CN112779307B - 一种两阶段调节cho表达外源蛋白糖型的方法 - Google Patents

一种两阶段调节cho表达外源蛋白糖型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法，通过第一阶段调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量，并调整一些工艺参数（温度，接种密度）和第二阶段利用DOE实验设计调整酶的辅因子、糖基合成前体等物质的浓度达到调节CHO表达外源蛋白糖型的目的。本发明提供的方法能够在1‑2个月内快速调控目标糖型，对于缩短药物开发时间，满足药物产品质量具有重要意义。

Description

一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法。
背景技术
糖基化是一种常见且重要的蛋白翻译后修饰，糖链的结构及糖型比例对蛋白生物活性，免疫原性、药物代谢动力学、构象、稳定性及溶解度具有重要影响。考虑到糖基化生物合成及哺乳动物细胞培养的的复杂性，在新药及生物仿制药开发中，快速有效的调控特定糖型仍存在一定难度。
目前，调节糖基化生物合成的方法一是通过对宿主细胞进行基因改造使得糖蛋白生物合成的特定的酶功能受到抑制或缺失达到目的。
专利CN106167525A中将至少一种编码靶向FUT8基因和FUT8基因的Exon1区域的编码区的至少一种TALEN（和/或CRISPR/CAS9）的载体同时引入细胞，抑制FUT8的抗体或IgG-Fc融合蛋白的岩藻糖化水平。专利CN110438083A通过锌指核酸酶靶向失活编码甘露糖基（α-1，3-）-糖蛋白β-1，2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ(MgatⅠ)的染色体序列编码区中2bp-220bp，产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组蛋白。
调节糖基化生物合成方法二是通过对细胞培养工艺的优化来调整，涉及到基础补料培养基的筛选，商业化糖型调剂剂筛选及细胞培养参数（转速，溶氧，pH）的优化。
专利CN104974979A公开了一种调控糖基化修饰的方法，其主要通过调整基础、补料培养基的配比及控制补料培养基比例来实现，但因培养基组分较多，培养基配比筛选及补料比例调节并不能做到对单一组分或某几种组分的精准调节，存在一定的局限性。
提供一种精准高效的方法调节细胞培养工艺以调节糖基化生物合成具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，在不涉及细胞株基因改造的前提下，本发明采用两阶段调控方法，1）利用DOE实验设计对平台培养基库中的基础培养基，补料培养基，补料培养基的比例和/或一些工艺参数（温度，接种密度）进行组合筛选，以期筛选到与目标糖型比例最为接近的培养基和/或工艺参数的组合，2）在筛选组合的基础上，利用DOE实验设计对酶的辅因子，糖基合成前体等物质进行浓度的精确筛选，将目标糖型的比例控制在与目标值附近。
一方面，本发明提供了一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法。
所述的方法包括第一阶段和第二阶段。
所述第一阶段为调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量。
具体地，所述的基础培养基为ActiPro、BalanCDCHO Growth A、Dynamis、AdvanceCHO Fed-batch、EmCD CHO 104、CDM4 CHO中的一种或多种；所述的补料培养基为BalanCDCHO Feed 4、Efficient Feed C plus、Cell Boost 7a、Cell Boost7b、EfficientFeed B plus、Advanced CHO Feed1中的一种或多种。
具体地，所述的补料培养基补料总量为初始培养基的25%-45%（w/w)，补料次数为4-12次。
优选地，所述的基础培养基为Dynamis，所述的补料培养基为BalanCDCHO Feed4。进一步优选地，所述的补料总量为初始培养基的35%-40%（w/w)，补料次数为10次，在培养第3-12天每天加入初始培养基的3.5%-4%（w/w)；更进一步地，所述的补料总量为初始培养基的40%（w/w)，补料次数为10次，在培养第3-12天每天加入初始培养基的4%（w/w)。
