KR20070048185A

KR20070048185A - 당단백질 조성물의 제조법

Info

Publication number: KR20070048185A
Application number: KR1020077002878A
Authority: KR
Inventors: 하루에 니시야; 미츠오 사토; 가츠히로 모리
Original assignee: 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2007-05-08
Also published as: EP1792987A4; JPWO2006013964A1; AU2005268060A1; EP1792987A1; US20060223147A1; WO2006013964A1; CA2576037A1

Abstract

본 발명은 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드의 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법 등을 제공한다.

Description

당단백질 조성물의 제조법{METHOD OF PRODUCING GLYCOPROTEIN COMPOSITION}

본 발명은 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법, 그 세포의 제조에 이용하는 RNA, 그 RNA 에 대응하는 DNA, 그리고 그 DNA 와 그 상보(相補) DNA 를 함유하는 벡터에 관한 것이다. 또, 본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당(糖)사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포, 그리고 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA, 그리고 그 DNA 를 함유하는 벡 터 및 그 벡터가 도입된 세포, 그리고 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터가 도입된 세포, 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 공학 또는 세포 공학적인 기술의 급속한 진보의 결과, 생체내에 미량밖에 존재하지 않는 생리 활성 단백질을 안정, 또한 다량으로 의료 현장에 공급할 수 있게 되어, 많은 환자의 치료가 가능해졌다. 이들 단백질 의약품은 유전자 재조합 의약품 또는 세포 배양 의약품으로서 제조, 판매되고 있다. 이들 단백질 의약품은 그 약리 활성에 당사슬이 관여하지 않는 단순 단백질 의약품과, 그 약리 활성에 당사슬이 중요한 역할을 담당하는 당단백질 의약품으로 분류된다.

약리 활성에, 당사슬이 중요한 역할을 담당하는 당단백질 의약품의 대표적인 예로서 에리트로포이에틴을 들 수 있다. 에리트로포이에틴의 당사슬 구조는 실제로 다양하지만, 3 개의 코어 구조 부분에 푸코오스가 결합한 N-글리코시드 결합 복합형 4 개 사슬 당사슬 및 1 개의 O-글리코시드 결합 당사슬을 갖는 것이 알려져 있다. 에리트로포이에틴의 생체 내에서의 생리 활성에 당사슬 구조는 깊게 관 여하고 있어, O-글리코시드 결합 당사슬을 제거해도 그 생리 활성에 영향을 주지 않지만 (비특허 문헌 1, 2), N-글리코시드 결합 당사슬을 제거하면 약리 활성이 소실된다 (비특허 문헌 3). 또, N-글리코시드 결합 당사슬로의 시알산 부가나 분기 구조 등의 당사슬 구조의 차이가 약리 활성에 영향을 준다 (비특허 문헌 4, 5, 6). 또한, 푸코오스 수식된 당사슬 구조를 갖는 단백질은 일반적으로 혈중 반감기가 짧아지는 것이 나타나 있다 (비특허 문헌 7).

항체에 관해서도, 그 당사슬 구조가 약리 활성에 큰 영향을 주는 것이 알려져 있다.

항체 IgG 분자의 Fc 영역에는, 2 개소의 N-글리코시드형 당사슬 결합 부위가 존재하고 있고, 혈청 중의 IgG 에서는 그 부위에 시알산이나 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민이 부가되는 비율이 적은, 복수의 분기사슬을 갖는 콤플렉스형 당사슬이 결합되어 있다. 이 콤플렉스형 당사슬의 비환원 말단으로의 갈락토오스의 부가 및 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로의 푸코오스의 부가에 관해서는 다양성이 있다 (비특허 문헌 8). 항체 의존성 세포 상해 활성 (이하, ADCC 활성이라고 표기한다) 이나 보체 의존성 세포 상해 활성 (이하, CDC 활성이라고 표기한다) 등의 항체의 이펙터 기능에는, 이 당사슬 구조, 즉 항체 Fc 영역에 결합되어 있는 N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 부가된 푸코오스가 중요한 역할을 담당하고 있다 (특허 문헌 1, 2, 비특허 문헌 9, 10).

의약으로의 응용이 생각되고 있는 당단백질의 대부분은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작되고, 동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포 등을 숙주 세포로서 이용하여 제조되고 있다. 그러나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작된 당단백질의 당사슬 구조는 숙주 세포에 따라 상이하므로 (비특허 문헌 10, 11), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작된 당단백질에는, 반드시 최적의 약리 활성을 발휘할 수 있는 당사슬이 부가되어 있지 않다.

세포의 당사슬의 수식과 관계되는 효소의 활성을 조절하고, 생산되는 당단백질의 당사슬 구조를 개변하는 하나의 방법으로서, 당사슬의 수식과 관계되는 효소의 저해제를 응용하는 것이 시도되고 있다. 그러나, 이들 저해제의 특이성은 낮고, 또 표적으로 하는 효소를 충분히 저해하는 것도 어려우므로, 생산 항체의 당사슬 구조를 확실하게 제어하는 것은 곤란하다.

또, 당사슬의 수식과 관계되는 효소 유전자를 도입함으로써, 생산되는 당단백질의 당사슬 구조를 개변하는 것도 시도되고 있다 (비특허 문헌 12, 비특허 문헌 13). β1,4-N-아세틸글루코사민 전이 효소 Ⅲ (GnTⅢ) 을 도입한 CHO 세포를 이용하여 항체를 발현시킨 경우에는, 친주로 발현시킨 항체와 비교하여 16 배 높은 ADCC 활성을 나타냈다 (비특허 문헌 11, 특허 문헌 3). 그러나, GnTⅢ 또는 β1,4-N-아세틸글루코사민 전이 효소 Ⅴ (GnTⅤ) 의 과잉 발현은 CHO 세포에 대해서 독성을 나타내는 것으로 보고되어 있기 때문에, 이러한 숙주 세포는 항체 의약의 생산에는 적절하지 않다.

