活性，增加的对FcγRIIIA的结合亲和力，以及降低的对FcγRIIA和IIB的结合亲和力(Yu等人，MAbs.[单克隆抗体]2012年7月1日；4(4):475-487.doi:10.4161/mabs.20737)。因此，具有增加的高甘露糖聚糖(例如Man-5)的抗体组合物可以提供某些治疗益处。
另一方面，还报道了Man-5和Man-6糖型也比复合岩藻糖基化糖型显示出更快的清除率(Yu等人，同上)。因此，高水平的Man-5聚糖可能导致抗体的半衰期降低和快速清除。因此，需要控制和调节抗体的高甘露糖含量，以实现PK特性和治疗活性(例如ADCC)之间的所需要的平衡。
发明内容
如本文所披露和示例的，已经开发了用于调节迪诺舒单抗(denosumab)上的高甘露糖聚糖水平的方法。具体地，通过在生产期期间减少培养基中葡萄糖的量和增加培养基中半乳糖的量，增加高甘露糖聚糖的水平。本文还披露和示例了包含各种聚糖谱的重组产生的迪诺舒单抗。
基于本文提供的披露内容，本领域技术人员将认知到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的特定实施例的许多等效实施例。此类等效实施例意在由以下实施例(E)涵盖。
E1.一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：
(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞直至细胞密度为至少1x 106个活细胞/mL，其中所述第一培养基包含从约1g/L至约20g/L的葡萄糖；以及随后
(b)在生产期期间在第二培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述第二培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖；
其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E2.一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：
(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞直至细胞密度为至少1x 106个活细胞/mL，其中所述第一培养基包含从约1g/L至约20g/L的葡萄糖；以及随后
(b)在生产期期间在第二培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述第二培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖；
其中与对照相比，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比增加。
E3.如E2所述的方法，其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E4.如E1至E3中任一项所述的方法，其中在生长期期间，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约20g/L。
E5.如E1至E3中任一项所述的方法，其中在生长期期间，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约4g/L至约20g/L。
E6.如E1至E5中任一项所述的方法，其中在生产期期间，这些宿主细胞最初在该第一培养基中维持约3至约15天，以及随后通过灌注或推注供给转移至该第二培养基。
E7.如E1至E6中任一项所述的方法，其中当在生产期期间在该第二培养基中孵育宿主细胞时，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从0g/L至10g/L，或从约0g/L至约8g/L。
E8.如E1至E7中任一项所述的方法，其中当在生产期期间在该第二培养基中孵育宿主细胞时，通过推注供给或灌注将半乳糖浓度维持在从约5g/L至约20g/L，或从约7g/L至约15g/L。
E9.如E1至E8中任一项所述的方法，其中当在生产期期间在该第二培养基中孵育宿主细胞时，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约10g/L，并将半乳糖浓度维持在从约5g/L至约20g/L。
E10.如E1至E9中任一项所述的方法，其中当在生产期期间在该第二培养基中孵育宿主细胞时，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约8g/L，并将半乳糖浓度维持在从约7g/L至约15g/L。
E11.如E1至E10中任一项所述的方法，其包括：
(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞，并用一个或多个推注供给补充该培养基，其中在该生长期期间将葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约20g/L；
(b)将来自步骤(a)的宿主细胞从生长期转移至生产期，并将葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约20g/L持续约3天至约15天；以及随后
(c)将(b)的宿主细胞转移至第二培养基，其中所述第二培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖。
E12.如E11所述的方法，其中在步骤(a)和(b)中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约20g/L。
E13.如E11或E12所述的方法，其中在步骤(a)和(b)中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约4g/L至约20g/L。
E14.如E11至E13中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约10g/L，或从约0g/L至约8g/L。
E15.如E11至E14中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，通过推注供给或灌注将半乳糖浓度维持在从约5g/L至约20g/L，或从约7g/L至约15g/L。
E16.如E11至E15中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约8g/L，并将半乳糖浓度维持在从约7g/L至约15g/L。
E17.如E1至E16中任一项所述的方法，其中所述第一和第二培养基是化学成分确定的培养基。
E18.如E1至E17中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含从约4g/L至约18g/L的葡萄糖。
E19.如E1至E18中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约1g/L至约8g/L、从约1g/L至约7g/L、从约1g/L至约6g/L、从约1g/L至约5/L的葡萄糖。
E20.如E1至E19中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约1g/L至约5/L的葡萄糖。
E21.如E1至E20中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约8g/L至约14g/L、从约9g/L至约13g/L、或从约10g/L至约12g/L的半乳糖。
E22.如E1至E21中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约10g/mL至约12g/mL的半乳糖。
E23.如E1至E21中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约1g/L至约5/L的葡萄糖，和从约10g/mL至约12g/mL的半乳糖。
E24.如E1至E23中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞密度为至少约2x 106个活细胞/mL、至少约5x 106个活细胞/mL、或至少约10x 106个活细胞/mL。
E25.如E1至E24中任一项所述的方法，其中从约4％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E25b.如E1至E24中任一项所述的方法，其中从约4％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E25c.如E1至E24中任一项所述的方法，其中从约5％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E25d.如E1至E24中任一项所述的方法，其中从约5％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E26.如E1至E25中任一项所述的方法，其中从2％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E27.如E1至E26中任一项所述的方法，其中从4％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E27b.如E1至E25中任一项所述的方法，其中从4％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E27c.如E1至E25中任一项所述的方法，其中从5％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E27d.如E1至E25中任一项所述的方法，其中从5％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E28.如E1至E27中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是从6.5％至7.5％。
E29.如E1至E27中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是从6.5％至8.5％。
E30.如E1至E27中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是从7.5％至8.5％。
E31.如E1至E30中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过灌注从该第一培养基转移至该第二培养基。
E32.如E1至E30中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过推注供给从该第一培养基转移至该第二培养基。
E33.一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：
(a)建立初始细胞培养物，其中所述哺乳动物宿主细胞的密度为至少1x 106个活细胞/mL；以及随后
(b)在生产期期间在培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖；
其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E34.一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：
(a)建立初始细胞培养物，其中所述哺乳动物宿主细胞的密度为至少1x 106个活细胞/mL；以及随后
(b)在生产期期间在培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖；
其中与对照相比，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比增加。
E35.如E34所述的方法，其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E36.如E33至E35中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约10g/L。
E37.如E33至E36中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，通过推注供给或灌注将半乳糖浓度维持在从约5g/L至约20g/L。
E38.如E33至E37中任一项所述的方法，其中所述培养基是化学成分确定的培养基。
E39.如E33至E38中任一项所述的方法，其中所述培养基包含从1g/L至约8g/L、从约1g/L至约7g/L、从约1g/L至约6g/L、从约1g/L至约5/L的葡萄糖。
E40.如E33至E39中任一项所述的方法，其中所述培养基包含从约1g/L至约5/L的葡萄糖。
E41.如E33至E40中任一项所述的方法，其中所述培养基包含从约从约8g/L至约14g/L、从约9g/L至约13g/L、或从约10g/L至约12g/L的半乳糖。
E42.如E33至E41中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含从约10g/mL至约12g/mL的半乳糖。
E43.如E33至E42中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞密度为至少约2x 106个活细胞/mL、至少约5x 106个活细胞/mL、或至少约10x 106个活细胞/mL。
E44.如E33至E43中任一项所述的方法，其中从约4％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E44b.如E33至E43中任一项所述的方法，其中从约4％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E44c.如E33至E43中任一项所述的方法，其中从约5％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E44d.如E33至E43中任一项所述的方法，其中从约5％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E45.如E33至E44中任一项所述的方法，其中从2％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E46.如E33至E45中任一项所述的方法，其中从4％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E46b.如E33至E45中任一项所述的方法，其中从4％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E46c.如E33至E45中任一项所述的方法，其中从5％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E46d.如E33至E45中任一项所述的方法，其中从5％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E47.如E33至E46中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在6.5％至7.5％之间。
E48.如E33至E46中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在6.5％至8.5％之间。
E49.如E33至E46中任一项所述的方法，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在7.5％至8.5％之间。
E50.如E1至E49中任一项所述的方法，其中所述培养物在收获时产生至少约10g/L的迪诺舒单抗。
E51.如E1或E33所述的方法，其中与对照相比，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比增加。
E52.如E2-E32和E34-E51中任一项所述的方法，其中当参考批次在包含从约5g/L至约15g/L的葡萄糖并且不包含半乳糖的培养基中产生时，所述对照是来自所述参考批次的在N-298位点的高甘露糖的百分比。
E53.如E2-E32和E34-E52中任一项所述的方法，其中所述对照是约1.5％或更少的在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子。
E54.如E1至E53中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
E55.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是CS-9、CHO-K1、CHO-DG44、或CHO-S细胞。
E56.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是CS-9细胞。
E57.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是AM1/D细胞。
E57b.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO DUX-B11细胞。
E57c.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO GS敲除细胞。
E57d.如E54所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
E58.如E54至E57中任一项所述的方法，其中所述CHO细胞已通过甲氨蝶呤(MTX)选择进行了扩增。
E59.如E1-E32至E50-E57中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含甲氨喋呤(MTX)。
E60.如E33至E57中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中的所述哺乳动物宿主细胞已经通过甲氨蝶呤(MTX)选择进行了扩增。
E61.如E1至E60中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞包含约500个拷贝或更多的核酸序列编码迪诺舒单抗。
E62.如E1至E61中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞包含约500个拷贝或更多的包含SEQ ID NO.3的核酸序列。
E63.如E1至E62中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞包含约500个拷贝或更多的包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
E64.如E1至E63中任一项所述的方法，其中从约7％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E65.如E1至E64中任一项所述的方法，其中所述高甘露糖是Man-5。
E66.如E1至E65中任一项所述的方法，其中从约7％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含Man-5。
E67.如E1至E66中任一项所述的方法，其中从约48％至约70％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G0。
E68.如E1至E67中任一项所述的方法，其中从约9％至约26％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G1。
