TW202003574A - 具有經調節的聚糖特徵之抗體 - Google Patents

Abstract

本發明涉及重組表現的迪諾舒單抗分子和調節迪諾舒單抗分子的聚糖特徵的方法。

Description

具有經調節的聚糖特徵之抗體

本發明涉及重組表現的抗體和調節此類抗體的聚糖特徵（glycan profile）的方法。背景技術

糖蛋白的聚糖部分的結構和組成可影響治療性蛋白質的安全性和功效，包括其免疫原性、溶解度和半衰期。哺乳動物細胞培養物中產生的蛋白質可含有不同量的高甘露糖糖型，例如甘露糖5（Man-5）、甘露糖6（Man-6）、甘露糖7（Man-7）、甘露糖8（Man-8）和甘露糖9（Man-9）。具有高甘露糖含量的抗體已經引起人們的興趣，因為具有Man-5聚糖和Man-7、8或9聚糖的抗體顯示出治療活性和清除率方面的差異。例如，用幾夫鹼（kifunensine）處理產生的高甘露糖抗體顯示出更高的ADCC活性和對FCγRIIIA的更大親和力（Zhou等人，(2008)，Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 99(3):652-665）。類似地，Yu等人，據報導，Man-5和Man-8/9糖型似乎具有增加的ADCC活性，降低的CDC活性，增加的對FcγRIIIA的結合親和力，以及降低的對FcγRIIA和IIB的結合親和力（Yu等人，MAbs. [單株抗體] 2012年7月1日；4(4):475-487. doi:10.4161/mabs.20737）。因此，具有增加的高甘露糖聚糖（例如Man-5）的抗體組成物可以提供某些治療益處。

另一方面，還報導了Man-5和Man-6糖型也比複合岩藻糖基化糖型顯示出更快的清除率（Yu等人，同上）。因此，高Man-5聚糖含量可能導致抗體的半衰期降低和快速清除。因此，需要控制和調節抗體的高甘露糖含量，以實現PK特性和治療活性（例如ADCC）之間的所需要的平衡。

如本文所揭露和示例的，已經開發了用於調節迪諾舒單抗（denosumab）上的高甘露糖聚糖含量之方法。具體地，藉由在生產期期間減少培養基中葡萄糖的量和增加培養基中半乳糖的量，增加高甘露糖聚糖的含量。本文還揭露和示例了包含各種聚糖特徵的重組產生的迪諾舒單抗。

基於本文提供的揭露內容，熟悉該項技術者將認知到、或僅使用常規實驗就能夠確定本文所述發明的特定實施方式的許多等效實施方式。此類等效實施方式意在由以下實施方式（E）涵蓋。 E1. 一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括： (a) 在生長期期間在第一培養基中培養培養所述哺乳動物宿主細胞直至細胞密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL，其中所述第一培養基包含從約1 g/L至約20 g/L的葡萄糖；以及隨後 (b) 在生產期期間在第二培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述第二培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖； 其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E2. 一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括： (a) 在生長期期間在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞直至細胞密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL，其中所述第一培養基包含從約1 g/L至約20 g/L的葡萄糖；以及隨後 (b) 在生產期期間在第二培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述第二培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖； 其中與對照相比，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比增加。 E3. 如E2所述之方法，其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E4. 如E1至E3中任一項所述之方法，其中在生長期期間，藉由批式供給（bolus feed）或灌注將葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約20 g/L。 E5. 如E1至E3中任一項所述之方法，其中在生長期期間，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約4 g/L至約20 g/L。 E6. 如E1至E5中任一項所述之方法，其中在生產期期間，該等宿主細胞最初在該第一培養基中維持約3至約15天，以及隨後藉由灌注或批式供給轉移至該第二培養基。 E7. 如E1至E6中任一項所述之方法，其中當在生產期期間在該第二培養基中培養宿主細胞時，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從0 g/L至10 g/L，或從約0 g/L至約8 g/L。 E8. 如E1至E7中任一項所述之方法，其中當在生產期期間在該第二培養基中培養宿主細胞時，藉由批式供給或灌注將半乳糖濃度維持在從約5 g/L至約20 g/L，或從約7 g/L至約15 g/L。 E9. 如E1至E8中任一項所述之方法，其中當在生產期期間在該第二培養基中培養宿主細胞時，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約10 g/L，並將半乳糖濃度維持在從約5 g/L至約20 g/L。 E10. 如E1至E9中任一項所述之方法，其中當在生產期期間在該第二培養基中培養宿主細胞時，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約8 g/L，並將半乳糖濃度維持在從約7 g/L至約15 g/L。 E11. 如E1至E10中任一項所述的方法，其包括： (a) 在生長期期間在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞，並用一個或多個批式供給補充該培養基，其中在該生長期期間將葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約20 g/L； (b) 將來自步驟 (a) 的宿主細胞從生長期轉移至生產期，並將葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約20 g/L持續約3天至約15天；以及隨後 (c) 將 (b) 的宿主細胞轉移至第二培養基，其中所述第二培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖。 E12. 如E11所述之方法，其中在步驟 (a) 和 (b) 中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約20 g/L。 E13. 如E11或E12所述之方法，其中在步驟 (a) 和 (b) 中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約4 g/L至約20 g/L。 E14. 如E11至E13中任一項所述之方法，其中在步驟 (c) 中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約10 g/L，或從約0 g/L至約8 g/L。 E15. 如E11至E14中任一項所述之方法，其中在步驟 (c) 中，藉由批式供給或灌注將半乳糖濃度維持在從約5 g/L至約20 g/L，或從約7 g/L至約15 g/L。 E16. 如E11至E15中任一項所述之方法，其中在步驟 (c) 中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約8 g/L，並將半乳糖濃度維持在從約7 g/L至約15 g/L。 E17. 如E1至E16中任一項所述之方法，其中所述第一和第二培養基係化學成分確定的培養基。 E18. 如E1至E17中任一項所述之方法，其中所述第一培養基包含從約4 g/L至約18 g/L的葡萄糖。 E19. 如E1至E18中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約1 g/L至約8 g/L、從約1 g/L至約7 g/L、從約1 g/L至約6 g/L、從約1 g/L至約5/L的葡萄糖。 E20. 如E1至E19中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約1 g/L至約5/L的葡萄糖。 E21. 如E1至E20中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約8 g/L至約14 g/L、從約9 g/L至約13g/L、或從約10 g/L至約12 g/L的半乳糖。 E22. 如E1至E21中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約10 g/mL至約12 g/mL的半乳糖。 E23. 如E1至E21中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約1 g/L至約5/L的葡萄糖，和從約10 g/mL至約12 g/mL的半乳糖。 E24. 如E1至E23中任一項所述之方法，其中在步驟 (a) 中，所述細胞密度為至少約2 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約5 x 10⁶ 個活細胞/mL、或至少約10 x 10⁶ 個活細胞/mL。 E25. 如E1至E24中任一項所述之方法，其中從約4%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E25b. 如E1至E24中任一項所述之方法，其中從約4%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E25c. 如E1至E24中任一項所述之方法，其中從約5%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E25d. 如E1至E24中任一項所述之方法，其中從約5%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。E26. 如E1至E25中任一項所述之方法，其中從2%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E27. 如E1至E26中任一項所述之方法，其中從4%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E27b. 如E1至E25中任一項所述之方法，其中從4%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E27c. 如E1至E25中任一項所述之方法，其中從5%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E27d. 如E1至E25中任一項所述之方法，其中從5%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E28. 如E1至E27中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是從6.5%至7.5%。 E29. 如E1至E27中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是從6.5%至8.5%。 E30. 如E1至E27中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是從7.5%至8.5%。 E31. 如E1至E30中任一項所述之方法，其中所述宿主細胞藉由灌注從該第一培養基轉移至該第二培養基。 E32. 如E1至E30中任一項所述之方法，其中所述宿主細胞藉由批式供給從該第一培養基轉移至該第二培養基。 E33. 一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括： (a) 建立初始細胞培養物，其中所述哺乳動物宿主細胞的密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL；以及隨後 (b) 在生產期期間在培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖； 其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E34. 一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括： (a) 建立初始細胞培養物，其中所述哺乳動物宿主細胞的密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL；以及隨後 (b) 在生產期期間在培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖； 其中與對照相比，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比增加。 E35. 如E34所述之方法，其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E36. 如E33至E35中任一項所述之方法，其中在步驟 (b) 中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約10 g/L。 E37. 如E33至E36中任一項所述之方法，其中在步驟 (b) 中，藉由批式供給或灌注將半乳糖濃度維持在從約5 g/L至約20 g/L。 E38. 如E33至E37中任一項所述之方法，其中所述培養基係化學成分確定的培養基。 E39. 如E33至E38中任一項所述之方法，其中所述培養基包含從1 g/L至約8 g/L、從約1 g/L至約7 g/L、從約1 g/L至約6 g/L、從約1 g/L至約5/L的葡萄糖。 E40. 如E33至E39中任一項所述之方法，其中所述培養基包含從約1 g/L至約5/L的葡萄糖。 E41. 如E33至E40中任一項所述之方法，其中所述培養基包含從約從約8 g/L至約14 g/L、從約9 g/L至約13 g/L、或從約10 g/L至約12 g/L的半乳糖。 E42. 如E33至E41中任一項所述之方法，其中所述第二培養基包含從約10 g/mL至約12 g/mL的半乳糖。 E43. 如E33至E42中任一項所述之方法，其中在步驟 (a) 中，所述細胞密度為至少約2 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約5 x 10⁶ 個活細胞/mL、或至少約10 x 10⁶ 個活細胞/mL。 E44. 如E33至E43中任一項所述之方法，其中從約4%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E44b. 如E33至E43中任一項所述之方法，其中從約4%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E44c. 如E33至E43中任一項所述之方法，其中從約5%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E44d. 如E33至E43中任一項所述之方法，其中從約5%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E45. 如E33至E44中任一項所述之方法，其中從2%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E46. 如E33至E45中任一項所述之方法，其中從4%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E46b. 如E33至E45中任一項所述之方法，其中從4%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E46c. 如E33至E45中任一項所述之方法，其中從5%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E46d. 如E33至E45中任一項所述之方法，其中從5%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E47. 如E33至E46中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在6.5%至7.5%之間。 E48. 如E33至E46中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在6.5%至8.5%之間。 E49. 如E33至E46中任一項所述的方法，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在7.5%至8.5%之間。 E50. 如E1至E49中任一項所述之方法，其中所述培養物在收穫時產生至少約10 g/L的迪諾舒單抗。 E51. 如E1或E33所述之方法，其中與對照相比，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比增加。 E52. 如E2-E32和E34-E51中任一項所述之方法，其中當參考批次在包含從約5 g/L至約15 g/L的葡萄糖並且不包含半乳糖的培養基中產生時，所述對照係來自所述參考批次的在N-298位點的高甘露糖的百分比。 E53. 如E2-E32和E34-E52中任一項所述之方法，其中所述對照係約1.5%或更少的在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子。 E54. 如E1至E53中任一項所述之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞係CHO細胞。 E55. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係CS-9、CHO-K1、CHO-DG44、或CHO-S細胞。 E56. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係CS-9細胞。 E57. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係AM1/D細胞。 E57b. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係CHO DUX-B11細胞。 E57c. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係CHO GS敲除細胞。 E57d. 如E54所述之方法，其中所述CHO細胞係CHO-K1細胞。 E58. 如E54至E57中任一項所述之方法，其中所述CHO細胞已藉由胺甲喋呤（MTX）選擇進行了擴增。 E59. 如E1-E32至E50-E57中任一項所述之方法，其中所述第一培養基包含胺甲喋呤（MTX）。 E60. 如E33至E57中任一項所述之方法，其中在步驟 (a) 中的所述哺乳動物宿主細胞已經藉由胺甲喋呤（MTX）選擇進行了擴增。 E61. 如E1至E60中任一項所述之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞包含約500個拷貝或更多的核酸序列編碼迪諾舒單抗。 E62. 如E1至E61中任一項所述之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞包含約500個拷貝或更多的包含SEQ ID NO. 3的核酸序列。 E63. 如E1至E62中任一項所述之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞包含約500個拷貝或更多的包含SEQ ID NO:4的核酸序列。 E64. 如E1至E63中任一項所述之方法，其中從約7%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E65. 如E1至E64中任一項所述之方法，其中所述高甘露糖係Man-5。 E66. 如E1至E65中任一項所述之方法，其中從約7%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含Man-5。 E67. 如E1至E66中任一項所述之方法，其中從約48%至約70%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G0。 E68. 如E1至E67中任一項所述之方法，其中從約9%至約26%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G1。 E69. 如E1至E68中任一項所述之方法，其中從約4%至約8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G0。 E70. 如E1至E69中任一項所述之方法，其中從約0.3%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G2。 E71. 如E1至E70中任一項所述之方法，其中從約0.5%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G1。 E72. 如E1至E71中任一項所述之方法，其中從約0.5%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1-G0。 E73. 如E1至E72中任一項所述之方法，其中從約1%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1F-G0。 E74. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中至少15%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。 E75. 如E74所述之組成物，其中所述糖化的賴胺酸殘基包含葡萄糖部分或半乳糖部分。 E76. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中至少5%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基，該一個或多個糖化的賴胺酸殘基包含半乳糖部分。 E77. 如E76所述之組成物，其中從約7%至約20%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基，該一個或多個糖化的賴胺酸殘基包含半乳糖部分。 E78. 如E74至E77中任一項所述之組成物，其中高達70%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。 E79. 如E74至E78中任一項所述之組成物，其中從約20%至約30%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。 E80. 如E74至E79中任一項所述之組成物，其中半乳糖糖化賴胺酸與葡萄糖糖化賴胺酸的比例為從約1 : 10至約10 : 1。 E81. 如E74至E80中任一項所述之組成物，其中半乳糖糖化賴胺酸與葡萄糖糖化賴胺酸的比例為約1 : 1。 E82. 如E74至E81中任一項所述之組成物，其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E83. 如E74至E82中任一項所述之組成物，其中從2%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E83b. 如E74至E82中任一項所述之組成物，其中從約4%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E83c. 如E74至E82中任一項所述之組成物，其中從4%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E83d. 如E74至E82中任一項所述之組成物，其中從約5%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E83e. 如E74至E82中任一項所述之組成物，其中從5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。E84. 如E74至E83中任一項所述之組成物，其中從約4%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E85. 如E74至E84中任一項所述之組成物，其中從4%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E85b. 如E74至E84中任一項所述之組成物，其中從約5%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E85c. 如E74至E84中任一項所述之組成物，其中從5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E86. 如E74至E85中任一項所述之組成物，其中從2%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E87. 如E74至E86中任一項所述之組成物，其中從4%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E87b. 如E74至E86中任一項所述之組成物，其中從4%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E87c. 如E74至E86中任一項所述之組成物，其中從5%至6.5%、或從8.5%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E87d. 如E74至E86中任一項所述之組成物，其中從5%至6.5%、或從8.5%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E88. 如E74至E87中任一項所述之組成物，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在6.5%至7.5%之間。 E89. 如E74至E88中任一項所述之組成物，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在6.5%至8.5%之間。 E90. 如E74至E89中任一項所述之組成物，條件係在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是在7.5%至8.5%之間。 E91. 如E74至E90中任一項所述之組成物，其中從約7%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。 E92. 如E74至E91中任一項所述之組成物，其中所述高甘露糖係Man-5。 E93. 如E74至E92中任一項所述之組成物，其中從約7%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含Man-5。 E94. 如E74至E93中任一項所述之組成物，其中從約48%至約70%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G0。 E95. 如E74至E94中任一項所述之組成物，其中從約9%至約26%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G1。 E96. 如E74至E95中任一項所述之組成物，其中從約0.5%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1-G0。 E97. 如E74至E96中任一項所述之組成物，其中從約1%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1F-G0。 E98. 如E74至E97中任一項所述之組成物，其中從約4%至約8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G0。 E99. 如E74至E98中任一項所述之組成物，其中從約0.5%至約4%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G1。 E100. 如E74至E99中任一項所述之組成物，其中從約0.3%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G2。 E101. 如E74至E100中任一項所述之組成物，其中所述糖化賴胺酸選自下組，該組由以下組成：(i) 重鏈K76、K98、K218、K249、K318、K327、和K335（根據SEQ ID NO:1進行編號）；以及 (ii) 輕鏈K104、K108、K150、K184、和K191（根據SEQ ID NO:2進行編號）。 E102. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，並且其中從約0.2%至約1.8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E103. 如E102所述之組成物，其中從0.2%至1.8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E104. 如E102至E103中任一項所述之組成物，其中從約0.5%至約1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E105. 如E102至E104中任一項所述之組成物，其中從0.5%至1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。 E106. 如E102至E105中任一項所述之組成物，其中所述高甘露糖聚糖係Man-5。 E107. 如E102至E106中任一項所述之組成物，其中從0.2%至1.8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含Man-5。 E108. 如E102至E107中任一項所述之組成物，其中從約0.5%至約1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含Man-5。 E109. 如E102至E108中任一項所述之組成物，其中從0.5%至1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含Man-5。 E110. 如E102至E109中任一項所述之組成物，其中從約30%至約60%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G0。 E111. 如E102至E110中任一項所述之組成物，其中從約20%至約50%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G1。 E112. 如E102至E111中任一項所述之組成物，其中所述從約0.1%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1-G0。 E113. 如E102至E112中任一項所述之組成物，其中從約0.1%至約4%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1F-G0。 E114. 如E102至E113中任一項所述之組成物，其中從約4%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G0。 E115. 如E102至E114中任一項所述之組成物，其中從約1%至約7%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G1。 E116. 如E102至E115中任一項所述之組成物，其中從約3%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G2。 E117. 如E74至E116中任一項所述之組成物，其中所述迪諾舒單抗與人RANKL結合的結合親和力（K_D ）值為約為25 pM或更低。 E118. 如E74至E117中任一項所述之組成物，其中所述迪諾舒單抗與人RANKL結合的結合親和力（K_D ）值為從約1 pM至約25 pM。

1. 概述

迪諾舒單抗係人IgG2單株抗體，對人RANKL（核因子κ-B配位基的受體活化劑）具有親和力和特異性。迪諾舒單抗具有約為147 kD的分子量，並且目前在基因工程化的哺乳動物（中國倉鼠卵巢）細胞中生產。在重組生產方法中，藉由轉譯後修飾將聚糖部分連接到迪諾舒單抗，例如藉由酶介導的方法（糖基化）或非酶介導的方法（糖化）。因為聚糖在抗體的治療功效和體內半衰期中具有重要作用，所以需要表徵治療性糖蛋白的糖型譜以滿足管理機構的要求。