优选地，所述的基础培养基为Dynamis，所述的补料培养基为Efficient Feed Cplus。进一步优选地，所述的补料总量为初始培养基的42%（w/w)，补料次数为12次，在培养第3-14天每天加入初始培养基的2.5%（w/w)；进一步优选地，所述的补料总量为初始培养基的24%（w/w)，补料次数为4次，分别在基础培养基培养第3，5，7，9天补料，每天补料为初始培养基的6.0%(w/w)。
具体地，所述第一阶段还包括调整工艺参数，所述的工艺参数包括但不限于细胞的接种密度和培养温度。
所述的接种密度为0.6×106-1.0×106 cells/mL，所述的培养温度为32-37℃。
优选地，所述接种密度为0.8×106 cells/mL，所述培养温度为37℃。
所述第二阶段为调整酶的辅因子和/或糖基合成前体等物质的浓度。
所述的酶的辅因子包括但不限于氯化锰。
所述的氯化锰的工作浓度为10-60μM。
所述的糖基合成前体物质包括但不限于尿苷、半乳糖。
所述的尿苷的工作浓度为5-10mM。
所述的半乳糖的工作浓度为10-30mM。
优选地，所述的第二阶段中仅包括调节酶的辅因子氯化锰，工作浓度为20μM。
优选地，所述的第二阶段中包括调节酶的辅因子氯化锰和糖基合成前体物质尿苷，其中氯化锰的工作浓度为40μM，尿苷的工作浓度为10mM。
优选地，所述的第二阶段中包括调节酶的辅因子氯化锰和糖基合成前体物质尿苷、半乳糖，其中氯化锰的工作浓度为20μM，尿苷的工作浓度为7.5mM，半乳糖的工作浓度为20mM。
具体地，所述CHO表达外源蛋白为单克隆抗体或融合蛋白。
进一步具体地，所述的单克隆抗体为IgG1、IgG2或IgG4亚型的抗体，所述单克隆抗体的作用靶点包括ALK-1，Her2，CD20，PD-L1，PD-1；所述的融合蛋白为ScFv-Fc，VHH-Fc，Protein-Fc或Peptide-Fc结构形式的融合蛋白，所述融合蛋白Fc片段类型为IgG1或IgG4。
优选地，所述的单克隆抗体为抗ALK-1的IgG2型单克隆抗体或抗Her2的IgG1型单克隆抗体，所述的融合蛋白为IgG4型的IL10R-Fc融合蛋白
具体地，所述糖型为Man5、半乳糖糖基化和/或非岩藻糖基化。
另一方面，本发明提供了前述方法在CHO细胞表达单克隆抗体或融合蛋白中的应用。
在一些实施例中，所述的CHO细胞表达IgG2型的抗ALK-1的单克隆抗体，优选地培养条件为：基础培养基为Dynamis，细胞接种密度为0.8×106 cells/mL，培养温度为37℃，补料培养基为Feed4，补料总量为初始培养基的40%（w/w)，补料次数为10次，在培养第3-12天每天加入初始培养基的4%（w/w)，并于第5天添加60μM的氯化锰。
在一些实施例中，所述的CHO细胞表达IgG4型的IL10R-Fc融合蛋白，优选地培养条件为：基础培养基为Dynamis，补料培养基为Efficient Feed C plus，补料总量为初始培养基的42%（w/w)，补料次数为12次，在培养第3-14天每天加入初始培养基的2.5%（w/w)，并于第5天添加40μM氯化锰和10mM的尿苷。
在一些实施例中，所述的CHO细胞表达IgG1型的抗Her2单克隆抗体，优选地培养条件为：基础培养基为Dynamis，补料培养基为Efficient Feed C plus，补料总量为初始培养基的24%（w/w)，补料次数为4次，分别在基础培养基培养第3，5，7，9天补料，每天补料为初始培养基的6.0%(w/w)，并于第5天添加氯化锰20μM，尿苷7.5mM，半乳糖20mM。
本发明提供的两阶段糖型调节方法整合了并进一步改进了专利CN104974979A的糖型修饰的方法：其一，扩大了基础和补料培养基的种类，和/或整合了对一些工艺的参数的筛选，其筛选的培养基种类更多，更有可能筛选出糖型差异范围较大的组合，对于筛选具有更大的指导意义；其二，对深刻理解糖生物合成的基础上，组合筛选了酶的辅因子，糖基合成前体等物质的浓度，将目标糖型比例精确调控在相近或更窄的范围内；其三，通过两轮DOE实验设计，能够在1-2个月内快速调控目标糖型，对于缩短药物开发时间，满足药物产品质量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中材料来源信息如下表1：
表1 材料来源信息表
物质类型 名称 供应商 货号
基础培养基 ActiPro Hyclone SH31037.04
基础培养基 CDM4 CHO Hyclone SH30556.02