E69.如E1至E68中任一项所述的方法，其中从约4％至约8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G0。
E70.如E1至E69中任一项所述的方法，其中从约0.3％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G2。
E71.如E1至E70中任一项所述的方法，其中从约0.5％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G1。
E72.如E1至E71中任一项所述的方法，其中从约0.5％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1-G0。
E73.如E1至E72中任一项所述的方法，其中从约1％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1F-G0。
E74.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少15％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。
E75.如E74所述的组合物，其中所述糖化的赖氨酸残基包含葡萄糖部分或半乳糖部分。
E76.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少5％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基，该一个或多个糖化的赖氨酸残基包含半乳糖部分。
E77.如E76所述的组合物，其中从约7％至约20％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基，该一个或多个糖化的赖氨酸残基包含半乳糖部分。
E78.如E74至E77中任一项所述的组合物，其中高达70％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。
E79.如E74至E78中任一项所述的组合物，其中从约20％至约30％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。
E80.如E74至E79中任一项所述的组合物，其中半乳糖糖化赖氨酸与葡萄糖糖化赖氨酸的比例为从约1:10至约10:1。
E81.如E74至E80中任一项所述的组合物，其中半乳糖糖化赖氨酸与葡萄糖糖化赖氨酸的比例为约1:1。
E82.如E74至E81中任一项所述的组合物，其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E83.如E74至E82中任一项所述的组合物，其中从2％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E83b.如E74至E82中任一项所述的组合物，其中从约4％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E83c.如E74至E82中任一项所述的组合物，其中从4％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E83d.如E74至E82中任一项所述的组合物，其中从约5％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E83e.如E74至E82中任一项所述的组合物，其中从5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E84.如E74至E83中任一项所述的组合物，其中从约4％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E85.如E74至E84中任一项所述的组合物，其中从4％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E85b.如E74至E84中任一项所述的组合物，其中从约5％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E85c.如E74至E84中任一项所述的组合物，其中从5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E86.如E74至E85中任一项所述的组合物，其中从2％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E87.如E74至E86中任一项所述的组合物，其中从4％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E87b.如E74至E86中任一项所述的组合物，其中从4％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E87c.如E74至E86中任一项所述的组合物，其中从5％至6.5％、或从8.5％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E87d.如E74至E86中任一项所述的组合物，其中从5％至6.5％、或从8.5％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E88.如E74至E87中任一项所述的组合物，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在6.5％至7.5％之间。
E89.如E74至E88中任一项所述的组合物，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在6.5％至8.5％之间。
E90.如E74至E89中任一项所述的组合物，条件是在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是在7.5％至8.5％之间。
E91.如E74至E90中任一项所述的组合物，其中从约7％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
E92.如E74至E91中任一项所述的组合物，其中所述高甘露糖是Man-5。
E93.如E74至E92中任一项所述的组合物，其中从约7％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含Man-5。
E94.如E74至E93中任一项所述的组合物，其中从约48％至约70％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G0。
E95.如E74至E94中任一项所述的组合物，其中从约9％至约26％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G1。
E96.如E74至E95中任一项所述的组合物，其中从约0.5％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1-G0。
E97.如E74至E96中任一项所述的组合物，其中从约1％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1F-G0。
E98.如E74至E97中任一项所述的组合物，其中从约4％至约8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G0。
E99.如E74至E98中任一项所述的组合物，其中从约0.5％至约4％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G1。
E100.如E74至E99中任一项所述的组合物，其中从约0.3％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G2。
E101.如E74至E100中任一项所述的组合物，其中所述糖化赖氨酸选自下组，该组由以下组成：(i)重链K76、K98、K218、K249、K318、K327、和K335(根据SEQ ID NO:1进行编号)；以及(ii)轻链K104、K108、K150、K184、和K191(根据SEQ ID NO:2进行编号)。
E102.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，并且其中从约0.2％至约1.8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E103.如E102所述的组合物，其中从0.2％至1.8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E104.如E102至E103中任一项所述的组合物，其中从约0.5％至约1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E105.如E102至E104中任一项所述的组合物，其中从0.5％至1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
E106.如E102至E105中任一项所述的组合物，其中所述高甘露糖聚糖是Man-5。
E107.如E102至E106中任一项所述的组合物，其中从0.2％至1.8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含Man-5。
E108.如E102至E107中任一项所述的组合物，其中从约0.5％至约1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含Man-5。
E109.如E102至E108中任一项所述的组合物，其中从0.5％至1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含Man-5。
E110.如E102至E109中任一项所述的组合物，其中从约30％至约60％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G0。
E111.如E102至E110中任一项所述的组合物，其中从约20％至约50％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G1。
E112.如E102至E111中任一项所述的组合物，其中所述从约0.1％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1-G0。
E113.如E102至E112中任一项所述的组合物，其中从约0.1％至约4％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1F-G0。
E114.如E102至E113中任一项所述的组合物，其中从约4％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G0。
E115.如E102至E114中任一项所述的组合物，其中从约1％至约7％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G1。
E116.如E102至E115中任一项所述的组合物，其中从约3％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G2。
E117.如E74至E116中任一项所述的组合物，其中所述迪诺舒单抗与人RANKL结合的结合亲和力(KD)值为约为25pM或更低。
E118.如E74至E117中任一项所述的组合物，其中所述迪诺舒单抗与人RANKL结合的结合亲和力(KD)值为从约1pM至约25pM。
附图说明
图1是显示来自CP2方法的样品的N-聚糖谱的图。
图2是显示来自CP2方法的迪诺舒单抗样品的用于糖化分析的CE-HPLC谱的图。
图3A是显示来自CP2和CP3方法的样品的N-聚糖谱以及参考标准的图。图3B是总结来自CP2和CP3方法的样品的N-聚糖谱的表。
图4A-4E总结了通过CP2和CP3方法产生的迪诺舒单抗的PK/PD谱。图4A-4B显示在向健康志愿者SC施用60mg迪诺舒单抗CP3或CP2后的平均(±SD)血清迪诺舒单抗浓度-时间谱(ng/mL)，分别以线性标度(图4A)和半对数标度(图4B)描绘。图4C显示在向健康志愿者皮下(SC)施用60mg迪诺舒单抗CP3或CP2后血清c-端肽(CTX1)自基线的平均(±SD)百分比变化。图4D-4E显示尽管迪诺舒单抗的Man-5水平随时间降低，但Gal-种类保持基本恒定。从总计4名CP2患者中分析时程。
图5显示了聚糖图谱(HP-AEX)叠加图。CP2迪诺舒单抗和CP4迪诺舒单抗显示出类似的N-聚糖谱。
图6A显示了迪诺舒单抗重链(SEQ ID NO:3)的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸1至57编码信号肽，其在蛋白质合成期间被切割以产生成熟重链。成熟重链的第一个氨基酸(E)以粗体和放大表示。图6B显示了迪诺舒单抗轻链(SEQ ID NO:4)的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸1至60编码信号肽，其在蛋白质合成期间被切割以产生成熟轻链。成熟轻链的第一个氨基酸(E)以粗体和放大表示。
图7A-7C显示葡萄糖和半乳糖浓度对迪诺舒单抗高甘露糖含量的影响。图7A显示了第17天Man-5的完整模型分析，其中在实验中心点处具有预测谱。图7B显示了第17天Man-5的预测，其中葡萄糖水平设定为2.5g/L。图7C显示了Man-5从第11天到第17天的时程变化。
图8A显示了第17天Man-5的完整模型分析。图8B显示了如通过HILIC评估的Man-5水平。图8C显示与CP2参考相比的Man-5和总高甘露糖种类。
图9A是显示10天的分批供给方案的图。图9B显示了在10天的分批供给期间细胞培养物保持高活力。对于所有测试条件，所有样品显示>80％的活力。实心圆形、矩形和菱形代表补充葡萄糖而不添加半乳糖以在供给日期间在生物反应器中维持葡萄糖10-12g/L水平的对照条件。空心圆形、矩形和菱形代表与葡萄糖一起补充10g/L半乳糖以在供给日期间在生物反应器中维持葡萄糖10-12g/L水平的条件。阴影条代表在供给日期间补充10g/L半乳糖同时允许生物反应器中葡萄糖水平通过消耗降低至1-5g/L水平的条件。图9C显示了供给日和收获日的生物反应器中的葡萄糖水平。进行葡萄糖的测量以指导两种培养条件所需的葡萄糖供给量。在第3、6和8天的每一天，向对照和gal/gluc培养物(分别为黑色和白色条)补充约5-6g/L葡萄糖，而不向仅有gal的培养物(阴影条)添加葡萄糖。
图10A-10C显示了改变糖源对细胞生长、滴度和比生产率的影响。图10A是显示所有样品的活细胞密度(VCD)的线型图。图10B是显示滴度的条形图，图10C显示10天的分批供给培养的比生产率。黑色条代表补充葡萄糖以在供给日期间在生物反应器中维持10-12g/L水平的对照条件。白色条代表与葡萄糖一起补充10g/L半乳糖以在供给日期间在生物反应器中维持葡萄糖10-12g/L水平的条件。阴影条代表在供给日期间补充10g/L半乳糖同时允许生物反应器中葡萄糖水平通过消耗降低至1-5g/L水平的条件。
图11显示了当添加半乳糖并且葡萄糖水平低时，高甘露糖水平增加。条形图显示在10天的分批供给结束时报告的每个池中Man-5的％面积。黑色条代表补充葡萄糖以在供给日期间在生物反应器中维持10-12g/L水平的对照条件。白色条代表与葡萄糖一起补充10g/L半乳糖以在供给日期间在生物反应器中维持葡萄糖10-12g/L水平的条件。阴影条代表在供给日期间补充10g/L半乳糖同时允许生物反应器中葡萄糖水平通过消耗降低至1-5g/L水平的条件。
图12显示了D-半乳糖的添加增加了单和双半乳糖聚糖残基，但没有增加半乳糖残基。条形图显示在10天的分批供给结束时报告的每个池中聚糖残基的％面积。黑色条代表补充葡萄糖以在供给日期间在生物反应器中维持10-12g/L水平的对照条件。白色条代表与葡萄糖一起补充10g/L半乳糖以在供给日期间在生物反应器中维持葡萄糖10-12g/L水平的条件。阴影条代表在供给日期间补充10g/L半乳糖同时允许生物反应器中葡萄糖水平通过消耗降低至1-5g/L水平的条件。
具体实施方式
1.概述
迪诺舒单抗是人IgG2单克隆抗体，对人RANKL(核因子κ-B配体的受体激活剂)具有亲和力和特异性。迪诺舒单抗具有约为147kD的分子量，并且目前在基因工程化的哺乳动物(中国仓鼠卵巢)细胞中生产。在重组生产方法中，通过翻译后修饰将聚糖部分连接到迪诺舒单抗，例如通过酶介导的方法(糖基化)或非酶介导的方法(糖化)。因为聚糖在抗体的治疗功效和体内半衰期中具有重要作用，所以需要表征治疗性糖蛋白的糖型谱以满足管理机构的要求。
如本文所披露和示例的，已经开发了不同的培养方法来修饰迪诺舒单抗的聚糖谱。迪诺舒单抗具有位于每条重链的第二恒定结构域(残基N-298)上的两个N-糖基化位点。此外，当糖部分经由赖氨酸残基与抗体连接时，抗体也可以通过糖化(有时也称为“非酶促糖基化”)修饰。
在第一示例性培养方法(本文称为“CP2”)中，使用衍生自AM-1/D的CHO细胞系。将细胞培养在改良的DMEM/F12培养基中，在第3天和第9天两次推注供给，然后在第14天收获培养物。得到的关键糖型包括以下：A2F-G0约55％-65％、A2F-G1约15％-25％、和Man-5约4％-9％。
在第二示例性培养方法(本文称为“CP3”)中，通过使用略微不同的方法实现了总体更高的产物产率。在生长期期间通过甲氨蝶呤(MTX)选择扩增了基于CS-9CHO细胞的细胞系。由于MTX选择，与CP2方法中使用的宿主细胞相比，编码迪诺舒单抗的核酸的拷贝数显著增加。通常，通过MTX选择，估计宿主细胞包含约700-1000个拷贝的重组序列，从而增加重组蛋白质生产的总产率。值得注意的是，通过CP3产生的重组迪诺舒单抗也显示出低Man-5含量，低于1％。通过CP3方法产生的迪诺舒单抗显示出在患者体内较高的血清半衰期和较慢的清除率。
第三示例性培养方法在本文中称为“CP4”。与CP3类似，在生长期期间通过MTX选择扩增了基于CS-9CHO细胞的细胞系，从而提高了迪诺舒单抗生产的总产率。此外，在生产期期间，在第11天改变灌注培养基。培养基的变化包括降低葡萄糖浓度和添加半乳糖作为可替代的碳水化合物来源。与CP2-迪诺舒单抗相比，通过CP4方法生产的迪诺舒单抗显示出类似水平的A2F-G0(约55％至65％)、A2F-G1(约10％-19％)和Man-5(约4％-9％)；并且与CP3-迪诺舒单抗相比，通过CP4方法生产的迪诺舒单抗显示出更高水平的Man-5。通过CP4方法生产的迪诺舒单抗中观察到糖化水平增加。此外，由于半乳糖在CP4中用作可替代的碳源，CP4-迪诺舒单抗还包含新种类，半乳糖糖化的赖氨酸。
令人惊讶的是，尽管与CP2-迪诺舒单抗相比，CP4-迪诺舒单抗显示出更高水平的糖化，但其与RANKL配体的结合以及生物活性不受影响。由于赖氨酸残基带电并且经常参与蛋白质-蛋白质相互作用，令人惊讶的是显著增加的糖化不会影响生物活性。另一个令人惊讶的发现是半乳糖糖化的赖氨酸不影响迪诺舒单抗的免疫原性。半乳糖天然存在于人血清中，浓度约为0.3mg/dL。在这些低血清半乳糖水平下，健康个体不太可能具有带有可测量水平的半乳糖糖化的循环蛋白，除了患有半乳糖血症的患者。因此，半乳糖糖化的临床安全性以前是未知的。据发现，在迪诺舒单抗的情况下，高水平的半乳糖糖化的迪诺舒单抗不影响免疫原性。
2.定义
“迪诺舒单抗”(商品名
Figure BDA0002752601960000181
和
Figure BDA0002752601960000182