당사슬의 수식과 관계되는 효소 유전자의 활성이 변화된 돌연 변이체를 숙주 세포로서 이용함으로써, 생산되는 당사슬 구조가 변화된 당단백질의 생산예도 보고되어 있다. 당사슬의 수식과 관계되는 효소의 활성이 변화된 돌연 변이체는, 예를 들어 WGA (T.vulgaris 유래의 wheat-germ agglutinin), ConA (C.ensiformis 유래의 concanavalin A), RIC (R.communis 유래의 독소), L-PHA (P.vulgaris 유래의 leukoagglutinin), LCA (L.culinaris 유래의 lentil agglutinin), PSA (P.sativum 유래의 Pea lectin) 등의 렉틴에 내성을 나타내는 주 (株) 로서 취득되어 있다 (비특허 문헌 14). 이러한 당사슬의 수식과 관계되는 효소의 활성이 변화된 돌연 변이체를 숙주 세포로서 이용함으로써, 생산되는 당사슬 구조가 변화된 당단백질이 생산되는 것도 보고되어 있고, 예를 들어 N-아세틸글루코사민 전이 효소 Ⅰ (GnTⅠ) 의 활성이 결손되어 있는 CHO 세포 변이주를 이용하여 하이만노오스형 당사슬 구조를 갖는 항체가 생산되는 것이 보고되어 있다 (비특허 문헌 15). 또, CMP-시알산 트랜스포터나 UDP-갈락토오스 트랜스포터의 결손주를 이용하여, 당사슬 비환원 말단측에 시알산이 부가되어 있지 않은 당사슬 구조를 갖는 항체의 발현이나, 갈락토오스의 부가가 없는 항체의 발현예가 보고되어 있지만, 의약으로의 응용에 적합하도록 이펙터 작용을 향상시킨 항체의 발현에는 성공하지 못했다 (비특허 문헌 15).

이러한 가운데, 최근, 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 de novo 합성 경로에 있어서, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소인 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 (이하, GMD 등이라고도 표기한다) 의 활성이 저하된 주를 숙주 세포로서 이용함으로써, ADCC 활성이 높은, 의약 응용에 적합한 항체를 생산할 수 있는 것이 보고되었다 (특허 문헌 1, 비특허 문헌 9, 비특허 문헌 10). 이들 보고에서는, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 나타내는 주, 예를 들어 AAL (Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 에 내성을 나타내는 CHO-AAL 주, LCA (L.culinaris 유래의 lentil agglutinin) 에 내성을 나타내는 CHO-LCA 주 또는 Lec13 주가 숙주 세포로서 이용되었다. 또, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 활성이 저하된 주로는, 이 외에도, 마우스 백혈병 유래의 세포주 BW5147 의 PSA (P.sativum 유래의 Pea lectin) 내성 변이주로서 수립된 PL^R1.3 이 알려져 있다 (비특허 문헌 16).

그러나, 상기 주는 완전한 유전자 결손체는 아니므로, 항체가 높은 ADCC 활성을 나타내는 원인이 되고 있는 당사슬 구조, 즉 N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로의 푸코오스의 부가를 완전하게 억제할 수는 없다. 또, PL^R1.3 이나 Lec13 주 등의 변이주는 변이제 처리에 의해 랜덤하게 변이를 도입함으로써 취득되고 있어, 의약품 제조에 이용하는 주로는 적합하지 않다.

이상과 같이, 생산되는 당단백질의 당사슬 구조를 개변하기 위해, 숙주 세포의 당사슬의 수식과 관계되는 효소나 단백질의 활성을 제어하는 시도가 행해지고 있지만, 당사슬의 수식 기구는 다양하고 또한 복잡하며, 또 당사슬이 갖는 생리적인 역할의 해명도 충분하다고는 하기 어려우므로 시행 착오를 반복하고 있는 것이 현재의 상황이다. 특히, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하된 세포주가 취득되고, 이펙터 활성이 높은 항체 조성물이 제조되었다고는 해도, 그 활성의 제어는 아직 불충분하다.

간편한, 숙주 세포의 당사슬의 수식과 관계되는 효소나 단백질의 활성을 제어하는 시도의 일례로서, siRNA (small interfering RNA) 를 이용하는, 특정 유전자의 기능 제어 방법이 알려져 있다 (특허 문헌 4). 또, 유전자의 기능 억제에 이용하는 RNA 분자의 설계 방법이 보고되어 있지만 (비특허 문헌 17), 이러한 방법으로 설계한 RNA 분자가 반드시 목적 유전자의 기능을 효과적으로 억제할 수 있는 분자는 되지 않고 (비특허 문헌 18), 특정 유전자에 대한 효과적인 기능 억제 효과를 나타내는 RNA 분자의 설계는 시행 착오를 수반한다.

또, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포를 이용함으로써, 생성 당단백질에 부가하는 당사슬로의 푸코오스 수식을 제어할 수 있는 것이 나타났다 (특허 문헌 2, 4). 이 보고에서는, 항체 분자를 생산하는 세포주에 α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 RNA 를 도입함으로써, 생성 항체 분자에 부가하는 당사슬 중 푸코오스 수식이 없는 당사슬의 비율을 높일 수 있는 것이 나타나 있다.