基础培养基 BalanCD CHO Growth A Irvine 94120
基础培养基 Dynamis Gibco A2617503
基础培养基 Advanced CHOFed-batch Sigma 24366C
基础培养基 EmCD CHO 104 Eminence P10400
补料培养基 Efficient Feed B plus Gibco A2503005
补料培养基 Advanced CHO Feed1 Sigma 24368C
补料培养基 BalanCD CHO Feed 4 Irvine 94134
补料培养基 Efficient Feed C plus Gibco A2503105
补料培养基 Cell boost 7a Hyclone SH31026.05
补料培养基 Cell boost 7b Hyclone SH31027.02CN
试剂 氯化锰 Sigma M8504
试剂 尿苷 Sigma V900421
试剂 半乳糖 Sigma G5388
实施例1 两阶段调节CHO表达单克隆抗体类产品的方法
本实施例中的CHO为ATCCCCL-61细胞株，转染后表达抗ALK-1的IgG2型单克隆抗体，经单细胞分选出来的细胞株C1。
（1）在摇瓶体系中通过对5种基础培养基（ActiPro， Growth A，Dynamis， AdvanceCHO Fed-batch，EmCD CHO 104），补料培养基（Feed 4，Efficient Feed C plus，CellBoost 7a/7b），补料比例（相对于初始培养重量的25%，30%，35%），不同接种密度（0.6×106，0.8×106，1.0×106 cells/mL）和培养温度（32℃，34.5℃，37℃）进行定制化筛选设计，共有60个实验组，筛选得到初步的优选培养条件：Dynamis和Feed4为基础和补料培养基，接种密度为0.8×106 cells/mL，第3天至第12天每天流加3.5% (w/w)初始培养重量的Feed 4补料培养基，培养温度37.0℃，其目标糖型Man5比例为12.33%。
（2）在生物反应器中进一步对Feed 4补料比例（35%，45%），酶的辅因子氯化锰浓度（20μM，60μM）进行筛选设计，共有5个实验组，筛选得到优选的培养条件：Dynamis和Feed4分别为基础培养基和补料培养基，接种密度为0.8×106 cells/mL，第3天至第12天，每天流加4.0% (w/w)初始培养重量的Feed 4补料培养基，培养温度37.0℃，第五天添加60μM的氯化锰，其目标糖型Man5比例降低至2.99%。
将确定的小试工艺放大至200L规模进行目标质量确认，man5比例均控制在3%以下。
实施例2两阶段调节CHO表达单克隆抗体类产品的方法
本实施例中的CHO为ATCCCCL-61细胞株，转染后表达抗ALK-1的IgG2型单克隆抗体，经单细胞分选后出来的细胞株C2。
（1）在摇瓶体系中通过对5种基础培养基（ActiPro， Growth A，Dynamis， AdvanceCHO Fed-batch，EmCD CHO 104），补料培养基（Feed 4，Efficient Feed C plus，CellBoost 7a/7b），补料比例（相对于初始培养重量的25%，30%，35%），不同接种密度（0.6×106，0.8×106，1.0×106 cells/mL）和培养温度（32℃，34.5℃，37℃）进行定制化筛选设计，共有60个实验组，筛选得到初步的优选培养条件：Actipro和Cellboost7a/b为基础和补料培养基，接种密度为0.8×106 cells/mL，第3天至第12天每天流加2.0%/0.2% (w/w)初始培养重量的Cell boost 7a/7b补料培养基，培养温度37.0℃，其目标糖型Man5比例为18.84%。
（2）在摇瓶中进一步酶的辅因子氯化锰浓度（0μM，10μM，20μM），糖生成合成的前体物质尿苷浓度（0，5，10mM）进行筛选设计，共有9个实验组，筛选得到优选的培养条件：Actipro和Cellboost7a/b分别为基础培养基和补料培养基，接种密度为0.8×106 cells/mL，第3天至第12天，每天流加2.0%/0.2% (w/w)初始培养重量的Cell boost 7a/7b补料培养基，培养温度37.0℃，第五天添加20μM的氯化锰，其目标糖型Man5比例降低至2.5%。
实施例3两阶段调节CHO表达融合蛋白产品的方法