)是指包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQ ID NO:2的轻链的人单克隆抗体。迪诺舒单抗的重链和轻链的氨基酸序列示于表1中。编码SEQ ID No:1和2的核酸序列示于图6A-6B中。如实例中所示，迪诺舒单抗的聚糖谱可以变化。
表1迪诺舒单抗的序列
Figure BDA0002752601960000191
抗体是糖蛋白，并且预期糖基化异质性。单克隆抗体在每个HC的CH2 Fc结构域中含有单个共有的N-连接糖基化位点，而LC缺乏共有的N-连接糖基化位点。Fc聚糖主要由3个聚糖类组成：(1)非唾液酸化双触角核心岩藻糖基化结构，其在末端半乳糖含量方面不同(A2GxF，其中x＝0、1或2)；(2)非唾液酸化单触角核心岩藻糖基化杂合结构，其在半乳糖含量方面不同(A1GxMyF，其中x＝0或1且y＝3、4或5)；以及(3)高甘露糖结构(Mx，其中x＝5、6、7、或8)。基于共有序列的存在以及从哺乳动物细胞培养物产生的IgG2单克隆抗体的历史表征，预期迪诺舒单抗在每条重链的N-298处含有单个N糖基化位点。
在文献中，根据Kabat EU编号，N-糖基化位点通常称为残基N-297。实际残基编号是SEQ ID NO:1的残基298。不同之处在于编号系统；两者都指相同的N残基。
本文参考常用的低聚糖命名法描述了碳水化合物部分。可以找到使用这种命名法的碳水化合物化学的综述例如，在Hubbard和Ivatt的Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]50:555-583(1981)中。该命名法包括，例如，代表甘露糖的Man；代表半乳糖的Gal；以及代表葡萄糖的Glc。通常已知的聚糖如表2所示。
表2.示例性的聚糖结构
Figure BDA0002752601960000201
Figure BDA0002752601960000211
Figure BDA0002752601960000221
a理论质量基于经验式，并包括聚糖和2-AA。
b方块代表GlcNAc残基，实心圆代表Man残基，空心圆代表Gal
残基，以及三角形代表Fuc残基。
“高甘露糖”聚糖是包含5-9个甘露糖单元的聚糖部分，例如高甘露糖5(Man-5)聚糖、高甘露糖6(Man-6)聚糖、高甘露糖7(Man-7)聚糖、高甘露糖8(Man-8)聚糖和高甘露糖9(Man-9)聚糖。
可以根据本领域已知的方法评估抗体的高甘露糖含量。测定通常涉及通过酶促(PNGAse-F或Endo-H)或化学处理(即肼解)从mAb释放聚糖。然后纯化释放的聚糖，随后在不进行进一步衍生化的情况下或在用不同的发色团/荧光团标记后进行分析。例如，通常通过色谱、电泳或质谱法分析酶促或化学处理的样品，以鉴定含高甘露糖糖型的mAb。本文提供了高甘露糖测定的实例。
迪诺舒单抗的聚糖含量通常表示为一定百分比(例如，2％-14％高甘露糖)。除非另有说明，否则理论上将聚糖的百分比计算为样品中总迪诺舒单抗分子中包含此类聚糖的迪诺舒单抗分子数。例如，2％高甘露糖意指100个迪诺舒单抗分子中2个迪诺舒单抗分子包含高甘露糖。该理论计算值假设100％的在N-298位点的天冬酰胺是糖基化的。然而，在实践中，非常小百分比的抗体分子可以是非糖基化的或去糖基化的(参见例如下面的实例3.1，在N-298位点约0.3％或更少的抗体分子可以是非糖基化的或去糖基化的)。此外，在单个分子水平上计数聚糖种类是不切实际/不可能的。因此，本文所述的聚糖含量的百分比通常根据常用分析方法基于相对百分比来计算。例如，如实例3.2中所例示的，用酶从蛋白质中释放所有N-聚糖；然后通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)分离聚糖。HPAEC产生各种峰，每个峰代表聚糖种类。8号峰代表Man-5。因此，基于峰8的面积从所有峰的总面积计算Man-5的百分比(在这种情况下为8.4％)。另一个实例是实例7.1，其中亲水相互作用液相色谱(HILIC)用于评估N-聚糖百分比。因此，除非另有说明，否则使用任何常用的分析方法(如HPAEC、CE-SDS、HILIC)根据在N-298位点的总N-聚糖中特定聚糖种类的相对百分比计算聚糖的百分比。该百分比在字面上不应被视为指单个分子水平的聚糖含量。
重组蛋白质生产方法通常分为两个阶段。在第一阶段，通常称为“生长期”，发生细胞增殖。在第二阶段，通常称为“生产期”，重组蛋白的表达在宿主细胞内开启，通常通过添加诱导物(例如IPTG)，或通过改变培养条件(例如改变温度)。
应该注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。术语“一个”(或“一种”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(atleast one)”可以在本文中互换使用。
3.重组产生的迪诺舒单抗的高甘露糖含量
3.1用于增加迪诺舒单抗的高甘露糖含量的方法
高甘露糖糖型越来越被认为是治疗性单克隆抗体的重要质量属性。如本文所述，存在于重组产生的迪诺舒单抗上的高甘露糖可通过操纵细胞培养基中葡萄糖和半乳糖的浓度来控制。
本发明提供了通过使用低浓度或有限浓度的葡萄糖与可替代的碳源(特别是半乳糖或蔗糖)组合来增加重组产生的迪诺舒单抗(特别是Man-5)的高甘露糖含量的方法。如本文所述，在细胞培养基中培养细胞(其中通过降低细胞培养基中葡萄糖的浓度来限制葡萄糖，与可替代的碳源(例如，半乳糖)组合)导致迪诺舒单抗组合物具有增加浓度的高甘露糖含量，同时将细胞生长、活力和滴度维持在可接受的水平。
在一个方面，本发明提供一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞直至细胞密度为至少1x 106个活细胞/mL，其中所述第一培养基包含从约1g/L至约20g/L的葡萄糖；以及随后(b)在生产期期间在第二培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述第二培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖；其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
通常，当讨论糖源(例如葡萄糖、蔗糖或半乳糖)以及其他营养素的浓度时，数量(例如，20g/L)通常是指供给到生物反应器中的浓度。在培养基进入生物反应器内部后，浓度通常由于细胞代谢、消耗和稀释而改变。生物反应器内部的实际浓度可能会随着时间的推移而显著变化，并且可能无法始终监测，因为它严重依赖于细胞密度和代谢率。因此，为了便利和一致，数字通常是指在将培养基供给生物反应器之前测量的浓度，而不考虑生物反应器内的消耗或稀释。在另一方面，生物反应器内的浓度通常被称为“耗过培养基”的浓度，或“生物反应器内”的浓度。
通常，在生长期期间，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约20g/L，以确保宿主细胞的有效扩增。在某些实施例中，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从约2g/L至约20g/L、从约3g/L至约20g/L、从约4g/L至约20g/L、从约2g/L至约19g/L、从约3g/L至约19g/L、从约4g/L至约19g/L、从约2g/L至约18g/L、从约3g/L至约18g/L、或从约4g/L至约18g/L。
在某些实施例中，在生长期期间，通过推注供给或灌注将耗过培养基中的葡萄糖浓度维持在从约1g/L至约10g/L，以确保宿主细胞的有效扩增。在某些实施例中，通过推注供给或灌注将耗过培养基中的葡萄糖浓度维持在从约2g/L至约10g/L、从约3g/L至约10g/L、从约4g/L至约10g/L、从约2g/L至约9g/L、从约3g/L至约9g/L、从约4g/L至约9g/L、从约2g/L至约8g/L、从约3g/L至约8g/L、或从约4g/L至约8g/L。
在某些实施例中，在生长期期间，将耗过培养基中的葡萄糖浓度维持在一个水平以支持细胞扩增至至少1x 106个活细胞/mL，其中通过推注供给或灌注维该葡萄糖浓度，其中推注供给或灌注培养基中的葡萄糖浓度是从约4g/L至约20g/L、从约4g/L至约19g/L、从约4g/L至约18g/L、从约5g/L至约20g/L、从约5g/L至约19g/L、从约5g/L至约18g/L、从约6g/L至约20g/L、从约6g/L至约19g/L、从约6g/L至约18g/L、从约7g/L至约20g/L、从约7g/L至约19g/L、或从约7g/L至约18g/L。推注供给的时间/频率或灌注的流速将取决于细胞培养物的消耗/代谢速率，并且在本领域技术人员的知识范围内。
在某些实施例中，在生长期期间，细胞密度达到从约1x 106个活细胞/mL至约80x106个活细胞/mL，例如至少约1x 106个活细胞/mL、至少约2x 106个活细胞/mL、至少约3x106个活细胞/mL、至少约4x 106个活细胞/mL、至少约5x 106个活细胞/mL、至少约6x 106个活细胞/mL、至少约7x 106个活细胞/mL、至少约8x 106个活细胞/mL、至少约9x 106个活细胞/mL、至少约10x 106个活细胞/mL、至少约20x 106个活细胞/mL、至少约30x 106个活细胞/mL、至少约40x 106个活细胞/mL、至少约50x 106个活细胞/mL、至少约60x 106个活细胞/mL、至少约70x 106个活细胞/mL、至少约80x 106个活细胞/mL、从约2x 106个活细胞/mL至约20x106个活细胞/mL、从约2x 106个活细胞/mL至约15x 106个活细胞/mL、从约2x 106个活细胞/mL至约10x 106个活细胞/mL、或从约2x 106个活细胞/mL至约10x 106个活细胞/mL。
当宿主细胞从生长期转变为生产期时，为了增加高甘露糖(例如，Man-5)含量，可以将第二培养基(其中葡萄糖的浓度降低(例如，从0-8g/L))与可替代的碳源(例如半乳糖或蔗糖，优选半乳糖)组合地供给细胞。
转换为低葡萄糖培养基不需要在生产期开始时发生。通常，在生产期期间，期望将宿主细胞维持在含有足够葡萄糖(例如，从约4g/L至约20g/L或更多)的培养基中持续3-15天(例如，3-11天)然后切换到低葡萄糖培养基。这可能有助于建立所希望的培养物参数(例如活细胞密度或细胞活力)，并有助于维持这些参数。在进入生产期3-15天(例如3-11天)后，当需要增加重组产生的迪诺舒单抗的高甘露糖含量时，然后可以将细胞培养基(其中葡萄糖的浓度降低并提供可替代的碳源)供给细胞培养物，导致所希望的高甘露糖含量的增加。
确定葡萄糖浓度需要降低程度的因素包括使用哪种可替代的碳源，以及使用了多少可替代的碳源；细胞培养生产方法；细胞类型和质量以及葡萄糖消耗。生物反应器中的细胞质量越大，细胞培养物的葡萄糖消耗越大，因此可以供给的葡萄糖的量越大，同时仍然保持产生所希望的高甘露糖含量的低葡萄糖状态。将葡萄糖供给到细胞培养物中的方式也可以影响维持低葡萄糖状态所必需的葡萄糖的量，所述低葡萄糖状态将产生所需的高甘露糖含量。例如，在分批供给的细胞培养中，可以将葡萄糖配制到细胞培养基中并通过推注供给补充。在灌注细胞培养方法中，葡萄糖浓度将取决于灌注培养基的供给速率(g/L/天)。另外，可以测量生产期间培养基中葡萄糖的量，例如通过用于灌注培养的消耗的培养基分析。另外，可以测量生产期间培养基中葡萄糖的量，例如通过用于灌注培养的消耗的培养基分析。观察到当耗过培养基中的葡萄糖量为或接近0g/L时，Man-5水平增加。在这种情况下，恰好足够的葡萄糖被供给至细胞以接近总消耗量，以确保蛋白质产量不会受到葡萄糖减少的显著影响。
降低生物反应器内的葡萄糖浓度可以通过例如通过灌注用第二培养基替换第一培养基来实现。可替代地，可以通过等待第一培养基中的葡萄糖被细胞消耗，然后调整推注供给方案和/或浓度以降低生物反应器内的葡萄糖浓度来实现。
在某些实施例中，第二培养基中的葡萄糖的量降低至限制量，使得在灌注培养基供给中，例如在耗过培养基中测量的葡萄糖的量为或刚刚高于0g/L。葡萄糖消耗速率可以通过葡萄糖添加速率和/或细胞培养物的质量来确定。葡萄糖可以以约0g/L至约10g/L的浓度供给。
在某些实施例中，将第二培养基中的葡萄糖浓度维持在从约0g/L至约10g/L、从约0g/L至约9g/L、从约0g/L至约8g/L、从约0g/L至约7g/L、从约0g/L至约6g/L、从约0g/L至约5g/L、从约1g/L至约10g/L、从约1g/L至约9g/L、从约1g/L至约8g/L、从约1g/L至约7g/L、从约1g/L至约6g/L、或从约0g/L至约5g/L。
与降低的葡萄糖浓度组合，第二培养基应含有或补充有可替代的碳源，例如半乳糖或蔗糖。在某些实施例中，第二培养基包含浓度高达20g/L的半乳糖。例如，可以将第二培养基中的半乳糖浓度维持在从约5g/L至约20g/L、从约5g/L至约19g/L、从约5g/L至约18g/L、从约5g/L至约17g/L、从约5g/L至约16g/L、从约5g/L至约15g/L、从约5g/L至约14g/L、从约5g/L至约13g/L、从约5g/L至约12g/L、从约7g/L至约20g/L、从约7g/L至约19g/L、从约7g/L至约18g/L、从约7g/L至约17g/L、从约7g/L至约16g/L、从约7g/L至约15g/L、从约7g/L至约14g/L、从约7g/L至约13g/L、从约7g/L至约12g/L、从约10g/L至约20g/L、从约10g/L至约19g/L、从约10g/L至约18g/L、从约10g/L至约17g/L、从约10g/L至约16g/L、从约10g/L至约15g/L、从约10g/L至约14g/L、从约10g/L至约13g/L、或从约10g/L至约12g/L。
在某些实施例中，为了增加迪诺舒单抗的高甘露糖含量，在进入生产期3-15天后，葡萄糖浓度降低，并且半乳糖用作可替代的糖源。例如，可以通过使用推注供给培养基或灌注培养基降低葡萄糖浓度，所述培养基包含(i)从约0g/L至约10g/L、从约0g/L至约9g/L、从约0g/L至约8g/L、从约0g/L至约7g/L、从约0g/L至约6g/L、从约0g/L至约5g/L、从约1g/L至约10g/L、从约1g/L至约9g/L、从约1g/L至约8g/L、从约1g/L至约7g/L、从约1g/L至约6g/L、或从约1g/L至约5g/L的葡萄糖，以及(ii)从约5g/L至约20g/L、从约5g/L至约19g/L、从约5g/L至约18g/L、从约5g/L至约17g/L、从约5g/L至约16g/L、从约5g/L至约15g/L、从约5g/L至约14g/L、从约5g/L至约13g/L、从约5g/L至约12g/L、从约7g/L至约20g/L、从约7g/L至约19g/L、从约7g/L至约18g/L、从约7g/L至约17g/L、从约7g/L至约16g/L、从约7g/L至约15g/L、从约7g/L至约14g/L、从约7g/L至约13g/L、从约7g/L至约12g/L、从约10g/L至约20g/L、从约10g/L至约19g/L、从约10g/L至约18g/L、从约10g/L至约17g/L、从约10g/L至约16g/L、从约10g/L至约15g/L、从约10g/L至约14g/L、从约10g/L至约13g/L、或从约10g/L至约12g/L的半乳糖。
在一个示例性的实施例中，通过使用推注供给培养基或灌注培养基降低葡萄糖浓度，所述培养基包含(i)从约1g/L至约5g/L的葡萄糖，以及(ii)从约10g/L至约12g/L的半乳糖。推注供给的时间/频率或灌注的流速将取决于细胞培养物的消耗/代谢速率，并且在本领域技术人员的知识范围内。
可能需要使低葡萄糖培养基的总糖含量与原始生长培养基的葡萄糖含量相匹配。例如，如果生长培养基包含15g/L的葡萄糖，那么，在生产期期间，如果低葡萄糖培养基仅包含3g/L的葡萄糖，则优选用12g/L的半乳糖补充，使得总糖含量匹配15mg/L。
在某些实施例中，在生产期期间，在切换到低葡萄糖培养基后，通过推注供给或灌注可以将耗过培养基中的葡萄糖浓度维持在从约0至约5g/L、从约0g/L至约4g/L、或从约0g/L至约3g/L；并通过推注供给或灌注可以将耗过培养基中的半乳糖浓度维持在从约2g/L至约12.5g/L、从约3g/L至约12.5g/L、从约4g/L至约12.5g/L、从约2g/L至约10g/L、从约3g/L至约10g/L、从约4g/L至约10g/L、从约2g/L至约9g/L、从约3g/L至约9g/L、从约4g/L至约9g/L、从约2g/L至约8g/L、从约3g/L至约8g/L，或从约4g/L至约8g/L。
在某些实施例中，与降低的葡萄糖浓度组合，细胞培养基含有或补充有蔗糖，浓度高达约48g/L，例如从约16g/L至约24g/L。
哺乳动物细胞培养物通常在生物反应器中生长，例如500L至20000L生物反应器。在某些实施例中，使用1000L至2000L生物反应器。在无血清培养基中，用至少0.5x 106高达以及超过3.0x 106个活细胞/mL接种生物反应器。在某些实施例中，接种为约1.0x 106个活细胞/mL。一旦接种到产物生物反应器中，哺乳动物细胞经历指数生长期。可以使用分批供给方法维持生长期，所述分批供给方法具有含有从约1g/L至约20g/L的葡萄糖的无血清供给培养基的推注供给。这些补充的推注供给通常在细胞接种到生物反应器中之后不久开始，此时预期或确定细胞培养物需要供给。例如，补充的供给可以在培养的约第3天或第4天或之前或之后的一天或两天开始。培养物可在生长期期间接受两次、三次或更多次推注供给。基础细胞培养基和推注供给培养基都不含有半乳糖或蔗糖。
当细胞进入静止期或生产期，或细胞培养物达到所需的活细胞密度和/或细胞滴度时，可停止分批推注供给并开始灌注。灌注培养是其中细胞培养物接收新鲜灌注供给培养基同时除去耗过培养基的培养。灌注可以是连续的、逐步的、间歇的、或任何这些中的任何一种或全部的组合。灌注率可以每天低于一工作容积至多个工作容积。优选地，细胞保留在培养物中，并且被除去的耗过培养基基本上不含细胞或具有比培养物显著更少的细胞。灌注可以通过许多方法完成，包括离心、沉降或过滤，参见例如Voisard等人，(2003),Biotechnology and Bioengineering[生物技术和生物工程]82:751-65。优选的过滤方法是交替切向流过滤。通过中空纤维过滤器模块泵送培养基来维持交替切向流。参见例如，美国专利号6,544,424。中空纤维模块可以是微过滤器或超滤器。
当分批供给培养物达到预定的触发点时，例如所需的细胞活力、细胞密度、填充细胞体积百分比、滴度、填充细胞体积调节的滴度、时间阶段等，可以在分批供给和灌注之间进行切换。例如，这种切换可以在培养的第7天或大约第7天进行，但可以在之前或之后的一天或两天进行。灌注供给配制品含有浓度高达20g/L或更高的葡萄糖，但不含有半乳糖或蔗糖。在一个实施例中，灌注培养基含有从约4g/L至约18g/L的葡萄糖。
当灌注培养物达到预定的触发点时，例如所需的细胞活力、细胞密度、填充细胞体积百分比、滴度、填充细胞体积调节的滴度、时间阶段等，细胞培养基中的葡萄糖浓度降低。例如，这种转换可以在培养的第11天开始，但可以在之前或之后的一天或两天发生。此时，用含有较低浓度葡萄糖的细胞培养基灌注细胞培养物。
通过监测细胞培养物中葡萄糖的浓度(例如通过测量耗过培养基中的葡萄糖浓度，并调节灌注培养基配制品中的葡萄糖浓度以维持所需水平)可以维持细胞培养物中的低葡萄糖状态。
细胞培养物可以连续维持在补充有半乳糖或蔗糖的低葡萄糖状态。细胞培养物可以维持在补充有半乳糖或蔗糖的低葡萄糖状态直至收获。细胞培养物可以恢复到正常葡萄糖水平而无需半乳糖或蔗糖补充剂，并且整个方法再次开始。
细胞培养物也可以在灌注培养系统中维持生长期和生产期。一旦接种到产物生物反应器中，哺乳动物细胞经历指数生长期，在此期间用无血清和/或化学成分确定的细胞培养基灌注细胞培养物。
一个示例性的实施例是CP4方法，如下面详细描述的。