如本文所揭露和示例的，已經開發了不同的培養方法來修飾迪諾舒單抗的聚糖特徵。迪諾舒單抗具有位於每條重鏈的第二恒定結構域（殘基N-298）上的兩個N-糖基化位點。此外，當糖部分經由賴胺酸殘基與抗體連接時，抗體也可以藉由糖化（有時也稱為「非酶促糖基化」）修飾。

在第一示例性培養方法（本文稱為「CP2」）中，使用衍生自AM-1/D的CHO細胞系。將細胞培養在改良的DMEM/F12培養基中，在第3天和第9天兩次批式供給，然後在第14天收穫培養物。得到的關鍵糖型包括以下：A2F-G0約55%-65%、A2F-G1約15%-25%、和Man-5約4%-9%。

在第二示例性培養方法（本文稱為「CP3」）中，藉由使用略微不同的方法實現了總體更高的產物產率。在生長期期間藉由胺甲喋呤（MTX）選擇擴增了基於CS-9 CHO細胞的細胞系。由於MTX選擇，與CP2方法中使用的宿主細胞相比，編碼迪諾舒單抗的核酸的拷貝數顯著增加。通常，藉由MTX選擇，估計宿主細胞包含約700-1000個拷貝的重組序列，從而增加重組蛋白質生產的總產率。值得注意的是，藉由CP3產生的重組迪諾舒單抗也顯示出低Man-5含量，低於1%。藉由CP3方法產生的迪諾舒單抗顯示出在患者體內較高的血清半衰期和較慢的清除率。

第三示例性培養方法在本文中稱為「CP4」。與CP3類似，在生長期期間藉由MTX選擇擴增了基於CS-9 CHO細胞的細胞系，從而提高了迪諾舒單抗生產的總產率。此外，在生產期期間，在第11天改變灌注培養基。培養基的變化包括降低葡萄糖濃度和添加半乳糖作為可替代的碳水化合物來源。與CP2-迪諾舒單抗相比，藉由CP4方法生產的迪諾舒單抗顯示出類似含量的A2F-G0（約55%至65%）、A2F-G1（約10%-19%）和Man-5（約4%-9%）；並且與CP3-迪諾舒單抗相比，藉由CP4方法生產的迪諾舒單抗顯示出更高的Man-5含量。藉由CP4方法生產的迪諾舒單抗中觀察到糖化量增加。此外，由於半乳糖在CP4中用作可替代的碳源，CP4-迪諾舒單抗還包含新種類，半乳糖糖化的賴胺酸。

令人驚訝的是，儘管與CP2-迪諾舒單抗相比，CP4-迪諾舒單抗顯示出更高量的糖化，但其與RANKL配位基的結合以及生物活性不受影響。由於賴胺酸殘基帶電並且經常參與蛋白質-蛋白質相互作用，令人驚訝的是顯著增加的糖化不會影響生物活性。另一個令人驚訝的發現係半乳糖糖化的賴胺酸不影響迪諾舒單抗的免疫原性。半乳糖天然存在於人血清中，濃度約為0.3 mg/dL。在該等低血清半乳糖含量下，健康個體不太可能具有帶有可測量的量的半乳糖糖化的循環蛋白，除了患有半乳糖血症的患者。因此，半乳糖糖化的臨床安全性以前係未知的。據發現，在迪諾舒單抗的情況下，高量的半乳糖糖化的迪諾舒單抗不影響免疫原性。2. 定義

「迪諾舒單抗」（商品名Prolia®和Xgeva®）係指包含含有SEQ ID NO:1的重鏈和含有SEQ ID NO:2的輕鏈的人單株抗體。迪諾舒單抗的重鏈和輕鏈的胺基酸序列示於表1中。編碼SEQ ID No:1和2的核酸序列示於圖6A-6B中。如實例中所示，迪諾舒單抗的聚糖特徵可以變化。 [表1] 迪諾舒單抗的序列

抗體係糖蛋白，並且預期糖基化異質性。單株抗體在每個HC的CH2 Fc結構域中含有單個共有的N-連接糖基化位點，而LC缺乏共有的N-連接糖基化位點。Fc聚糖主要由3個聚糖類組成：(1) 非唾液酸化雙觸角核心岩藻糖基化結構，其在末端半乳糖含量方面不同（A2GxF，其中x = 0、1或2）；(2) 非唾液酸化單觸角核心岩藻糖基化雜合結構，其在半乳糖含量方面不同（A1GxMyF，其中x = 0或1且y = 3、4或5）；以及 (3) 高甘露糖結構（Mx，其中x = 5、6、7、或8）。基於共有序列的存在以及從哺乳動物細胞培養物產生的IgG2單株抗體的歷史表徵，預期迪諾舒單抗在每條重鏈的N-298處含有單個N糖基化位點。

在文獻中，根據Kabat EU編號，N-糖基化位點通常稱為殘基N-297。實際殘基編號係SEQ ID NO:1的殘基298。不同之處在於編號系統；兩者都指相同的N殘基。

本文參考常用的低聚糖命名法描述了碳水化合物部分。可以找到使用這種命名法的碳水化合物化學的綜述例如，在Hubbard和Ivatt的Ann. Rev. Biochem.[生物化學年鑒] 50:555-583 (1981)中。該命名法包括，例如，代表甘露糖的Man；代表半乳糖的Gal；以及代表葡萄糖的Glc。通常已知的聚糖如表2所示。 [表2].示例性的聚糖結構

a 理論質量基於經驗式，並包括聚糖和2-AA。 b 方塊代表GlcNAc殘基，實心圓代表Man殘基，空心圓代表Gal殘基，以及三角形代表Fuc殘基。

「高甘露糖」聚糖係包含5-9個甘露糖單元的聚糖部分，例如高甘露糖5（Man-5）聚糖、高甘露糖6（Man-6）聚糖、高甘露糖7（Man-7）聚糖、高甘露糖8（Man-8）聚糖和高甘露糖9（Man-9）聚糖。

可以根據本領域已知的方法評估抗體的高甘露糖含量。測定通常涉及藉由酶促（PNGAse-F或Endo-H）或化學處理（即肼解）從mAb釋放聚糖。然後純化釋放的聚糖，隨後在不進行進一步衍生化的情況下或在用不同的發色團/螢光團標記後進行分析。例如，通常藉由層析、電泳或質譜法分析酶促或化學處理的樣品，以鑒定含高甘露糖糖型的mAb。本文提供了高甘露糖測定的實例。

迪諾舒單抗的聚糖含量通常表示為一定百分比（例如，2%-14%高甘露糖）。除非另有說明，否則理論上將聚糖的百分比計算為樣品中總迪諾舒單抗分子中包含此類聚糖的迪諾舒單抗分子數。例如，2%高甘露糖意指100個迪諾舒單抗分子中2個迪諾舒單抗分子包含高甘露糖。該理論計算值假設100%的在N-298位點的天冬醯胺係糖基化的。然而，在實踐中，非常小百分比的抗體分子可以是非糖基化的或去糖基化的（參見例如下面的實例3.1，在N-298位點約0.3%或更少的抗體分子可以是非糖基化的或去糖基化的）。此外，在單個分子水平(level)上計數聚糖種類係不切實際/不可能的。因此，本文所述的聚糖含量的百分比通常根據常用分析方法基於相對百分比來計算。例如，如實例3.2中所例示的，用酶從蛋白質中釋放所有N-聚糖；然後藉由高效陰離子交換層析（HPAEC）分離聚糖。HPAEC產生各種峰，每個峰代表聚糖種類。8號峰代表Man-5。因此，基於峰8的面積從所有峰的總面積計算Man-5的百分比（在這種情況下為8.4%）。另一個實例係實例7.1，其中親水相互作用液相層析（HILIC）用於評估N-聚糖百分比。因此，除非另有說明，否則使用任何常用的分析方法（如HPAEC、CE-SDS、HILIC）根據在N-298位點的總N-聚糖中特定聚糖種類的相對百分比計算聚糖的百分比。該百分比在字面上不應被視為指單個分子水平的聚糖含量。

重組蛋白質生產方法通常分為兩個階段。在第一階段，通常稱為「生長期」，發生細胞增殖。在第二階段，通常稱為「生產期」，重組蛋白的表現在宿主細胞內開啟，通常藉由添加誘導物（例如IPTG），或藉由改變培養條件（例如改變溫度）。

應該注意的是，如在本說明書和所附申請專利範圍中使用的，單數形式「一個（a）」、「一種（an）」和「該（the）」包括複數指代物，除非上下文另外明確地指示。術語「一個」（或「一種」）、以及術語「一個或多個/一種或多種（one or more）」和「至少一個/至少一種（at least one）」可以在本文中互換使用。3. 重組產生的迪諾舒單抗的高甘露糖含量 3.1 用於增加迪諾舒單抗的高甘露糖含量的方法

高甘露糖糖型越來越被認為係治療性單株抗體的重要品質屬性。如本文所述，存在於重組產生的迪諾舒單抗上的高甘露糖可藉由操縱細胞培養基中葡萄糖和半乳糖的濃度來控制。

本發明提供了藉由使用低濃度或有限濃度的葡萄糖與可替代的碳源（特別是半乳糖或蔗糖）組合來增加重組產生的迪諾舒單抗（特別是Man-5）的高甘露糖含量的方法。如本文所述，在細胞培養基中培養細胞（其中藉由降低細胞培養基中葡萄糖的濃度來限制葡萄糖，與可替代的碳源（例如，半乳糖）組合）導致迪諾舒單抗組成物具有增加濃度的高甘露糖含量，同時將細胞生長、活力和滴度維持在可接受的水平。

在一個方面，本發明提供一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括：(a) 在生長期期間在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞直至細胞密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL，其中所述第一培養基包含從約1 g/L至約20 g/L的葡萄糖；以及隨後 (b) 在生產期期間在第二培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述第二培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖；其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。

通常，當討論糖源（例如葡萄糖、蔗糖或半乳糖）以及其他營養素的濃度時，數量（例如，20 g/L）通常是指供給到生物反應器中的濃度。在培養基進入生物反應器內部後，濃度通常由於細胞代謝、消耗和稀釋而改變。生物反應器內部的實際濃度可能會隨著時間的推移而顯著變化，並且可能無法始終監測，因為它嚴重依賴於細胞密度和代謝率。因此，為了便利和一致，數字通常是指在將培養基供給生物反應器之前測量的濃度，而不考慮生物反應器內的消耗或稀釋。在另一方面，生物反應器內的濃度通常被稱為「耗過培養基」的濃度，或「生物反應器內」的濃度。

通常，在生長期期間，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約20 g/L，以確保宿主細胞的有效擴增。在某些實施方式中，藉由批式供給或灌注將葡萄糖濃度維持在從約2 g/L至約20 g/L、從約3 g/L至約20 g/L、從約4 g/L至約20 g/L、從約2 g/L至約19 g/L、從約3 g/L至約19 g/L、從約4 g/L至約19 g/L、從約2 g/L至約18 g/L、從約3 g/L至約18 g/L、或從約4 g/L至約18 g/L。

在某些實施方式中，在生長期期間，藉由批式供給或灌注將耗過培養基中的葡萄糖濃度維持在從約1 g/L至約10 g/L，以確保宿主細胞的有效擴增。在某些實施方式中，藉由批式供給或灌注將耗過培養基中的葡萄糖濃度維持在從約2 g/L至約10 g/L、從約3 g/L至約10 g/L、從約4 g/L至約10 g/L、從約2 g/L至約9 g/L、從約3 g/L至約9 g/L、從約4 g/L至約9 g/L、從約2 g/L至約8 g/L、從約3 g/L至約8 g/L、或從約4 g/L至約8 g/L。

在某些實施方式中，在生長期期間，將耗過培養基中的葡萄糖濃度維持在一個含量以支持細胞擴增至至少1x10⁶ 個活細胞/mL，其中藉由批式供給或灌注維該葡萄糖濃度，其中批式供給或灌注培養基中的葡萄糖濃度係從約4 g/L至約20 g/L、從約4 g/L至約19 g/L、從約4 g/L至約18 g/L、從約5 g/L至約20 g/L、從約5 g/L至約19 g/L、從約5 g/L至約18 g/L、從約6 g/L至約20 g/L、從約6 g/L至約19 g/L、從約6 g/L至約18 g/L、從約7 g/L至約20 g/L、從約7 g/L至約19 g/L、或從約7 g/L至約18 g/L。批式供給的時間/頻率或灌注的流速將取決於細胞培養物的消耗/代謝速率，並且在熟悉該項技術者的知識範圍內。

在某些實施方式中，在生長期期間，細胞密度達到從約1 x 10⁶ 個活細胞/mL至約80x10⁶ 個活細胞/mL，例如至少約1 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約2 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約3 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約4 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約5 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約6 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約7 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約8 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約9 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約10 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約20 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約30 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約40 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約50 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約60 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約70 x 10⁶ 個活細胞/mL、至少約80 x 10⁶ 個活細胞/mL、從約2 x 10⁶ 個活細胞/mL至約20 x 10⁶ 個活細胞/mL、從約2 x 10⁶ 個活細胞/mL至約15 x 10⁶ 個活細胞/mL、從約2 x 10⁶ 個活細胞/mL至約10 x 10⁶ 個活細胞/mL、或從約2 x 10⁶ 個活細胞/mL至約10 x 10⁶ 個活細胞/mL。

當宿主細胞從生長期轉變為生產期時，為了增加高甘露糖（例如，Man-5）含量，可以將第二培養基（其中葡萄糖的濃度降低（例如，從0-8 g/L））與可替代的碳源（例如半乳糖或蔗糖，較佳的是半乳糖）組合地供給細胞。

轉換為低葡萄糖培養基不需要在生產期開始時發生。通常，在生產期期間，期望將宿主細胞維持在含有足夠葡萄糖（例如，從約4 g/L至約20 g/L或更多）的培養基中持續3-15天（例如，3-11天）然後切換到低葡萄糖培養基。這可能有助於建立所希望的培養物參數（例如活細胞密度或細胞活力），並有助於維持該等參數。在進入生產期3-15天（例如3-11天）後，當需要增加重組產生的迪諾舒單抗的高甘露糖含量時，然後可以將細胞培養基（其中葡萄糖的濃度降低並提供可替代的碳源）供給細胞培養物，導致所希望的高甘露糖含量的增加。

確定葡萄糖濃度需要降低程度的因素包括使用哪種可替代的碳源，以及使用了多少可替代的碳源；細胞培養生產方法；細胞類型和質量以及葡萄糖消耗。生物反應器中的細胞質量越大，細胞培養物的葡萄糖消耗越大，因此可以供給的葡萄糖的量越大，同時仍然保持產生所希望的高甘露糖含量的低葡萄糖狀態。將葡萄糖供給到細胞培養物中的方式也可以影響維持低葡萄糖狀態所必需的葡萄糖的量，所述低葡萄糖狀態將產生所需的高甘露糖含量。例如，在分批供給的細胞培養中，可以將葡萄糖配製到細胞培養基中並藉由批式供給補充。在灌注細胞培養方法中，葡萄糖濃度將取決於灌注培養基的供給速率（g/L/天）。另外，可以測量生產期間培養基中葡萄糖的量，例如藉由用於灌注培養的消耗的培養基分析。另外，可以測量生產期間培養基中葡萄糖的量，例如藉由用於灌注培養的消耗的培養基分析。觀察到當耗過培養基中的葡萄糖量為或接近0 g/L時，Man-5含量增加。在這種情況下，恰好足夠的葡萄糖被供給至細胞以接近總消耗量，以確保蛋白質產量不會受到葡萄糖減少的顯著影響。

降低生物反應器內的葡萄糖濃度可以藉由例如藉由灌注用第二培養基替換第一培養基來實現。可替代地，可以藉由等待第一培養基中的葡萄糖被細胞消耗，然後調整批式供給方案和/或濃度以降低生物反應器內的葡萄糖濃度來實現。

在某些實施方式中，第二培養基中的葡萄糖的量降低至限制量，使得在灌注培養基供給中，例如在耗過培養基中測量的葡萄糖的量為或剛剛高於0 g/L。葡萄糖消耗速率可以藉由葡萄糖添加速率和/或細胞培養物的質量來確定。葡萄糖可以以約0 g/L至約10 g/L的濃度供給。

在某些實施方式中，將第二培養基中的葡萄糖濃度維持在從約0 g/L至約10 g/L、從約0 g/L至約9 g/L、從約0 g/L至約8 g/L、從約0 g/L至約7 g/L、從約0 g/L至約6 g/L、從約0 g/L至約5 g/L、從約1 g/L至約10 g/L、從約1 g/L至約9 g/L、從約1 g/L至約8 g/L、從約1 g/L至約7 g/L、從約1 g/L至約6 g/L、或從約0 g/L至約5 g/L。

與降低的葡萄糖濃度組合，第二培養基應含有或補充有可替代的碳源，例如半乳糖或蔗糖。在某些實施方式中，第二培養基包含濃度高達20 g/L的半乳糖。例如，可以將第二培養基中的半乳糖濃度維持在從約5 g/L至約20 g/L、從約5 g/L至約19 g/L、從約5 g/L至約18 g/L、從約5 g/L至約17 g/L、從約5 g/L至約16 g/L、從約5 g/L至約15 g/L、從約5 g/L至約14 g/L、從約5 g/L至約13 g/L、從約5 g/L至約12 g/L、從約7 g/L至約20 g/L、從約7 g/L至約19 g/L、從約7 g/L至約18 g/L、從約7 g/L至約17 g/L、從約7 g/L至約16 g/L、從約7 g/L至約15 g/L、從約7 g/L至約14 g/L、從約7 g/L至約13 g/L、從約7 g/L至約12 g/L、從約10 g/L至約20 g/L、從約10 g/L至約19 g/L、從約10 g/L至約18 g/L、從約10 g/L至約17 g/L、從約10 g/L至約16 g/L、從約10 g/L至約15 g/L、從約10 g/L至約14 g/L、從約10 g/L至約13 g/L、或從約10 g/L至約12 g/L。