특허 문헌 1 : WO00/61739

특허 문헌 2 : WO02/31140

특허 문헌 3 : WO99/54342

특허 문헌 4 : WO03/85118

비특허 문헌 1 : Biochemistry, 31, 9872 (1992)

비특허 문헌 2 : J.Biol.Chem., 267, 7703 (1992)

비특허 문헌 3 : J.Biol.Chem., 265, 12127 (1990)

비특허 문헌 4 : Blood, 73, 84 (1989)

비특허 문헌 5 : Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86, 7819 (1989)

비특허 문헌 6 : British J.Cancer, 84, 3 (2001)

비특허 문헌 7 : Science, 295, 1898 (2002)

비특허 문헌 8 : Biochemistry, 36, 130, 1997

비특허 문헌 9 : J.Biol.Chem., 277, 26733 (2002)

비특허 문헌 10 : J.Biol.Chem., 278, 3466 (2003)

비특허 문헌 11 : Glycobiology, 5, 813 (1995)

비특허 문헌 12 : J.Biol.Chem., 261, 13848 (1989)

비특허 문헌 13 : Science, 252, 1668 (1991)

비특허 문헌 14 : Somatic cell Mol.Genet., 12, 51 (1986)

비특허 문헌 15 : J.Immunol., 160, 3393 (1998)

비특허 문헌 16 : J.Biol.Chem., 255, 9900 (1980)

비특허 문헌 17 : Nature Biotech., 22, 326 (2004)

비특허 문헌 18 : Current Opinion in Molecular Therapeutics, 6, 129 (2004)

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법, 그 세포의 제조에 이용하는 RNA, 그 RNA 에 대응하는 DNA, 그리고 그 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터를 제공하는 것이다. 또, 본 발명의 목적은, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포, 그리고 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA, 그리고 그 DNA 를 함유하는 벡터 및 그 벡터가 도입된 세포, 그리고 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터가 도입된 세포, 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은 이하의 (1)∼(71) 에 관한 것이다.

(1) 이하의 (a) 또는 (b) 에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 를 세포내에 도입한 세포 ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.

(2) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 탈수 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 (1) 에 기재된 세포.

(3) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (2) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(4) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (2) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.

(5) 이하의 (a) 또는 (b) 에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA.

(6) (5) 에 기재된 RNA 에 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA.

(7) (5) 에 기재된 RNA 에 대응하는 DNA 를 함유하는 벡터.

(8) (7) 에 기재된 벡터를 세포에 도입한 세포.

(9) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체 (Golgi body) 로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포.

(10) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포.

(11) 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소인 (9) 또는 (10) 에 기재된 세포.

(12) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 (9)∼(11) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(13) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (12) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(e) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(g) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(h) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(14) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (12) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(e) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(j) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(k) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(l) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.

(15) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (9)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.

(16) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (9)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.

(17) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 (11)∼(16) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(18) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (17) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(19) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (17) 에 기재된 세포 ;

(20) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (11)∼(19) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.

(21) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (11)∼(19) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.

(22) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA.

(23) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA.

(24) 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소인 (22) 또는 (23) 에 기재된 DNA.

(25) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 (22)∼(24) 중 어느 한 항에 기재된 DNA.

(26) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (25) 에 기재된 DNA ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(27) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (25) 에 기재된 DNA ;

(28) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 (22)∼(27) 중 어느 한 항에 기재된 DNA ;

(29) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 (22)∼(27) 중 어느 한 항에 기재된 DNA ;

(b) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.

(30) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 (24)∼(29) 중 어느 한 항에 기재된 DNA.

(31) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (30) 에 기재된 DNA ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(32) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (30) 에 기재된 DNA ;

(33) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 (24)∼(32) 중 어느 한 항에 기재된 DNA ;

(34) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 (24)∼(32) 중 어느 한 항에 기재된 DNA ;

(35) (22)∼(34) 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 함유하는 벡터.

(36) 서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 (35) 에 기재된 벡터.

(37) 서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 (35) 에 기재된 벡터.

(38) 서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 (35) 에 기재된 벡터.

(39) 서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 (35) 에 기재된 벡터.

(40) (35)∼(39) 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 도입한 세포.

(41) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터를 도입한 세포.

(42) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터를 도입한 세포.

(43) 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 가 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 인 (41) 또는 (42) 에 기재된 세포.

(44) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 (41)∼(43) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(45) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (44) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(46) α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (44) 에 기재된 세포 ;

(47) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (41)∼(46) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(48) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (41)∼(46) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(49) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 (43)∼(48) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(50) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 (49) 에 기재된 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(51) GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 (49) 에 기재된 세포 ;

(52) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (43)∼(51) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(53) GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 (43)∼(51) 중 어느 한 항에 기재된 세포 ;

(54) 세포가, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 세포인 (1)∼(4), (8)∼(21) 및 (40)∼(53) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(55) 렉틴이, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 렉틴인 (54) 에 기재된 세포 ;

(a) 렌즈콩 렉틴 LCA (Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin) ;

(b) 완두콩 렉틴 PSA (Pisumsativum 유래의 Pea Lectin) ;

(c) 잠두콩 렉틴 VFA (Viciafaba 유래의 Agglutinin) ;

(d) 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuria aurantia 유래의 Lectin).