在另一个方面，本发明提供一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞直至细胞密度为至少1x 106个活细胞/mL，其中所述第一培养基包含从约1g/L至约20g/L的葡萄糖；以及随后(b)在生产期期间在第二培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述第二培养基包含从约0g/L至约10g/L的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L的半乳糖。如披露的方法的结果，与对照相比，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比增加。
对照可以是预定范围或阈值，本领域普遍接受的范围，或来自迪诺舒单抗产生的历史范围。可替代的，对照可以是参考批次，其中宿主细胞在培养基中培养，其中葡萄糖浓度不降低或补充有可替代得碳源。例如，宿主细胞可以在整个生产期期间在包含从约1g/L至约20g/L(例如，从约4g/L至约18g/L)的葡萄糖的第一培养基中培养，而无需转移至包含从约0g/L至约10g/L(例如，从约1g/L至约5g/L)的葡萄糖和从约5g/L至约20g/L(例如，从约10g/L至约12g/L)的半乳糖的第二培养基。
在某些实施例中，对照是预定阈值。例如，对照可以是在约1.8％或更低、约1.7％或更低、约1.6％或更低、约1.5％或更低、约1.4％或更低、约1.3％或更低、约1.2％或更低、约1.1％或更低、约1.0％或更低、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％，或约0.1％或更低的高甘露糖水平。
在另一个方面，本发明提供了重组产生的迪诺舒单抗，其中从约2％至约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。例如，从约2％至约14％、从约3％至约14％、从约4％至约14％、从约5％至约14％、从约2％至约13％、从约2％至约12％、从约2％至约11％、从约3％至约13％、从约3％至约12％、从约3％至约11％、从约4％至约13％、从约4％至约12％、从约4％至约11％、从约2％至约6.5％、从约3％至约6.5％、从约4％至约6.5％、从约8.5％至约14％、从约8.5％至约13％、从约8.5％至约12％、从约8.5％至约11％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、约11％、约11.5％、约12％、约12.5％、约13％、约13.5％、或约14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
在某些实施例中，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比为从约5％至约14％。在某些实施例中，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比为从约5％至约12％。在某些实施例中，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比为从约5％至约11％。
在某些实施例中，在N-298位点包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比不是从6.5％至7.5％、不是从6.5％至8.5％，或不是从7.5％至8.5％。
如上所述，高甘露糖水平，在此表示为百分比，不是字面上指的是在单个分子水平上计数高甘露糖含量。相反，该百分比使用任何常用的分析方法反映基于抗体组合物的总N-聚糖含量的高甘露糖种类的相对百分比。例如(参见例如实例3.2、实例7.1)，可以基于色谱峰的面积计算百分比。
本文提供的迪诺舒单抗的高甘露糖含量范围主要基于PK/PD评估(与市售
Figure BDA0002752601960000321
和
Figure BDA0002752601960000322
相比基本相似的PK)。最广泛的范围(例如，2％-14％)不应简单地作为通过FDA进行生物相似性评估的决定性标准。为了评估生物相似性，FDA建议采用逐步方法获得证明提出的生物仿制产品与创新(参考)生物产品之间生物相似性的证据整体性。逐步方法开始于对所提出的生物仿制产品的制造方法的各个阶段的功能和结构表征的分析研究。分析型相似性评估涉及鉴定与临床结果相关的关键质量属性(CQA)。因此，为了证明生物相似性的目的，可能需要不同或更窄范围的高甘露糖含量。生物相似性也可能需要生物仿制产品匹配其他属性(例如，其他类型的聚糖)。
3.2具有降低的高甘露糖水平的迪诺舒单抗
本文还提供了具有降低的高甘露糖水平的迪诺舒单抗。在一个示例性的实施例中(参见下文详细描述的CP3方法)，少于1％的重组产生的迪诺舒单抗在N-298位点具有Man-5。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，并且其中从约0.2％至约1.8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。在某些实施例中，约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、从约0.2％至约1.8％、从约0.2％至约1.7％、从约0.2％至约1.6％、从约0.2％至约1.5％、从约0.2％至约1.4％、从约0.2％至约1.3％、从约0.2％至约1.2％、从约0.2％至约1.1％、从约0.2％至约1.0％、从约0.3％至约1.8％、从约0.4％至约1.8％、从约0.5％至约1.8％、从约0.3％至约1.5％、从约0.4％至约1.5％、从约0.5％至约1.5％、从约0.3％至约1.2％、从约0.4％至约1.2％、从约0.5％至约1.2％、从约0.3％至约1.0％、从约0.4％至约1.0％、或从约0.5％至约1.0％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
治疗性抗体的功效受血清清除率即抗体的血清半衰期的影响。IgG抗体的血清半衰期受许多受体调节，包括甘露糖受体，其结合含有高甘露糖的病原体以及内源蛋白质。通常，含有高甘露糖聚糖的IgG在人体中比其他聚糖形式更快地清除(Goetze等人，Glycobiology[糖生物学]第21卷，第7期，第949-959页,2011)。因此，带有高甘露糖的糖型的减少改善了抗体组合物的半衰期(这是所需的质量属性)。
特别是，Goetze指出单克隆抗体(Mab1)和含M5的Mab1群体之间清除半衰期的差异随着剂量的减少而增加(表VII)，表明含有M5的IgG在较低的静脉内剂量下相对更快地被清除。作者提出，甘露糖受体有助于更快地清除M5 IgG群体，较高剂量时的较慢相对清除可能反映该受体的饱和度。虽然血清IgG的半衰期通常由FcRn介导，而治疗性IgG的半衰期可能另外通过基于靶标的清除来调节，但甘露糖受体显然有助于更快速清除治疗性IgG的非天然(高甘露糖)聚糖变体。这与甘露糖受体在清除外源病原体以及不需要的内源性分子中所起的作用一致，并且得到早期研究的支持，证明小鼠中含有M5的IgG1的清除速度更快。
在临床研究中，向健康志愿者施用CP2-迪诺舒单抗或CP3-迪诺舒单抗。PK/PD分析显示，与CP2-迪诺舒单抗相比，CP3-迪诺舒单抗具有平均10％延长的半衰期。因此，CP3-迪诺舒单抗由于其有利的PK/PD特征而具有延长治疗效果的潜在益处。这种有益效果可能导致较低频率的给药要求，并增加患者的依从性。
3.3用于评估高甘露糖含量的分析方法
可以使用各种方法分析重组产生的迪诺舒单抗上的高甘露糖结构。此类方法可用于测量以下一项或多项：聚糖或糖蛋白制剂中高甘露糖的存在和/或量(例如，相对于总聚糖质量)；高甘露糖结构的相对比例(例如，高甘露糖种类与彼此的相对比例(例如，Man-5、Man-6、Man-7、Man-8和/或Man-9及其异构体的相对丰度或比率)、高甘露糖与杂合结构的相对比例、高甘露糖与复合结构的相对比例、高甘露糖与岩藻糖基化结构的相对比例)；修饰的高甘露糖结构的存在或丰度(例如，岩藻糖基化高甘露糖结构的存在或丰度)。
高甘露糖含量可以通过本领域熟知的一种或多种方法测量，例如，如在Wuhrer等人(Journal of Chromatography B[色谱杂志B辑]第825卷:124-133,2005)和Dell等人(Science[科学]第291卷:2351-2356)所述的和本文所述的那些，包括例如糖蛋白的N-聚糖作图的分析方法。简言之，从重组糖蛋白(例如重组单克隆抗体)酶促除去N-聚糖，并在还原末端用荧光标签(2-氨基苯甲酰胺)标记。通过高pH阴离子交换色谱(HPAEC)分离荧光N-聚糖，并使用荧光检测进行检测。中性N-聚糖的分离通常基于N-聚糖结构的复杂性增加。带电的N-聚糖的分离基于存在的可以从中获得电荷数唾液酸、硫酸盐或其他修饰的数量和类型。将这些测试样品的聚糖谱与适当的标准进行目测比较。
高甘露糖含量还可以使用WO 2007/087384中披露的方法测量，该方法是用于检测和/或定量糖蛋白的高甘露糖含量的高通量方法。简言之，用内切糖苷酶消化糖蛋白，然后用还原剂(如果需要)还原消化的糖蛋白，并通过变性电泳分离消化的糖蛋白。高甘露糖/杂合型聚糖的比例通过从去糖基化重链的级分(内切糖苷酶消化后的峰)减去非糖基化重链的级分(没有内切糖苷酶处理的峰级分)来确定。通过使相同的样品或组合物经受相同的消化条件(除了其中不存在内切糖苷酶外)，产生非糖基化的重链级分或没有内切糖苷酶处理的峰级分。该步骤可以与内切糖苷酶消化步骤同时进行或分开进行。
可以使用任何内切糖苷酶，其选择性切割核心聚糖上的GlcNAc1和GlcNAc2之间的高甘露糖和杂合聚糖(或在蛋白质上产生短聚糖)，同时保留复合N-连接聚糖完整。进行内切糖苷酶消化的具体条件，包括酶的浓度、孵育温度和消化时间，取决于所用的内切糖苷酶的类型。与本发明相关的内切糖苷酶的实例包括但不限于内切糖苷酶H和内切糖苷酶F1。在本发明的一个实施例中，将包含糖蛋白的样品用内切糖苷酶H在37℃处理约2小时，用β-巯基乙醇还原，并进行CE-SDS分析。
用于从糖基化糖蛋白(例如糖基化抗体)中分离去糖基化糖蛋白(例如去糖基化抗体)的实例方法包括但不限于以下两种方法：
1)在还原条件下的CE-SDS。用SDS和还原剂使糖基化糖蛋白(例如抗体)变性，并通过毛细管电泳-SDS(CE-SDS)将其含有聚糖的重链(HC)与切割的HC(去糖基化的HC)分离。电泳图由UV信号产生。峰下面积与相对量成正比。因此，高甘露糖/杂合类型的量由在较早的去糖基化HC位置洗脱的级分确定。由于GlcNAc-HC与去糖基化的HC共迁移，因此从消化的样品的前峰中减去来自未消化的样品的％去糖基化的HC，以产生％高甘露糖值。分离需要15-30分钟，具体取决于构型。
2)基于微流体的CE-SDS。糖蛋白如1)中那样变性，但使用“芯片上实验室”仪器(例如Caliper公司的LC90)分离。尽管使用荧光染料检测蛋白质，但在测定和分离中使用相同的原理。每次测定的分离时间减少至约30秒，并且可以从微量滴定板取样。
实例7.1使用亲水相互作用液相色谱(HILIC)。简言之，可以基于以下步骤分析聚糖种类：(i)释放N-聚糖(例如，通过例如PNGase F的酶)，(ii)标记(例如，用2-氨基苯甲酸或2-氨基苯甲酰胺)，(iii)除去游离标记(例如，通过凝胶过滤或固相萃取)；(iv)通过HILIC分离聚糖种类；以及(v)检测(例如，通过荧光光谱法)。由Melmer等人，Analyticaland Bioanalytical Chemistry[分析和生物分析化学]，2010年9月，第398卷，第2期，第905-914页提供了HILIC的另外的细节。
另一种常用的方法是液相色谱-串联质谱(LC-MS)。在释放N-聚糖、标记并去除游离标记后，可以通过将液相色谱(或HPLC)的物理分离能力与质谱(MS)的质量分析能力相结合的技术来分析样品。参见例如，Wang等人，BiotechMethod[生物技术方法]，2018年1月17日,doi.org/10.1002/biot.201700185。
另外的合适的方法包括但不限于正离子MALDI-TOF分析、负离子MALDI-TOF分析、HPLC、弱阴离子交换(WAX)色谱、正相色谱(NP-HPLC)、Bio-Gel P-4色谱、阴离子交换色谱和一维NMR光谱、及其组合。参见例如，Pace等人，Biotechnol.Prog.[生物技术进展],2016,第32卷，第5期，第1181-1192页；Shah,B.等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.[美国质谱学会学报](2014)25:999；Mattu等人，JBC 273:2260-2272(1998)；Field等人，Biochem J[生物化学杂志]299(Pt1):261-275(1994)；Yoo等人，MAbs[单克隆抗体]2(3):320-334(2010)WuhrerM.等人，Journal ofChromatographyB[色谱杂志B辑],2005,第825卷，第2期，第124-133页；RuhaakL.R.,Anal Bioanal Chem[分析和生物分析化学],2010,第397卷:3457-3481；Kurogochi等人，PLOS One[公共科学图书馆期刊]10(7):e0132848；doi:10.1371/journal.pone.0132848；Thomann等人，PLOS One[公共科学图书馆期刊]10(8):e0134949.Doi:10.1371/journal.pone.0134949；Pace等人，Biotechnol.Prog.[生物技术进展]32(5):1181-1192(2016)；和Geoffrey,R.G.等人，Analytical Biochemistry[分析生物化学]1996,第240卷，第210-226页。
当评估高甘露糖含量时，可以将对照用于比较目的，如上所述。
4.重组产生的迪诺舒单抗的糖化
糖化(有时称为非酶促糖基化)是在没有酶的控制作用情况下糖分子(例如葡萄糖或果糖)与蛋白质或脂质分子共价键合的结果。糖化发生在带正电荷的伯胺上，通常位于蛋白质分子的表面上。没有鉴定出指示潜在糖化位点的特定序列。然而，已经观察到碱性残基(精氨酸和其他赖氨酸)与具有已知结构的一些蛋白质中的糖化发生相关。糖化不同于N-298位点的N-糖基化。
对于治疗性mAb，糖化的潜在影响，例如阻断生物功能位点或诱导聚集的进一步降解，使糖化成为潜在的关键质量属性(CQA)。糖化对抗体活性的影响范围从无影响(Quan等人，Anal Biochem[分析生物化学]2008；373(2):179-91；Miller等人，J Pharm Sci[药物科学杂志]2011；100(7):2543-50)到失去活性(Kennedy等人，Clin Exp Immunol[临床和实验免疫学]1994；98(2):245-51；Dolhofer等人，Biol Chem Hoppe Seyler[生物化学HoppeSeyler]1985；366(4):361-6)。
由于赖氨酸残基带电并且经常参与蛋白质-蛋白质相互作用，令人惊讶的是显著增加的糖化不会影响CP4-迪诺舒单抗的生物活性。因此，在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少15％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。如实例中所示，与CP2-迪诺舒单抗相比，CP4-迪诺舒单抗显示出更高水平的糖化。令人惊讶的是，尽管糖化水平较高，但迪诺舒单抗与其配体的结合以及生物活性不受影响。事实上，在一项强制糖化实验中，高达70％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化赖氨酸残基，同时维持其生物活性。因此，在某些实施例中，约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、从约15％至约70％、从约15％至约65％、从约15％至约60％、从约15％至约55％、从约15％至约50％、从约15％至约45％、从约15％至约40％、从约15％至约35％、从约15％至约30％、从约20％至约70％、从约20％至约65％、从约20％至约60％、从约20％至约55％、从约20％至约50％、从约20％至约45％、从约20％至约40％、从约20％至约35％、从约20％至约30％、或约24％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。
另一个令人惊讶的发现是半乳糖糖化的赖氨酸不影响迪诺舒单抗的生物学活性或免疫原性。半乳糖天然存在于人血清中，浓度约为0.3mg/dL。在这些低血清半乳糖水平下，健康个体不太可能具有带有可测量水平的半乳糖糖化的循环蛋白，除了患有半乳糖血症的患者。因此，半乳糖糖化的临床安全性是未知的。据发现，在迪诺舒单抗的情况下，高水平的半乳糖糖化的迪诺舒单抗不影响免疫原性。因此，在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少5％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基，该一个或多个糖化的赖氨酸残基包含半乳糖部分。例如，约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、从约5％至约35％、从约5％至约30％、从约5％至约25％、从约5％至约20％、从约5％至约15％、从约10％至约35％、从约10％至约30％、从约10％至约25％、从约10％至约20％、或从约10％至约15％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基，该一个或多个糖化的赖氨酸残基包含半乳糖部分。
与上述N-298聚糖水平类似，糖化水平(此处以百分比表示)不应在字面上理解为指在单个分子水平上计数具有糖化赖氨酸的分子。相反，该百分比使用任何常用的分析方法反映了基于抗体组合物的总赖氨酸含量的糖化赖氨酸种类的相对百分比。参见例如，实例7.2，其中基于CE-HPLC峰计算K-98处的糖化赖氨酸的百分比。
在某些实施例中，半乳糖糖化的赖氨酸与葡萄糖糖化的赖氨酸的比值为从约1:10至约10:1，例如约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、从约7:1至约1:7、从约6:1至约1:6、从约5:1至约1:5、从约4:1至约1:4、从约3:1至约1:3、或从约2:1至约1:2。
在某些实施例中，糖化的赖氨酸选自下组，该组由以下各项组成：(i)重链K76、K98、K218、K249、K318、K327、和K335；以及(ii)轻链K104、K108、K150、K184、和K191。
在某些实施例中，本发明的迪诺舒单抗分子以高亲和力结合人RANKL，但不结合鼠RANKL。抗体的结合亲和力可以表达为KD值，其是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。KD是解离速率(也称为“解离速率(koff)”)与缔合速率或“结合速率(kon)”的比率。因此，KD等于koff/kon(解离/缔合)并且表达为摩尔浓度(M)，并且KD越小，结合的亲和力越强。可以使用本领域中已确立的方法确定抗体的KD值。除非另有说明，否则“结合亲和力”是指单价相互作用(内在活性；例如，抗体通过单价相互作用与抗原结合)。
KD的值可以通过众所周知的方法直接确定，并且甚至可以通过诸如Caceci等人(1984，Byte 9:340-362)所述的方法对复合混合物进行计算。例如，可以使用双过滤硝酸纤维素滤膜结合试验建立KD，例如Wong&Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5428-5432)所披露的。用于评估配体(例如抗体)对靶抗原的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析，以及本文其他地方所例示的其他测定。