在某些實施方式中，為了增加迪諾舒單抗的高甘露糖含量，在進入生產期3-15天後，葡萄糖濃度降低，並且半乳糖用作可替代的糖源。例如，可以藉由使用批式供給培養基或灌注培養基降低葡萄糖濃度，所述培養基包含 (i) 從約0 g/L至約10 g/L、從約0 g/L至約9 g/L、從約0 g/L至約8 g/L、從約0 g/L至約7 g/L、從約0 g/L至約6 g/L、從約0 g/L至約5 g/L、從約1 g/L至約10 g/L、從約1 g/L至約9 g/L、從約1 g/L至約8 g/L、從約1 g/L至約7 g/L、從約1 g/L至約6 g/L、或從約1 g/L至約5 g/L的葡萄糖，以及 (ii) 從約5 g/L至約20 g/L、從約5 g/L至約19 g/L、從約5 g/L至約18 g/L、從約5 g/L至約17 g/L、從約5 g/L至約16 g/L、從約5 g/L至約15 g/L、從約5 g/L至約14 g/L、從約5 g/L至約13 g/L、從約5 g/L至約12 g/L、從約7 g/L至約20 g/L、從約7 g/L至約19 g/L、從約7 g/L至約18 g/L、從約7 g/L至約17 g/L、從約7 g/L至約16 g/L、從約7 g/L至約15 g/L、從約7 g/L至約14 g/L、從約7 g/L至約13 g/L、從約7 g/L至約12 g/L、從約10 g/L至約20 g/L、從約10 g/L至約19 g/L、從約10 g/L至約18 g/L、從約10 g/L至約17 g/L、從約10 g/L至約16 g/L、從約10 g/L至約15 g/L、從約10 g/L至約14 g/L、從約10 g/L至約13 g/L、或從約10 g/L至約12 g/L的半乳糖。

在一個示例性的實施方式中，藉由使用批式供給培養基或灌注培養基降低葡萄糖濃度，所述培養基包含 (i) 從約1 g/L至約5 g/L的葡萄糖，以及 (ii) 從約10 g/L至約12 g/L的半乳糖。批式供給的時間/頻率或灌注的流速將取決於細胞培養物的消耗/代謝速率，並且在熟悉該項技術者的知識範圍內。

可能需要使低葡萄糖培養基的總糖含量與原始生長培養基的葡萄糖含量相匹配。例如，如果生長培養基包含15 g/L的葡萄糖，那麼，在生產期期間，如果低葡萄糖培養基僅包含3 g/L的葡萄糖，則較佳的是用12 g/L的半乳糖補充，使得總糖含量匹配15 mg/L。

在某些實施方式中，在生產期期間，在切換到低葡萄糖培養基後，藉由批式供給或灌注可以將耗過培養基中的葡萄糖濃度維持在從約0至約5 g/L、從約0 g/L至約4 g/L、或從約0 g/L至約3 g/L；並藉由批式供給或灌注可以將耗過培養基中的半乳糖濃度維持在從約2 g/L至約12.5 g/L、從約3 g/L至約12.5 g/L、從約4 g/L至約12.5 g/L、從約2 g/L至約10 g/L、從約3 g/L至約10 g/L、從約4 g/L至約10 g/L、從約2 g/L至約9 g/L、從約3 g/L至約9 g/L、從約4 g/L至約9 g/L、從約2 g/L至約8 g/L、從約3 g/L至約8 g/L，或從約4 g/L至約8 g/L。

在某些實施方式中，與降低的葡萄糖濃度組合，細胞培養基含有或補充有蔗糖，濃度高達約48 g/L，例如從約16 g/L至約24 g/L。

哺乳動物細胞培養物通常在生物反應器中生長，例如500L至20000L生物反應器。在某些實施方式中，使用1000L至2000L生物反應器。在無血清培養基中，用至少0.5 x 10⁶ 高達以及超過3.0 x 10⁶ 個活細胞/mL接種生物反應器。在某些實施方式中，接種為約1.0 x 10⁶ 個活細胞/mL。一旦接種到產物生物反應器中，哺乳動物細胞經歷指數生長期。可以使用分批供給方法維持生長期，所述分批供給方法具有含有從約1 g/L至約20 g/L的葡萄糖的無血清供給培養基的批式供給。該等補充的批式供給通常在細胞接種到生物反應器中之後不久開始，此時預期或確定細胞培養物需要供給。例如，補充的供給可以在培養的約第3天或第4天或之前或之後的一天或兩天開始。培養物可在生長期期間接受兩次、三次或更多次批式供給。基礎細胞培養基和批式供給培養基都不含有半乳糖或蔗糖。

當細胞進入靜止期或生產期，或細胞培養物達到所需的活細胞密度和/或細胞滴度時，可停止分批批式供給並開始灌注。灌注培養係其中細胞培養物接收新鮮灌注供給培養基同時除去耗過培養基的培養。灌注可以是連續的、逐步的、間歇的、或任何該等中的任何一種或全部的組合。灌注率可以每天低於一工作容積至多個工作容積。較佳的是，細胞保留在培養物中，並且被除去的耗過培養基基本上不含細胞或具有比培養物顯著更少的細胞。灌注可以藉由許多方法完成，包括離心、沈降或過濾，參見例如Voisard等人，(2003)，Biotechnology and Bioengineering [生物技術和生物工程] 82:751-65。較佳的過濾方法係交替切向流過濾。藉由中空纖維過濾器模組泵送培養基來維持交替切向流。參見例如，美國專利號6,544,424。中空纖維模組可以是微過濾器或超濾器。

當分批供給培養物達到預定的觸發點時，例如所需的細胞活力、細胞密度、填充細胞體積百分比、滴度、填充細胞體積調節的滴度、時間階段等，可以在分批供給和灌注之間進行切換。例如，這種切換可以在培養的第7天或大約第7天進行，但可以在之前或之後的一天或兩天進行。灌注供給配製物含有濃度高達20 g/L或更高的葡萄糖，但不含有半乳糖或蔗糖。在一個實施方式中，灌注培養基含有從約4 g/L至約18 g/L的葡萄糖。

當灌注培養物達到預定的觸發點時，例如所需的細胞活力、細胞密度、填充細胞體積百分比、滴度、填充細胞體積調節的滴度、時間階段等，細胞培養基中的葡萄糖濃度降低。例如，這種轉換可以在培養的第11天開始，但可以在之前或之後的一天或兩天發生。此時，用含有較低濃度葡萄糖的細胞培養基灌注細胞培養物。

藉由監測細胞培養物中葡萄糖的濃度（例如藉由測量耗過培養基中的葡萄糖濃度，並調節灌注培養基配製物中的葡萄糖濃度以維持所需含量）可以維持細胞培養物中的低葡萄糖狀態。

細胞培養物可以連續維持在補充有半乳糖或蔗糖的低葡萄糖狀態。細胞培養物可以維持在補充有半乳糖或蔗糖的低葡萄糖狀態直至收穫。細胞培養物可以恢復到正常葡萄糖含量而無需半乳糖或蔗糖補充劑，並且整個方法再次開始。

細胞培養物也可以在灌注培養系統中維持生長期和生產期。一旦接種到產物生物反應器中，哺乳動物細胞經歷指數生長期，在此期間用無血清和/或化學成分確定的細胞培養基灌注細胞培養物。

一個示例性的實施方式係CP4方法，如下面詳細描述的。

在另一個方面，本發明提供一種提高迪諾舒單抗分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括：(a) 在生長期期間在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞直至細胞密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL，其中所述第一培養基包含從約1 g/L至約20 g/L的葡萄糖；以及隨後 (b) 在生產期期間在第二培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述第二培養基包含從約0 g/L至約10 g/L的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L的半乳糖。如揭露的方法的結果，與對照相比，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比增加。

對照可以是預定範圍或閾值，本領域普遍接受的範圍，或來自迪諾舒單抗產生的歷史範圍。可替代的，對照可以是參考批次，其中宿主細胞在培養基中培養，其中葡萄糖濃度不降低或補充有可替代得碳源。例如，宿主細胞可以在整個生產期期間在包含從約1 g/L至約20 g/L（例如，從約4 g/L至約18 g/L）的葡萄糖的第一培養基中培養，而無需轉移至包含從約0 g/L至約10 g/L（例如，從約1 g/L至約5 g/L）的葡萄糖和從約5 g/L至約20 g/L（例如，從約10 g/L至約12 g/L）的半乳糖的第二培養基。

在某些實施方式中，對照係預定閾值。例如，對照可以是在約1.8%或更低、約1.7%或更低、約1.6%或更低、約1.5%或更低、約1.4%或更低、約1.3%或更低、約1.2%或更低、約1.1%或更低、約1.0%或更低、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%，或約0.1%或更低的高甘露糖含量。

在另一個方面，本發明提供了重組產生的迪諾舒單抗，其中從約2%至約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。例如，從約2%至約14%、從約3%至約14%、從約4%至約14%、從約5%至約14%、從約2%至約13%、從約2%至約12%、從約2%至約11%、從約3%至約13%、從約3%至約12%、從約3%至約11%、從約4%至約13%、從約4%至約12%、從約4%至約11%、從約2%至約6.5%、從約3%至約6.5%、從約4%至約6.5%、從約8.5%至約14%、從約8.5%至約13%、從約8.5%至約12%、從約8.5%至約11%、約2%、約2.5%、約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約10.5%、約11%、約11.5%、約12%、約12.5%、約13%、約13.5%、或約14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。

在某些實施方式中，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比為從約5%至約14%。在某些實施方式中，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比為從約5%至約12%。在某些實施方式中，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比為從約5%至約11%。

在某些實施方式中，在N-298位點包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比不是從6.5%至7.5%、不是從6.5%至8.5%，或不是從7.5%至8.5%。

如上所述，高甘露糖含量，在此表示為百分比，不是字面上指的是在單個分子水平上計數高甘露糖含量。相反，該百分比使用任何常用的分析方法反映基於抗體組成物的總N-聚糖含量的高甘露糖種類的相對百分比。例如（參見例如實例3.2、實例7.1），可以基於層析峰的面積計算百分比。

本文提供的迪諾舒單抗的高甘露糖含量範圍主要基於PK/PD評估（與市售Prolia®和Xgeva®相比基本相似的PK）。最廣泛的範圍（例如，2%-14%）不應簡單地作為藉由FDA進行生物相似性評估的決定性標準。為了評估生物相似性，FDA建議採用逐步方法獲得證明提出的生物仿製產品與創新（參考）生物產品之間生物相似性的證據整體性。逐步方法開始於對所提出的生物仿製產品的製造方法的各個階段的功能和結構表徵的分析研究。分析型相似性評估涉及鑒定與臨床結果相關的關鍵品質屬性（CQA）。因此，為了證明生物相似性的目的，可能需要不同或更窄範圍的高甘露糖含量。生物相似性也可能需要生物仿製產品匹配其他屬性（例如，其他類型的聚糖）。 3.2 具有降低的高甘露糖含量的迪諾舒單抗

本文還提供了具有降低的高甘露糖含量的迪諾舒單抗。在一個示例性的實施方式中（參見下文詳細描述的CP3方法），少於1%的重組產生的迪諾舒單抗在N-298位點具有Man-5。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，並且其中從約0.2%至約1.8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。在某些實施方式中，約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、從約0.2%至約1.8%、從約0.2%至約1.7%、從約0.2%至約1.6%、從約0.2%至約1.5%、從約0.2%至約1.4%、從約0.2%至約1.3%、從約0.2%至約1.2%、從約0.2%至約1.1%、從約0.2%至約1.0%、從約0.3%至約1.8%、從約0.4%至約1.8%、從約0.5%至約1.8%、從約0.3%至約1.5%、從約0.4%至約1.5%、從約0.5%至約1.5%、從約0.3%至約1.2%、從約0.4%至約1.2%、從約0.5%至約1.2%、從約0.3%至約1.0%、從約0.4%至約1.0%、或從約0.5%至約1.0%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。

治療性抗體的功效受血清清除率即抗體的血清半衰期的影響。IgG抗體的血清半衰期受許多受體調節，包括甘露糖受體，其結合含有高甘露糖的病原體以及內源蛋白質。通常，含有高甘露糖聚糖的IgG在人體中比其他聚糖形式更快地清除（Goetze等人，Glycobiology[糖生物學]第21卷，第7期，第949-959頁，2011）。因此，帶有高甘露糖的糖型的減少改善了抗體組成物的半衰期（這係所需的品質屬性）。

特別是，Goetze指出單株抗體（Mab1）和含M5的Mab1群體之間清除半衰期的差異隨著劑量的減少而增加（表VII），表明含有M5的IgG在較低的靜脈內劑量下相對更快地被清除。作者提出，甘露糖受體有助於更快地清除M5 IgG群體，較高劑量時的較慢相對清除可能反映該受體的飽和度。雖然血清IgG的半衰期通常由FcRn介導，而治療性IgG的半衰期可能另外藉由基於靶標的清除來調節，但甘露糖受體顯然有助於更快速清除治療性IgG的非天然（高甘露糖）聚糖變體。這與甘露糖受體在清除外源病原體以及不需要的內源性分子中所起的作用一致，並且得到早期研究的支持，證明小鼠中含有M5的IgG1的清除速度更快。

在臨床研究中，給予健康志願者CP2-迪諾舒單抗或CP3-迪諾舒單抗。PK/PD分析顯示，與CP2-迪諾舒單抗相比，CP3-迪諾舒單抗具有平均10%延長的半衰期。因此，CP3-迪諾舒單抗由於其有利的PK/PD特徵而具有延長治療效果的潛在益處。這種有益效果可能導致較低頻率的給藥要求，並增加患者的依從性。 3.3 用於評估高甘露糖含量的分析方法

可以使用各種方法分析重組產生的迪諾舒單抗上的高甘露糖結構。此類方法可用於測量以下一項或多項：聚糖或糖蛋白製劑中高甘露糖的存在和/或量（例如，相對於總聚糖質量）；高甘露糖結構的相對比例（例如，高甘露糖種類與彼此的相對比例（例如，Man-5、Man-6、Man-7、Man-8和/或Man-9及其異構物的相對豐度或比率）、高甘露糖與雜合結構的相對比例、高甘露糖與複合結構的相對比例、高甘露糖與岩藻糖基化結構的相對比例）；修飾的高甘露糖結構的存在或豐度（例如，岩藻糖基化高甘露糖結構的存在或豐度）。

高甘露糖含量可以藉由本領域熟知的一種或多種方法測量，例如，如在Wuhrer等人（Journal of Chromatography B [層析雜誌B輯] 第825卷:124-133，2005）和Dell等人（Science [科學]第291卷:2351-2356）所述的和本文所述的那些，包括例如糖蛋白的N-聚糖作圖的分析方法。簡言之，從重組糖蛋白（例如重組單株抗體）酶促除去N-聚糖，並在還原末端用螢光標籤（2-胺基苯甲醯胺）標記。藉由高pH陰離子交換層析（HPAEC）分離螢光N-聚糖，並使用螢光檢測進行檢測。中性N-聚糖的分離通常基於N-聚糖結構的複雜性增加。帶電的N-聚糖的分離基於存在的可以從中獲得電荷數唾液酸、硫酸鹽或其他修飾的數量和類型。將該等測試樣品的聚糖特徵與適當的標準進行目測比較。

高甘露糖含量還可以使用WO 2007/087384中揭露的方法測量，該方法係用於檢測和/或定量糖蛋白的高甘露糖含量的高通量方法。簡言之，用內切糖苷酶消化糖蛋白，然後用還原劑（如果需要）還原消化的糖蛋白，並藉由變性電泳分離消化的糖蛋白。高甘露糖/雜合型聚糖的比例藉由從去糖基化重鏈的級分（內切糖苷酶消化後的峰）減去非糖基化重鏈的級分（沒有內切糖苷酶處理的峰級分）來確定。藉由使相同的樣品或組成物經受相同的消化條件（除了其中不存在內切糖苷酶外），產生非糖基化的重鏈級分或沒有內切糖苷酶處理的峰級分。該步驟可以與內切糖苷酶消化步驟同時進行或分開進行。

可以使用任何內切糖苷酶，其選擇性切割核心聚糖上的GlcNAc1和GlcNAc2之間的高甘露糖和雜合聚糖（或在蛋白質上產生短聚糖），同時保留複合N-連接聚糖完整。進行內切糖苷酶消化的具體條件，包括酶的濃度、培養溫度和消化時間，取決於所用的內切糖苷酶的類型。與本發明相關的內切糖苷酶的實例包括但不限於內切糖苷酶H和內切糖苷酶F1。在本發明的一個實施方式中，將包含糖蛋白的樣品用內切糖苷酶H在37°C處理約2小時，用β-巰基乙醇還原，並進行CE-SDS分析。

用於從糖基化糖蛋白（例如糖基化抗體）中分離去糖基化糖蛋白（例如去糖基化抗體）的實例方法包括但不限於以下兩種方法：

1) 在還原條件下的CE-SDS。用SDS和還原劑使糖基化糖蛋白（例如抗體）變性，並藉由毛細管電泳-SDS（CE-SDS）將其含有聚糖的重鏈（HC）與切割的HC（去糖基化的HC）分離。電泳圖由UV信號產生。峰下面積與相對量成正比。因此，高甘露糖/雜合類型的量由在較早的去糖基化HC位置洗脫的級分確定。由於GlcNAc-HC與去糖基化的HC共遷移，因此從消化的樣品的前峰中減去來自未消化的樣品的%去糖基化的HC，以產生%高甘露糖值。分離需要15-30分鐘，具體取決於構型。

2) 基於微流體的CE-SDS。糖蛋白如1）中那樣變性，但使用「晶片上實驗室」儀器（例如Caliper公司的LC90）分離。儘管使用螢光染料檢測蛋白質，但在測定和分離中使用相同的原理。每次測定的分離時間減少至約30秒，並且可以從微量滴定板取樣。

實例7.1 使用親水相互作用液相層析（HILIC）。簡言之，可以基於以下步驟分析聚糖種類：(i) 釋放N-聚糖（例如，藉由例如PNGase F的酶），(ii) 標記（例如，用2-胺基苯甲酸或2-胺基苯甲醯胺），(iii) 除去游離標記（例如，藉由凝膠過濾或固相萃取）；(iv) 藉由HILIC分離聚糖種類；以及 (v) 檢測（例如，藉由螢光光譜法）。由Melmer等人，Analytical and Bioanalytical Chemistry[分析和生物分析化學]，2010年9月，第398卷，第2期，第905-914頁提供了HILIC的另外的細節。

另一種常用的方法係液相層析 - 串聯質譜（LC-MS）。在釋放N-聚糖、標記並去除游離標記後，可以藉由將液相層析（或HPLC）的物理分離能力與質譜（MS）的質量分析能力相結合的技術來分析樣品。參見例如，Wang等人，Biotech Method[生物技術方法]，2018年1月17日，doi.org/10.1002/biot.201700185 。