本实施例中的CHO来源为ATCC CCL-61细胞株，转染后表达的融合蛋白为IgG4型的IL10R-Fc融合蛋白。
（1）摇瓶体系中通过对基础培养基（ActiPro，Dynamis，CDM4 CHO，Advanced CHOfed-batch），补料培养基(Advanced CHO Feed1,Efficient Feed C plus, EfficientFeed B plus,Cell boost 7a,Cell boost 7b)进行16个实验组的筛选实验，筛选得到初步的优选培养条件：Dynamis和Efficient Feed C plus分别为基础培养基和补料培养基。培养第3天至第14天，每天流加2.5% (w/w)初始培养重量的Efficient Feed C plus4补料培养基，其目标糖型Man5比例为4.53%。
（2）培养第五天对酶的辅因子氯化锰的浓度（0，10，20，40μM）及糖生成合成的一种前体物质尿苷浓度（0，5，10mM）进行12个组合的筛选实验，筛选得到优选的培养条件：Dynamis和Efficient Feed C plus分别为基础培养基和补料培养基，基础培养基培养后第3天至第14天，每天流加2.5% (w/w)初始培养重量的Efficient Feed C plus4补料培养基，第五天添加40μM氯化锰和10mM的尿苷，其Man5比例降低至2.67%。
将确定的小试工艺放大至200L规模进行目标质量确认，man5比例均控制在3%以下。
实施例4两阶段调节CHO表达融合蛋白产品的方法
本实施例中的CHO来源为ATCC CCL-61细胞株，转染后表达的融合蛋白为IgG4型的IL10R-Fc融合蛋白。
（1）摇瓶体系中通过对基础培养基（ActiPro，Dynamis，CDM4 CHO，Advanced CHOfed-batch），补料培养基（Advanced CHO Feed1,Efficient Feed C plus, EfficientFeed B plus,Cell boost 7a,Cell boost 7b）进行16个实验组的筛选实验，筛选得到初步的优选培养条件：ActiPro和Cellboost 7a/7b分别为基础培养基和补料培养基。培养第3，5，7，9，11，13，15天，流加5.0%/0.5% (w/w)初始培养重量的Cellboost 7a/b补料培养基，其目标糖型Man5比例为8.32%。
（2）摇瓶中，在培养第五天对酶的辅因子氯化锰的浓度（0，10，20，40μM）及糖生成合成的一种前体物质尿苷浓度（0，5，10mM）进行12个组合的筛选实验，筛选得到优选的培养条件：ActiPro和Cell boost 7a/7b分别为基础培养基和补料培养基，培养第3，5，7，9，11，13，15天，流加5.0%/0.5% (w/w)初始培养重量的Cellboost 7a/b补料培养基，，第五天添加40μM氯化锰和20mM的尿苷，其Man5比例降低至3.0%。
实施例5两阶段调节CHO表达单克隆抗体产品的方法
本实施例中的CHO为来源于ECACC的CHO-K1，转染后表达抗Her2的IgG1型单克隆抗体，经单细胞分选出来的细胞株C1。
（1）通过对补料培养基（Efficient Feed C plus，cell boost 7a，cell boost7b），补料次数（补料4次，补料5次）和平台糖型调节剂添加量（0，2.67%，5.33%）进行12个实验组的实验筛选，筛选得到初步的优选培养条件：Dynamis和Efficient Feed C plus分别为基础培养基和补料培养基，培养第3，5，7，9天补料四次，流加6.0%(w/w)初始培养重量的Efficient Feed C plus补料培养基，培养第5天添加2.67%初始培养重量的糖型调节剂，其目标糖型Man5比例在6-8%，半乳糖糖基化比例在42-46%左右，非岩藻糖基化比例为10-12%之间。
（2）为了进一步控制各目标糖型的比例，摇瓶体系中对平台糖型调节剂中的三个组分：酶的辅因子氯化锰浓度（10，20，40μM）及糖生成合成的两种前体物质尿苷浓度（5，7.5，10mM）和半乳糖浓度（10，20，30mM）进行18个实验组的响应曲面设计，筛选出3个组分合适的浓度配比，为氯化锰20μM，尿苷7.5mM，半乳糖20mM，该条件下目标糖型Man5比例在3.86%，半乳糖糖基化比例在42.19%，非岩藻糖基化比例为7.07%。
将确定的小试培养工艺放大至15L规模进行目标质量确认，其糖型Man5比例在3.60%，半乳糖糖基化比例在43.20%左右，非岩藻糖基化比例为8.56%。