用于测量结合亲和力(KD)值的一种示例性方法是表面等离子体共振(SPR)，通常使用生物传感器系统，例如
Figure BDA0002752601960000401
系统。SPR是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化(例如使用
Figure BDA0002752601960000402
系统)来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。BIAcore动力学分析包括在其表面上分析抗原与具有固定化分子(例如，包含抗原结合结构域的分子)的芯片的结合和解离；或者，抗体或其抗原结合片段与具有固定化抗原的芯片的解离。
在某些实施例中，使用基于溶液的动力学排除测定(KinExATM)测量结合亲和力(KD)值。在一个具体实施例中，使用KinExATM 3200仪器(Sapidyne)进行KinExA测量。动力学排除测定(KinExATM)是通用免疫测定平台(基本上是流动分光荧光计)，其能够测量平衡解离常数，以及抗原/抗体相互作用的缔合和解离速率常数。由于KinExATM在获得平衡后进行，因此是用于测量高亲和力相互作用(其中相互作用的解离速率可能非常慢)的KD的有利的技术。KinExATM方法通常可如Drake等人(2004)Analytical Biochemistry[分析生物化学]328,35-43中所述进行。
确定抗体KD的另一种方法是使用生物层干涉法，通常使用
Figure BDA0002752601960000403
技术(OctetQKe系统，ForteBio)。
迪诺舒单抗的结合亲和力通常低于100pM。在某些实施例中，迪诺舒单抗与人RANKL结合的亲和力为约100pM或更低、约75pM或更低、约50pM或更低、约25pM或更低、约20pM或更低、约10pM或更低、约5pM或更低、从约0.1pM至约50pM、从约0.5pM至约50pM、从约1pM至约50pM、从约0.1pM至约25pM、从约0.5pM至约25pM、或从约1pM至约25pM。在某些实施例中，结合亲和力根据Kostenuik等人，Journal of Bone and Mineral Research[骨与矿物研究杂志],第24卷,182-195(2009)披露的方法，使用KinExA 3000系统(SapidyneInstruments)通过溶液平衡结合分析进行测量。简言之，将Reacti-Gel 63珠粒用20mg/ml人RANKL在4℃下预包衣过夜，用1mg/ml BSA封闭2小时，并在PBS中洗涤三次。将迪诺舒单抗(50pM)与各种浓度的可溶性人RANKL(0-5nM)在室温下孵育>6h，以允许平衡结合，然后通过RANKL包衣的珠粒。通过荧光标记的(花青Cy5染料)山羊抗人抗体定量游离迪诺舒单抗与珠粒的结合。
许多测定可用于评估糖化水平。一种示例性方法是硼酸盐亲和色谱。硼酸盐亲和色谱(BAC)是用于分离和富集顺式二醇化合物的技术。固定相上的硼酸官能团将在碱性pH条件下形成四面体阴离子，其可与糖分子上发现的顺式-1,2-二醇阵列相互作用(Quan等人，Anal Biochem[分析生物化学]2008；373(2):179-91)并将糖化种类与非糖化种类分离。为了洗脱糖化种类，通过降低pH或添加竞争的羟基基团源(例如山梨糖醇)来破坏相互作用。BAC已被用于分析碳水化合物和完整蛋白质。
对于抗体糖化分析，BAC是鉴定、定量和分离糖化抗体的常用方法，因为它需要最少的样品制备并使用本地运行条件。优化屏蔽剂的浓度、pH和缓冲盐组成允许定量大量药物物质的糖化水平。
评估糖化水平的另一种方法是基于电荷的方法。毛细管等电聚焦(cIEF)或成像毛细管电聚焦(icIEF)是基于电荷的分离方法，其可以检测由于糖化位点上的正电荷损失而引起的糖化。与未糖化的，未保留的硼酸盐级分相比，完全糖化的保留硼酸盐级分向酸性区域转变。已知icIEF将具有0.05-pI差异的种类分开，并且可以分辨由于赖氨酸残基阻断而理论上具有0.09-pI单位差异的糖化抗体。在共混的糖化和非糖化硼酸盐级分中也可观察到该电荷差异分离。
离子交换色谱(IEC)也可以分辨具有表面电荷差异的糖化和非糖化蛋白质。糖化硼酸盐级分的分析显示在线性梯度条件下向主峰的明显酸性转变。相应地，从IEC分馏的酸性变体也显示出小的糖化富集。
Quan等人(同上)报道了与原始未分级分离的抗体相比，保留完全糖化硼酸盐的抗体向酸性区域的转变。在线性梯度中，转变的量相当于约0.5mM氯化钠。保留硼酸盐的级分的IEC峰也明显变宽，而未保留硼酸盐的级分(非糖化)的IEC峰比未分级分离的起始材料更尖锐。然而，IEC有时可能没有足够的分辨率来分离起始材料(其表现出来自分子中多个低水平糖化位点的组合电荷效应)中的糖化种类。相比之下，在羧基末端具有零个、一个或两个赖氨酸残基的分子彼此彻底分辨，显然是由于与树脂的单一和独特的位置相互作用。
另一种评估糖化水平的方法是液相色谱-质谱法。完整抗体或酶切割的mAb片段的自上而下的质谱法也可用于通过以下来确定糖化水平：基质辅助激光解吸/电离(MALDI)(参见例如，Kislinger等人，Ann N Y Acad Sci[纽约科学学术年报]2005；1043:249-59)，或电喷雾电离(ESI)(参见例如，Miller等人，J Pharm Sci[药物科学杂志]2011；100(7):2543-50)。由于每个糖化位点显示+162Da质量转移，因此自上而下方法可用作抗体中糖化水平的快速估计。据报道，在去糖基化和去除C-末端赖氨酸后，通过质谱法定量糖化可以具有1.0％的检测限和3.0％的定量限，并且BAC和质谱结果之间存在相关性。
为了定位糖化位点，通常使用自下而上的肽作图方法。由于胰蛋白酶被赖氨酸残基的糖化抑制，因此在+162Da质量添加情况下错过的胰蛋白酶切割表明糖化赖氨酸。收集的BAC保留级分或强制糖化样品的胰蛋白酶肽图谱显示抗体上糖化易感性的位点。
质谱法中片段化的另一种方法是电子转移解离(ETD)。对片段化方法比较的研究表明ETD提供完整的序列片段化而没有任何中性丢失。
改善糖化肽的灵敏度和降低中性丢失的一种方法是通过使用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原，然后用胰蛋白酶切割和用MS/MS检测的肽图谱分析(参见例如，Brady等人，Anal Chem[分析化学]2007；79(24):9403-13)。在该方法中，由于还原的糖化糖部分，碳水化合物和肽之间的键稳定，这导致更高质量的MS/MS谱。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)也是研究蛋白质糖化水平的常用方法。
也可以使用比色测定法。由抗体糖化形成的酮胺可以通过氮蓝四唑(NBT)还原测定来定量。NBT被糖化蛋白的酮胺形式还原，这导致在525nm处吸光度的变化。该方法已用于测量聚赖氨酸和糖化白蛋白。
另外，应用酶联免疫吸附测定(ELISA)形式研究糖化抗体，其是利用样品和靶向特定种类糖化终产物的生物素缀合的一级抗体之间的结合。
5.其他聚糖种类
通常已知的聚糖如表2所示。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约48％至约70％的迪诺舒单抗分子包含A2F-G0。例如，从约48％至约55％、从约50％至约65％、从约50％至约60％、或从约55％至约65％的迪诺舒单抗分子包含A2F-G0。
在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约30％至约60％(例如，从约30％至约55％、从约30％至约50％、从约30％至约45％、从约35％至约55％、从约35％至约50％、或从约35％至约45％)的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G0。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约9％至约26％(例如，从约10％至约26％、从约11％至约26％、从约12％至约26％、从约13％至约26％、从约10％至约20％、或从约15％至约25％)的迪诺舒单抗分子包含A2F-G1。
在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约20％至约50％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G1。例如，从约25％至约45％、从约25％至约40％、从约30％至约45％、或从约30％至约40％的迪诺舒单抗分子包含A2F-G1。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中所述从约0.1％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1-G0。在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中所述从约0.5％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1-G0。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约0.1％至约4％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1F-G0。在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约1％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A1F-G0。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约4％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G0。在另一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约4％至约8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G0。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约1％至约7％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G1。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约0.5％至约4％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2-G1。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约3％至约10％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G2。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约0.3％至约5％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含A2F-G2。
在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、从约0.1％至约5％、从约0.1％至约4％、从约0.1％至约3％、从约0.1％至约2.5％、从约0.1％至约2％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含唾液酸化的N-聚糖。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约0.3％至约1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含唾液酸化的N-聚糖。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约0.3％至约2％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含唾液酸化的N-聚糖。在一个方面，本发明提供包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中从约1％至约3％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含唾液酸化的N-聚糖。
如上所述，各种聚糖种类的水平，在此表示为百分比，不能从字面上理解为指在单个分子水平上计数N-聚糖含量。该百分比使用任何常用的分析方法反映基于抗体组合物的总N-聚糖含量的聚糖种类的相对百分比。例如(参见例如实例3.2和实例7.1)，可以基于色谱峰的面积计算百分比。
尽管通过示例性方法产生的迪诺舒单抗分子显示出与高甘露糖不同的上述种类的不同聚糖含量，但迪诺舒单抗的生物活性和PK/PD谱不受这些聚糖种类的变化的影响。因此，聚糖谱可能会容忍显著的变化。在某些实施例中，可能需要具有从约48％至约70％的A2F-G0、和约13％至约26％的A2F-G1；或从约48％至约70％的A2F-G0、和约10％至约20％的A2F-G1。
此外，最广泛的范围(例如，从约48％至约70％的迪诺舒单抗分子包含A2F-G0)不应简单地作为生物相似性评估的决定性标准，因为生物相似性评估基于以下的证据整体性。例如，Fc聚糖上糖残基(例如，岩藻糖、唾液酸、末端β-半乳糖)的存在或不存在影响Fc的构象，从而潜在地影响Fc介导的效应子功能。已知G0聚糖与甘露糖结合蛋白相互作用以(i)激活补体和(ii)促进血清清除(参见例如，Dong等人，J.Immunol.[免疫学杂志],163(1999),第5427-5434页；Malhotra等人，Nat.Med.[自然医学],1(1995),第237-243页)。已知G2糖型在孕妇和脐带中增加(Kibe等人，J.Clin.Biochem.Nutr.[临床生物化学与营养杂志]，21(1996),第57-63页)。已知静脉内免疫球蛋白(IVIG)的脱唾液酸化在KN小鼠中消除抗炎特性(Yang等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]，448(2014)，第82-91页)。已知IgG上的核心α(1,6)岩藻糖的丢失增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性(参见例如，Ferrara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],108(2011),第12669-12674页；Shields等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志],277(2002),第26733-26740页。最后，N-连接的复合聚糖的末端单糖有时被唾液酸占据。该唾液酸的存在影响相应糖蛋白的吸收、血清半衰期和血清清除，以及物理、化学和免疫原性特性(参见例如，Bork等人，JPharm Sci.[药学科学杂志]2009年10月；98(10):3499-508.doi:10.1002/jps.21684)。因此，为了证明生物相似性，可能需要不同或更窄范围的聚糖含量。
6.细胞系
本发明中使用的细胞系(也称为“宿主细胞”)经遗传工程改造以表达迪诺舒单抗。细胞系通常源自来自原代培养物的谱系，其可在培养中维持无限时间。基因工程改造细胞系涉及用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，和/或以其他方式改变(例如，通过同源重组和基因活化或重组细胞与非重组细胞的融合)以引起宿主细胞表达所需的重组多肽。用于遗传工程细胞和/或细胞系以表达目的多肽的方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，各种技术在Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，Ausubel等人编辑(Wiley&Sons，纽约，1988,以及季度更新)；Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](冷泉实验室出版社,1989)；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture[大规模哺乳动物细胞培养],1990,第15-69页中说明。
动物细胞系衍生自其祖细胞来源于多细胞动物的细胞。一种动物细胞系是哺乳动物细胞系。适用于在培养中生长的多种哺乳动物细胞系可从美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯)和商业供应商处获得。工业中常用的细胞系的实例包括VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NSO、NS1)、PC12、WI38细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在某些实施例中，该哺乳动物宿主细胞是啮齿动物细胞。啮齿动物细胞系的实例包括例如幼仓鼠肾(BHK)(例如BHK21、BH TK)、小鼠Sertoli(TM4)、水牛大鼠肝(BRL 3A)、小鼠乳腺肿瘤(MMT)、大鼠肝癌(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠杂交瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中国仓鼠卵巢(CHO)和CHO细胞衍生物、小鼠胚胎(NIH/3T3、3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠肾(miMCD-3)。
在某些实施例中，该哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。如本文所用，“CHO细胞”还包括CHO衍生物，其中已将另外的遗传修饰引入CHO细胞。CHO细胞广泛用于生产复合重组蛋白，例如，细胞因子、凝血因子和抗体(Brasel等人，(1996),Blood[血液]88:2004-2012；Kaufman等人，(1988),J.Biol Chem[生物化学杂志]263:6352-6362；McKinnon等人，(1991),J.Mol Endocrinol[分子内分泌学杂志]6:231-239；Wood等人，(1990),J.Immunol.[免疫学杂志]145:301 1-3016)。
合适的CHO细胞包括例如DUXB11和DG44细胞系。这两种细胞系缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性，因此生长依赖于核苷酸前体的外源来源。DHFR缺陷是易于操作的表型，适于针对基因组整合和外源DNA的稳定表达进行选择。通过用目的基因和DHFR基因的表达盒转染细胞来完成基因组整合。转染后，将细胞置于缺乏核苷酸前体的选择培养基中。此外，这些细胞易于作为贴壁培养或悬浮培养操作，并表现出相对良好的遗传稳定性。CHO细胞和在其中重组表达的蛋白质已被广泛表征，并已被批准用于监管机构的临床商业制造。
通过向培养物中添加甲氨蝶呤(MTX)可以进一步增强DHFR缺陷细胞系中的重组蛋白表达，从而可以选择高拷贝数的引入的表达载体。MTX是DHFR酶的竞争性抑制剂。在没有核苷酸前体的情况下施加这种另外的选择压力使得能够选择和分离已经经历包含DHFR选择标记和(在大多数情况下)感兴趣的基因的整合表达载体的自发扩增的少数细胞群。多个基因拷贝的存在有助于实现外源蛋白的高水平表达。可替代地，可以独立于DHFR缺陷进行MTX选择(即，使用MTX选择最初具有DHFR能力的宿主细胞)。