另外的合適的方法包括但不限於正離子MALDI-TOF分析、負離子MALDI-TOF分析、HPLC、弱陰離子交換（WAX）層析、正相層析（NP-HPLC）、Bio-Gel P-4 層析、陰離子交換層析和一維NMR光譜、及其組合。參見例如，Pace等人，Biotechnol.Prog.[生物技術進展]，2016，第32卷，第5期，第1181-1192頁；Shah，B.等人，J. Am. Soc.Mass Spectrom. [美國質譜學會學報] (2014) 25：999；Mattu等人，JBC 273：2260-2272 (1998)；Field等人，Biochem J[生物化學雜誌] 299(Pt 1)：261-275 (1994)；Yoo等人，MAbs [單株抗體] 2(3)：320-334 (2010) Wuhrer M.等人，Journal of Chromatography B [層析雜誌B輯]，2005, 第825卷，第2期，第124-133頁；Ruhaak L.R.，Anal Bioanal Chem[分析和生物分析化學]，2010, 第397卷:3457-3481；Kurogochi等人，PLOS One[公共科學圖書館期刊] 10(7)：e0132848；doi:10.1371/journal.pone.0132848；Thomann等人，PLOS One[公共科學圖書館期刊] 10(8)：e0134949.Doi:10.1371/journal.pone.0134949；Pace等人，Biotechnol. Prog.[生物技術進展]32(5)：1181-1192 (2016)；和Geoffrey，R. G.等人，Analytical Biochemistry[分析生物化學] 1996, 第240卷，第210-226頁。

當評估高甘露糖含量時，可以將對照用於比較目的，如上所述。4. 重組產生的迪諾舒單抗的糖化

糖化（有時稱為非酶促糖基化）係在沒有酶的控制作用情況下糖分子（例如葡萄糖或果糖）與蛋白質或脂質分子共價鍵合的結果。糖化發生在帶正電荷的一級胺上，通常位於蛋白質分子的表面上。沒有鑒定出指示潛在糖化位點的特定序列。然而，已經觀察到鹼性殘基（精胺酸和其他賴胺酸）與具有已知結構的一些蛋白質中的糖化發生相關。糖化不同於N-298位點的N-糖基化。

對於治療性mAb，糖化的潛在影響，例如阻斷生物功能位點或誘導聚集的進一步降解，使糖化成為潛在的關鍵品質屬性（CQA）。糖化對抗體活性的影響範圍從無影響（Quan等人，Anal Biochem[分析生物化學]2008；373(2):179-91；Miller等人，J Pharm Sci[藥物科學雜誌]2011；100(7):2543-50）到失去活性（Kennedy等人，Clin Exp Immunol[臨床和實驗免疫學]1994；98(2):245-51；Dolhofer等人，Biol Chem Hoppe Seyler[生物化學Hoppe Seyler] 1985；366(4):361-6）。

由於賴胺酸殘基帶電並且經常參與蛋白質-蛋白質相互作用，令人驚訝的是顯著增加的糖化不會影響CP4-迪諾舒單抗的生物活性。因此，在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中至少15%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。如實例中所示，與CP2-迪諾舒單抗相比，CP4-迪諾舒單抗顯示出更高量的糖化。令人驚訝的是，儘管糖化量較高，但迪諾舒單抗與其配位基的結合以及生物活性不受影響。事實上，在一項強制糖化實驗中，高達70%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化賴胺酸殘基，同時維持其生物活性。因此，在某些實施方式中，約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、從約15%至約70%、從約15%至約65%、從約15%至約60%、從約15%至約55%、從約15%至約50%、從約15%至約45%、從約15%至約40%、從約15%至約35%、從約15%至約30%、從約20%至約70%、從約20%至約65%、從約20%至約60%、從約20%至約55%、從約20%至約50%、從約20%至約45%、從約20%至約40%、從約20%至約35%、從約20%至約30%、或約24%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。

另一個令人驚訝的發現係半乳糖糖化的賴胺酸不影響迪諾舒單抗的生物學活性或免疫原性。半乳糖天然存在於人血清中，濃度約為0.3 mg/dL。在該等低血清半乳糖含量下，健康個體不太可能具有帶有可測量的量的半乳糖糖化的循環蛋白，除了患有半乳糖血症的患者。因此，半乳糖糖化的臨床安全性係未知的。據發現，在迪諾舒單抗的情況下，高量的半乳糖糖化的迪諾舒單抗不影響免疫原性。因此，在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中至少5%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基，該一個或多個糖化的賴胺酸殘基包含半乳糖部分。例如，約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、從約5%至約35%、從約5%至約30%、從約5%至約25%、從約5%至約20%、從約5%至約15%、從約10%至約35%、從約10%至約30%、從約10%至約25%、從約10%至約20%、或從約10%至約15%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基，該一個或多個糖化的賴胺酸殘基包含半乳糖部分。

與上述N-298聚糖含量類似，糖化量（此處以百分比表示）不應在字面上理解為指在單個分子水平上計數具有糖化賴胺酸的分子。相反，該百分比使用任何常用的分析方法反映了基於抗體組成物的總賴胺酸含量的糖化賴胺酸種類的相對百分比。參見例如，實例7.2，其中基於CE-HPLC峰計算K-98處的糖化賴胺酸的百分比。

在某些實施方式中，半乳糖糖化的賴胺酸與葡萄糖糖化的賴胺酸的比值為從約1 : 10至約10 : 1，例如約1 : 10、約1 : 9、約1 : 8、約1 : 7、約1 : 6、約1 : 5、約1 : 4、約1 : 3、約1 : 2、約1 : 1、約2 : 1、約3 : 1、約4 : 1、約5 : 1、約6 : 1、約7 : 1、約8 : 1、約9 : 1、約10 : 1、從約7 : 1至約1 : 7、從約6 : 1至約1 : 6、從約5 : 1至約1 : 5、從約4 : 1至約1 : 4、從約3 : 1至約1 : 3、或從約2 : 1至約1 : 2。

在某些實施方式中，糖化的賴胺酸選自下組，該組由以下各項組成：(i) 重鏈K76、K98、K218、K249、K318、K327、和K335；以及 (ii) 輕鏈K104、K108、K150、K184、和K191。

在某些實施方式中，本發明的迪諾舒單抗分子以高親和力結合人RANKL，但不結合鼠RANKL。抗體的結合親和力可以表現為K_D 值，其係指特定抗原-抗體相互作用的解離速率。K_D 係解離速率（也稱為「解離速率（k_off ）」）與締合速率或「結合速率（k_on ）」的比率。因此，K_D 等於k_off /k_on （解離/締合）並且表現為莫耳濃度（M），並且K_D 越小，結合的親和力越強。可以使用本領域中已確立的方法確定抗體的K_D 值。除非另有說明，否則「結合親和力」係指單價相互作用（內在活性；例如，抗體藉由單價相互作用與抗原結合）。

K_D 的值可以藉由眾所周知的方法直接確定，並且甚至可以藉由諸如Caceci等人（1984，Byte 9：340-362）所述的方法對複合混合物進行計算。例如，可以使用雙過濾硝酸纖維素濾膜結合試驗建立K_D ，例如Wong＆Lohman（1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90：5428-5432）所揭露的。用於評估配位基（例如抗體）對靶抗原的結合能力的其他標準測定係本領域已知的，包括例如ELISA、Western印跡、RIA和流式細胞術分析，以及本文其他地方所例示的其他測定。

用於測量結合親和力（K_D ）值的一種示例性方法係表面電漿共振（SPR），通常使用生物感測器系統，例如BIACORE®系統。SPR係指允許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度的變化（例如使用BIACORE®系統）來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。BIAcore動力學分析包括在其表面上分析抗原與具有固定化分子（例如，包含抗原結合結構域的分子）的晶片的結合和解離；或者，抗體或其抗原結合片段與具有固定化抗原的晶片的解離。

在某些實施方式中，使用基於溶液的動力學排除測定（KinExA™）測量結合親和力（K_D ）值。在一個具體實施方式中，使用KinExA™ 3200儀器（Sapidyne）進行KinExA測量。動力學排除測定（KinExA™）係通用免疫測定平台（基本上係流動分光螢光計），其能夠測量平衡解離常數，以及抗原/抗體相互作用的締合和解離速率常數。由於KinExA™在獲得平衡後進行，因此係用於測量高親和力相互作用（其中相互作用的解離速率可能非常慢）的K_D 的有利的技術。KinExA™方法通常可如Drake等人(2004)Analytical Biochemistry[分析生物化學] 328，35-43中所述進行。

確定抗體K_D 的另一種方法係使用生物層干涉法，通常使用OCTET®技術（Octet QKe系統，ForteBio）。

迪諾舒單抗的結合親和力通常低於100 pM。在某些實施方式中，迪諾舒單抗與人RANKL結合的親和力為約100 pM或更低、約75 pM或更低、約50 pM或更低、約25 pM或更低、約20 pM或更低、約10 pM或更低、約5 pM或更低、從約0.1 pM至約50 pM、從約0.5 pM至約50 pM、從約1 pM至約50 pM、從約0.1 pM至約25 pM、從約0.5 pM至約25 pM、或從約1 pM至約25 pM。在某些實施方式中，結合親和力根據Kostenuik等人，Journal of Bone and Mineral Research[骨與礦物研究雜誌],第24卷，182-195 (2009)揭露的方法，使用KinExA 3000系統（Sapidyne Instruments）藉由溶液平衡結合分析進行測量。簡言之，將Reacti-Gel 63珠粒用20 mg/ml人RANKL在4°C下預包衣過夜，用1 mg/ml BSA封閉2小時，並在PBS中洗滌三次。將迪諾舒單抗（50 pM）與各種濃度的可溶性人RANKL（0-5 nM）在室溫下培養 ＞ 6 h，以允許平衡結合，然後通過RANKL包衣的珠粒。藉由螢光標記的（花青Cy5染料）山羊抗人抗體定量游離迪諾舒單抗與珠粒的結合。

許多測定可用於評估糖化量。一種示例性方法係硼酸鹽親和層析。硼酸鹽親和層析（BAC）係用於分離和富集順式二醇化合物的技術。固定相上的硼酸官能基將在鹼性pH條件下形成四面體陰離子，其可與糖分子上發現的順式-1,2-二醇陣列相互作用（Quan等人，Anal Biochem[分析生物化學]2008；373(2):179-91）並將糖化種類與非糖化種類分離。為了洗脫糖化種類，藉由降低pH或添加競爭的羥基基團源（例如山梨糖醇）來破壞相互作用。BAC已被用於分析碳水化合物和完整蛋白質。

對於抗體糖化分析，BAC係鑒定、定量和分離糖化抗體的常用方法，因為它需要最少的樣品製備並使用本地運行條件。優化遮罩劑的濃度、pH和緩衝鹽組成允許定量大量藥物物質的糖化量。

評估糖化量的另一種方法係基於電荷的方法。毛細管等電聚焦（cIEF）或成像毛細管電聚焦（icIEF）係基於電荷的分離方法，其可以檢測由於糖化位點上的正電荷損失而引起的糖化。與未糖化的，未保留的硼酸鹽級分相比，完全糖化的保留硼酸鹽級分向酸性區域轉變。已知icIEF將具有0.05-pI差異的種類分開，並且可以分辨由於賴胺酸殘基阻斷而理論上具有0.09-pI單位差異的糖化抗體。在共混的糖化和非糖化硼酸鹽級分中也可觀察到該電荷差異分離。

離子交換層析（IEC）也可以分辨具有表面電荷差異的糖化和非糖化蛋白質。糖化硼酸鹽級分的分析顯示在線性梯度條件下向主峰的明顯酸性轉變。相應地，從IEC分餾的酸性變體也顯示出小的糖化富集。

Quan等人（同上）報導了與原始未分級分離的抗體相比，保留完全糖化硼酸鹽的抗體向酸性區域的轉變。在線性梯度中，轉變的量相當於約0.5 mM氯化鈉。保留硼酸鹽的級分的IEC峰也明顯變寬，而未保留硼酸鹽的級分（非糖化）的IEC峰比未分級分離的起始材料更尖銳。然而，IEC有時可能沒有足夠的解析度來分離起始材料（其表現出來自分子中多個低量糖化位點的組合電荷效應）中的糖化種類。相比之下，在羧基末端具有零個、一個或兩個賴胺酸殘基的分子彼此徹底分辨，顯然係由於與樹脂的單一和獨特的位置相互作用。

另一種評估糖化量的方法係液相層析-質譜法。完整抗體或酶切割的mAb片段的自上而下的質譜法也可用於藉由以下來確定糖化量：基質輔助雷射解吸/電離（MALDI）（參見例如，Kislinger等人，Ann N Y Acad Sci[紐約科學學術年報] 2005；1043:249-59），或電噴霧電離（ESI）（參見例如，Miller等人，J Pharm Sci[藥物科學雜誌]2011；100(7):2543-50）。由於每個糖化位點顯示+ 162 Da質量轉移，因此自上而下方法可用作抗體中糖化量的快速估計。據報導，在去糖基化和去除C-末端賴胺酸後，藉由質譜法定量糖化可以具有1.0%的檢測限和3.0%的定量限，並且BAC和質譜結果之間存在相關性。

為了定位糖化位點，通常使用自下而上的肽作圖方法。由於胰蛋白酶被賴胺酸殘基的糖化抑制，因此在+ 162 Da質量添加情況下錯過的胰蛋白酶切割表明糖化賴胺酸。收集的BAC保留級分或強制糖化樣品的胰蛋白酶肽圖譜顯示抗體上糖化易感性的位點。

質譜法中片段化的另一種方法係電子轉移解離（ETD）。對片段化方法比較的研究表明ETD提供完整的序列片段化而沒有任何中性丟失。

改善糖化肽的靈敏度和降低中性丟失的一種方法係藉由使用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉還原，然後用胰蛋白酶切割和用MS/MS檢測的肽圖譜分析（參見例如，Brady等人，Anal Chem [分析化學]2007；79(24):9403-13）。在該方法中，由於還原的糖化糖部分，碳水化合物和肽之間的鍵穩定，這導致更高品質的MS/MS譜。

液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS）也是研究蛋白質糖化量的常用方法。

也可以使用比色測定法。由抗體糖化形成的酮胺可以藉由氮藍四唑（NBT）還原測定來定量。NBT被糖化蛋白的酮胺形式還原，這導致在525 nm處吸光度的變化。該方法已用於測量聚賴胺酸和糖化白蛋白。

另外，應用酶聯免疫吸附測定（ELISA）形式研究糖化抗體，其係利用樣品和靶向特定種類糖化終產物的生物素綴合的一級抗體之間的結合。5. 其他聚糖種類

通常已知的聚糖如表2所示。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約48%至約70%的迪諾舒單抗分子包含A2F-G0。例如，從約48%至約55%、從約50%至約65%、從約50%至約60%、或從約55%至約65%的迪諾舒單抗分子包含A2F-G0。

在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約30%至約60%（例如，從約30%至約55%、從約30%至約50%、從約30%至約45%、從約35%至約55%、從約35%至約50%、或從約35%至約45%）的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G0。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約9%至約26%（例如，從約10%至約26%、從約11%至約26%、從約12%至約26%、從約13%至約26%、從約10%至約20%、或從約15%至約25%）的迪諾舒單抗分子包含A2F-G1。

在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約20%至約50%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G1。例如，從約25%至約45%、從約25%至約40%、從約30%至約45%、或從約30%至約40%的迪諾舒單抗分子包含A2F-G1。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中所述從約0.1%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1-G0。在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中所述從約0.5%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1-G0。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約0.1%至約4%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1F-G0。在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約1%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A1F-G0。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約4%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G0。在另一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約4%至約8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G0。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約1%至約7%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G1。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約0.5%至約4%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2-G1。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約3%至約10%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G2。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約0.3%至約5%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含A2F-G2。

在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中約5%或更少、約4%或更少、約3%或更少、約2%或更少、從約0.1%至約5%、從約0.1%至約4%、從約0.1%至約3%、從約0.1%至約2.5%、從約0.1%至約2%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含唾液酸化的N-聚糖。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約0.3%至約1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含唾液酸化的N-聚糖。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約0.3%至約2%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含唾液酸化的N-聚糖。在一個方面，本發明提供包含重組產生的迪諾舒單抗分子的組成物，其中從約1%至約3%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含唾液酸化的N-聚糖。

如上所述，各種聚糖種類的含量，在此表示為百分比，不能從字面上理解為指在單個分子水平上計數N-聚糖含量。該百分比使用任何常用的分析方法反映基於抗體組成物的總N-聚糖含量的聚糖種類的相對百分比。例如（參見例如實例3.2和實例7.1），可以基於層析峰的面積計算百分比。

儘管藉由示例性方法產生的迪諾舒單抗分子顯示出與高甘露糖不同的上述種類的不同聚糖含量，但迪諾舒單抗的生物活性和PK/PD譜不受該等聚糖種類的變化的影響。因此，聚糖特徵可能會容忍顯著的變化。在某些實施方式中，可能需要具有從約48%至約70%的A2F-G0、和約13%至約26%的A2F-G1；或從約48%至約70%的A2F-G0、和約10%至約20%的A2F-G1。

此外，最廣泛的範圍（例如，從約48%至約70%的迪諾舒單抗分子包含A2F-G0）不應簡單地作為生物相似性評估的決定性標準，因為生物相似性評估基於以下的證據整體性。例如，Fc聚糖上糖殘基（例如，岩藻糖、唾液酸、末端β-半乳糖）的存在或不存在影響Fc的構象，從而潛在地影響Fc介導的效應子功能。已知G0聚糖與甘露糖結合蛋白相互作用以 (i) 活化補體和 (ii) 促進血清清除（參見例如，Dong等人，J. Immunol.[免疫學雜誌]，163 (1999),第5427-5434頁；Malhotra等人，Nat. Med.[自然醫學]，1 (1995),第237-243頁）。已知G2糖型在孕婦和臍帶中增加（Kibe等人，J. Clin. Biochem. Nutr.[臨床生物化學與營養雜誌]，21 (1996),第57-63頁）。已知靜脈內免疫球蛋白（IVIG）的脫唾液酸化在KN小鼠中消除抗炎特性（Yang等人，Anal. Biochem.[分析生物化學]，448 (2014)，第82-91頁）。已知IgG上的核心α（1,6）岩藻糖的丟失增強了抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）活性（參見例如，Ferrara等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.[美國國家科學院院刊]，108 (2011),第12669-12674頁；Shields等人，J. Biol. Chem.[生物化學雜誌]，277 (2002),第26733-26740頁。最後，N-連接的複合聚糖的末端單糖有時被唾液酸佔據。該唾液酸的存在影響相應糖蛋白的吸收、血清半衰期和血清清除，以及物理、化學和免疫原性特性（參見例如，Bork等人，J Pharm Sci.[藥學科學雜誌] 2009年10月;98(10):3499-508. doi：10.1002/jps.21684）。因此，為了證明生物相似性，可能需要不同或更窄範圍的聚糖含量。6. 細胞系

