CN111440225A - 一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法 - Google Patents

一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种采用Ala‑Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法。通过向表达蛋白的细胞的培养过程中添加Ala‑Gln调节半乳糖修饰比例，同时保证了蛋白产量，解决了常用的降温方法降低抗体半乳糖修饰比例同时也会降低细胞培养蛋白产量的问题。本发明提供的方法操作简单，程序可控，适于量化生产。

Description

一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法。
背景技术
蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类分子转移至蛋白质特定位置。蛋白质上糖链的结构和组成会显著影响蛋白的稳定性、安全性和有效性。因此，理解蛋白糖型的功效和控制糖型合成十分重要。
哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为3种：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的特征序列ASN-X-SER/THR(X代表任何一种氨基酸)的天冬酰胺上，天冬酰胺作为糖链受体。核心寡聚糖由2分子N-乙酰葡萄糖胺、9分子甘露糖和3分子葡萄糖依次组成，第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合，当ER膜上有新多肽合成时，整个糖链一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后，在ER中进一步加工，依次切除3分子葡萄糖和1分子甘露糖。在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，发生了一系列有序的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。
单克隆抗体作为一种糖蛋白是非常重要的治疗药物。单克隆抗体在体内的生理活性受2种独立的机制调节：靶向抗原并中和或者引发细胞凋亡以及抗体Fc效应功能，其中抗体Fc效应功能包括抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。研究发现，抗体的Fc端效应功能与位于该区域的寡糖链有关。提高IgG抗体半乳糖修饰比例会显著增强CDC效应。并且，半乳糖增加可能会提高抗体唾液酸化水平，唾液酸化水平增强可以提高糖蛋白血清中的半衰期；但是，半乳糖增加也会降低ADCC效应，因此，降低抗体半乳糖可能能防止ADCC效应降低。因此，需要采用合适的细胞培养方法调控抗体半乳糖基化水平至合适的水平。
单克隆抗体的糖基化可以影响蛋白药物的药效动力学和药代动力学，从而增强药物治疗效果。单克隆抗体IgG的N-糖基化位点一般位于Fc端CH2结构域上的ASN-297残基上。目前，大部分抗体药物由中国仓鼠卵巢细胞CHO表达，采用该表达系统生产的抗体蛋白抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后修饰最准确。但是，采用该表达系统生产的抗体糖型受到细胞培养方法影响展现出多样性，从而可能影响抗体蛋白FC效应功能。
在生物类似药开发过程中，抗体质量要求与原研药可比，糖型属于抗体的关键质量属性，需要将所开发的生物类似药糖型调控至与原研药可比。目前，通过细胞培养获得的抗体蛋白半乳糖修饰比例高于原研药，细胞培养方法对抗体糖型调控有显著影响。细胞培养的细胞株、工艺参数以及培养基成分均影响单克隆抗体的糖基化。有研究采用基因工程策略改变糖型合成过程中涉及的糖基转移酶基因，也有研究对表达的蛋白在体外进行修饰。细胞培养工艺参数pH、温度、pCO2会影响抗体糖型。其中，采用降温方法来降低半乳糖修饰比例是比较常用的方法。但是采用降温方法降低抗体半乳糖修饰比例同时也会降低细胞培养蛋白产量。
Ala-Gln主要用于细胞培养，具有提高细胞培养密度、细胞活率和表达量的作用，Ala-Gln调节抗体半乳糖修饰比例的方法尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过优化Ala-Gln添加浓度，达到调控半乳糖修饰比例的目的，同时保证了抗体表达量。
术语：本发明中糖指的是单糖或者多糖。
本发明中描述的糖蛋白指的是具有糖链的蛋白或者多肽，因此，凡是蛋白质或多肽上连接有糖链的均定义为糖蛋白。
本发明中所述糖型指的是连接在糖蛋白FC端ASN297上的糖链。
本发明中描述的半乳糖包含G1F糖型和/或G2F糖型。
本发明中描述的Ala-Gln指的是谷丙二肽。
本发明中描述的CHO细胞指中国仓鼠卵巢细胞。
本发明中细胞接种当天即为第1天，后续顺延。
一方面，本发明提供了一种调节糖蛋白中半乳糖修饰比例的方法，所述的方法为在表达糖蛋白的细胞的培养过程中添加Ala-Gln。
所述的调节指降低半乳糖修饰比例。
所述的糖蛋白为抗体、融合蛋白或多肽。
所述的融合蛋白包括但不限于阿柏西普。
所述的抗体为单克隆抗体。
所述的单克隆抗体包括但不限于EGFR抗体、地诺单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗中的一种或多种。
所述的Ala-Gln在表达糖蛋白的细胞接种当天添加，和/或在培养中间过程添加。
所述的Ala-Gln于表达糖蛋白的细胞接种的第1-15天中的任意一天或几天进行添加。
所述的Ala-Gln单次添加量为终浓度1-50mM；优选为2-40mM；更优选为2-30mM；进一步优选为4-20mM；更进一步优选为4-16mM。