另一种合适的CHO细胞系是野生型CHO-K1细胞系(例如ATCC#CCL-61)及其衍生物CHO-K1 SV。CHO-K1细胞系的一种常用选择方法是谷氨酰胺合成酶(GS)选择。没有外源谷氨酰胺来源情况下，细胞存活依赖于GS酶来产生谷氨酰胺。对于具有相对低的内源性GS酶活性的宿主细胞系，例如鼠骨髓瘤衍生的NS/0细胞和CHO细胞，该方法允许在表达载体和无谷氨酰胺选择培养基中使用GS选择标记时的简单选择方案。与DHFR/MTX系统类似，可以将GS竞争性抑制剂甲硫氨酸氨基亚砜(MSX)添加到培养基中以施加另外的压力并选择从整合载体驱动高水平表达的CHO细胞。
CHO-K1细胞或任何其他常用的CHO细胞也可以基于有或没有DHFR缺陷情况下的MTX选择。通常，当使用DFHR缺陷细胞系时，外源序列的拷贝数通常高得多，有时高达几百拷贝。
适用于本文所述发明的其他CHO细胞株包括例如CHO-ICAM-1细胞和CHO-hIFNγ细胞。这些遗传修饰的细胞允许将重组DNA稳定插入细胞的特定基因或表达区，扩增插入的DNA，并选择表现出重组蛋白高水平表达的细胞。
通常在工业实验室中使用的CHO细胞系的另外的实例包括CS-9和AM-1/D细胞(描述于美国专利号6,210,924中)。CS-9和AM1/D通过适应无血清培养基和亚克隆衍生自DUXB11。其他示例性CHO细胞系包括EM9(ATCC CRL-1861)、UV20(ATCC CRL-1862)、CHO dfhr-(ECACC 94060607)、RR CHO KI(ECACC 92052129)、hCBE11(ATCC PTA-3357)、E77.4(ATCCPTA-3765)、hLT-B:R-hG1CHO#14(ATCC CRL-11965)、MOR-CHO-MORAb-003-RCB(ATCC PTA-7552)、AQ.C2克隆11B(ATCC PTA-3274)、AQ.C2克隆11B(ATCC PTA-3274)、hsAQC2于CHO-DG44(ATCC PTA-3356)、xrs5(ATCC CRL-2348)、Led[原名Pro-5WgaRI3C](ATCC CRL-1735)、Pro-5(ATCC CRL-1781)、ACY1-E(ATCC 65421)、ACY1-E(ATCC 65420)、pgsE-606(ATCC CRL-2246)、CHO-CD36(ATCC CRL-2092)、pgsC-605(ATCC CRL-2245)、MC2/3(ATCC CRL-2143)、CHO-ICAM-1(ATCC CRL-2093)、和pgsB-618(ATCC CRL-2241)。可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平的重组迪诺舒单抗来选择细胞系。
如本文举例说明的，在CP3和CP4方法中，在生长期期间使用MTX选择来扩增CHO细胞。一般来说，在MTX选择情况下，估计宿主细胞包含约700-1000个拷贝的重组序列，从而增加重组蛋白质产生的总产率。因此，在某些实施例中，已经通过甲氨蝶呤(MTX)选择扩增了本发明的哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，该哺乳动物宿主细胞包含约500个拷贝或更多的编码迪诺舒单抗的核酸序列，例如约500个拷贝或更多、约600个拷贝或更多、或约700个拷贝或更多。
在某些实施例中，本发明的哺乳动物宿主细胞包含约500个拷贝或更多的包含SEQID NO.3的核酸序列，和/或约500个拷贝或更多的包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
在某些实施例中，本发明的哺乳动物宿主细胞包含编码SEQ ID NO:1的核酸序列，和/或编码SEQ ID NO:2的核酸序列。在某些实施例中，本发明的哺乳动物宿主细胞包含编码抗体的核酸序列，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链、和含有SEQ ID NO:2的轻链。在某些实施例中，本发明的哺乳动物宿主细胞包含含有SEQ ID NO.3的核酸序列，和/或含有SEQ ID NO:4的核酸序列。
在某些实施例中，CHO细胞系是当在提供足够葡萄糖的培养基中培养时在N-298位点提供低水平的高甘露糖的细胞系。此类宿主细胞包括以下CHO细胞，当在包含1g/L至20g/L的葡萄糖(例如4g/L至20g/L葡萄糖)的培养基中培养时，这些CHO细胞产生其中在N-298位点的高甘露糖水平为约1.8％或更少的迪诺舒单抗组合物。例如，在整个生产期期间，当在包含从约1g/L至约20g/L(例如，约4g/L至约18g/L)的葡萄糖的培养基中培养宿主细胞时(无需转换至低葡萄糖培养基)，在N-298位点的高甘露糖水平是约1.8％或更低、约1.7％或更低、约1.6％或更低、约1.5％或更低、约1.4％或更低、约1.3％或更低、约1.2％或更低、约1.1％或更低、约1.0％或更低、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、或约0.1％或更低。因为当在常规富含葡萄糖的培养基中培养时，此类CHO细胞不能在N-298位点提供所需的高甘露糖含量，所以使用本文所述的方法具有特别的优势，以增加由这些CHO细胞宿主产生的迪诺舒单抗分子的高甘露糖水平。
实例
实例1：CP2和CP3培养方法的比较
通过解冻来自70S工作细胞库的小瓶开始CP2培养扩增方法。将解冻的小瓶的内容物转移到摇瓶中的CP2细胞培养生长培养基中。将培养物连续传送到较大的摇瓶中，直到可以合并足够的细胞团用于接种20L生物反应器。然后将培养物扩增到60L生物反应器中，三天后扩增到300L生物反应器中。在300L生物反应器中三至四天后，接种2,000L生产生物反应器。
通过解冻来自25B12细胞系的WCB的小瓶开始CP3培养扩增方法。将解冻的小瓶的内容物转移到摇瓶中的含有甲氨蝶呤(MTX)的CP3细胞培养生长培养基中。将培养物连续传送到较大的摇瓶中，直到可以合并足够的细胞团用于接种10L培养袋生物反应器。在10L培养袋生物反应器中三天后，将细胞团接种到50L生物反应器中，在该阶段从生长培养基中除去MTX。这随后每三天进行一次，然后扩增到100L生物反应器中，之后是500L生物反应器中。在500L生物反应器中三天后，接种到2,000L生产生物反应器。
表3列出了CP2和CP3细胞培养扩增和生产方法的方法流程图的对比。在产生足够的生物质以接种生产生物反应器之前，两种方法都使用三个接种物生物反应器阶段。在接种物生物反应器的操作期间，将pH、温度、压力、搅拌和溶解氧控制在对每种方法特定的设定点。CP2方法涉及接种物生物反应器之间的全体积转移，而CP3方法靶向初始活细胞密度(VCD)。这是由于操作偏好所致。
细胞系从CP2变化到CP3带来了更高的产量。CP3细胞系(25B12)基于CS-9亲本CHO细胞。
另一个变化是在培养扩增方法中引入培养袋单元操作。这是一次性生物反应器技术，其被引入以减少接种N-3生物反应器所需的摇瓶的数量。
两种生产生物反应器的方法均在相同温度设定点的2,000L生产容器中操作。在生产生物反应器的操作期间，温度、初始VCD、pH和溶解氧被控制在每种方法(已针对不同细胞系进行了最优化)的特定设定点。
两种方法都通过先前的种子生物反应器(N-1)培养物稀释到产物生物反应器分批培养基中来进行接种。CP2方法涉及接种物生物反应器之间的全体积转移，且生产生物反应器中的最大初始VCD为10x 105个细胞/mL。CP3方法靶向5x 105个细胞/mL的初始VCD。差异是由于操作偏好所致。
CP2生产方法基于修改的DMEM/F12培养基，并且在第14天收获培养物之前在第3天和第9天有两次推注供给。CP2供给培养基基于ACO 4.4并含有大豆水解产物。CP3生产方法基于IMX 7.0培养基，并且在第10天收获培养物之前在第4天、第7天和第9天有三次推注供给。CP3供给培养基基于AFM004和AFM020培养基并含有酵母提取物(Yeastolate)。来自这两种方法的所有培养基均基于DMEM/F12培养基，并针对不同细胞系进行了优化。
表3.迪诺舒单抗CP2和CP3方法的细胞培养扩增(生长)和生产期的流程图
Figure BDA0002752601960000521
实例2：CP2和CP3收获和纯化方法的比较
在完成生产期后，将生物反应器内容物冷却并收获。将CP2方法冷却至18℃±3℃，CP3方法冷却至10℃-15℃。收获澄清涵盖圆盘堆叠离心、深度过滤(阶段1)和膜过滤(阶段2)。
圆盘堆叠离心完成了生产细胞和细胞碎片与培养基的初步分离。离心分离之后进行阶段1(深度)过滤，其进一步精炼收获的浓缩物，使得阶段2(膜)过滤和随后的纯化操作可以在没有显著污垢的情况下进行。在阶段1过滤器之后，阶段2膜过滤器提供具有高透明度和减少了生物负载的收获滤液池。
比较CP2纯化方法和CP3纯化方法的方法流程图如表4所示。两种方法都包含相同的基本类型的单元操作，但每个单元操作的操作参数以及这些单元操作的顺序已针对每种方法进行了优化。这是由于上游性能参数中细胞系的差异所致。
两种方法中的第一单元操作是对澄清的收获物进行的蛋白A亲和色谱分析步骤。蛋白A色谱步骤是初级的纯化阶段，其使用固定的蛋白A配体和迪诺舒单抗的Fc区之间的特异性高亲和力相互作用来捕获迪诺舒单抗。两种方法中的第二单元操作是低pH病毒灭活阶段，其设计用于灭活包膜病毒。
然后，在两阶段过滤之前，CP2方法使用2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)和Tris溶液将产物池中和至pH 6.5。在两阶段过滤之前，CP3方法使用柠檬酸三钠溶液将产物池中和至pH5.2。在此阶段，CP2方法可以保持在2-8℃进行长期储存，直到被征用进行进一步处理。CP3方法可在室温下保持5天。
在两种方法中的第二色谱分析步骤和第三单元操作是阳离子交换(CEX)。每种方法的操作条件相似。方法中的接下来的两个单元操作是病毒过滤和疏水相互作用色谱分析(HIC)阶段。两种方法的最终单元操作是超滤和透滤(UF/DF)，以将纯化的迪诺舒单抗交换到配制缓冲液中。对于CP2，最终药物物质浓度为70mg/mL。对于CP3，最终药物物质浓度为120mg/mL。
如表4所总结，CP3方法提高了迪诺舒单抗产量。
表4.迪诺舒单抗CP2和CP3方法的纯化流程图
Figure BDA0002752601960000541
实例3：CP2方法生产的迪诺舒单抗的聚糖图谱
迪诺舒单抗的糖基化包括占据重链上天冬酰胺298的单个N-连接位点的寡糖结构。
3.1聚糖占用
Asn-298的N-糖基化位点的占有是在用PNGaseF孵育后从迪诺舒单抗的Lys-C肽图谱确定的。质谱分析证明在PNGaseF处理后不存在对应于糖基化肽的离子，证实完全除去N-聚糖。在Asn-298处缺乏糖基化的肽被分辨为非糖基化肽；通过PNGaseF在Asn-298处的聚糖被除去的肽被分辨为去糖基化的肽。通过重建两种肽的+2至+5电荷状态的提取离子色谱图(EIC)，建立图中非糖基化和去糖基化肽的鉴定和定量。仅使用2种肽的每种电荷状态的单同位素峰来重建EIC。
N-糖基化位点的占有由非糖基化和去糖基化肽的EIC迹线的绝对峰面积确定。占用百分比使用以下等式计算：
Figure BDA0002752601960000551
计算假设非糖基化和去糖基化种类的电离效率相等；实际上，假定非糖基化肽含有Asn残基，而去糖基化肽在位置298处含有带负电荷的Asp残基，则非糖基化种类的电离效率可能略高于去糖基化种类。因此，可能过度报道了非糖基化肽的比例。在Asn-298的糖基化位点占有约为99.7％。通过与质谱联用的Lys-C肽图谱确定在Asn-298处非糖基化的形式的水平为约0.3％。
基于来自整个序列的肽作图研究的质量数据，没有任何可检测水平的另外N-连接糖基化或O-连接糖基化的证据。
3.2N-连接聚糖和O-连接聚糖的质量分析
通过寡糖作图、质谱法和外切糖苷酶测序表征N-连接的聚糖。寡糖作图涉及使用内切糖苷酶PNGase-F通过水解从蛋白质释放N-聚糖。然后通过用荧光标签(2-氨基苯甲酰胺，2-AB)进行还原胺化来标记释放的聚糖的还原末端，并通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)分离标记的聚糖，并进行荧光检测。
收集半制备型HPAEC谱中的每种聚糖种类用于质谱分析。将每个峰重新注入分析柱以验证级分的纯度(对于大多数级分，大于90％)。然后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析纯化的级分，以基于观察到的质量阐明聚糖结构。
每个级分的指定聚糖结构(参见图1)和基于经验式的理论质量与观察质量的关系如表5所示。观察质量均在理论质量的1,000ppm范围内，这在实验精度范围内。由于在分析条件下其低丰度和不足的电离特性，未鉴定出次要种类(峰1、15、16、17和18)的确切结构。
表5.建议的聚糖结构的质量
Figure BDA0002752601960000561
a通过质谱分析未鉴定峰1、15、16、17和18。
b观察到的质量假定从观察到的m/z中排除Na+加合物(22.99Da)。
c理论质量基于经验式，并包括聚糖和2-AB标记(净质量为118.14Da)。
存在于N-聚糖谱中的主要种类是具有不同程度的末端半乳糖基化的双触角结构(约85％)，如CHO衍生的抗体所预期的。接下来最普遍的物种是高甘露糖种类(约10％)，其中大部分是甘露糖5(8.1％)。在N-聚糖谱中也发现了单触角结构(峰2和4，3.7％)。岩藻糖基化与非岩藻糖基化双触角形式的比例约为9:1。
通过使用以下外切糖苷酶的酶促释放进一步证实了主要的N-连接的寡糖(表5中的峰2至9)的结构；α-(2-3,6,8,9)唾液酸酶、β-(1-4)半乳糖苷酶、β-(1-2,3,4,6)氨基葡萄糖苷酶、和α-(1-2,3,4,6)岩藻糖苷酶。
对照样品和样品中的聚糖谱用α-(2-3,6,8,9)唾液酸酶处理以切割唾液酸。八种主要种类中没有一种受到唾液酸酶处理的影响，证明这些主要种类不是唾液酸化的聚糖。还分析了用α-唾液酸酶和β-(1-4)半乳糖苷酶的组合消化的谱，β-(1-4)半乳糖苷酶特异性切割β-(1-4)连接的末端半乳糖残基。表5中列出的三个峰(A2F-G1、A2F-G2、A2-G1)具有提出的含有一个或多个末端半乳糖的结构。用β-(1-4)半乳糖苷酶处理后，这些峰不存在，证实在这3个峰中存在末端β-(1-4)连接的半乳糖残基。
除了前面描述的α-唾液酸酶和β-半乳糖苷酶的组合外，还分析了用β-(1-2,3,4,6)氨基葡萄糖苷酶(一种特异性切割末端GlcNAc残基的酶)消化的谱。在用唾液酸酶和半乳糖苷酶连续消化后，表5中列出了四种主要的聚糖种类，其中提出的结构含有末端GlcNAc：A1F-G0、A2G-G0、A1-G0和A2-G0。用β-(1-2,3,4,6)氨基葡萄糖苷酶处理后，不存在这些峰，证实在这四个峰中存在末端GlcNAc。
用α-唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和β-氨基葡萄糖苷酶的混合物消化后，在谱中剩余3个峰。收集在10分钟洗脱的峰并通过MALDI-TOF MS分析。观察到的质量为1,198.7Da，与2-AB标记的岩藻糖基化甘露糖3(1,198.1Da)的预期质量一致，岩藻糖化的甘露糖-3结构是由上述酶促处理从岩藻糖化的双触角结构中除去半乳糖和N-乙酰半乳糖胺而得到的。
除了α-唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和前面描述的β-葡糖胺酶的混合物外，还分析了用α-(1-2,3,4,6)岩藻糖苷酶(一种特异性切割与三甘露糖核心连接的岩藻糖残基的酶)消化的谱。在用α-(1-2,3,4,6)岩藻糖苷酶消化后，在10分钟从洗脱的峰不再存在于谱中，并且在16分钟处洗脱的峰的强度显著增加。该结果证实，在10分钟处洗脱的峰是岩藻糖基化的甘露糖3，并且在16分钟处洗脱的峰是非岩藻糖基化的甘露糖3。
除了上述外切糖苷酶处理之外，用α-(1-3,4,6)半乳糖苷酶消化聚糖池以鉴定迪诺舒单抗聚糖部分中任何潜在的免疫原性末端α-(1-3)半乳糖残基。在用α-半乳糖苷酶消化后，将迪诺舒单抗的HPAEC聚糖谱与对照样品进行比较。为了解释谱中的任何细微变化，进行对照和消化样品的三次注射。来自一式三份注射的色谱图的叠加显示聚糖谱没有变化，表明没有可检测量的末端α-(1-3)半乳糖残基。
基于上述外切糖苷酶处理研究，证实了通过HPAEC/MALDI-TOF MS(表5)鉴定了8种主要的N-连接的寡糖。
进行基于质谱的综合序列研究以表征迪诺舒单抗的一级结构。结果证实，没有证据表明迪诺舒单抗中存在任何O-连接的糖基化。
3.3糖化
在邻近Lys-98的可变区的重链中观察到非酶促糖化。修饰是对重链特异的。糖化有助于电荷异质性，因为它导致正电荷(Lys)的损失，导致酸性变体和162Da的质量增加。
通过CE-HPLC评估迪诺舒单抗的电荷异质性。迪诺舒单抗的CE-HPLC谱含有4个不同的峰：前峰1(PP-1)、主峰(MP)、碱性峰1(B-1)和碱性峰2(B-2)(图2A)。纯化的峰通过各种分析技术表征，包括基于正交电荷的技术和一级结构技术，以阐明电荷修饰的性质和位置。PP-1在Lys-98处含有糖化重链。用Lys-C肽图谱分析纯化的PP-1。在87分钟保留时间洗脱的峰中观察到与Lys-98处的糖化修饰一致的肽质量。
为了进一步确认作为糖化修饰的峰同一性，制备强制糖化样品并通过Lys-C肽图谱运行。通过将迪诺舒单抗与缓冲的葡萄糖溶液混合并在37℃下孵育过夜来完成强制糖化。还制备对照样品，其中从制剂中省略葡萄糖。在纯化的PP-1样品以及强制糖化样品中发现在87分钟处洗脱的肽水平升高，这进一步证实了纯化的PP-1样品中存在糖化变体。
推定的糖化肽峰和天然肽峰通过在肽图谱的洗脱期间原位电喷雾MS分析来表征。从3+离子的变焦扫描在88分钟洗脱的肽的测量的单同位素质量为5,572.48Da。在87.02分钟洗脱的来自糖化肽的3+离子的测量的单同位素质量为5,734.54Da(5,572.48+162.06Da)，与预期的+162质量的糖化添加一致。通过SE-HPLC和rCE-SDS检查PP-1的大小分布。通过SE-HPLC测定PP-1含有天然单体。还原的CE-SDS显示在重链后区域存在比重链略大的分子量种类。
通过CP2方法产生的迪诺舒单抗具有约10％的糖化(通过去糖基化的完整质量分析)，这可能是由于生产细胞培养液中存在的葡萄糖所致。
为了研究PP-1中电荷变体的生物学影响，使用HTRF受体-配体结合、报告基因和TRAP活性测定分析该级分的效力(表6)。强制糖化样品包括在分析中。PP-1和强制糖化药物物质都显示出完全的效力。
表6.PP-1和强制糖化样品的效力测定结果
Figure BDA0002752601960000591
注释：针对HTRF，3次测定；针对其他分析，5次测定
实例3：CP2和CP3方法产生的迪诺舒单抗的N-聚糖谱的比较
通过用N-聚糖酶处理除去聚糖，随后用荧光化合物2-氨基苯甲酰胺标记。使用高pH阴离子交换色谱分离聚糖种类，并使用荧光检测(激发λ＝330nm和发射λ＝420nm)定量。然后定量聚糖峰。所有测试样品的N-聚糖谱的叠加以及参考标准示于图3A中。来自CP3和CP2批次的迪诺舒单抗中N-聚糖的相对分布显示在图3B中。
如图3A中的聚糖图谱中所示，CP3和CP2批次含有八种命名的聚糖种类和两个命名的组。因此，整体聚糖图谱显示CP3和CP2批次中存在的类似聚糖模式。在CP3批次的图谱中没有观察到新的糖型。然而，CP3和CP2批次之间的聚糖分布存在差异。具体而言，CP3批次更多半乳糖基化，相应的唾液酸化程度增加。此外，CP3批次含有较少的Man-5和单触角结构(图3B)。表7总结了聚糖图谱历史数据。
注意，CP2和CP3的表7(最后一栏)中提供的“优选”范围被认为是临床范围(其通常基于临床试验期间的患者暴露)。临床范围通常比商业范围(由商业批次产生)更宽，更不严格。同样，这些优选范围不应简单地作为生物相似性评估的决定性标准。出于生物相似性的目的，可能需要不同或更窄范围的各种聚糖含量。
表7.聚糖图谱历史数据