本發明中使用的細胞系（也稱為「宿主細胞」）經遺傳工程改造以表現迪諾舒單抗。細胞系通常源自來自原代培養物的譜系，其可在培養中維持無限時間。基因工程改造細胞系涉及用重組多核苷酸分子轉染、轉化或轉導細胞，和/或以其他方式改變（例如，藉由同源重組和基因活化或重組細胞與非重組細胞的融合）以引起宿主細胞表現所需的重組多肽。用於遺傳工程細胞和/或細胞系以表現目的多肽的方法和載體係熟悉該項技術者熟知的；例如，各種技術在Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學現代方法]，Ausubel等人編輯（Wiley & Sons，紐約，1988，以及季度更新）；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]（冷泉實驗室出版社，1989）；Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture[大規模哺乳動物細胞培養]，1990,第15-69頁中說明。

動物細胞系衍生自其祖細胞來源於多細胞動物的細胞。一種動物細胞系係哺乳動物細胞系。適用於在培養中生長的多種哺乳動物細胞系可從美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection）（維吉尼亞州馬納薩斯）和商業供應商處獲得。工業中常用的細胞系的實例包括VERO、BHK、HeLa、CV1 （包括Cos）、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞系（例如NSO、NS1）、PC12、WI38細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞。

在某些實施方式中，該哺乳動物宿主細胞係齧齒動物細胞。齧齒動物細胞系的實例包括例如幼倉鼠腎（BHK）（例如BHK21、BH TK）、小鼠Sertoli（TM4）、水牛大鼠肝（BRL 3A）、小鼠乳腺腫瘤（MMT）、大鼠肝癌（HTC）、小鼠骨髓瘤（NSO）、鼠雜交瘤（Sp2/0）、小鼠胸腺瘤（EL4）、中國倉鼠卵巢（CHO）和CHO細胞衍生物、小鼠胚胎（NIH/3T3、3T3 Li）、大鼠心肌（H9c2）、小鼠成肌細胞（C2C12）和小鼠腎（miMCD-3）。

在某些實施方式中，該哺乳動物宿主細胞係CHO細胞。如本文所用，「CHO細胞」還包括CHO衍生物，其中已將另外的遺傳修飾引入CHO細胞。CHO細胞廣泛用於生產複合重組蛋白，例如，細胞因子、凝血因子和抗體（Brasel等人，(1996)，Blood[血液]88:2004-2012；Kaufman等人，(1988)，J. Biol Chem[生物化學雜誌] 263:6352-6362；McKinnon等人，(1991)，J. Mol Endocrinol[分子內分泌學雜誌] 6:231-239；Wood等人，(1990)，J. Immunol.[免疫學雜誌] 145:301 1-3016）。

合適的CHO細胞包括例如DUXB11和DG44細胞系。這兩種細胞系缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR）活性，因此生長依賴於核苷酸先質的外源來源。DHFR缺陷係易於操作的表型，適於針對基因組整合和外源DNA的穩定表現進行選擇。藉由用目的基因和DHFR基因的表現盒轉染細胞來完成基因組整合。轉染後，將細胞置於缺乏核苷酸先質的選擇培養基中。此外，該等細胞易於作為貼壁培養或懸浮培養操作，並表現出相對良好的遺傳穩定性。CHO細胞和在其中重組表現的蛋白質已被廣泛表徵，並已被批准用於監管機構的臨床商業製造。

藉由向培養物中添加胺甲喋呤（MTX）可以進一步增強DHFR缺陷細胞系中的重組蛋白表現，從而可以選擇高拷貝數的引入的表現載體。MTX係DHFR酶的競爭性抑制劑。在沒有核苷酸先質的情況下施加這種另外的選擇壓力使得能夠選擇和分離已經經歷包含DHFR選擇標記和（在大多數情況下）感興趣的基因的整合表現載體的自發擴增的少數細胞群。多個基因拷貝的存在有助於實現外源蛋白的高量表現。可替代地，可以獨立於DHFR缺陷進行MTX選擇（即，使用MTX選擇最初具有DHFR能力的宿主細胞）。

另一種合適的CHO細胞系係野生型CHO-K1細胞系（例如ATCC# CCL-61）及其衍生物CHO-K1 SV。CHO-K1細胞系的一種常用選擇方法係麩醯胺酸合成酶（GS）選擇。沒有外源麩醯胺酸來源情況下，細胞存活依賴於GS酶來產生麩醯胺酸。對於具有相對低的內源性GS酶活性的宿主細胞系，例如鼠骨髓瘤衍生的NS/0細胞和CHO細胞，該方法允許在表現載體和無麩醯胺酸選擇培養基中使用GS選擇標記時的簡單選擇方案。與DHFR/MTX系統類似，可以將GS競爭性抑制劑甲硫胺酸胺基亞碸（MSX）添加到培養基中以施加另外的壓力並選擇從整合載體驅動高量表現的CHO細胞。

CHO-K1細胞或任何其他常用的CHO細胞也可以基於有或沒有DHFR缺陷情況下的MTX選擇。通常，當使用DFHR缺陷細胞系時，外源序列的拷貝數通常高得多，有時高達幾百拷貝。

適用於本文所述發明的其他CHO細胞株包括例如CHO-ICAM-1細胞和CHO-hIFNγ細胞。該等遺傳修飾的細胞允許將重組DNA穩定插入細胞的特定基因或表現區，擴增插入的DNA，並選擇表現出重組蛋白高量表現的細胞。

通常在工業實驗室中使用的CHO細胞系的另外的實例包括CS-9和AM-1/D細胞（描述於美國專利號6,210,924中）。CS-9和AM1/D藉由適應無血清培養基和亞選殖衍生自DUX B11。其他示例性CHO細胞系包括EM9（ATCC CRL-1861）、UV20（ATCC CRL-1862）、CHO dfhr-（ECACC 94060607）、RR CHO KI（ECACC 92052129）、hCBE11（ATCC PTA-3357）、E77.4（ATCC PTA-3765）、hLT-B：R-hG1 CHO #14（ATCC CRL-1 1965）、MOR-CHO- MORAb-003-RCB（ATCC PTA-7552）、AQ.C2殖株11B（ATCC PTA-3274）、AQ.C2殖株11B（ATCC PTA-3274）、hsAQC2於CHO-DG44（ATCC PTA-3356）、xrs5（ATCC CRL-2348）、Led [原名Pro- 5WgaRI3C]（ATCC CRL-1735）、Pro-5（ATCC CRL-1781）、ACY1-E（ATCC 65421）、ACY1-E（ATCC 65420）、pgsE-606（ATCC CRL-2246）、CHO-CD36（ATCC CRL-2092）、pgsC-605（ATCC CRL-2245）、MC2/3（ATCC CRL-2143）、CHO-ICAM-1（ATCC CRL-2093）、和pgsB-618（ATCC CRL-2241）。可以藉由確定哪些細胞系具有高表現量的重組迪諾舒單抗來選擇細胞系。

如本文舉例說明的，在CP3和CP4方法中，在生長期期間使用MTX選擇來擴增CHO細胞。一般來說，在MTX選擇情況下，估計宿主細胞包含約700-1000個拷貝的重組序列，從而增加重組蛋白質產生的總產率。因此，在某些實施方式中，已經藉由胺甲喋呤（MTX）選擇擴增了本發明的哺乳動物宿主細胞。在某些實施方式中，該哺乳動物宿主細胞包含約500個拷貝或更多的編碼迪諾舒單抗的核酸序列，例如約500個拷貝或更多、約600個拷貝或更多、或約700個拷貝或更多。

在某些實施方式中，本發明的哺乳動物宿主細胞包含約500個拷貝或更多的包含SEQ ID NO. 3的核酸序列，和/或約500個拷貝或更多的包含SEQ ID NO:4的核酸序列。

在某些實施方式中，本發明的哺乳動物宿主細胞包含編碼SEQ ID NO:1的核酸序列，和/或編碼SEQ ID NO:2的核酸序列。在某些實施方式中，本發明的哺乳動物宿主細胞包含編碼抗體的核酸序列，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO:1的重鏈、和含有SEQ ID NO:2的輕鏈。在某些實施方式中，本發明的哺乳動物宿主細胞包含含有SEQ ID NO. 3的核酸序列，和/或含有SEQ ID NO:4的核酸序列。

在某些實施方式中，CHO細胞系係當在提供足夠葡萄糖的培養基中培養時在N-298位點提供低量的高甘露糖的細胞系。此類宿主細胞包括以下CHO細胞，當在包含1 g/L至20 g/L的葡萄糖（例如4 g/L至20 g/L葡萄糖）的培養基中培養時，該等CHO細胞產生其中在N-298位點的高甘露糖含量為約1.8%或更少的迪諾舒單抗組成物。例如，在整個生產期期間，當在包含從約1 g/L至約20 g/L（例如，約4 g/L至約18 g/L）的葡萄糖的培養基中培養宿主細胞時（無需轉換至低葡萄糖培養基），在N-298位點的高甘露糖含量係約1.8%或更低、約1.7%或更低、約1.6%或更低、約1.5%或更低、約1.4%或更低、約1.3%或更低、約1.2%或更低、約1.1%或更低、約1.0%或更低、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、或約0.1%或更低。因為當在常規富含葡萄糖的培養基中培養時，此類CHO細胞不能在N-298位點提供所需的高甘露糖含量，所以使用本文所述的方法具有特別的優勢，以增加由該等CHO細胞宿主產生的迪諾舒單抗分子的高甘露糖含量。實例 實例 1 ： CP2 和 CP3 培養方法的比較

藉由解凍來自70S工作細胞庫的小瓶開始CP2培養擴增方法。將解凍的小瓶的內容物轉移到搖瓶中的CP2細胞培養生長培養基中。將培養物連續傳送到較大的搖瓶中，直到可以合併足夠的細胞團用於接種20 L生物反應器。然後將培養物擴增到60 L生物反應器中，三天後擴增到300 L生物反應器中。在300 L生物反應器中三至四天後，接種2,000 L生產生物反應器。

藉由解凍來自25B12細胞系的WCB的小瓶開始CP3培養擴增方法。將解凍的小瓶的內容物轉移到搖瓶中的含有胺甲喋呤（MTX）的CP3細胞培養生長培養基中。將培養物連續傳送到較大的搖瓶中，直到可以合併足夠的細胞團用於接種10 L培養袋生物反應器。在10 L培養袋生物反應器中三天後，將細胞團接種到50 L生物反應器中，在該階段從生長培養基中除去MTX。這隨後每三天進行一次，然後擴增到100 L生物反應器中，之後是500 L生物反應器中。在500 L生物反應器中三天後，接種到2,000 L生產生物反應器。

表3列出了CP2和CP3細胞培養擴增和生產方法的方法流程圖的對比。在產生足夠的生物質以接種生產生物反應器之前，兩種方法都使用三個接種物生物反應器階段。在接種物生物反應器的操作期間，將pH、溫度、壓力、攪拌和溶解氧控制在對每種方法特定的設定點。CP2方法涉及接種物生物反應器之間的全體積轉移，而CP3方法靶向初始活細胞密度（VCD）。這係由於操作偏好所致。

細胞系從CP2變化到CP3帶來了更高的產量。CP3細胞系（25B12）基於CS-9親本CHO細胞。

另一個變化係在培養擴增方法中引入培養袋單元操作。這係一次性生物反應器技術，其被引入以減少接種N-3生物反應器所需的搖瓶的數量。

兩種生產生物反應器的方法均在相同溫度設定點的2,000 L生產容器中操作。在生產生物反應器的操作期間，溫度、初始VCD、pH和溶解氧被控制在每種方法（已針對不同細胞系進行了最優化）的特定設定點。

兩種方法都藉由先前的種子生物反應器（N-1）培養物稀釋到產物生物反應器分批培養基中來進行接種。CP2方法涉及接種物生物反應器之間的全體積轉移，且生產生物反應器中的最大初始VCD為10 x 10⁵ 個細胞/mL。CP3方法靶向5 x 10⁵ 個細胞/mL的初始VCD。差異係由於操作偏好所致。

CP2生產方法基於修改的DMEM/F12培養基，並且在第14天收穫培養物之前在第3天和第9天有兩次批式供給。CP2供給培養基基於ACO 4.4並含有大豆水解產物。CP3生產方法基於IMX 7.0培養基，並且在第10天收穫培養物之前在第4天、第7天和第9天有三次批式供給。CP3供給培養基基於AFM004和AFM020培養基並含有酵母提取物（Yeastolate）。來自這兩種方法的所有培養基均基於DMEM/F12培養基，並針對不同細胞系進行了優化。 [表3].迪諾舒單抗 CP2 和 CP3 方法的細胞培養擴增（生長）和生產期的流程圖

實例 2 ： CP2 和 CP3 收穫和純化方法的比較

在完成生產期後，將生物反應器內容物冷卻並收穫。將CP2方法冷卻至18°C ± 3°C，CP3方法冷卻至10°C-15°C。收穫澄清涵蓋圓盤堆疊離心、深度過濾（階段1）和膜過濾（階段2）。

圓盤堆疊離心完成了生產細胞和細胞碎片與培養基的初步分離。離心分離之後進行階段1（深度）過濾，其進一步精煉收穫的濃縮物，使得階段2（膜）過濾和隨後的純化操作可以在沒有顯著污垢的情況下進行。在階段1過濾器之後，階段2膜過濾器提供具有高透明度和減少了生物負載的收穫濾液池。

比較CP2純化方法和CP3純化方法的方法流程圖如表4所示。兩種方法都包含相同的基本類型的單元操作，但每個單元操作的指令引數以及該等單元操作的順序已針對每種方法進行了優化。這係由於上游性能參數中細胞系的差異所致。

兩種方法中的第一單元操作係對澄清的收穫物進行的蛋白A親和層析分析步驟。蛋白A層析步驟係初級的純化階段，其使用固定的蛋白A配位基和迪諾舒單抗的Fc區之間的特異性高親和力相互作用來捕獲迪諾舒單抗。兩種方法中的第二單元操作係低pH病毒滅活階段，其設計用於滅活包膜病毒。

然後，在兩階段過濾之前，CP2方法使用2-(N-𠰌啉代)-乙磺酸（MES）和Tris溶液將產物池中和至pH 6.5。在兩階段過濾之前，CP3方法使用檸檬酸三鈉溶液將產物池中和至pH 5.2。在此階段，CP2方法可以保持在2-8°C進行長期儲存，直到被徵用進行進一步處理。CP3方法可在室溫下保持5天。

在兩種方法中的第二層析分析步驟和第三單元操作係陽離子交換（CEX）。每種方法的操作條件相似。方法中的接下來的兩個單元操作係病毒過濾和疏水相互作用層析分析（HIC）階段。兩種方法的最終單元操作係超濾和透濾（UF/DF），以將純化的迪諾舒單抗交換到配製緩衝液中。對於CP2，最終藥物物質濃度為70 mg/mL。對於CP3，最終藥物物質濃度為120 mg/mL。

如表4所總結，CP3方法提高了迪諾舒單抗產量。 [表4]. 迪諾舒單抗 CP2 和 CP3 方法的純化流程圖

實例 3 ： CP2 方法生產的迪諾舒單抗的聚糖圖譜

迪諾舒單抗的糖基化包括佔據重鏈上天冬醯胺298的單個N-連接位點的寡糖結構。3.1 聚糖佔用

Asn-298的N-糖基化位點的佔有係在用PNGaseF培養後從迪諾舒單抗的Lys-C肽圖譜確定的。質譜分析證明在PNGaseF處理後不存在對應於糖基化肽的離子，證實完全除去N-聚糖。在Asn-298處缺乏糖基化的肽被分辨為非糖基化肽；藉由PNGaseF在Asn-298處的聚糖被除去的肽被分辨為去糖基化的肽。藉由重建兩種肽的+2至+5電荷狀態的提取離子層析圖（EIC），建立圖中非糖基化和去糖基化肽的鑒定和定量。僅使用2種肽的每種電荷狀態的單同位素峰來重建EIC。

N-糖基化位點的佔有由非糖基化和去糖基化肽的EIC跡線的絕對峰面積確定。佔用百分比使用以下等式計算：

計算假設非糖基化和去糖基化種類的電離效率相等；實際上，假定非糖基化肽含有Asn殘基，而去糖基化肽在位置298處含有帶負電荷的Asp殘基，則非糖基化種類的電離效率可能略高於去糖基化種類。因此，可能過度報導了非糖基化肽的比例。在Asn-298的糖基化位點佔有約為99.7%。藉由與質譜聯用的Lys-C肽圖譜確定在Asn-298處非糖基化的形式的量為約0.3%。

基於來自整個序列的肽作圖研究的質量數據，沒有任何可檢測的量的另外N-連接糖基化或O-連接糖基化的證據。3.2 N- 連接聚糖和 O- 連接聚糖的質量分析

藉由寡糖作圖、質譜法和外切糖苷酶測序表徵N-連接的聚糖。寡糖作圖涉及使用內切糖苷酶PNGase-F藉由水解從蛋白質釋放N-聚糖。然後藉由用螢光標籤（2-胺基苯甲醯胺，2-AB）進行還原胺化來標記釋放的聚糖的還原末端，並藉由高效陰離子交換層析（HPAEC）分離標記的聚糖，並進行螢光檢測。

收集半製備型HPAEC譜中的每種聚糖種類用於質譜分析。將每個峰重新注入分析柱以驗證級分的純度（對於大多數級分，大於90%）。然後藉由基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）分析純化的級分，以基於觀察到的質量闡明聚糖結構。

每個級分的指定聚糖結構（參見圖1）和基於經驗式的理論質量與觀察質量的關係如表5所示。觀察質量均在理論質量的1000 ppm範圍內，這在實驗精度範圍內。由於在分析條件下其低豐度和不足的電離特性，未鑒定出次要種類（峰1、15、16、17和18）的確切結構。 [表5].建議的聚糖結構的質量

^a 藉由質譜分析未鑒定峰1、15、16、17和18。^b 觀察到的質量假定從觀察到的m/z中排除Na⁺ 加合物（22.99 Da）。^c 理論質量基於經驗式，並包括聚糖和2-AB標記（淨質量為118.14 Da）。