(56) 세포가, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 (1)∼(4), (8)∼(21) 및 (40)∼(55) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(57) 동물 세포가, 이하의 (a)∼(k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 (56) 에 기재된 세포 ;

(a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포 ;

(b) 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 ;

(c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포 ;

(d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포 ;

(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포 ;

(f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 ;

(g) 인간 백혈병 세포주 나마르바 세포 ;

(h) 인간 백혈병 세포주 NM-F9 세포 ;

(i) 인간 배아 망막 세포주 PER.C6 세포 ;

(j) 배아 줄기 세포 ;

(k) 수정란 세포.

(58) 당단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 (1)∼(4), (8)∼(21) 및 (40)∼(57) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(59) 당단백질이 항체 분자인 (58) 에 기재된 세포.

(60) 항체 분자가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 (59) 에 기재된 세포 ;

(a) 인간 항체 ;

(b) 인간화 항체 ;

(c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편 ;

(d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.

(61) 항체 분자의 클래스가 IgG 인 (59) 또는 (60) 에 기재된 세포.

(62) (58) 에 기재된 세포를 사용하는 당단백질 조성물의 제조 방법.

(63) (58) 에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 당단백질 조성물을 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 당단백질 조성물을 채취 정제하는 공정을 포함하는 당단백질 조성물의 제조 방법.

(64) (59)∼(61) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물의 제조 방법.

(65) (59)∼(61) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 항체 조성물을 채취 정제하는 공정을 포함하는 항체 조성물의 제조 방법.

(66) 항체 조성물이, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 상해 활성이 높은 항체 조성물인 (64) 또는 (65) 에 기재된 방법.

(67) 항체 의존성 세포 상해 활성이 높은 항체 조성물이, 그 항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬의 비율이, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 높은 것을 특징으로 하는 (66) 에 기재된 방법.

(68) 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬이, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당사슬인 (67) 에 기재된 방법.

(69) (62) 또는 (63) 에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 당단백질 조성물.

(70) (64)∼(68) 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 항체 조성물.

(71) (69) 또는 (70) 에 기재된 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.

발명의 효과

본 발명에 의하면, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법, 그 세포의 제조에 이용하는 RNA, 그 RNA 에 대응하는 DNA, 그리고 그 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터가 제공된다. 또, 본 발명에 의하면, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포, 그리고 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명에 의하면, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA, 그리고 그 DNA 를 함유하는 벡터 및 그 벡터가 도입된 세포, 그리고 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터가 도입된 세포, 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본원은 2004 년 8 월 5 일에 출원된 일본 특허출원 2004-228928호, 2004 년 8 월 31 일에 출원된 일본 특허출원 2004-252682호 및 2005 년 5 월 9 일에 출원된 일본 특허출원 2005-136410호의 우선권을 주장하는 것으로, 당해 특허 출원의 명세서 및 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1 은, 플라스미드 pBS-U6term 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 2 는, 플라스미드 pPUR-U6term 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 3 은, 플라스미드 pPUR/GMDshB 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 4 는, 각 세포주에 있어서의 GMD 의 mRNA 량을 나타낸 도면이다. 횡축에는 GMD mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대해 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 한 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 나타냈다. 도면 중 검게 칠한 바는 siRNA 를 도입하고 있지 않은 친주 세포를, 백색 바는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 단독으로 도입하여 얻어진 세포주를 각각 나타낸다.

도 5 는, CHO/DG44 세포 유래 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12AF 주, 그리고 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주인 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주의, 무혈청 페드 배치 배양 중의 생세포 밀도의 변화를 나타낸 도면이다. 횡축에는 배양 일수를, 종축에는 생세포 밀도를 각각 나타냈다. 도면 중 ▲ 는 32-05-12AF 주를, ○ 는 12-GMDB-2AF 주를, ● 는 12-GMDB-5 주를 각각 나타낸다.

도 6 은, CHO/DG44 세포 유래 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12AF 주, 그리고 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주인 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주의, 무혈청 페드 배치 배양 중의, 배양 상청 중에 축적된 항체량의 변화를 나타낸 도면이다. 횡축에는 배양 일수를, 종축에는 항체 축적량을 각각 나타냈다. 도면 중 ▲ 는 32-05-12AF 주를, ○ 는 12-GMDB-2AF 주를, ● 는 12-GMDB-5 주를 각각 나타낸다.

도 7 은, 플라스미드 FUT8shRNA/lib2B/pPUR 및 FUT8shRNA/lib3/pPUR 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 8 은, 플라스미드 FT8libB/pBS 및 FT8lib3/pBS 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 9 는, 플라스미드 FT8libB/pAGE 및 FT8lib3/pAGE 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 10 은, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 단독으로 도입하여 얻어진 각 세포주 또는 친주 세포에 있어서의, GMD 의 mRNA 량을 나타낸 도면이다. 횡축에는 GMD mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대해 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 한 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 나타냈다. 도면 중 검게 칠한 바는 siRNA 를 도입하고 있지 않은 친주 세포를, 백색 바는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 단독으로 도입하여 얻어진 세포주를 각각 나타낸다.

도 11 은, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 단독으로 도입하여 얻어진 각 세포주 또는 친주 세포에 있어서의, FUT8 의 mRNA 량을 나타낸 도면이다. 횡축에는 FUT8 mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대해 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 한 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 나타냈다. 도면 중 검게 칠한 바는 siRNA 를 도입하고 있지 않은 친주 세포를, 백색 바는 CMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 단독으로 도입하여 얻어진 세포주를 각각 나타낸다.

도 12 는, CHO/DG44 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12AF 주, 그리고 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주인 Wi23-5AF 주의, 무혈청 페드 배치 배양 중의 생세포 밀도의 변화를 나타낸 도면이다. 횡축에는 배양 일수를, 종축에는 생세포 밀도를 각각 나타내었다. 도면 중 점선은 32-05-12AF 주를, 실선은 Wi23-5AF 주를 각각 나타낸다.