参数 参考批次 CP2-1 CP2-2 CP3 优选的
A2F-G0 48.9-51.2 54.9-64.7 56.6-58.6 40.7-42.6 48％-70％
A2F-G1 27.8-29.5 14.5-19.2 18.8-20.6 35.6-35.8 13％-26％
A2-G0 5.0-6.7 5.0-5.8 4.5-5.8 6.8-7.1
A2F-G2 4.2-4.5 1.2-2.0 1.6-2.2 7.1-7.5
高甘露糖(Man 5) 2.4-4.0 6.6-10.6 8.0-9.3 0.7 2％-14％
A2-G1 2.0-2.2 0.7-0.9 0.9-1.4 3.6-4.0
％唾液酸化的 1.3-1.8 0.9-1.4 0.9-1.3 2.0-2.1
与CP2方法相比，使用CP3方法制造的迪诺舒单抗中不存在新的碳水化合物种类，但种类的分布略有不同。使用迪诺舒单抗进行的研究表明，糖基化差异不影响迪诺舒单抗与RANK配体的结合。通过所有3种生物测定，去糖基化的迪诺舒单抗也具有完全效力。
实例4：CP3方法产生的迪诺舒单抗的PK/PD研究
4.1研究设计
在健康志愿者中进行了开放标签、随机、单剂量、平行组研究。
受试者被随机化(1:1分配比例)以接受单次60mg SC剂量的使用CP3方法(治疗A)制造的迪诺舒单抗或单次60mg SC剂量的使用CP2方法(治疗B)制造的迪诺舒单抗。在从施用迪诺舒单抗之前到研究结束的指定时间点收集血样用于PK和PD分析。在进行所有研究程序后，受试者在第113天完成研究。
共有115名受试者参加该研究。共有112名受试者(97％)完成该研究。三名受试者(3％)未完成该研究。57名受试者接受CP3-迪诺舒单抗(55名完成研究)，58名受试者接受CP2-迪诺舒单抗(57名完成研究)。
使用经验证的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量迪诺舒单抗的血清浓度。测定的定量下限(LLOQ)为20ng/mL。简言之，将NF-κB配体的重组人受体活化剂(RANKL)包被在聚苯乙烯96孔板上并用作捕获试剂。通过将迪诺舒单抗掺入100％人血清中来制备标准品(STD)和质量对照(QC)。在用测定稀释剂(1X PBS，含1％BSA、1M NaCl、0.5％吐温20)1:10预处理后，将标准品、质量对照、研究样品和空白加载到孔中。通过固定的重组人RANKL捕获STD、QC和研究样品中的迪诺舒单抗。洗涤步骤后，添加生物素化的兔抗迪诺舒单抗检测抗体。在另一个洗涤步骤后，添加与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素以结合复合物。在最后的洗涤步骤后，将四甲基联苯胺(TMB)-过氧化物酶底物添加到板中。停止显色，并参照650nm在450nm下测量颜色强度(光密度，OD)。通过计算机软件介导的与同一运行的标准曲线的比较(根据加权因子为1/Y的逻辑自动估计回归模型进行回归(使用Watson LIMS版本7.0.0.01数据缩减包))，实现质量对照和研究样品的OD单位转换为浓度。
通过验证的血清CrossLaps ELISA测量血清C-端肽(CTX1)的浓度。LLOQ为0.049ng/mL。简言之，血清
Figure BDA0002752601960000611
ELISA基于2种针对EKAHD-β-GGR氨基酸序列的高度特异性单克隆抗体，其中天冬氨酸残基(D)是β-异构化的。为了在血清
Figure BDA0002752601960000612
ELISA中获得特异性信号，必须交联2条EKAHD-β-GGR链。将标准品(STD)、质量对照(QC)、样品对照(SC)、空白和研究样品添加至涂有链霉亲和素的微量滴定板中，然后添加生物素化抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体的混合物。存在于STD、QC、SC或样品中的CTX1将与生物素化抗体和HRP缀合抗体形成复合物。该复合物通过生物素化抗体与链霉亲和素包被的微量滴定板结合。在环境室温下孵育后，洗涤板。将四甲基联苯胺(TMB)溶液添加至板中。停止显色，并参照650nm在450nm下测量颜色强度(光密度，OD)。OD单位转换为浓度是通过计算机软件介导的与在同一平板上测定的标准曲线的比较并使用Watson版本7.0.0.01数据缩减包根据4参数逻辑(自动估计)回归模型(加权因子为1/Y2)回归实现的。
4.2药代动力学分析
使用PKS v3.1a中的WinNonlin Enterprise v 5.1.1，build 200610240912(Pharsight Corporation，加利福尼亚州山景城)，通过非房室方法分析血清迪诺舒单抗浓度-时间数据。使用SigmaPlot v10 build 10.0.1.2(SPSS科学公司(SPSS Science)，伊利诺伊州芝加哥)创建图。除非实际时间偏差等于或大于10％(在这种情况下使用实际时间)，否则在分析中使用标称采样时间。在非房室分析和总结统计的计算中，将低于定量下限(LLOQ)(20ng/mL)的迪诺舒单抗血清浓度设定为零。使用非取整值计算汇总统计数据。
通过检查数据鉴定给药后观察到的最大血清迪诺舒单抗浓度(Cmax)。还记录了相应的Cmax时间(tmax)。通过线性-对数梯形法(其将线性梯形法则应用到Cmax，然后将对数梯形法则应用于剩余的曲线)计算从0到16周(AUC0-16周)的浓度-时间曲线下的面积。
迪诺舒单抗CP3和CP2的平均血清迪诺舒单抗浓度-时间谱以线性标度和半对数标度分别显示在图4A-4B中。在线性标度上评估谱(图4A)表明，采样到16周(112天)捕获了两种处理的大部分暴露。显示由CP3方法产生的迪诺舒单抗。与通过CP2方法生产的迪诺舒单抗相比，CP3-迪诺舒单抗具有更多的gal种类，更少的高甘露糖种类。
如图4A和4B所示，通过CP3方法产生的迪诺舒单抗在患者中显示出更高的血清半衰期(平均半衰期延长10％)，表明清除速率更慢。CP2产生的迪诺舒单抗的平均半衰期为约25.8(6.5)天(中位数＝25.0)；CP2产生的迪诺舒单抗的平均半衰期为约28.3(6.5)天(中位数＝27.4)。CP3的几何平均AUC0-16周和Cmax值分别比CP2的值大约16％和14％(表8.1和8.2)。
如图4D和4E所示，CP3-迪诺舒单抗的半衰期延长是由于Man-5种类的更快清除。优先清除包含Man-5的迪诺舒单抗分子，导致Man-5水平随时间整体降低。相反，gal种类的水平在同一时期内基本保持不变。这表明与没有Man-5的迪诺舒单抗相比，具有Man-5的迪诺舒单抗分子优先在血清中清除，导致Man-5水平的总体降低。在研究开始时，大约8％的迪诺舒单抗分子包含Man-5；在第60天左右，少于4％的迪诺舒单抗分子包含Man-5。
表8.1 CP3-迪诺舒单抗的PK/PD总结
Figure BDA0002752601960000631
*CP3/CP2比率的点估计值(90％置信区间)
表8.2向健康志愿者SC施用60mg迪诺舒单抗CP3或CP2后的平均(SD)血清迪诺舒单抗药代动力学参数估计值
Figure BDA0002752601960000632
Figure BDA0002752601960000641
AUC0-16周＝从0到16周血清迪诺舒单抗浓度-时间曲线下面积
Cmax＝最大观察浓度
tmax＝观察到Cmax的时间并表示为以中位数(范围)
a平均值四舍五入为3个有效数字(tmax为2个)，SD报告的精度与其各自平均值相同；
所有计算均使用非取整值进行
b点估计值(PE)和90％置信区间(CI)用于对数变换的比率(CP3/CP2)
AUC0-16周和Cmax
cN＝56和55(分别对于CP2和CP3 AUC0-16周值)
4.3药效学分析
基线血清CTX1浓度计算为在给予迪诺舒单抗之前获得的3个样品中测定的浓度的中值。自基线的百分比变化计算为给药后测量值减去基线测量值除以基线测量值乘以100％。将低于分析方法的LLOQ的基线后CTX1浓度指定为LLOQ(0.049ng/mL)的值，用于计算自基线的百分比变化。所有计算均使用非取整值进行。除非实际时间偏差等于或大于10％(在这种情况下使用实际时间)，否则在分析中使用标称采样时间。使用SigmaPlot v10build 10.0.1.2(SPSS科学公司(SPSS Science)，伊利诺伊州芝加哥)创建图。
给药后CTX1的抑制％计算为自基线的％变化乘以-1。使用WinNonlin Enterprisev 5.1.1(图视公司(Pharsight Corporation)，加利福尼亚州山景城)，通过非房室方法分析CTX1相对于时间数据的单独％抑制。记录观察到的CTX1(Imax)的最大抑制％及其发生的时间(tmax，CTX1)。通过线性-对数梯形法(其将线性梯形法则应用于Imax然后对数梯形法则应用于曲线的其余部分)计算在时间0至16周(AUEC0-16周)的效应曲线下面积(CTX1相对于时间的抑制％)。
在基线时，CP3组的CTX1的平均(±SD)血清浓度为0.555(±0.288)ng/mL，CP2组为0.488(±0.251)ng/mL。图4C中提供了2种治疗的相对于时间的从基线CTX1的平均(±SD)百分比变化。两种治疗的从基线CTX1谱的平均变化百分比基本上是可叠加的。几何平均值AUEC0-16周和Imax值在处理组之间差异≤3％(表8.1和8.3)。AUEC0-16周和Imax的几何平均值之比的90％CI在0.80至1.25的范围内。尽管CP3和CP2之间的中位数tmax、CTX1值不同(25天相对于12天)，但从基线谱的平均CTX1百分比变化(图10-3)可以看出，从第7天到第112天，两种治疗方法总体抑制程度相对恒定。
表8.3向健康志愿者SC施用60mg迪诺舒单抗CP3或CP2后的平均(SD)血清C-端肽参数估计值
Figure BDA0002752601960000651
AUEC0-16周＝从0到16周的效应曲线下的面积
Imax＝最大观察％抑制
tmax,CTX1＝观察到Imax的时间，表示为中位数(范围)
a平均值四舍五入为3个有效数字(tmax为2个)，SD报告的精度与其各自平均值相同；
所有计算均使用非取整值进行
b点估计值(PE)和90％置信区间(CI)用于对数变换的比率(CP3/CP2)
AUEC0-16周和Imax
cN＝56和55(分别对于CP2和CP3 AUEC0-16周值)。
实例5：CP2和CP4培养方法的比较
表9列出了比较CP2方法与CP4方法的细胞培养和收获操作的方法流程图。CP4细胞培养扩增和生产方法基于CS-9CHO(25B12)亲本细胞系。CP4方法使用以灌注模式操作的较小生产生物反应器，并且专门使用一次性(用后可弃)细胞培养扩增和生产容器。CP2和CP4生产培养方法在针对每种细胞系优化的方法特异性设定点进行控制。针对优化细胞健康和生产设计培养基配制品和营养物供给的时间。CP4生产生物反应器使用化学成分确定的培养基配制品，并用甲氨蝶呤(MTX)扩增。对于这两种方法，在摇瓶中进行细胞团的解冻和初始扩增。两种方法均使用Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM)/基于F12的培养基；然而，配制品是不同的，并且针对不同的细胞系进行了优化。
表9.迪诺舒单抗CP2和CP4方法的细胞培养和收获
Figure BDA0002752601960000661
Figure BDA0002752601960000671
*聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)和聚乙二醇(PEG)
对于这两种方法，扩增生物反应器阶段以分批模式操作，除了以分批供给模式操作的CP4 N-1。在扩增生物反应器阶段期间，CP2方法使用4个不锈钢生物反应器，而CP4方法使用2个一次性袋(SUB)系统，每个系统具有2个阶段。CP4扩增方法中的第一一次性使用系统是2阶段50L培养袋，其温度、pCO2和覆盖气体流速控制在方法特定的设定点。CP4扩增方法中的第二一次性使用系统是2阶段500L SUB，在第二阶段的第2天(N-1)具有营养物供给。在所有扩增生物反应器(CP2和CP4 SUB阶段)的操作期间，将pH、温度、压力、搅拌和溶解氧控制为方法特定的设定点。
生产生物反应器在不同模式下操作。CP2方法使用16kL不锈钢，分批供给生物反应器，在第3天和第9天供给，并在第14天收获培养物。CP4方法在第3天和第6天使用2kL SUB和2次推注供给，在第7天开始灌注，第11天改变培养基，并且在第18天收获培养物。在第11天改变培养基降低了葡萄糖浓度，并添加了半乳糖作为可替代得碳水化合物来源。进行这种改变使得来自CP4方法的高甘露糖聚糖谱与CP2方法的高甘露糖聚糖谱相当，因为单克隆抗体上的高甘露糖聚糖谱可能具有影响体内清除的潜力。灌注分离技术使用具有30kDa标称孔径的膜，使得大于该尺寸的所有组分保留在生物反应器中，包括细胞和产物。所有设定点都针对每种细胞系和生产模式进行了优化。
CP2生产和供给培养基基于改良的DMEM/F12培养基并含有大豆水解产物。CP4生产、供给和灌注培养基是化学成分确定的配制品，不含水解产物。
实例6：CP2和CP4收获和纯化方法的比较
在两种方法中，在生产阶段完成后，将生物反应器内容物冷却至CP2中10±3℃的目标温度和CP4中≤12℃的目标温度。对于CP2方法，圆盘堆叠离心完成了生产细胞和细胞碎片与培养基的初步分离。对于CP4方法，使用聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)和聚乙二醇(PEG)絮凝然后沉降来完成初步分离。两种方法都遵循深度和膜过滤的初步分离。另外，CP4方法在收获方法中利用空气或氧气喷射。
表10列出了比较CP2方法和CP4方法的纯化操作的方法流程图。
表10.迪诺舒单抗CP2和CP4方法的纯化
Figure BDA0002752601960000681
Figure BDA0002752601960000691
两种纯化方法都使用相同的基本单元操作：2个专门的病毒清除/灭活操作(低pH病毒灭活和200nm病毒过滤)、3个色谱操作(蛋白A亲和力、阳离子交换和疏水相互作用)、以及超滤(UF)/渗滤(DF)操作，以将迪诺舒单抗浓缩和缓冲液交换进入最终的DS配制品。每个单元操作的操作参数以及这些单元操作的顺序已针对每种方法进行了优化。另外的差异包括色谱树脂、缓冲液、过滤器类型以及操作区域和顺序的变化。这些差异是由于细胞系的变化和在CP4方法生产生物反应器中使用灌注模式导致的较高细胞浓度。
第一单元操作是第1列，对收获滤液进行蛋白A亲和色谱步骤。第1列是初级纯化阶段，利用固定化蛋白A和IgG型抗体Fc区之间的特异性高亲和力相互作用来捕获迪诺舒单抗。CP4方法使用MabSelect SuRe树脂，CP2方法使用MabSelect树脂。两种方法中的第二单元操作是低pH病毒灭活步骤，这是灭活和清除病毒的2个专门操作中的第一个。CP4方法在pH 3.5±0.1下进行病毒灭活60-90分钟，CP2方法在pH 3.31-3.60下进行60-120分钟，差异是由于宿主细胞系的变化和方法。
在CP4方法中的低pH孵育期结束时，用Tris碱将病毒灭活池的pH调节至5.0，然后通过0.2μm聚醚砜(PES)膜过滤器对池过滤。对于CP2方法，用1-(N-吗啉代)-乙磺酸钠(MES)和Tris碱将池的pH调节至3.31-3.60，然后通过2级过滤系统使池澄清。pH的差异是由于第2列的操作差异。
两种方法中的第三单元操作是第2列，阳离子交换色谱(CEX)步骤。该步骤使用CEX树脂从来自产物流的过滤的病毒灭活池中除去存在的杂质。CP4方法使用Fractogel COO-(M)树脂，CP2方法使用Fractogel SO3 -(M)树脂。
两种方法的下两个单元操作是病毒过滤和疏水相互作用色谱(HIC)阶段；然而，顺序被颠倒了。
两种方法的下一个单元操作是UF/DF以将纯化的迪诺舒单抗交换到配制品缓冲液中。将CP4和CP2产物流均用pH 4.80的10mM乙酸钠、5％山梨糖醇渗滤至最终的迪诺舒单抗浓度为70mg/mL。未对DS存储容器或存储条件进行任何更改
实例7：CP4方法产生的迪诺舒单抗的聚糖图
7.1CP4方法产生的迪诺舒单抗的N-聚糖图
通过N-连接的寡糖结构的作图来评估糖基化。该程序涉及用PNGaseF处理从迪诺舒单抗释放N-连接聚糖。释放的聚糖用2-氨基苯甲酸(2-AA)标记，然后用亲水相互作用液相色谱(HILIC)进行荧光检测。用荧光检测器监测洗脱峰。通过质谱法的寡糖作图进行迪诺舒单抗N聚糖图谱峰的表征。每个聚糖的指定聚糖结构和基于经验式的理论质量相对于观察质量显示在表2和5中。观察质量均在预期的实验精度范围内。
表11.主要N-连接聚糖的组成
Figure BDA0002752601960000701
Figure BDA0002752601960000711
a.“％”是指根据HILIC峰计算的相对百分比
大多数种类是核心岩藻糖基化，复合双触角结构，具有0或1个末端半乳糖，具有相对低水平的非岩藻糖化双触角结构。聚糖群包含非常低水平的唾液酸化的种类和杂合型聚糖，以及约8％高甘露糖聚糖(主要作为甘露糖5结构)。通过整合所有聚糖峰确定迪诺舒单抗N-连接聚糖的百分比。此类峰的实例如图5所示。
已知未存在于共有位点基序(Asn-Xxx-Ser/Thr)内的Asn上的N-糖基化在人抗体上以低水平发生。该种类通常通过rCE SDS分辨为重链后峰。确定该重链后峰面积相对于总重链峰面积的相对百分比在迪诺舒单抗中产生约1.5％的非共有糖基化水平。
进行基于质谱的序列研究以表征迪诺舒单抗的一级结构。结果证实，没有证据表明迪诺舒单抗中存在任何O-连接的糖基化。
7.2非酶促糖化表征
7.2.1糖化表征
非酶促糖化是通过在糖的醛基和蛋白质的伯胺之间形成席夫碱而使还原糖(葡萄糖或半乳糖)与蛋白质反应的方法。在CP2产生的迪诺舒单抗中，非酶促糖化(CE-HPLC前峰中富集的种类)位于迪诺舒单抗的一个赖氨酸残基(Lys-98)上。
表征技术和高分辨率质谱仪器的进步使得能够进一步表征迪诺舒单抗上的非酶促糖化。用硼氢化钠处理迪诺舒单抗，然后用胰蛋白酶还原、烷基化和消化，用于用质谱检测的肽图谱分析。用硼氢化钠处理，如Brady等人所述(Anal.Chem.[分析化学],2007,79(24),第9403-9413页)，稳定糖和蛋白质之间的键，允许通过MS/MS进行位点鉴定。使用该技术，阐明了CP4产生的迪诺舒单抗中多个糖化位点的鉴定。表12中提供了来自两种方法的迪诺舒单抗的非酶促糖化的鉴定位点，表明存在相同的糖化位点。这一预期结果是由于糖化不是随机事件，而是高度依赖于溶剂可及性以及蛋白质的局部化学环境(Gadgil等人，JPharm Sci.[药学科学杂志]2007年10月；96(10):2607-21.)。
表12.迪诺舒单抗糖化位点
Figure BDA0002752601960000721
CP4方法在细胞培养期间利用葡萄糖和半乳糖，产生用葡萄糖和半乳糖糖化的抗体。CP4上存在的糖化约为24％，估计为12％是由于半乳糖糖化。
葡萄糖在人血清中以约70-100mg/dL(Pesce和Bodourian 1982)存在，导致循环蛋白的非酶促糖化。半乳糖天然存在于人血清中，浓度约为0.3mg/dL。在这些低血清半乳糖水平下，健康个体不太可能具有可测量水平的半乳糖糖化的循环蛋白，除了半乳糖血症患者。半乳糖糖化的临床安全性未知，因此可能被认为是一种新的分子种类，可能是一个潜在的安全问题。为了解决这一潜在的安全问题，我们进行了一项研究，以评估这种翻译后修饰的糖化水平、临床安全性和疗效影响。
CP4-迪诺舒单抗具有约24％的糖化，而CP2具有约10％的糖化。在CP2上鉴定出12个糖化位点。在CP4上检测到相同的12个位点，未发现新的糖化位点。CP4、CP2和富集糖化的CP4样品(70％)在两种功能性生物测定中具有相同的效力，证明糖化水平和半乳糖糖化不影响产物功能。另外，胰蛋白酶肽作图实验证实糖化的药物物质位点在CP2和CP4方法之间是相同的，其中鉴定了总共12个糖化位点，没有一个存在于迪诺舒单抗的CDR区中。