存在於N-聚糖特徵中的主要種類係具有不同程度的末端半乳糖基化的雙觸角結構（約85%），如CHO衍生的抗體所預期的。接下來最普遍的物種係高甘露糖種類（約10%），其中大部分係甘露糖5（8.1%）。在N-聚糖特徵中也發現了單觸角結構（峰2和4，3.7%）。岩藻糖基化與非岩藻糖基化雙觸角形式的比例約為9 : 1。

藉由使用以下外切糖苷酶的酶促釋放進一步證實了主要的N-連接的寡糖（表5中的峰2至9）的結構；α-(2-3，6，8，9)唾液酸酶、β-(1-4）半乳糖苷酶、β-(1-2，3，4，6)胺基葡萄糖苷酶、和α-(1-2，3，4，6)岩藻糖苷酶。

對照樣品和樣品中的聚糖特徵用α-(2-3，6，8，9)唾液酸酶處理以切割唾液酸。八種主要種類中沒有一種受到唾液酸酶處理的影響，證明該等主要種類不是唾液酸化的聚糖。還分析了用α-唾液酸酶和β-(1-4)半乳糖苷酶的組合消化的譜，β-(1-4)半乳糖苷酶特異性切割β-(1-4)連接的末端半乳糖殘基。表5中列出的三個峰（A2F-G1、A2F-G2、A2-G1）具有提出的含有一個或多個末端半乳糖的結構。用β-(1-4)半乳糖苷酶處理後，該等峰不存在，證實在這3個峰中存在末端β-(1-4)連接的半乳糖殘基。

除了前面描述的α-唾液酸酶和β-半乳糖苷酶的組合外，還分析了用β-(1-2，3，4，6)胺基葡萄糖苷酶（一種特異性切割末端GlcNAc殘基的酶）消化的譜。在用唾液酸酶和半乳糖苷酶連續消化後，表5中列出了四種主要的聚糖種類，其中提出的結構含有末端GlcNAc：A1F-G0、A2G-G0、A1-G0和A2-G0。用β-(1-2，3，4，6)胺基葡萄糖苷酶處理後，不存在該等峰，證實在這四個峰中存在末端GlcNAc。

用α-唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和β-胺基葡萄糖苷酶的混合物消化後，在譜中剩餘3個峰。收集在10分鐘洗脫的峰並藉由MALDI-TOF MS分析。觀察到的質量為1,198.7 Da，與2-AB標記的岩藻糖基化甘露糖3（1,198.1 Da）的預期質量一致，岩藻糖化的甘露糖-3結構係由上述酶促處理從岩藻糖化的雙觸角結構中除去半乳糖和N-乙醯半乳糖胺而得到的。

除了α-唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和前面描述的β-葡糖胺酶的混合物外，還分析了用α-(1-2，3，4，6)岩藻糖苷酶（一種特異性切割與三甘露糖核心連接的岩藻糖殘基的酶）消化的譜。在用α-(1-2，3，4，6)岩藻糖苷酶消化後，在10分鐘從洗脫的峰不再存在於譜中，並且在16分鐘處洗脫的峰的強度顯著增加。該結果證實，在10分鐘處洗脫的峰係岩藻糖基化的甘露糖3，並且在16分鐘處洗脫的峰係非岩藻糖基化的甘露糖3。

除了上述外切糖苷酶處理之外，用α-(1-3，4，6)半乳糖苷酶消化聚糖池以鑒定迪諾舒單抗聚糖部分中任何潛在的免疫原性末端α-(1-3)半乳糖殘基。在用α-半乳糖苷酶消化後，將迪諾舒單抗的HPAEC聚糖特徵與對照樣品進行比較。為了解釋譜中的任何細微變化，進行對照和消化樣品的三次注射。來自一式三份注射的層析圖的疊加顯示聚糖特徵沒有變化，表明沒有可檢測量的末端α-(1-3)半乳糖殘基。

基於上述外切糖苷酶處理研究，證實了藉由HPAEC/MALDI-TOF MS（表5）鑒定了8種主要的N-連接的寡糖。

進行基於質譜的綜合序列研究以表徵迪諾舒單抗的一級結構。結果證實，沒有證據表明迪諾舒單抗中存在任何O-連接的糖基化。3.3 糖化

在鄰近Lys-98的可變區的重鏈中觀察到非酶促糖化。修飾係對重鏈特異的。糖化有助於電荷異質性，因為它導致正電荷（Lys）的損失，導致酸性變體和162 Da的質量增加。

藉由CE-HPLC評估迪諾舒單抗的電荷異質性。迪諾舒單抗的CE-HPLC譜含有4個不同的峰：前峰1（PP-1）、主峰（MP）、鹼性峰1（B-1）和鹼性峰2（B-2）（圖2A）。純化的峰藉由各種分析技術表徵，包括基於正交電荷的技術和一級結構技術，以闡明電荷修飾的性質和位置。PP-1在Lys-98處含有糖化重鏈。用Lys-C肽圖譜分析純化的PP-1。在87分鐘保留時間洗脫的峰中觀察到與Lys-98處的糖化修飾一致的肽質量。

為了進一步確認作為糖化修飾的峰同一性，製備強制糖化樣品並藉由Lys-C肽圖譜運行。藉由將迪諾舒單抗與緩衝的葡萄糖溶液混合並在37°C下培養過夜來完成強制糖化。還製備對照樣品，其中從製劑中省略葡萄糖。在純化的PP-1樣品以及強制糖化樣品中發現在87分鐘處洗脫的肽含量升高，這進一步證實了純化的PP-1樣品中存在糖化變體。

推定的糖化肽峰和天然肽峰藉由在肽圖譜的洗脫期間原位電噴霧MS分析來表徵。從3+離子的變焦掃描在88分鐘洗脫的肽的測量的單同位素質量為5,572.48 Da。在87.02分鐘洗脫的來自糖化肽的3+離子的測量的單同位素質量為5,734.54 Da（5,572.48 + 162.06 Da），與預期的+162質量的糖化添加一致。藉由SE-HPLC和rCE-SDS檢查PP-1的大小分佈。藉由SE-HPLC測定PP-1含有天然單體。還原的CE-SDS顯示在重鏈後區域存在比重鏈略大的分子量種類。

藉由CP2方法產生的迪諾舒單抗具有約10%的糖化（藉由去糖基化的完整質量分析），這可能是由於生產細胞培養液中存在的葡萄糖所致。

為了研究PP-1中電荷變體的生物學影響，使用HTRF受體-配位基結合、報告基因和TRAP活性測定分析該級分的效力（表6）。強制糖化樣品包括在分析中。PP-1和強制糖化藥物物質都顯示出完全的效力。 [表6].PP-1 和強制糖化樣品的效力測定結果

注釋：針對HTRF，3次測定；針對其他分析，5次測定實例 3 ： CP2 和 CP3 方法產生的迪諾舒單抗的 N- 聚糖特徵的比較

藉由用N-聚糖酶處理除去聚糖，隨後用螢光化合物2-胺基苯甲醯胺標記。使用高pH陰離子交換層析分離聚糖種類，並使用螢光檢測（激發λ = 330 nm和發射λ = 420 nm）定量。然後定量聚糖峰。所有測試樣品的N-聚糖特徵的疊加以及參考標準示於圖3A中。來自CP3和CP2批次的迪諾舒單抗中N-聚糖的相對分佈顯示在圖3B中。

如圖3A中的聚糖圖譜中所示，CP3和CP2批次含有八種命名的聚糖種類和兩個命名的組。因此，整體聚糖圖譜顯示CP3和CP2批次中存在的類似聚糖模式。在CP3批次的圖譜中沒有觀察到新的糖型。然而，CP3和CP2批次之間的聚糖分佈存在差異。具體而言，CP3批次更多半乳糖基化，相應的唾液酸化程度增加。此外，CP3批次含有較少的Man-5和單觸角結構（圖3B）。表7總結了聚糖圖譜歷史數據。

注意，CP2和CP3的表7（最後一欄）中提供的「較佳的」範圍被認為係臨床範圍（其通常基於臨床試驗期間的患者暴露）。臨床範圍通常比商業範圍（由商業批次產生）更寬，更不嚴格。同樣，該等較佳的範圍不應簡單地作為生物相似性評估的決定性標準。出於生物相似性的目的，可能需要不同或更窄範圍的各種聚糖含量。 [表7]. 聚糖圖譜歷史數據

與CP2方法相比，使用CP3方法製造的迪諾舒單抗中不存在新的碳水化合物種類，但種類的分佈略有不同。使用迪諾舒單抗進行的研究表明，糖基化差異不影響迪諾舒單抗與RANK配位基的結合。藉由所有3種生物測定，去糖基化的迪諾舒單抗也具有完全效力。實例 4 ： CP3 方法產生的迪諾舒單抗的 PK/PD 研究 4.1 研究設計

在健康志願者中進行了開放標籤、隨機、單劑量、平行組研究。受試者被隨機化（1 : 1分配比例）以接受單次60 mg SC劑量的使用CP3方法（治療A）製造的迪諾舒單抗或單次60 mg SC劑量的使用CP2方法（治療B）製造的迪諾舒單抗。在從給予迪諾舒單抗之前到研究結束的指定時間點收集血樣用於PK和PD分析。在進行所有研究程序後，受試者在第113天完成研究。

共有115名受試者參加該研究。共有112名受試者（97%）完成該研究。三名受試者（3%）未完成該研究。57名受試者接受CP3-迪諾舒單抗（55名完成研究），58名受試者接受CP2-迪諾舒單抗（57名完成研究）。

使用經驗證的酶聯免疫吸附測定（ELISA）測量迪諾舒單抗的血清濃度。測定的定量下限（LLOQ）為20 ng/mL。簡言之，將NF-κB配位基的重組人受體活化劑（RANKL）包被在聚苯乙烯96孔板上並用作捕獲試劑。藉由將迪諾舒單抗摻入100%人血清中來製備標準品（STD）和品質對照（QC）。在用測定稀釋劑（1X PBS，含1%BSA、1M NaCl、0.5%吐溫20）1 : 10預處理後，將標準品、品質對照、研究樣品和空白載入到孔中。藉由固定的重組人RANKL捕獲STD、QC和研究樣品中的迪諾舒單抗。洗滌步驟後，添加生物素化的兔抗迪諾舒單抗檢測抗體。在另一個洗滌步驟後，添加與辣根過氧化物酶綴合的鏈黴親和素以結合複合物。在最後的洗滌步驟後，將四甲基聯苯胺（TMB）- 過氧化物酶底物添加到板中。停止顯色，並參照650 nm在450 nm下測量顏色強度（光密度，OD）。藉由電腦軟體介導的與同一運行的標準曲線的比較（根據加權因子為1/Y的邏輯自動估計回歸模型進行回歸（使用Watson LIMS版本7.0.0.01數據縮減包）），實現品質對照和研究樣品的OD單位轉換為濃度。

藉由驗證的血清CrossLaps ELISA測量血清C-端肽（CTX1）的濃度。LLOQ為0.049 ng/mL。簡言之，血清CrossLap®ELISA基於2種針對EKAHD-β-GGR胺基酸序列的高度特異性單株抗體，其中天冬胺酸殘基（D）係β-異構化的。為了在血清CrossLaps®ELISA中獲得特異性信號，必須交聯2條EKAHD-β-GGR鏈。將標準品（STD）、品質對照（QC）、樣品對照（SC）、空白和研究樣品添加至塗有鏈黴親和素的微量滴定板中，然後添加生物素化抗體和辣根過氧化物酶（HRP）綴合抗體的混合物。存在於STD、QC、SC或樣品中的CTX1將與生物素化抗體和HRP綴合抗體形成複合物。該複合物藉由生物素化抗體與鏈黴親和素包被的微量滴定板結合。在環境室溫下培養後，洗滌板。將四甲基聯苯胺（TMB）溶液添加至板中。停止顯色，並參照650 nm在450 nm下測量顏色強度（光密度，OD）。OD單位轉換為濃度係藉由電腦軟體介導的與在同一平板上測定的標準曲線的比較並使用Watson版本7.0.0.01數據縮減包根據4參數邏輯（自動估計）回歸模型（加權因子為1/Y² ）回歸實現的。4.2 藥物動力學 分析

使用PKS v3.1a中的WinNonlin Enterprise v 5.1.1，build 200610240912（Pharsight Corporation，加利福尼亞州山景城），藉由非房室方法分析血清迪諾舒單抗濃度 - 時間數據。使用SigmaPlot v10 build 10.0.1.2（SPSS科學公司（SPSS Science），伊利諾州芝加哥）創建圖。除非實際時間偏差等於或大於10%（在這種情況下使用實際時間），否則在分析中使用標稱採樣時間。在非房室分析和總結統計的計算中，將低於定量下限（LLOQ）（20 ng/mL）的迪諾舒單抗血清濃度設定為零。使用非取整值計算匯總統計數據。

藉由檢查數據鑒定給藥後觀察到的最大血清迪諾舒單抗濃度（Cmax）。還記錄了相應的Cmax時間（tmax）。藉由線性 - 對數梯形法（其將線性梯形法則應用到Cmax，然後將對數梯形法則應用於剩餘的曲線）計算從0到16周（AUC0-16周）的濃度 - 時間曲線下的面積。

迪諾舒單抗CP3和CP2的平均血清迪諾舒單抗濃度 - 時間譜以線性標度和半對數標度分別顯示在圖4A-4B中。在線性標度上評估譜（圖4A）表明，採樣到16周（112天）捕獲了兩種處理的大部分暴露。顯示由CP3方法產生的迪諾舒單抗。與藉由CP2方法生產的迪諾舒單抗相比，CP3-迪諾舒單抗具有更多的gal種類，更少的高甘露糖種類。

如圖4A和4B所示，藉由CP3方法產生的迪諾舒單抗在患者中顯示出更高的血清半衰期（平均半衰期延長10%），表明清除速率更慢。CP2產生的迪諾舒單抗的平均半衰期為約25.8（6.5）天（中位數 = 25.0）；CP2產生的迪諾舒單抗的平均半衰期為約28.3（6.5）天（中位數 = 27.4）。CP3的幾何平均AUC_0-16 周和C_max 值分別比CP2的值大約16%和14%（表8.1和8.2）。

如圖4D和4E所示，CP3-迪諾舒單抗的半衰期延長係由於Man-5種類的更快清除。優先清除包含Man-5的迪諾舒單抗分子，導致Man-5含量隨時間整體降低。相反，gal種類的含量在同一時期內基本保持不變。這表明與沒有Man-5的迪諾舒單抗相比，具有Man-5的迪諾舒單抗分子優先在血清中清除，導致Man-5含量的總體降低。在研究開始時，大約8%的迪諾舒單抗分子包含Man-5；在第60天左右，少於4%的迪諾舒單抗分子包含Man-5。 [表8.1] CP3-迪諾舒單抗的PK/PD總結

*CP3/CP2比率的點估計值（90%置信區間） [表8.2] 給予健康志願者60mg SC迪諾舒單抗CP3或CP2後的平均（SD）血清迪諾舒單抗藥物動力學 參數估計值

AUC_{0-16 周} = 從0到16周血清迪諾舒單抗濃度 - 時間曲線下面積 C_max = 最大觀察濃度 t_max = 觀察到C_max 的時間並表示為以中位數（範圍）^a 平均值四捨五入為3個有效數字（t_max 為2個），SD報告的精度與其各自平均值相同；所有計算均使用非取整值進行^b 點估計值（PE）和90%置信區間（CI）用於對數變換的比率（CP3/CP2）AUC_{0-16 周} 和C_max ^c N = 56和55（分別對於CP2和CP3 AUC_{0-16 周} 值）4.3 藥效學分析

基線血清CTX1濃度計算為在給予迪諾舒單抗之前獲得的3個樣品中測定的濃度的中值。自基線的百分比變化計算為給藥後測量值減去基線測量值除以基線測量值乘以100％。將低於分析方法的LLOQ的基線後CTX1濃度指定為LLOQ（0.049 ng/mL）的值，用於計算自基線的百分比變化。所有計算均使用非取整值進行。除非實際時間偏差等於或大於10%（在這種情況下使用實際時間），否則在分析中使用標稱採樣時間。使用SigmaPlot v10 build 10.0.1.2（SPSS科學公司（SPSS Science），伊利諾州芝加哥）創建圖。

給藥後CTX1的抑制%計算為自基線的%變化乘以-1。使用WinNonlin Enterprise v 5.1.1（圖視公司（Pharsight Corporation），加利福尼亞州山景城），藉由非房室方法分析CTX1相對於時間數據的單獨%抑制。記錄觀察到的CTX1（Imax）的最大抑制%及其發生的時間（tmax，CTX1）。藉由線性 - 對數梯形法（其將線性梯形法則應用於Imax然後對數梯形法則應用於曲線的其餘部分）計算在時間0至16周（AUEC_0-16 周）的效應曲線下面積（CTX1相對於時間的抑制%）。

在基線時，CP3組的CTX1的平均（± SD）血清濃度為0.555（± 0.288）ng/mL，CP2組為0.488（± 0.251）ng/mL。圖4C中提供了2種治療的相對於時間的從基線CTX1的平均（± SD）百分比變化。兩種治療的從基線CTX1譜的平均變化百分比基本上係可疊加的。幾何平均值AUEC_{0-16 周} 和I_max 值在處理組之間差異 ≤ 3%（表8.1和8.3）。AUEC_{0-16 周} 和I_max 的幾何平均值之比的90% CI在0.80至1.25的範圍內。儘管CP3和CP2之間的中位數t_max 、CTX1值不同（25天相對於12天），但從基線譜的平均CTX1百分比變化（圖10-3）可以看出，從第7天到第112天，兩種治療方法總體抑制程度相對恒定。 [表8.3] 給予健康志願者60mg SC迪諾舒單抗CP3或CP2後的平均（SD）血清C-端肽參數估計值

AUEC_{0-16 周} = 從0到16周的效應曲線下的面積 I_max = 最大觀察%抑制 t_{max ， CTX1} = 觀察到I_max 的時間，表示為中位數（範圍）^a 平均值四捨五入為3個有效數字（t_max 為2個），SD報告的精度與其各自平均值相同；所有計算均使用非取整值進行^b 點估計值（PE）和90%置信區間（CI）用於對數變換的比率（CP3/CP2）AUEC_{0-16 周} 和I_max ^c N = 56和55（分別對於CP2和CP3 AUEC_{0-16 周} 值）。實例 5 ： CP2 和 CP4 培養方法的比較