도 13 은, CHO/DG44 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12AF 주, 그리고 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주인 Wi23-5AF 주의, 무혈청 페드 배치 배양 중의, 배양 상청 중에 축적된 항체량의 변화를 나타낸 도면이다. 횡축에는 배양 일수를, 종축에는 항체 축적량을 각각 나타내었다. 도면 중 점선은 32-05-12AF 주를, 실선은 Wi23-5AF 주를 각각 나타낸다.

도 14 는, 항 CCR4 키메라 항체의 푸코오스(-)% 를 알고 있는 표준품 샘플의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다. 횡축에는 푸코오스(-)% 를, 종축에는 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 나타내는 파장 490㎚ 에 있어서의 흡광도를 각각 나타내었다.

도 15 는, CHO/DG44 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12AF 주, 그리고 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡 터를 도입한 렉틴 내성주인 Wi23-5AF 주의, 무혈청 페드 배치 배양 중의, 배양 상청에 포함되는 항 CCR4 키메라 항체의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성으로부터 산출되는 푸코오스(-)% 를 각각 나타낸 도면이다. 횡축에는 배양 일수를, 종축에는 푸코오스(-)% 를 각각 나타내었다. 도면 중 점선은 32-05-12AF 주를, 실선은 Wi23-5AF 주를 각각 나타낸다.

도 16 은, 플라스미드 pCR/GMDshB 및 pCR/GMDmB 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 17 은, 플라스미드 FT8libB_GMDB/pAGE, FT8lib3_GMDB/pAGE, FT8libB_GMDmB/pAGE 및 FT8lib3_GMDmB/pAGE 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 18 은, CHO/DC44 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12 주에, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주주에 있어서의, GMD mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, GMD mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 했을 경우의 GMD mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

도 19 는, CHO/DG44 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 32-05-12 주에, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주에 있어서의, FUT8 mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, FUT8 mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인32-05-12 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 각각 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 32-05-12 주의 값을 100 으로 했을 경우의 FUT8 mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

도 20 은, 플라스미드 pPUR/GMDmB 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 21 은, SP2/0 세포 유래의 항 GM₂ 항체 생산주인 KM968 주에, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터을 도입하여 얻어진 각 세포주에 있어서의, GMD mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, GMD mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인 KM968 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 각각 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 KM968 주의 값을 100 으로 했을 경우의 GMD mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

도 22 는, SP2/0 세포 유래의 항 GM₂ 항체 생산주인 KM968 주에 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주에 있어서의, FUT8 mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, FUT8 mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인 KM968 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 각각 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 KM968 주의 값을 100 으로 했을 경우의 FUT8 mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

도 23 은, NS0 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 NS0/2160 주에, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주에 있어서의, GMD mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, GMD mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인 NS0/2160 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 각각 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 NS0/2160 주의 값을 100 으로 했을 경우의 GMD mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

도 24 는, NS0 세포 유래의 항 CCR4 항체 생산주인 NS0/2160 주에, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주에 있어서의, FUT8 mRNA 의 상대적 발현량을 나타낸 도면이다. 횡축에는, FUT8 mRNA 량의 β-액틴 mRNA 에 대한 비율에 대하여 친주인 NS0/2160 주의 값을 100 으로 했을 경우의 상대치를, 종축에는 각 세포주를 각각 나타내었다. 도면 중 검정색 막대기는 친주의, 흰색 막대기는 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입하여 얻어진 각 세포주의, 친주인 NS0/2160 주의 값을 100 으로 했을 경우의 FUT8 mRNA 량의 상대치를 각각 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 있어서, 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 (이하, GDP-푸코오스 합성 효소라고도 표기한다) 로서는, 세포내에서 당사슬에의 푸코오스의 공급원인 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함한다. 또한, 본 발명의 GDP-푸코오스 합성 효소에는, 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 영향을 주는 효소 등도 포함된다.

세포내 GDP-푸코오스는, de novo 의 합성 경로 혹은 Salvage 합성 경로에 의해 공급되고 있다. 따라서, 이들 합성 경로에 관여하는 효소 또는 단백질은 모두, GDP-푸코오스 합성 효소에 포함된다.

de novo 의 합성 경로에 관여하는 GDP-푸코오스 합성 효소로서는, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소, GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스를 GDP-푸코오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소 등을 들 수 있다.

본 발명의 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소로서는, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 탈수 반응을 촉매하는 효소가 바람직하게 사용된다. GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 탈수 반응을 촉매하는 효소로서는, 구체적으로는, GDP-mannose 4,6-dehydratase (GDP-만노오스 4,6-데히드라타제) 를 들 수 있다.

본 발명의 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스를 GDP-푸코오스로 변환하는 반 응을 촉매하는 효소로서는, GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-푸코오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소, GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-푸코오스의 4 위치를 환원하는 반응을 촉매하는 효소 등을 들 수 있고, 구체적으로는, GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-푸코오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소 활성을 갖고, 또한, GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-푸코오스의 4 위치를 환원하는 반응을 촉매하는 효소인, GDP-keto-6-deoxymannose3,5-epimerase,4-reductase (GDP-케토데옥시만노오스 3,5-에피머라제,4-리덕타제) 등을 들 수 있다.

Salvage 합성 경로에 관여하는 GDP-푸코오스 합성 효소로서는, GDP-beta-L-fucosepyrophosphorylase (GDP-베타-L-푸코오스피로포스포리라제), Fucokinase (푸코키나제) 등을 들 수 있다.