实施例6两阶段调节CHO表达单克隆抗体产品的方法
本实施例中的CHO为来源于ECACC的CHO-K1，转染后表达抗Her2的IgG1型单克隆抗体，经单细胞分选出来的细胞株C2。
（1）通过对补料培养基（Efficient Feed C plus，cell boost 7a，cell boost7b），补料次数（补料4次，补料5次）和平台糖型调节剂添加量（0，2.67%，5.33%）进行12个实验组的实验筛选，筛选得到初步的优选培养条件：Dynamis和Cellboost 7a/7b分别为基础培养基和补料培养基，培养至第3，5，7，9天补料四次，流加5.0%/0.5%(w/w)初始培养重量的Cell boost 7a/7b补料培养基，培养第5天添加2.67%初始培养重量的糖型调节剂，其目标糖型Man5比例在7-10%，半乳糖糖基化比例在37-43%左右，非岩藻糖基化比例为10-14%之间。
（2）为了进一步控制各目标糖型的比例，摇瓶体系中对平台糖型调节剂中的三个组分：酶的辅因子氯化锰浓度（10，20，40μM）及糖生成合成的两种前体物质尿苷浓度（5，7.5，10mM）和半乳糖浓度（10，20，30mM）进行18个实验组的响应曲面设计，筛选出3个组分合适的浓度配比，为氯化锰40μM，尿苷10mM，半乳糖20mM，该条件下目标糖型Man5比例在3.75%，半乳糖糖基化比例在42.14%，非岩藻糖基化比例为10.09%。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法，其特征在于，
所述CHO表达外源蛋白为抗ALK-1的IgG2型单克隆抗体；
所述方法包括第一阶段和第二阶段；
所述第一阶段为调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量；
所述第二阶段为调整酶的辅因子；
所述基础培养基为Actipro，所述补料培养基为Cell Boost 7a和Cell Boost7b，所述酶的辅因子为氯化锰，所述的氯化锰工作浓度为20μM；
所述糖型为Man5。
2.一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法，其特征在于，
所述CHO表达外源蛋白为IgG4型的IL10R-Fc融合蛋白；
所述方法包括第一阶段和第二阶段；
所述第一阶段为调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量；
所述第二阶段为调整酶的辅因子和糖基合成前体物质的浓度；
所述基础培养基为Dynamis，所述补料培养基的为Efficient Feed C plus，所述酶的辅因子为氯化锰，所述的氯化锰工作浓度为40μM；所述糖基合成前体物质为尿苷，所述的尿苷的工作浓度为10mM；
所述糖型为Man5。
3.一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法，其特征在于，
所述CHO表达外源蛋白为抗Her2的IgG1型单克隆抗体；
所述方法包括第一阶段和第二阶段；
所述第一阶段为调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量；
所述第二阶段为调整酶的辅因子和糖基合成前体物质的浓度；
所述基础培养基为Dynamis，所述补料培养基的为Efficient Feed C plus，所述酶的辅因子为氯化锰，所述的氯化锰工作浓度为40μM，所述糖基合成前体物质为尿苷和半乳糖，所述的尿苷的工作浓度为7.5mM，所述的半乳糖的工作浓度为20mM；
所述糖型为Man5、半乳糖糖基化和非岩藻糖基化。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的补料培养基补料总量为初始培养基重量的25-45％，补料次数为4-12次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，第一阶段还包括调整工艺参数，所述的工艺参数包括细胞的接种密度和培养温度；所述的接种密度为0.6×106-1.0×106cells/mL，所述的培养温度为32-37℃。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在CHO表达单克隆抗体或融合蛋白中的应用。
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