表9列出了比較CP2方法與CP4方法的細胞培養和收穫操作的方法流程圖。CP4細胞培養擴增和生產方法基於CS-9 CHO（25B12）親本細胞系。CP4方法使用以灌注模式操作的較小生產生物反應器，並且專門使用一次性（用後可棄）細胞培養擴增和生產容器。CP2和CP4生產培養方法在針對每種細胞系優化的方法特異性設定點進行控制。針對優化細胞健康和生產設計培養基配製物和營養物供給的時間。CP4生產生物反應器使用化學成分確定的培養基配製物，並用胺甲喋呤（MTX）擴增。對於這兩種方法，在搖瓶中進行細胞團的解凍和初始擴增。兩種方法均使用Dulbecco改良Eagle's培養基（DMEM）/基於F12的培養基；然而，配製物係不同的，並且針對不同的細胞系進行了優化。 [表9]. 迪諾舒單抗 CP2 和 CP4 方法的細胞培養和收穫

*聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDADMAC）和聚乙二醇（PEG）

對於這兩種方法，擴增生物反應器階段以分批模式操作，除了以分批供給模式操作的CP4 N-1。在擴增生物反應器階段期間，CP2方法使用4個不銹鋼生物反應器，而CP4方法使用2個一次性袋（SUB）系統，每個系統具有2個階段。CP4擴增方法中的第一一次性使用系統係2階段50升培養袋，其溫度、pCO₂ 和覆蓋氣體流速控制在方法特定的設定點。CP4擴增方法中的第二一次性使用系統係2階段500 L SUB，在第二階段的第2天（N-1）具有營養物供給。在所有擴增生物反應器（CP2和CP4 SUB階段）的操作期間，將pH、溫度、壓力、攪拌和溶解氧控制為方法特定的設定點。

生產生物反應器在不同模式下操作。CP2方法使用16 kL不銹鋼，分批供給生物反應器，在第3天和第9天供給，並在第14天收穫培養物。CP4方法在第3天和第6天使用2 kL SUB和2次批式供給，在第7天開始灌注，第11天改變培養基，並且在第18天收穫培養物。在第11天改變培養基降低了葡萄糖濃度，並添加了半乳糖作為可替代得碳水化合物來源。進行這種改變使得來自CP4方法的高甘露糖聚糖特徵與CP2方法的高甘露糖聚糖特徵相當，因為單株抗體上的高甘露糖聚糖特徵可能具有影響體內清除的潛力。灌注分離技術使用具有30 kDa標稱孔徑的膜，使得大於該尺寸的所有組分保留在生物反應器中，包括細胞和產物。所有設定點都針對每種細胞系和生產模式進行了優化。

CP2生產和供給培養基基於改良的DMEM/F12培養基並含有大豆水解產物。CP4生產、供給和灌注培養基係化學成分確定的配製物，不含水解產物。實例 6 ： CP2 和 CP4 收穫和純化方法的比較

在兩種方法中，在生產階段完成後，將生物反應器內容物冷卻至CP2中10°C ± 3°C的目標溫度和CP4中 ≤ 12°C的目標溫度。對於CP2方法，圓盤堆疊離心完成了生產細胞和細胞碎片與培養基的初步分離。對於CP4方法，使用聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDADMAC）和聚乙二醇（PEG）絮凝然後沈降來完成初步分離。兩種方法都遵循深度和膜過濾的初步分離。另外，CP4方法在收穫方法中利用空氣或氧氣噴射。

表10列出了比較CP2方法和CP4方法的純化操作的方法流程圖。 [表10]. 迪諾舒單抗 CP2 和 CP4 方法的純化

兩種純化方法都使用相同的基本單元操作：2個專門的病毒清除/滅活操作（低pH病毒滅活和200 nm病毒過濾）、3個層析操作（蛋白A親和力、陽離子交換和疏水相互作用）、以及超濾（UF）/滲濾（DF）操作，以將迪諾舒單抗濃縮和緩衝液交換進入最終的DS配製物。每個單元操作的指令引數以及該等單元操作的順序已針對每種方法進行了優化。另外的差異包括層析樹脂、緩衝液、過濾器類型以及操作區域和順序的變化。該等差異係由於細胞系的變化和在CP4方法生產生物反應器中使用灌注模式導致的較高細胞濃度。

第一單元操作係第1列，對收穫濾液進行蛋白A親和層析步驟。第1列係初級純化階段，利用固定化蛋白A和IgG型抗體Fc區之間的特異性高親和力相互作用來捕獲迪諾舒單抗。CP4方法使用MabSelect SuRe樹脂，CP2方法使用MabSelect樹脂。兩種方法中的第二單元操作係低pH病毒滅活步驟，這係滅活和清除病毒的2個專門操作中的第一個。CP4方法在pH 3.5 ± 0.1下進行病毒滅活60-90分鐘，CP2方法在pH 3.31-3.60下進行60-120分鐘，差異係由於宿主細胞系的變化和方法。

在CP4方法中的低pH培養期結束時，用Tris鹼將病毒滅活池的pH調節至5.0，然後通過0.2 μm聚醚碸（PES）膜過濾器對池過濾。對於CP2方法，用1-(N-𠰌啉代)-乙磺酸鈉（MES）和Tris鹼將池的pH調節至3.31-3.60，然後藉由2級過濾系統使池澄清。pH的差異係由於第2列的操作差異。

兩種方法中的第三單元操作係第2列，陽離子交換層析（CEX）步驟。該步驟使用CEX樹脂從來自產物流的過濾的病毒滅活池中除去存在的雜質。CP4方法使用Fractogel COO^- （M）樹脂，CP2方法使用Fractogel SO₃ ^- （M）樹脂。

兩種方法的下兩個單元操作係病毒過濾和疏水相互作用層析（HIC）階段；然而，順序被顛倒了。

兩種方法的下一個單元操作係UF/DF以將純化的迪諾舒單抗交換到配製物緩衝液中。將CP4和CP2產物流均用pH 4.80的10 mM乙酸鈉、5%山梨糖醇滲濾至最終的迪諾舒單抗濃度為70 mg/mL。未對DS存儲容器或存儲條件進行任何更改實例 7 ： CP4 方法產生的迪諾舒單抗的聚糖圖 7.1 CP4 方法產生的迪諾舒單抗的 N- 聚糖圖

藉由N-連接的寡糖結構的作圖來評估糖基化。該程序涉及用PNGaseF處理從迪諾舒單抗釋放N-連接聚糖。釋放的聚糖用2-胺基苯甲酸（2-AA）標記，然後用親水相互作用液相層析（HILIC）進行螢光檢測。用螢光檢測器監測洗脫峰。藉由質譜法的寡糖作圖進行迪諾舒單抗N聚糖圖譜峰的表徵。每個聚糖的指定聚糖結構和基於經驗式的理論質量相對於觀察質量顯示在表2和5中。觀察質量均在預期的實驗精度範圍內。 [表11].主要 N- 連接聚糖的組成

a. 「%」係指根據HILIC峰計算的相對百分比

大多數種類係核心岩藻糖基化，複合雙觸角結構，具有0或1個末端半乳糖，具有相對低量的非岩藻糖化雙觸角結構。聚糖群包含非常低量的唾液酸化的種類和雜合型聚糖，以及約8%高甘露糖聚糖（主要作為甘露糖5結構）。藉由整合所有聚糖峰確定迪諾舒單抗N-連接聚糖的百分比。此類峰的實例如圖5所示。

已知未存在於共有位點模體（Asn-Xxx-Ser/Thr）內的Asn上的N-糖基化在人抗體上以低量發生。該種類通常藉由rCE SDS分辨為重鏈後峰。確定該重鏈後峰面積相對於總重鏈峰面積的相對百分比在迪諾舒單抗中產生約1.5%的非共有糖基化量。

進行基於質譜的序列研究以表徵迪諾舒單抗的一級結構。結果證實，沒有證據表明迪諾舒單抗中存在任何O-連接的糖基化。7.2 非酶促糖化表徵 7.2.1 糖化表徵

非酶促糖化係藉由在糖的醛基和蛋白質的一級胺之間形成席夫鹼而使還原糖（葡萄糖或半乳糖）與蛋白質反應的方法。在CP2產生的迪諾舒單抗中，非酶促糖化（CE-HPLC前峰中富集的種類）位於迪諾舒單抗的一個賴胺酸殘基（Lys-98）上。

表徵技術和高解析度質譜儀器的進步使得能夠進一步表徵迪諾舒單抗上的非酶促糖化。用硼氫化鈉處理迪諾舒單抗，然後用胰蛋白酶還原、烷基化和消化，用於用質譜檢測的肽圖譜分析。用硼氫化鈉處理，如Brady等人所述（Anal. Chem.[分析化學]，2007，79 (24), 第9403-9413頁），穩定糖和蛋白質之間的鍵，允許藉由MS/MS進行位點鑒定。使用該技術，闡明了CP4產生的迪諾舒單抗中多個糖化位點的鑒定。表12中提供了來自兩種方法的迪諾舒單抗的非酶促糖化的鑒定位點，表明存在相同的糖化位點。這一預期結果係由於糖化不是隨機事件，而是高度依賴於溶劑可及性以及蛋白質的局部化學環境（Gadgil等人，J Pharm Sci. [藥學科學雜誌] 2007年10月；96(10):2607-21.）。 [表12]. 迪諾舒單抗糖化位點

CP4方法在細胞培養期間利用葡萄糖和半乳糖，產生用葡萄糖和半乳糖糖化的抗體。CP4上存在的糖化約為24%，估計為12%係由於半乳糖糖化。

葡萄糖在人血清中以約70-100 mg/dL（Pesce和Bodourian 1982）存在，導致循環蛋白的非酶促糖化。半乳糖天然存在於人血清中，濃度約為0.3 mg/dL。在該等低血清半乳糖含量下，健康個體不太可能具有可測量的量的半乳糖糖化的循環蛋白，除了半乳糖血症患者。半乳糖糖化的臨床安全性未知，因此可能被認為係一種新的分子種類，可能是一個潛在的安全問題。為了解決這一潛在的安全問題，我們進行了一項研究，以評估這種轉譯後修飾的糖化量、臨床安全性和療效影響。

CP4-迪諾舒單抗具有約24%的糖化，而CP2具有約10%的糖化。在CP2上鑒定出12個糖化位點。在CP4上檢測到相同的12個位點，未發現新的糖化位點。CP4、CP2和富集糖化的CP4樣品（70%）在兩種功能性生物測定中具有相同的效力，證明糖化量和半乳糖糖化不影響產物功能。另外，胰蛋白酶肽作圖實驗證實糖化的藥物物質位點在CP2和CP4方法之間係相同的，其中鑒定了總共12個糖化位點，沒有一個存在於迪諾舒單抗的CDR區中。

CP4方法利用含葡萄糖的培養基進行第1-10天的細胞培養，然後在第11-18天使用含有低葡萄糖和高半乳糖的灌注培養基。培養基的單糖分析確定細胞培養第12天的葡萄糖含量低於可檢測的量。因此，半乳糖可能是培養基改變後大部分糖化的原因。基於該數據，進行理論計算以估計CP4-迪諾舒單抗上存在的葡萄糖含量與半乳糖糖化的關係。該計算確定大約50%的CP4糖化（24%）係由於半乳糖。這對應於用半乳糖糖化的8種抗體中的1種和用葡萄糖糖化的8種抗體中的1種。7.2.2 糖化的生物學特徵

治療性抗體的修飾可導致臨床功效降低或可能影響患者安全性。因此，進行了特異加強糖化的CP4-迪諾舒單抗的徹底表徵。使用HTRF的效力分析和報告基因結合測定來評估CP4-迪諾舒單抗與CP-迪諾舒單抗相比的生物學功能。

在CP2-迪諾舒單抗的開發中，進行強制糖化研究以評估糖化和對效力的影響。迪諾舒單抗CP2被強制糖化至比起始材料高約68倍的量。當藉由HTRF和報告基因測定分析時，該樣品保留了所有效力。

在一個測定中，純化的CP4 CEX前峰種類具有約70%的糖化，而主峰和鹼性級分中係24%。藉由HTRF和報導基因測定，所有三種純化的級分保留其效力，表明升高的糖化量不影響產物功能。此外，藉由HTRF和報導基因測定，CP2和CP4的相對效力相當，進一步證明CP4的糖化不影響產物效力。7.2.3 糖化和對 Fc 功能的潛在影響

IgG抗體的清除或血清半衰期受新生兒Fc受體（FcRn）調節。先前對IgG1和IgG2抗體進行的強制糖化研究（Goetze等人，2012）已確定對FcRn結合沒有影響，表明糖化修飾對蛋白質功能幾乎沒有影響。然而，在CP2和CP4樣品上進行FcRn，該等數據證明了相似的FcRn。基於強制糖化研究結果並且鑒於CP2和CP4具有相同的糖化位點，CP4糖化量的升高不影響FcRn結合。7.2.4 半乳糖糖化的免疫原性評估

具有半乳糖糖化的D迪諾舒單抗係先前藥物產品展示中未出現的新種類，因此，進行了免疫原性風險評估。成熟的體液免疫應答需要B細胞表位和T細胞表位。B細胞表位係抗體結合位點並且通常依賴於蛋白質構象。T細胞表位係線性胺基酸序列，其與抗原呈遞細胞表面上的主要組織相容性II類蛋白結合，並引發T細胞分泌細胞因子，其引發抗體成熟。免疫原性風險評估考慮了以下因素：

B細胞表位風險。與僅含有葡萄糖糖化的CP2相比，CP4含有用半乳糖糖化的新種類。沒有患者接觸過該等新種類，並且對免疫反應存在一些不確定性。糖化分佈在多達11個不同的賴胺酸中，約12%的迪諾舒單抗分子具有1個半乳糖。因此，具有用半乳糖修飾的特定胺基酸的任何一個分子的濃度都很低。

由於非耐受性序列，針對完全人單株抗體的抗體通常與CDR區結合。迪諾舒單抗中的CDR含有1個賴胺酸和在相鄰框架中含有6個賴胺酸，其可能被半乳糖糖化。然而，尚未檢測到CDR中的糖化。

T 細胞表位風險。 電腦模擬分析預測只有1個次要T細胞「限制位」。糖化不會導致引起 T 細胞輔助的序列變體。 半乳糖可以增強抗原加工，然而，富含半乳糖的分子的攝取增加可能是由於更高階的寡糖。

總體而言，半乳糖糖化改變迪諾舒單抗免疫原性的風險很小。7.3 非共有 N- 聚糖（ NCG ）

非共有N-聚糖（NCG），如在Valliere-Douglas等人（J Biol Chem. [生物化學雜誌] 2009年11月20日；284(47)：32493-32506)中描述，表示寡糖與Asn殘基的連接，該Asn殘基不是共有模體的一部分，通常在抗體CH2結構域中。該種類通常富集在CE-HPLC前峰中，並藉由rCE-SDS分辨為重鏈後峰。

藉由rCE-SDS分析CE-HPLC級分表明CE-HPLC前峰略微富集非糖基化重鏈（NGHC）峰。另外，rCE-SDS數據表明CE-HPLC前峰級分略微富集重鏈後峰（表13），結果與Valliere-Douglas等人 (2009) 中的發現一致。 [表13]. 用於 CE-HPLC 級分的 rCE-SDS 分析的峰面積

實例 8 ： CP2 和 CP4 方法產生的迪諾舒單抗的聚糖特徵的比較

比較了來自CP2和CP4批次的高pH陰離子交換層析（HP-AEX）產生的寡糖圖譜。所有CP4和CP2批次均符合4%至11%甘露糖-5的可比性驗收標準（表14）。CP4藥物物質批次具有與CP2歷史數據相比可比較的甘露糖-5含量，並且在歷史最小值和最大值（5%至9%甘露糖-5）之內。聚糖圖譜（HP-AEX）疊加圖示於圖5中。與預期的CP2批次相比，疊加圖顯示CP4藥物物質中的A2F-G1含量較低。 [表14]. 甘露糖 -5 聚糖圖譜（ HP-AEX ）批次藥物物質釋放測試

a. 可比性驗收標準基於內部歷史數據。該等範圍不應簡單地作為生物相似性評估的決定性標準。出於生物相似性的目的，可能需要不同或更窄範圍的甘露糖-5。

作為修改CP4細胞培養方法以控制Man-5含量的結果，預期CP4-迪諾舒單抗將具有比CP2-迪諾舒單抗更少的%A2F-G1和更多%A2F-G0寡糖種類。該等種類係人血清中天然存在的糖型，因此不被認為係安全或功效問題。

為了評估聚糖特徵的潛在變化，使用聚糖圖譜分析來評估迪諾舒單抗的N-連接聚糖。圖5顯示了藉由兩種方法產生的迪諾舒單抗之間一致的N-聚糖特徵。在CP4批次的圖譜中沒有觀察到新的糖型。表14中顯示了%A2F-G0、%A2F-G1和%Man 5寡糖種類的總結。CP4數據在計算的容許區間（TI）範圍內，%A2F-G1結果位於計算的CP2 TI範圍的低端。CP2批次與CP4批次的末端半乳糖基化的輕微變化預計不會影響產物安全性或功效。

如該等數據所示，與CP2方法相比，使用CP4方法製造的迪諾舒單抗中不存在新的碳水化合物種類。CP4和CP2批次符合HP-AEX可比性標準。表15.1和15.2總結了HP-AEX分析方法中記錄的所有N-聚糖種類的總結。如此匯總表所示，CP4批次獲得的值與CP2方法中的值類似。CP4和CP2批次之間的唾液酸化的種類的量相似。在CP4和CP2批次之間觀察到%A1F-G0含量的微小差異；但是，預計該等差異不會影響產物的功效。 [表15.1].來自 CP4 和 CP2 的迪諾舒單抗， HP-AEX 可比性匯總表

a. 可比性驗收標準基於內部歷史數據。該等範圍不應簡單地作為生物相似性評估的決定性標準。出於生物相似性的目的，可能需要不同或更窄範圍的聚糖種類。 [表15.2].HP-AEX 迪諾舒單抗 CP4 和 CP2 N- 糖聚種類匯總表

與CP2藥物物質相比，在迪諾舒單抗CP4藥物物質中觀察到的糖化量增加與CP4方法的變化一致，即細胞培養基中細胞培養方法持續時間的增加和葡萄糖和半乳糖的使用的組合。在CP2生產供給中沒有使用半乳糖，並且已經顯示培養基中的半乳糖導致比葡萄糖更高量的非酶促糖化（Quan等人，Anal Biochem [分析生物化學] 2008；373(2):179-91）。CP4藥物物質具有約24%的總糖化，相比CP2藥物物質約為10%。預期CP4藥物物質上存在的升高的糖化量係葡萄糖和半乳糖的組合。