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 영향을 주는 효소로서는, 상기 기술한 GDP-푸코오스 합성 효소의 활성에 영향을 주거나, 그 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.

본 발명의 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질로서는, 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질이면 어떠한 단백질도 포함되고, 구체적으로는, GDP-푸코오스트랜스포터 등을 들 수 있다.

본 발명의 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포란, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소 (이하, 「GDP-만노오스 변환 효소」라고도 표기한다) 의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 가 도입된 세포이면, 어떠한 세포도 포함된다.

본 발명에 있어서, GDP-만노오스 변환 효소로서는, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가 바람직하게 사용된다.

본 발명에 있어서, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제로서는, 하기 (a)∼(f) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 하기 (g)∼(o) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(j) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질

(k) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질

(l) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질

(m) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질

(n) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질

(o) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.

또한, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로서는, 서열 번호 8∼10 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 8∼10 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포에 관한 것이다.

본 발명의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포란, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소 (이하, 「α1,6-푸코오스 수식 효소」라고도 표기한다) 의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 가 도입된 세포이면, 어떠한 세포도 포함되고, 바람직하게는 α1,6-푸코오스 수식 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 가 도입된 세포를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는, α1,6-푸코오스 수식 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA, 및 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소 (GDP-만노오스 변환 효소) 의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 가 도입된 세포를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, α1,6-푸코오스 수식 효소란, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다.

α1,6-푸코오스 수식 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스페라아제나 α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.

α1,6-푸코실트랜스페라아제로서는, 하기 (a)∼(h) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 하기 (i)∼(t) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(e) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(f) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(g) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(h) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA

(i) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(j) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(k) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(l) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(m) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(n) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸 코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(o) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(p) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(q) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(r) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(s) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질

(t) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.

또한, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로서는, 서열 번호 1∼4 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 1∼4 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브 리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 란, 예를 들어 서열 번호 1∼4 중 어느 하나 또는 8∼10 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등의 DNA 또는 그 일부의 단편을 프로브로 하고, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법 혹은 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 이용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는, 콜로니 혹은 플라크 유래의 DNA 를 고정화한 필터를 이용하여, 0.7∼1mmol/L 의 염화 나트륨 존재하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1∼2배 농도의 SSC 용액 (1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/L 염화 나트륨, 15mmol 구연산나트륨으로 이루어진다) 을 이용하여, 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (이하, Molecular Cloning Second Edition 이라 약칭), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (이하, Current Protocols in Molecular Biology 이라 약칭), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준해 실시할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA 로서 구체적으로는, 서열 번호 1∼4 중 어느 하나 또는 8∼10 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하 게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 5∼7 및 84 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 또는 서열 번호 11∼13 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질이란, Molecular Cloning Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 79, 6409(1982), Gene, 34,315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc.Natl.Acad.Sci USA, 82, 488(1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 예를 들어, 서열 번호 5∼7 및 84 중 어느 하나, 또는 서열 번호 11∼13 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있는 단백질을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1 개 이상이며 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기의 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 치환 혹은 부가할 수 있는 정도의 수이고, 예를 들어, 1∼수십개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개이다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 11∼13 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서 열과 80% 이상의 상동성을 갖고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질이란, 서열 번호 11∼13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질이다.

또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 5∼7 및 84 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질이란, 서열 번호 5∼7 및 84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질이다.

본 발명에 기재되는 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치이면 되지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST 〔J.Mol.Biol., 215, 403(1990)〕에 있어서 디폴트 패러미터를 이용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2〔Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997) ; Genome Res., 7, 649(1997) ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html〕에 있어서 디폴트 패러미터를 이용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.

디폴트 패러미터로서는, G (Cost to open gap) 가 염기 서열의 경우는 5, 아 미노산 서열의 경우는 11, -E (Cost to extend gap) 이 염기 서열의 경우는 2, 아미노산 서열의 경우는 1, -q (Penalty for nucleotide mismatch) 가 -3, -r (reward for nucleotide match) 가 1, -e (expect value) 가 10, -W (wordsize) 가 염기 서열의 경우는 11잔기, 아미노산 서열의 경우는 3잔기, -y (Dropoff(X) for blast extensions in bits) 가 blastn 의 경우는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X (X dropoff value for gapped alignment in bits) 가 15 및 -Z (final X dropoff value for gapped aligllment in bits) 가 blastn 의 경우는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25 이다 (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html). 또한, 아미노산 서열의 해석 소프트로서는 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63(1990)〕등도 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세포로서는, 항체 분자 등의 당단백질을 발현할 수 있는 세포이면 어떠한 세포여도 되지만, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 동물 세포를 들 수 있다. 동물 세포의 바람직한 구체예로서는, 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래의 CHO 세포, 래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 마우스 미엘로마 세포주 NS0 세포, 마우스 미엘로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래의 BHK 세포, 항체를 생성 하는 하이브리도마 세포, 인간 백혈병 세포주 나마르바 세포, 배아 간세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포, 혹은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글리코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 (이하, 양자를 통합하여 본 발명의 세포라고도 칭한다) 는, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는다. 그 RNA 를 도입하고 있지 않는 친주 세포는 그 렉틴에 내성을 갖지 않다.