作为一些优选的实施方式，所述的Ala-Gln单次添加量为终浓度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mM。
作为一类优选的实施方式：
所述的Ala-Gln于细胞接种当天添加，并于第6、8天分别再次添加；进一步地，细胞接种当天添加Ala-Gln 8mM，第6、8天分别添加2mM。
所述的Ala-Gln于细胞接种当天添加，并于第6、8、10、12天分别再次添加；进一步地，细胞接种当天添加加Ala-Gln 8mM，第6、8、10、12天分别添加2mM。
所述表达糖蛋白的细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
优选地，所述的细胞培养选用的培养基以FortiCHO+1g/L P188+0.1g/L DEX作为基础培养基，采用EfficientFeed A、EfficientFeed B、EfficientFeed C、Cell boost1、HYPEP 1511、Glycosylation Adjust作为补料。
优选地，CHO细胞接种密度为0.35±0.15×106cells/mL。
优选地，细胞培养温度为36.5±0.5℃、摇床转速120～130rpm、CO2浓度为5％～8％。
优选地，细胞培养时间为21天。
优选地，所述的抗体表达量用Poros-HPLC检测。
应当明确的是，以上述方法为基础的、以降低糖蛋白中半乳糖修饰比例为目的的所有方法均应在本发明的保护范围之内，例如一种降低半乳糖修饰比例的细胞培养工艺、一种降低半乳糖修饰比例的抗体生产工艺等。
另一方面，本申请提供了一种调节糖蛋白中半乳糖修饰比例的产品、配置品、培养基或添加剂，其特征在于，所述的产品、配置品、培养基或添加剂包含Ala-Gln。
附图说明
图1为在接种当天分别补加4mM和8mM Ala-Gln两种条件下培养的活细胞随时间的密度变化。
图2为在接种当天分别补加4mM和8mM Ala-Gln两种条件下培养的活细胞随时间的活率变化。
图3为在接种当天分别补加4mM和8mM Ala-Gln两种条件下培养的细胞21天后的蛋白表达量。
图4为接种当天补加8mM Ala-Gln，D6和D8分别补加2mM Ala-Gln和接种当天补加8mM Ala-Gln，D6/D8/D10/D12分别补加2mM Ala-Gln两种条件下培养的活细胞随时间的密度变化。
图5为接种当天补加8mM Ala-Gln，D6和D8分别补加2mM Ala-Gln和接种当天补加8mM Ala-Gln，D6/D8/D10/D12分别补加2mM Ala-Gln两种条件下培养的活细胞随时间的活率变化。
图6为接种当天补加8mM Ala-Gln，D6和D8分别补加2mM Ala-Gln和接种当天补加8mM Ala-Gln，D6/D8/D10/D12分别补加2mM Ala-Gln两种条件下培养的细胞21天后的蛋白表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例所选用的试剂和材料来源如下：
FortiCHO：购自Gibco，货号为A11483。
P188：购自SIGMA，货号为K4894。
DEX(DEXTRAN SULFATE SODIUM)：购自SIGMA，货号为31404。
Efficient Feed A：购自Gibco，货号为A14420。
Efficient Feed B：购自Gibco，货号为A12456。
Efficient Feed C：购自Gibco，货号为A13275。
Cell boost 1：购自Hyclone，货号为SH30584。
HYPEP 1511：购自Kerry，货号为5X00062。
Glycosylation Adjust：购自SIGMA，货号为14701C。
CHO细胞(表达地诺单抗Denosumab)：细胞中的表达载体使用Aragen Bioscience公司的Ab-2(轻链)和Ab-11(重链)，所用的表达细胞为CHO DG44(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)。所表达的目标抗体的轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO:1，其一级结构如下：
Figure BDA0002442373510000051
所表达的目标蛋白的重链序列为：SEQ ID NO:2，其一级结构如下：
Figure BDA0002442373510000061
对比例：一种采用单抗培养表达方法
参照下述实施例1，除了不补加Ala-Gln之外，其余步骤均与实施例1相同，检测结果为：
糖型 未补加Ala-Gln
*G0F-GN 0.52
*G0 0
G0F 45.12
Man5 3
G1F[6] 20.31
G1F[3] 19.82
G2F 11.23
半乳糖％ 51.36
岩藻糖％ 97
注：半乳糖％＝G1F[6]+G1F[3]+G2F；岩藻糖％＝G0F-GN+G0F+G1F[6]+G1F[3]+G2F。
实施例1一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
本实施例采用接种当天补加Ala-Gln的方法，具体步骤如下：
(1)以FortiCHO+1g/L P188+0.1g/L DEX作为基础培养基，采用Efficient FeedA、Efficient Feed B、Efficient Feed C、Cell boost 1、HYPEP 1511、GlycosylationAdjust作为补料；
(2)按0.35±0.15×106细胞/mL接种密度将CHO细胞(表达地诺单抗Denosumab)接种在250mL摇瓶中，摇瓶装液量60mL；
(3)细胞培养温度为36.5±0.5℃、摇床转速120-130rpm、CO2浓度为5％-8％；
(4)在接种当天补加4mM Ala-Gln；
(5)培养至21天收获细胞，离心后进行抗体蛋白纯化。
(6)用Poros-HPLC检测抗体表达量和半乳糖修饰比例。
结果如下表所示：