在先前的研究中，即使當糖化增加約68倍（藉由強制糖化）時，藉由HTRF和報導基因測定，CP2藥物物質保留完全效力。藉由HTRF和報告基因測定，CP4藥物物質和CP2藥物物質的效力相當，進一步證明迪諾舒單抗CP4藥物物質的糖化量大約高2倍不影響效力（表16.1和16.2）。另外，IgG1和IgG2抗體的強制糖化不會對FcRn結合產生可測量的影響，進一步表明糖化對迪諾舒單抗的生物學功能幾乎沒有影響。總之，該等數據表明，預計CP4觀察到的糖化增加不會影響產物安全性或功效。 [表16.1].HTRF 效力結果

a. 可比性驗收標準基於內部歷史數據。該等範圍不應簡單地作為生物相似性評估的決定性標準。出於生物相似性的目的，可能需要不同或更窄的相對效力範圍。 [表16.2].可比性報告基因測定匯總表

實例 9 ：葡萄糖、蔗糖和半乳糖濃度對高甘露糖含量的影響

在該實施方式中，使用不同濃度的葡萄糖、蔗糖和半乳糖來評估它們對迪諾舒單抗的高甘露糖含量的影響。

選擇針對葡萄糖的兩種碳源替代物二糖蔗糖和單糖半乳糖來評估它們對包含高甘露糖的迪諾舒單抗分子的百分比的影響。如上文詳細描述的，藉由灌注在第11天至第17天發生培養基變化。

在一項研究中，評估了葡萄糖和半乳糖濃度對Man-5含量的影響。實驗設計如表17所示。 [表17].實驗設計：葡萄糖和半乳糖

圖7A顯示了第17天Man-5的完整模型分析，其中在實驗中心點處具有預測譜。數據表明，葡萄糖和半乳糖之間的相互作用可能對Man-5含量很重要。圖7B顯示了第17天Man-5的預測，其中葡萄糖量設定為2.5 g/L。藉由HELIC分析方法獲得Man-5結果。圖7C顯示了Man-5從第11天到第17天的時程變化。該圖顯示了Man-5隨時間的增加。

表18顯示了該研究的聚糖特徵。該等聚糖種類的變異都沒有統計學意義。 [表18].第 17 天聚糖特徵

基於該研究，確定對於約10% Man-5，培養基應包含約2.5 g/L的葡萄糖和約11.5 g/L的半乳糖。該等濃度導致生長、活力和滴度之間的平衡，同時實現獲得Man-5靶標的主要目標。分析還顯示葡萄糖濃度與生長和滴度之間的相關性，較高的葡萄糖產生較高的生長和滴度。選擇濃度為2.5 g/L的半乳糖，即使較高的半乳糖可以產生較高的Man-5含量，但較高的半乳糖可能對培養物的活力具有潛在的負面影響。

在第二項研究中，評估了葡萄糖和蔗糖濃度對Man-5含量的影響。實驗設計如表19所示。靶標Man-5至少為7%-9%。 [表19]. 實驗設計：葡萄糖和蔗糖

在測試的因素中，所有因素都在第17天達到Man-5含量超過8%，並且許多因素在第15天達到10%以上。Man-5的第17天的範圍從9%至略低於16%。最接近CP2水平的兩個條件係具有2 g/L葡萄糖和16 g/L或24 g/L蔗糖的條件。藉由HILIC測定的Man-5的圖示於圖8B中。圖8C顯示與CP2參考相比的Man-5和總高甘露糖種類。實例 10 ：低葡萄糖和半乳糖補充對 SR3 GS-KO 宿主細胞的影響

在該實例中，使用另一種CHO宿主細胞系來評估補充有可替代的碳源（半乳糖）的低葡萄糖培養基的效果。細胞系SR3 GS-KO衍生自CHO-K1細胞系，具有GS敲除。

使用10天分批供給（FB）平台評估生產條件下生長、迪諾舒單抗分子的表現和產物品質（PQ）譜，其中步驟如下（圖9A）：1. N-1 接種。在10天FB之前，將池恢復至 ＞ 85%的存活率。將迪諾舒單抗轉染的SR3-E1 GS-KO細胞的4天種子培養培養物以5 x 10⁵ 個細胞/ml接種在培養基中。2. N 接種。 從N-1種子培養中建立生產培養物，其中將細胞接種在50 mL旋轉管中。在第0天用高活力細胞（＞ 98%）以1 x 10⁶ 個細胞/ml接種分批供給培養物。將培養容器保持在36°C + 5%CO₂ ，同時在生產期期間以225 rpm振盪。3. 方法中監控。使用Vicell在第3、6、8和10天測量活細胞密度和百分比活力。使用Novaflex在同一天測量葡萄糖消耗量。4. 供給和補充。生產培養物在第3、6和8天用供給以下：以5%的初始培養物起始體積的供給培養基和1x酪胺酸-半胱胺酸補充物（以0.4%的供給體積供給）。在供給日添加作為批式(bolus)的10 g/L半乳糖，同時允許葡萄糖含量藉由消耗下降，並且僅在生產期間供給以維持1-5 g/L含量。5. 滴度和產物品質評估。在第10天收穫之前，測量活細胞密度、百分比活力和葡萄糖含量。為了收穫條件培養基（CM），將培養物以200 g離心15分鐘。收集CM用於滴度測量和ATOLL中心柱純化。純化的材料用於產物品質評估，包括HILIC、CEX-HPLC、SE-HPLC、nrCE-SDS和rCE-SDS測定。10.1 在 10 天的分批供給期間添加 D- 半乳糖不影響培養物的活力。

在三種培養條件下重複測試三組迪諾舒單抗轉染的SR3-E1 GSKO細胞：1) 對照（Ctrl）或對照（control），供給日補充葡萄糖，培養期間保持10-12 g/L含量；2) Gal/Gluc，10 g/L 半乳糖作為批式與葡萄糖一起補充以維持10-12 g/L含量；以及3) 僅含Gal，10g/L 半乳糖作為批式補充，不供給葡萄糖，以在培養期間維持1-5g/L 葡萄糖含量。在供給和收穫前第3、6、8和10天使用Vicell測量10天的分批供給期間細胞的活力。跨池和條件的所有培養物在整個10天的分批供給中顯示高活力（＞ 80%）（圖9B），表明在生產培養中修改糖含量和來源對活力的影響最小。10.2 低葡萄糖 含量對細胞生長和比生產率的影響。

在供給前第3天、第6天、第8天和第10天使用Novaflex進行生物反應器中葡萄糖含量的測量，以確保葡萄糖在每種條件下保持在適當的量。對於僅gal的培養條件，在第6天允許葡萄糖含量降低至約2 g/L。在這種條件下，葡萄糖在10天的分批供給的剩餘時間內保持在該含量（圖9C）。這一觀察表明，在沒有葡萄糖作為糖源的情況下，表現迪諾舒單抗的SR3-E1 GSKO細胞可能轉而使用半乳糖來維持其生長和其他細胞活動。

低葡萄糖含量不影響活力，但在添加半乳糖的培養物中細胞生長稍慢。在補充半乳糖和葡萄糖的培養物中觀察到最慢的生長（圖10A）。在該培養條件下，滴度顯得較低，與對照培養物相比，比生產率沒有顯示出顯著差異（圖10B-10C）。在低葡萄糖條件下添加半乳糖與滴度稍微下降和比生產率降低相關。10.3 D- 半乳糖與低葡萄糖組合的添加增加了迪諾舒單抗的高甘露糖 含量。

來自10天的分批供給的條件培養基進行ATOLL純化和產物品質屬性測定。使用尺寸排阻層析（SE-HPLC）分析純化的產物，發現其具有約99%純度和 ＜ 1%的高分子量和低分子量雜質（數據未顯示）。

隨後進行親水相互作用層析（HILIC）以測量產物的聚糖含量。結果表明，在高葡萄糖含量存在下添加半乳糖不會影響迪諾舒單抗的高甘露糖（M5）含量。另一方面，在低葡萄糖含量下補充10 g/L半乳糖使高甘露糖含量增加約1.5倍或更多（圖11）。該數據表明，在小規模生產期間將糖源從葡萄糖改變為半乳糖對產物的高甘露糖含量具有直接影響。10.4 半乳糖的添加增加了單和雙半乳糖基化的聚糖殘基。

對聚糖特徵的分析進一步表明，在10天的分批供給期間添加半乳糖補充劑導致半乳糖殘基的最小減少，但增加去唾液酸單半乳糖和二半乳糖殘基。該等殘基的增加與低葡萄糖條件的培養物中存在的葡萄糖含量成反比，顯示出約2-4倍的增加（圖12）。

根據在說明書內引用的參考文獻的教導，將最徹底地理解本說明書。在說明書內的實施方式提供了本發明的實施方式的展示，並且不應構成對本發明範圍的限制。技術人員很容易認識到，本發明涵蓋了很多其他實施方式。在本揭露中引用的所有公開物、專利和Genbank序列藉由引用以其全部內容進行結合。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時，本說明書將替代任何此類材料。在此的任何參考文獻的引用都不是承認此類參考文獻係本發明的先前技術。

在上面單個章節中提及的本發明的各種特徵和實施方式，作必要的修正的情況下適當時適用於其他章節。因此，適當時，在一個章節中限定的特徵可以和在其他章節中限定的特徵組合。

熟悉該項技術者將認知到、或不使用過度常規實驗就能夠確定本文所述發明的特定實施方式的許多等效實施方式。此類等效實施方式意在由以下實施方式涵蓋。

無

[圖1]係顯示來自CP2方法的樣品的N-聚糖特徵的圖。

[圖2]係顯示來自CP2方法的迪諾舒單抗樣品的用於糖化分析的CE-HPLC譜的圖。

[圖3A]係顯示來自CP2和CP3方法的樣品的N-聚糖特徵以及參考標準的圖。[圖3B]係總結來自CP2和CP3方法的樣品的N-聚糖特徵的表。

[圖4A-4E]總結了藉由CP2和CP3方法產生的迪諾舒單抗的PK/PD譜。[圖4A-4B]顯示在SC給予健康志願者60 mg迪諾舒單抗CP3或CP2後的平均（±SD）血清迪諾舒單抗濃度-時間譜（ng/mL），分別以線性標度（圖4A）和半對數標度（圖4B）描繪。[圖4C]顯示在皮下（SC）給予健康志願者60 mg迪諾舒單抗CP3或CP2後血清c-端肽（CTX1）自基線的平均（± SD）百分比變化。[圖4D-4E]顯示儘管迪諾舒單抗的Man-5含量隨時間降低，但Gal-種類保持基本恒定。從總計4名CP2患者中分析時程。

[圖5]顯示了聚糖圖譜（HP-AEX）疊加圖。CP2迪諾舒單抗和CP4迪諾舒單抗顯示出類似的N-聚糖特徵。

[圖6A]顯示了迪諾舒單抗重鏈（SEQ ID NO:3）的核苷酸和胺基酸序列。核苷酸1至57編碼訊息肽，其在蛋白質合成期間被切割以產生成熟重鏈。成熟重鏈的第一個胺基酸（E）以粗體和放大表示。[圖6B]顯示了迪諾舒單抗輕鏈（SEQ ID NO:4）的核苷酸和胺基酸序列。核苷酸1至60編碼訊息肽，其在蛋白質合成期間被切割以產生成熟輕鏈。成熟輕鏈的第一個胺基酸（E）以粗體和放大表示。

[圖7A-7C]顯示葡萄糖和半乳糖濃度對迪諾舒單抗高甘露糖含量的影響。[圖7A]顯示了第17天Man-5的完整模型分析，其中在實驗中心點處具有預測譜。[圖7B]顯示了第17天Man-5的預測，其中葡萄糖量設定為2.5 g/L。[圖7C]顯示了Man-5從第11天到第17天的時程變化。

[圖8A]顯示了第17天Man-5的完整模型分析。[圖8B]顯示了如藉由HILIC評估的Man-5含量。[圖8C]顯示與CP2參考相比的Man-5和總高甘露糖種類。

[圖9A]係顯示10天的分批供給方案的圖。[圖9B]顯示了在10天的分批供給期間細胞培養物保持高活力。對於所有測試條件，所有樣品顯示 ＞ 80%的活力。實心圓形、矩形和菱形代表補充葡萄糖而不添加半乳糖以在供給日期間在生物反應器中維持葡萄糖10-12 g/L含量的對照條件。空心圓形、矩形和菱形代表與葡萄糖一起補充10 g/L半乳糖以在供給日期間在生物反應器中維持葡萄糖10-12 g/L含量的條件。陰影條代表在供給日期間補充10 g/L半乳糖同時允許生物反應器中葡萄糖含量藉由消耗降低至1-5 g/L含量的條件。[圖9C]顯示了供給日和收穫日的生物反應器中的葡萄糖含量。進行葡萄糖的測量以指導兩種培養條件所需的葡萄糖供給量。在第3、6和8天的每一天，向對照和gal/gluc培養物（分別為黑色和白色條）補充約5-6 g/L葡萄糖，而不向僅有gal的培養物（陰影條）添加葡萄糖。

[圖10A-10C]顯示了改變糖源對細胞生長、滴度和比生產率的影響。[圖10A]係顯示所有樣品的活細胞密度（VCD）的線型圖。[圖10B]係顯示滴度的橫條圖，圖10C顯示10天的分批供給培養的比生產率。黑色條代表補充葡萄糖以在供給日期間在生物反應器中維持10-12 g/L含量的對照條件。白色條代表與葡萄糖一起補充10 g/L半乳糖以在供給日期間在生物反應器中維持葡萄糖10-12 g/L含量的條件。陰影條代表在供給日期間補充10 g/L半乳糖同時允許生物反應器中葡萄糖含量藉由消耗降低至1-5 g/L含量的條件。

[圖11]顯示了當添加半乳糖並且葡萄糖含量低時，高甘露糖含量增加。橫條圖顯示在10天的分批供給結束時報告的每個池中Man-5的%面積。黑色條代表補充葡萄糖以在供給日期間在生物反應器中維持10-12 g/L含量的對照條件。白色條代表與葡萄糖一起補充10 g/L半乳糖以在供給日期間在生物反應器中維持葡萄糖10-12 g/L含量的條件。陰影條代表在供給日期間補充10 g/L半乳糖同時允許生物反應器中葡萄糖含量藉由消耗降低至1-5 g/L含量的條件。

[圖12]顯示了D-半乳糖的添加增加了單和雙半乳糖聚糖殘基，但沒有增加半乳糖殘基。橫條圖顯示在10天的分批供給結束時報告的每個池中聚糖殘基的%面積。黑色條代表補充葡萄糖以在供給日期間在生物反應器中維持10-12 g/L含量的對照條件。白色條代表與葡萄糖一起補充10 g/L半乳糖以在供給日期間在生物反應器中維持葡萄糖10-12 g/L含量的條件。陰影條代表在供給日期間補充10 g/L半乳糖同時允許生物反應器中葡萄糖含量藉由消耗降低至1-5 g/L含量的條件。

無

Claims (20)

1. 一種提高迪諾舒單抗(denosumab)分子上存在的高甘露糖含量之方法，其中所述迪諾舒單抗分子由哺乳動物宿主細胞重組表現，該方法包括： (a) 在生長期期間，在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞，直至細胞密度為至少1 x 10⁶ 個活細胞/mL，其中所述第一培養基包含從1 g/L至20 g/L的葡萄糖；以及隨後 (b) 在生產期期間，在第二培養基中培養來自步驟 (a) 的宿主細胞，以表現所述迪諾舒單抗分子，其中所述第二培養基包含從0 g/L至10 g/L的葡萄糖及從5 g/L至20 g/L的半乳糖； 其中從2%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。
2. 如請求項1之方法，其中在該生長期期間，藉由批式供給或灌注，將葡萄糖濃度維持在從4 g/L至20 g/L。
3. 如請求項2之方法，其中當在該生產期期間在該第二培養基中培養宿主細胞時，藉由批式供給或灌注，將葡萄糖濃度維持在從0 g/L至8 g/L，並將半乳糖濃度維持在從7 g/L至15 g/L。
4. 如請求項1之方法，其中在該生產期期間，該等宿主細胞最初在該第一培養基中維持約3至約15天，隨後藉由灌注或批式供給，轉移至該第二培養基中。
5. 如請求項1之方法，其中在步驟 (a)中，所述細胞密度為從5 x 10⁶ 個活細胞/mL至12 x 10⁶ 個活細胞/mL。
6. 如請求項1之方法，其中從約4%至約11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。
7. 如請求項1之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞係CHO細胞。
8. 如請求項1之方法，其中所述哺乳動物宿主細胞係CS-9細胞。
9. 如請求項1之方法，其中所述第一培養基包含胺甲喋呤（MTX）。
10. 如請求項1之方法，其包括： (a) 在生長期期間，在第一培養基中培養所述哺乳動物宿主細胞，並用一個或多個批式供給補充該培養基，其中在該生長期期間，將葡萄糖濃度維持在從約4 g/L至約18 g/L； (b) 將來自步驟 (a) 的宿主細胞從生長期轉移至生產期，並將葡萄糖濃度維持在從約4 g/L至約18 g/L，持續約3天至約15天；以及隨後 (c) 將 (b) 的宿主細胞轉移至第二培養基，其中所述第二培養基包含從約1 g/L至約5 g/L的葡萄糖和從約10 g/L至約12 g/L的半乳糖。
11. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子之組成物，其中至少15%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基。
12. 如請求項11之組成物，其中從2%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。
13. 如請求項11之組成物，其中從4%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。
14. 如請求項11之組成物，其中所述迪諾舒單抗以約25 pM或更低的結合親和力（K_D ）值與人RANKL結合。
15. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子之組成物，其中至少5%的迪諾舒單抗分子包含一個或多個糖化的賴胺酸殘基，該一個或多個糖化的賴胺酸殘基包含半乳糖部分。
16. 如請求項15之組成物，其中從2%至14%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。
17. 如請求項15之組成物，其中從4%至11%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖。
18. 如請求項15之組成物，其中所述迪諾舒單抗以約25 pM或更低的結合親和力（K_D ）值與人RANKL結合。
19. 一種包含重組產生的迪諾舒單抗分子之組成物，並且其中從0.2%至1.8%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。
20. 如請求項19之組成物，其中從約0.5%至約1%的迪諾舒單抗分子在N-298位點包含高甘露糖聚糖。

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