따라서, 본 발명의 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등의 당단백질 조성물을 제조할 수 있는 세포로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 세포를 들 수 있고, 구체적으로는, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는, 하이브리도마 세포, 인간 항체 및 인간화 항체를 제조하기 위한 숙주 세포, 인간 항체를 생산하기 위한 트랜스제닉 비인간 동물을 제조하는 배아 간세포 및 수정란 세포, 인간 항체를 생산하기 위한 트랜스제닉 식물을 제조하는 식물 칼루스 세포, 미엘로마 세포, 트랜스제닉 비인간 동물 유래의 세포 등을 들 수 있다. 미엘로마 세포는 하이브리도마 세포를 제조할 때에 융합 세포로서 이용할 수 있다. 또한, 트랜 스제닉 비인간 동물에 항원을 면역하고 그 동물의 비장 세포 등의 항체 생성 세포를 이용하여 하이브리도마 세포를 제조할 수도 있다.

렉틴에 내성을 갖는 세포란, 배양 배지에 렉틴을 유효 농도 부여하여 세포 배양을 실시했을 때에도, 생육이 저해되지 않는 세포를 말한다.

본 발명에 있어서, 생육이 저해되지 않는 렉틴 유효 농도는, 친주 세포에 이용하는 세포주에 따라 적절히 정하면 되지만, 통상 10㎍/㎖∼10㎎/㎖, 바람직하게는 0.5∼2.0㎎/㎖ 이다. 친주 세포에 GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입했을 경우, 혹은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입했을 경우의 렉틴의 유효 농도란, 그 친주 세포를 정상적으로 생육할 수 없는 농도 이상이며, 바람직하게는 친주 세포를 정상적으로 생육할 수 없는 농도와 동일 농도, 보다 바람직하게는 2∼5배, 더욱 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 20배 이상의 농도를 말한다.

친주 세포란, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입하기 전의 세포, 혹은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입하기 전의 세포를 말한다.

친주 세포로서는, 특별히 한정은 없지만, 구체예로서 이하에 나타내는 세포를 들 수 있다.

NS0 세포의 친주 세포로서는, BIO/TECHNOLOGY, 10, 169(1992), Biotechnol.Bioeng., 73, 261(2001) 등의 문헌에 기재되어 있는 NS0 세포를 들 수 있다. 또한, 이화학 연구소 세포 개발 은행에 등록되어 있는 NS0 세포주 (RCB0213), 혹은 이들 주를 생육 가능한 여러가지 배지에 순화시킨 아주(亞株) 등도 들 수 있다.

SP2/0-Ag14 세포의 친주 세포로서는, J.Immunol., 126, 317(1981), Nature, 276, 269(1978), Human Antibodies and Hybridomas, 3, 129(1992) 등의 문헌에 기재되어 있는 SP2/0-Ag14 세포를 들 수 있다. 또한, ATCC 에 등록되어 있는 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL-1581) 혹은 이들 주식을 생육 가능한 여러가지 배지에 순화시킨 아주 (ATCC CRL-1581.1) 등도 들 수 있다.

차이니즈 햄스터 난소 조직 유래의 CHO 세포의 친주 세포로서는, Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 60, 1275(1968), Genetics, 55, 513(1968), Chromosoma, 41, 129(1973), Methods in Cell Science, 18, 115(1996), Radiation Research, 148, 260(1997), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 4216(1980), Proc.Natl.Acad.Sci., 60, 1275(1968), Cell, 6, 121(1975), Molecular Cell Genetics, Appendix Ⅰ, Ⅱ(p883-900) 등의 문헌에 기재되어 있는 CHO 세포 등을 들 수 있다. 또한, ATCC 에 등록되어 있는 CHO-K1 주 (ATCC CCL-61), DUXB11주 (ATCC CRL-9096), Pro-5 주 (ATCC CRL-1781) 나, 시판되는 CHO-S 주 (Lifetechnologies 사 Cat#11619), 혹은 이들 주식을 생육 가능한 여러가지 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포의 친주 세포로서는, Y3/Ag1.2.3 세포 (ATCC CRL-1631) 로부터 수립된 주화 세포가 포함된다. 그 구체적인 예로서는, J.Cell.Biol., 93, 576(1982), Methods Enzymol., 73B, 1(1981) 등의 문헌에 기재되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포를 들 수 있다. 또한, ATCC 에 등록되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 (ATCC CRL-1662) 혹은 이들 주를 생육 가능한 여러가지 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

상기 이외에도, 본 발명에 사용되는 친주 세포로서는, 인간 백혈병 세포주 NM-F9 세포 (DSM ACC2605, WO05/17130) 또는 인간 배아 망막 세포주 PER.C6 세포 (ECACC No.96022940, US6855544), 혹은 이들 주를 생육 가능한 여러가지 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴으로서는, 그 당사슬 구조를 인식할 수 있는 렉틴이면, 어느 렉틴도 포함된다. 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA (LensCulinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA (Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 누에콩 렉틴 VFA (Vicia faba 유래의 Agglutinin), 비색 차왕버섯 렉틴 AAL (Aleuriaaurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 로서는, RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되고, 또한 α1,6-푸코오스 수식 효소의 mRNA 량을 감소시키는 것이 가능한 2 개 사슬 RNA 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 mRNA 량 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 mRNA 량을 감소시키는 것이 가능한 2 개 사슬 RNA 이면 어떠한 것이어도 되지만, RNA 의 길이로서는, 10∼40, 바람직하게는 10∼30, 보다 바람직하게는 15∼30 의 연속한 RNA 를 들 수 있다.

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 로서는, 바람직하게는 GDP-만노오스 변환 효소의 mRNA 량을 감소시키는 것이 가능한 RNA 를 들 수 있고, 구체적으로는,

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

를 들 수 있고, 보다 바람직하게는,

(1) 서열 번호 37 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(2) 서열 번호 37 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(3) 서열 번호 57 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(4) 서열번편 57 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(5) 서열 번호 58 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(6) 서열 번호 58 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA 를 들 수 있다.