糖型 4mM Ala-Gln
*G0F-GN 0.66
*G0 0
G0F 44.08
Man5 2.4
G1F[6] 18.59
G1F[3] 19.82
G2F 10.33
半乳糖％ 48.74
岩藻糖％ 93.48
注：半乳糖％＝G1F[6]+G1F[3]+G2F；岩藻糖％＝G0F-GN+G0F+G1F[6]+G1F[3]+G2F。
培养21天后的CHO细胞抗体表达量为1.80g/L(图3)，半乳糖修饰比例为48.74％。培养期间，活细胞密度变化如图1，细胞活率变化如图2。
实施例2一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
参考实施例1，其中步骤(4)为在接种当天补加8mM Ala-Gln。
结果如下表：
糖型 8mM Ala-Gln
*G0F-GN 0.95
*G0 0
G0F 60.69
Man5 2.56
G1F[6] 13.15
G1F[3] 15.13
G2F 4.68
半乳糖％ 32.96
岩藻糖％ 94.6
注：半乳糖％＝G1F[6]+G1F[3]+G2F；岩藻糖％＝G0F-GN+G0F+G1F[6]+G1F[3]+G2F。
培养21天后的CHO细胞抗体表达量为2.10g/L(图3)，半乳糖修饰比例为32.96％。培养期间，活细胞密度变化如图1，细胞活率变化如图2。
实施例3一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
参考实施例1，其中步骤(4)为在接种当天补加8mM Ala-Gln，接种后第6天(D6)和第8天(D8)分别补加2mM Ala-Gln。
参照实施例2设置对照组。
结果分析如下表：
糖型 对照 D6/D8各补加2mM Ala-Gln
*G0F-GN 0.95 1.11
*G0 0 0
G0F 60.69 66.1
Man5 2.56 2.96
G1F[6] 13.15 11
G1F[3] 15.13 12.76
G2F 4.68 3.5
半乳糖％ 32.96 27.26
岩藻糖％ 94.6 94.47
注：半乳糖％＝G1F[6]+G1F[3]+G2F；岩藻糖％＝G0F-GN+G0F+G1F[6]+G1F[3]+G2F。
培养21天后的CHO细胞抗体表达量为1.91g/L(图6)，半乳糖修饰比例为27.26％。培养期间，活细胞密度变化如图4，细胞活率变化如图5。
实施例4一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
参考实施例1，其中步骤(4)为在接种当天补加8mM Ala-Gln，并于接种后第6天(D6)、第8天(D8)、第10天(D10)、第12天(D12)分别补加2mM Ala-Gln。
参照实施例2设置对照组。
结果如下表：
Figure BDA0002442373510000081
Figure BDA0002442373510000091
注：半乳糖％＝G1F[6]+G1F[3]+G2F；岩藻糖％＝G0F-GN+G0F+G1F[6]+G1F[3]+G2F。
培养21天后的CHO细胞抗体表达量为1.88g/L(图6)，半乳糖修饰比例为24.91％。培养期间，活细胞密度变化如图4，细胞活率变化如图5。
序列表
<110> 兴盟生物医药（苏州）有限公司
<120> 一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法
<130> 20200326
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (10)

1.一种调节糖蛋白中半乳糖修饰比例的方法，其特征在于，所述的方法为在表达糖蛋白的细胞的培养过程中添加Ala-Gln。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糖蛋白为抗体、酶、融合蛋白或多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白为阿柏西普。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体为EGFR抗体、地诺单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述的Ala-Gln在表达糖蛋白的细胞接种当天添加，和/或在培养中间过程添加。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述的Ala-Gln于表达糖蛋白的细胞接种的第1-15天中的任意一天或几天进行添加。
8.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述的Ala-Gln单次添加量为终浓度1-50mM；优选为4-16mM。
9.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述表达糖蛋白的细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
10.一种调节糖蛋白中半乳糖修饰比例的产品、配置品、培养基或添加剂，其特征在于，所述的产品、配置品、培养基或添加剂包含Ala-Gln。
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CN113549667A (zh) * 2021-07-21 2021-10-26 杭州奕安济世生物药业有限公司 一种降低抗体半乳糖基化的方法

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CN102333872A (zh) * 2009-02-25 2012-01-25 默沙东公司 在糖工程化的酵母巴斯德毕赤酵母中对半乳糖同化途径的代谢工程化

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