CP4方法利用含葡萄糖的培养基进行第1-10天的细胞培养，然后在第11-18天使用含有低葡萄糖和高半乳糖的灌注培养基。培养基的单糖分析确定细胞培养第12天的葡萄糖水平低于可检测水平。因此，半乳糖可能是培养基改变后大部分糖化的原因。基于该数据，进行理论计算以估计CP4-迪诺舒单抗上存在的葡萄糖水平与半乳糖糖化的关系。该计算确定大约50％的CP4糖化(24％)是由于半乳糖。这对应于用半乳糖糖化的8种抗体中的1种和用葡萄糖糖化的8种抗体中的1种。
7.2.2糖化的生物学特征
治疗性抗体的修饰可导致临床功效降低或可能影响患者安全性。因此，进行了特异加强糖化的CP4-迪诺舒单抗的彻底表征。使用HTRF的效力分析和报告基因结合测定来评估CP4-迪诺舒单抗与CP-迪诺舒单抗相比的生物学功能。
在CP2-迪诺舒单抗的开发中，进行强制糖化研究以评估糖化和对效力的影响。迪诺舒单抗CP2被强制糖化至比起始材料高约68倍的水平。当通过HTRF和报告基因测定分析时，该样品保留了所有效力。
在一个测定中，纯化的CP4 CEX前峰种类具有约70％的糖化，而主峰和碱性级分中是24％。通过HTRF和报道基因测定，所有三种纯化的级分保留其效力，表明升高的糖化水平不影响产物功能。此外，通过HTRF和报道基因测定，CP2和CP4的相对效力相当，进一步证明CP4的糖化不影响产物效力。
7.2.3糖化和对Fc功能的潜在影响
IgG抗体的清除或血清半衰期受新生儿Fc受体(FcRn)调节。先前对IgG1和IgG2抗体进行的强制糖化研究(Goetze等人，2012)已确定对FcRn结合没有影响，表明糖化修饰对蛋白质功能几乎没有影响。然而，在CP2和CP4样品上进行FcRn，这些数据证明了相似的FcRn。基于强制糖化研究结果并且鉴于CP2和CP4具有相同的糖化位点，CP4糖化水平的升高不影响FcRn结合。
7.2.4半乳糖糖化的免疫原性评估
具有半乳糖糖化的D迪诺舒单抗是先前药物产品展示中未出现的新种类，因此，进行了免疫原性风险评估。成熟的体液免疫应答需要B细胞表位和T细胞表位。B细胞表位是抗体结合位点并且通常依赖于蛋白质构象。T细胞表位是线性氨基酸序列，其与抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性II类蛋白结合，并引发T细胞分泌细胞因子，其引发抗体成熟。免疫原性风险评估考虑了以下因素：
B细胞表位风险。与仅含有葡萄糖糖化的CP2相比，CP4含有用半乳糖糖化的新种类。没有患者接触过这些新种类，并且对免疫反应存在一些不确定性。糖化分布在多达11个不同的赖氨酸中，约12％的迪诺舒单抗分子具有1个半乳糖。因此，具有用半乳糖修饰的特定氨基酸的任何一个分子的浓度都很低。
由于非耐受性序列，针对完全人单克隆抗体的抗体通常与CDR区结合。迪诺舒单抗中的CDR含有1个赖氨酸和在相邻框架中含有6个赖氨酸，其可能被半乳糖糖化。然而，尚未检测到CDR中的糖化。
T细胞表位风险。电脑模拟分析预测只有1个次要T细胞“限制位”。糖化不会导致引起T细胞辅助的序列变体。半乳糖可以增强抗原加工，然而，富含半乳糖的分子的摄取增加可能是由于更高阶的寡糖。
总体而言，半乳糖糖化改变迪诺舒单抗免疫原性的风险很小。
7.3非共有N-聚糖(NCG)
非共有N-聚糖(NCG)，如在Valliere-Douglas等人(J Biol Chem.[生物化学杂志]2009年11月20日；284(47):32493–32506)中描述，表示寡糖与Asn残基的连接，该Asn残基不是共有基序的一部分，通常在抗体CH2结构域中。该种类通常富集在CE-HPLC前峰中，并通过rCE-SDS分辨为重链后峰。
通过rCE-SDS分析CE-HPLC级分表明CE-HPLC前峰略微富集非糖基化重链(NGHC)峰。另外，rCE-SDS数据表明CE-HPLC前峰级分略微富集重链后峰(表13)，结果与Valliere-Douglas等人(2009)中的发现一致。
表13.用于CE-HPLC级分的rCE-SDS分析的峰面积
Figure BDA0002752601960000751
实例8：CP2和CP4方法产生的迪诺舒单抗的聚糖谱的比较
比较了来自CP2和CP4批次的高pH阴离子交换色谱(HP-AEX)产生的寡糖图谱。所有CP4和CP2批次均符合4％至11％甘露糖-5的可比性验收标准(表14)。CP4药物物质批次具有与CP2历史数据相比可比较的甘露糖-5水平，并且在历史最小值和最大值(5％至9％甘露糖-5)之内。聚糖图谱(HP-AEX)叠加图示于图5中。与预期的CP2批次相比，叠加图显示CP4药物物质中的A2F-G1水平较低。
表14.甘露糖-5聚糖图谱(HP-AEX)批次药物物质释放测试
Figure BDA0002752601960000752
a.可比性验收标准基于内部历史数据。这些范围不应简单地作为生物相似性评估的决定性标准。出于生物相似性的目的，可能需要不同或更窄范围的甘露糖-5。
作为修改CP4细胞培养方法以控制Man-5水平的结果，预期CP4-迪诺舒单抗将具有比CP2-迪诺舒单抗更少的％A2F-G1和更多％A2F-G0寡糖种类。这些种类是人血清中天然存在的糖型，因此不被认为是安全或功效问题。
为了评估聚糖谱的潜在变化，使用聚糖图谱分析来评估迪诺舒单抗的N-连接聚糖。图5显示了通过两种方法产生的迪诺舒单抗之间一致的N-聚糖谱。在CP4批次的图谱中没有观察到新的糖型。表14中显示了％A2F-G0、％A2F-G1和％Man 5寡糖种类的总结。CP4数据在计算的容许区间(TI)范围内，％A2F-G1结果位于计算的CP2 TI范围的低端。CP2批次与CP4批次的末端半乳糖基化的轻微变化预计不会影响产物安全性或功效。
如这些数据所示，与CP2方法相比，使用CP4方法制造的迪诺舒单抗中不存在新的碳水化合物种类。CP4和CP2批次符合HP-AEX可比性标准。表15.1和15.2总结了HP-AEX分析方法中记录的所有N-聚糖种类的总结。如此汇总表所示，CP4批次获得的值与CP2方法中的值类似。CP4和CP2批次之间的唾液酸化的种类的水平相似。在CP4和CP2批次之间观察到％A1F-G0水平的微小差异；但是，预计这些差异不会影响产物的功效。
表15.1.来自CP4和CP2的迪诺舒单抗，HP-AEX可比性汇总表
Figure BDA0002752601960000761
a.可比性验收标准基于内部历史数据。这些范围不应简单地作为生物相似性评估的决定性标准。出于生物相似性的目的，可能需要不同或更窄范围的聚糖种类。
表15.2.HP-AEX迪诺舒单抗CP4和CP2 N-糖聚种类汇总表
Figure BDA0002752601960000762
Figure BDA0002752601960000771
与CP2药物物质相比，在迪诺舒单抗CP4药物物质中观察到的糖化水平增加与CP4方法的变化一致，即细胞培养基中细胞培养方法持续时间的增加和葡萄糖和半乳糖的使用的组合。在CP2生产供给中没有使用半乳糖，并且已经显示培养基中的半乳糖导致比葡萄糖更高水平的非酶促糖化(Quan等人，Anal Biochem[分析生物化学]2008；373(2):179-91)。CP4药物物质具有约24％的总糖化，相比CP2药物物质约为10％。预期CP4药物物质上存在的升高的糖化水平是葡萄糖和半乳糖的组合。
在先前的研究中，即使当糖化增加约68倍(通过强制糖化)时，通过HTRF和报道基因测定，CP2药物物质保留完全效力。通过HTRF和报告基因测定，CP4药物物质和CP2药物物质的效力相当，进一步证明迪诺舒单抗CP4药物物质的糖化水平大约高2倍不影响效力(表16.1和16.2)。另外，IgG1和IgG2抗体的强制糖化不会对FcRn结合产生可测量的影响，进一步表明糖化对迪诺舒单抗的生物学功能几乎没有影响。总之，这些数据表明，预计CP4观察到的糖化增加不会影响产物安全性或功效。
表16.1.HTRF效力结果
Figure BDA0002752601960000772
a.可比性验收标准基于内部历史数据。这些范围不应简单地作为生物相似性评估的决定性标准。出于生物相似性的目的，可能需要不同或更窄的相对效力范围。
表16.2.可比性报告基因测定汇总表
Figure BDA0002752601960000781
实例9：葡萄糖、蔗糖和半乳糖浓度对高甘露糖含量的影响
在该实施例中，使用不同浓度的葡萄糖、蔗糖和半乳糖来评估它们对迪诺舒单抗的高甘露糖含量的影响。
选择针对葡萄糖的两种碳源替代物二糖蔗糖和单糖半乳糖来评估它们对包含高甘露糖的迪诺舒单抗分子的百分比的影响。如上文详细描述的，通过灌注在第11天至第17天发生培养基变化。
在一项研究中，评估了葡萄糖和半乳糖浓度对Man-5含量的影响。实验设计如表17所示。
表17.实验设计：葡萄糖和半乳糖
Figure BDA0002752601960000782
图7A显示了第17天Man-5的完整模型分析，其中在实验中心点处具有预测谱。数据表明，葡萄糖和半乳糖之间的相互作用可能对Man-5水平很重要。图7B显示了第17天Man-5的预测，其中葡萄糖水平设定为2.5g/L。通过HELIC分析方法获得Man-5结果。图7C显示了Man-5从第11天到第17天的时程变化。该图显示了Man-5随时间的增加。
表18显示了该研究的聚糖谱。这些聚糖种类的变异都没有统计学意义。
表18.第17天聚糖谱
Figure BDA0002752601960000791
基于该研究，确定对于约10％Man-5，培养基应包含约2.5g/L的葡萄糖和约11.5g/L的半乳糖。这些浓度导致生长、活力和滴度之间的平衡，同时实现获得Man-5靶标的主要目标。分析还显示葡萄糖浓度与生长和滴度之间的相关性，较高的葡萄糖产生较高的生长和滴度。选择浓度为2.5g/L的半乳糖，即使较高的半乳糖可以产生较高的Man-5水平，但较高的半乳糖可能对培养物的活力具有潜在的负面影响。
在第二项研究中，评估了葡萄糖和蔗糖浓度对Man-5含量的影响。实验设计如表19所示。靶标Man-5至少为7％-9％。
表19.实验设计：葡萄糖和蔗糖
Figure BDA0002752601960000801
在测试的因素中，所有因素都在第17天达到Man-5水平超过8％，并且许多因素在第15天达到10％以上。Man-5的第17天的范围从9％至略低于16％。最接近CP2水平的两个条件是具有2g/L葡萄糖和16g/L或24g/L蔗糖的条件。通过HILIC测定的Man-5的图示于图8B中。图8C显示与CP2参考相比的Man-5和总高甘露糖种类。
实例10：低葡萄糖和半乳糖补充对SR3 GS-KO宿主细胞的影响
在该实例中，使用另一种CHO宿主细胞系来评估补充有可替代的碳源(半乳糖)的低葡萄糖培养基的效果。细胞系SR3 GS-KO衍生自CHO-K1细胞系，具有GS敲除。
使用10天分批供给(FB)平台评估生产条件下生长、迪诺舒单抗分子的表达和产物质量(PQ)谱，其中步骤如下(图9A)：
1.N-1接种。在10天FB之前，将池恢复至>85％的存活率。将迪诺舒单抗转染的SR3-E1 GS-KO细胞的4天种子培养培养物以5x105个细胞/ml接种在培养基中。
2.N接种。从N-1种子培养中建立生产培养物，其中将细胞接种在50mL旋转管中。在第0天用高活力细胞(>98％)以1x 106个细胞/ml接种分批供给培养物。将培养容器保持在36℃+5％CO2，同时在生产期期间以225rpm振荡。
3.方法中监控。使用Vicell在第3、6、8和10天测量活细胞密度和百分比活力。使用Novaflex在同一天测量葡萄糖消耗水平。
4.供给和补充。生产培养物在第3、6和8天用供给以下：以5％的初始培养物起始体积的供给培养基和1x酪氨酸-半胱氨酸补充物(以0.4％的供给体积供给)。在供给日添加作为推注的10g/L半乳糖，同时允许葡萄糖水平通过消耗下降，并且仅在生产期间供给以维持1-5g/L水平。
5.滴度和产物质量评估。在第10天收获之前，测量活细胞密度、百分比活力和葡萄糖水平。为了收获条件培养基(CM)，将培养物以200g离心15分钟。收集CM用于滴度测量和ATOLL中心柱纯化。纯化的材料用于产物质量评估，包括HILIC、CEX-HPLC、SE-HPLC、nrCE-SDS和rCE-SDS测定。
10.1在10天的分批供给期间添加D-半乳糖不影响培养物的活力。
在三种培养条件下重复测试三组迪诺舒单抗转染的SR3-E1GSKO细胞：1)对照(Ctrl)或对照(control)，供给日补充葡萄糖，培养期间保持10-12g/L水平；2)Gal/Gluc，10g/L半乳糖作为推注与葡萄糖一起补充以维持10-12g/L水平；以及3)仅含Gal，10g/L半乳糖作为推注补充，不供给葡萄糖，以在培养期间维持1-5g/L葡萄糖水平。在供给和收获前第3、6、8和10天使用Vicell测量10天的分批供给期间细胞的活力。跨池和条件的所有培养物在整个10天的分批供给中显示高活力(>80％)(图9B)，表明在生产培养中修改糖水平和来源对活力的影响最小。
10.2低葡萄糖水平对细胞生长和比生产率的影响。
在供给前第3天、第6天、第8天和第10天使用Novaflex进行生物反应器中葡萄糖水平的测量，以确保葡萄糖在每种条件下保持在适当的水平。对于仅gal的培养条件，在第6天允许葡萄糖水平降低至约2g/L。在这种条件下，葡萄糖在10天的分批供给的剩余时间内保持在该水平(图9C)。这一观察表明，在没有葡萄糖作为糖源的情况下，表达迪诺舒单抗的SR3-E1 GSKO细胞可能转而使用半乳糖来维持其生长和其他细胞活动。
低水平的葡萄糖不影响活力，但在添加半乳糖的培养物中细胞生长稍慢。在补充半乳糖和葡萄糖的培养物中观察到最慢的生长(图10A)。在该培养条件下，滴度显得较低，与对照培养物相比，比生产率没有显示出显著差异(图10B-10C)。在低葡萄糖条件下添加半乳糖与滴度稍微下降和比生产率降低相关。
10.3D-半乳糖与低葡萄糖组合的添加增加了迪诺舒单抗的高甘露糖水平。
来自10天的分批供给的条件培养基进行ATOLL纯化和产物质量属性测定。使用尺寸排阻色谱(SE-HPLC)分析纯化的产物，发现其具有约99％纯度和<1％的高分子量和低分子量杂质(数据未显示)。
随后进行亲水相互作用色谱(HILIC)以测量产物的聚糖水平。结果表明，在高葡萄糖水平存在下添加半乳糖不会影响迪诺舒单抗的高甘露糖(M5)水平。另一方面，在低葡萄糖水平下补充10g/L半乳糖使高甘露糖水平增加约1.5倍或更多(图11)。该数据表明，在小规模生产期间将糖源从葡萄糖改变为半乳糖对产物的高甘露糖水平具有直接影响。
10.4半乳糖的添加增加了单和双半乳糖基化的聚糖残基。
对聚糖谱的分析进一步表明，在10天的分批供给期间添加半乳糖补充剂导致半乳糖残基的最小减少，但增加去唾液酸单半乳糖和二半乳糖残基。这些残基的增加与低葡萄糖条件的培养物中存在的葡萄糖水平成反比，显示出约2-4倍的增加(图12)。
根据在说明书内引用的参考文献的教导，将最彻底地理解本说明书。在说明书内的实施例提供了本发明的实施例的展示，并且不应构成对本发明范围的限制。技术人员很容易认识到，本发明涵盖了很多其他实施例。在本披露中引用的所有公开物、专利和GenBank序列通过引用以其全部内容进行结合。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时，本说明书将替代任何此类材料。在此的任何参考文献的引用都不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。
在上面单个章节中提及的本发明的各种特征和实施例，作必要的修正的情况下适当时适用于其他章节。因此，适当时，在一个章节中限定的特征可以和在其他章节中限定的特征组合。
本领域技术人员将认知到、或不使用过度常规实验就能够确定本文所述发明的特定实施例的许多等效实施例。此类等效实施例意在由以下实施例涵盖。

Claims (20)

1.一种提高迪诺舒单抗分子上存在的高甘露糖水平的方法，其中所述迪诺舒单抗分子由哺乳动物宿主细胞重组表达，该方法包括：
(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞直至细胞密度为至少1x106个活细胞/mL，其中所述第一培养基包含从1g/L至20g/L的葡萄糖；以及随后
(b)在生产期期间在第二培养基中孵育来自步骤(a)的宿主细胞以表达所述迪诺舒单抗分子，其中所述第二培养基包含从0g/L至10g/L的葡萄糖和从5g/L至20g/L的半乳糖；
其中从2％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
2.如权利要求1所述的方法，其中在该生长期期间，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从4g/L至20g/L。
3.如权利要求2所述的方法，其中当在该生产期期间在该第二培养基中孵育这些宿主细胞时，通过推注供给或灌注将葡萄糖浓度维持在从0g/L至8g/L，并将半乳糖浓度维持在从7g/L至15g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其中在该生产期期间，这些宿主细胞最初在该第一培养基中维持约3至约15天，以及随后通过灌注或推注供给转移至该第二培养基中。
5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞密度为从5x 106个活细胞/mL至12x 106个活细胞/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其中从约4％至约11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是CS-9细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一培养基包含甲氨喋呤(MTX)。
10.如权利要求1所述的方法，该方法包括：
(a)在生长期期间在第一培养基中孵育所述哺乳动物宿主细胞，并用一个或多个推注供给补充该培养基，其中在该生长期期间将葡萄糖浓度维持在从约4g/L至约18g/L；
(b)将来自步骤(a)的宿主细胞从生长期转移至生产期，并将葡萄糖浓度维持在从约4g/L至约18g/L持续约3天至约15天；以及随后
(c)将(b)的宿主细胞转移至第二培养基，其中所述第二培养基包含从约1g/L至约5g/L的葡萄糖和从约10g/L至约12g/L的半乳糖。
11.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少15％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基。
12.如权利要求11所述的组合物，其中从2％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
13.如权利要求11所述的组合物，其中从4％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
14.如权利要求11所述的组合物，其中所述迪诺舒单抗以约25pM或更低的结合亲和力(KD)值与人RANKL结合。
15.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，其中至少5％的迪诺舒单抗分子包含一个或多个糖化的赖氨酸残基，该一个或多个糖化的赖氨酸残基包含半乳糖部分。
16.如权利要求15所述的组合物，其中从2％至14％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
17.如权利要求15所述的组合物，其中从4％至11％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述迪诺舒单抗以约25pM或更低的结合亲和力(KD)值与人RANKL结合。
19.一种包含重组产生的迪诺舒单抗分子的组合物，并且其中从0.2％至1.8％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
20.如权利要求19所述的组合物，其中从约0.5％至约1％的迪诺舒单抗分子在N-298位点包含高甘露糖聚糖。
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