상기 (a)∼(c) 및 (1)∼(6) 의 RNA 에 있어서, (a), (1) 및 (2) 는 햄스터 유래의 친주 세포에 있어서, (b), (3) 및 (4) 는 인간 유래의 친주 세포에 있어서, (c), (5) 및 (6) 은 마우스 유래의 친주 세포에 있어서, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 로서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA 로서는, 바람직하게는 α1,6-푸코오스 수식 효소의 mRNA 량을 감소시킬 수 있는 RNA 를 들 수 있고, RNA 의 길이로서는, 10∼40, 바람직하게는 10∼30, 보다 바람직하게는 15∼30 이다. 구체적으로는,

(d) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(e) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(f) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(g) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열 중의 연속한 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

를 들 수 있고, 보다 바람직하게는,

(7) 서열 번호 14 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(8) 서열 번호 14 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(9) 서열 번호 15 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(10) 서열 번호 15 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코오스 수식 효소 의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(11) 서열 번호 16 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(12) 서열 번호 16 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(13) 서열 번호 17 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(14) 서열 번호 17 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(15) 서열 번호 18 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(16) 서열 번호 18 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(17) 서열 번호 19 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(18) 서열 번호 19 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(19) 서열 번호 20 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(20) 서열 번호 20 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스 페라아제를 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(21) 서열 번호 21 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(22) 서열 번호 21 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(23) 서열 번호 22 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(24) 서열 번호 22 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(25) 서열 번호 23 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(26) 서열 번호 23 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(27) 서열 번호 24 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(28) 서열 번호 24 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(29) 서열 번호 25 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(30) 서열 번호 25 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페 라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(31) 서열 번호 26 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(32) 서열 번호 26 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(33) 서열 번호 27 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(34) 서열 번호 27 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(35) 서열 번호 28 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(36) 서열 번호 28 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(37) 서열 번호 29 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(38) 서열 번호 29 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(39) 서열 번호 30 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(40) 서열 번호 30 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스 페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(41) 서열 번호 31 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(42) 서열 번호 31 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(43) 서열 번호 32 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(44) 서열 번호 32 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(45) 서열 번호 33 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(46) 서열 번호 33 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(47) 서열 번호 34 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(48) 서열 번호 34 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(49) 서열 번호 35 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(50) 서열 번호 35 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페 라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(51) 서열 번호 85 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(52) 서열 번호 85 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(53) 서열 번호 86 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(54) 서열 번호 86 으로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(55) 서열 번호 87 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(56) 서열 번호 87 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(57) 서열 번호 88 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(58) 서열 번호 88 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA ;

(59) 서열 번호 89 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(60) 서열 번호 89 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아 제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA 를 들 수 있다.

상기의 (d)∼(g) 및 (7)∼(60) 의 RNA 에 있어서, (d) 및 (7)∼(26) 은 햄스터 유래의 친주 세포에 있어서, (e), (11), (12), (23)∼(28), (33)∼(39), (41), (42), (45), (46), (51), (52), (57) 및 (58) 은 마우스 유래의 친주 세포에 있어서, (f), (7), (8), (11), (12), (19), (20), (23)∼(26), (33), (34), (39)∼(42), (49), (50), (55) 및 (56) 은 래트 유래의 친주 세포에 있어서, (g), (23)∼(26), (29)∼(34), (37), (38), (43), (44), (47), (48), (53), (54), (59) 및 (60) 은 인간 유래의 친주 세포에 있어서, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 RNA 로서 사용하는 것이 바람직하다.

1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열이란, 예를 들어 서열 번호 14∼37, 57, 58, 85∼89 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열 중에서 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입/또는 부가된 염기 서열을 말한다. 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 결과 발생하는 2 개 사슬 RNA 는, 한쪽의 사슬에만 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되고 있어도 되고, 즉, 그 2 개 사슬 RNA 는, 본 발명의 효과가 얻어지 범위에 있어서, 반드시 완전한 상보사슬이 아니어도 된다.

또, 본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA, 및 그 DNA 를 함유하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 로서는, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 이면, 어떠한 DNA 도 함유되고, 바람직하게는 α1,6-푸코실트랜스페라아제의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 활성 또는 발현을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명의 벡터는, 상기의 본 발명의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 를 함유하고 있으면 어떠한 벡터이어도 된다.

본 발명의 벡터로서는, 예를 들어, 시판되는 siRNA 발현 벡터에, 상기의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA 를 삽입하여 구축해도 된다.

본 발명의 벡터로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 각각 독립적인 프로모터에서 전사 되도록 벡터에 삽입하고, 또한 세포내 당뉴클레오티드 GDP- 푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 각각 독립적인 프로모터에서 전사되도록 그 벡터에 삽입하여, 1 개의 벡터로서도 제작해도 되지만, 2 개 사슬 RNA 를 형성시키기 쉽게 하기 위해서, α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 독립적인 프로모터에서 전사 되도록 벡터에 삽입하고, 또한 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커로 연결한 DNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커로 연결한 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 독립적인 프로모터에서 전사 되도록 벡터에 삽입하여, 1 개의 벡터로서 제작하는 것이 바람직하다.

또, 상기의, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커로 연결한 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 링커로 연결한 DNA 를 하나의 프로모터 하에 삽입하여 1 개의 연속한 RNA 에 전사되도록 벡터에 삽입해도 된다.

두 개의 독립적인 프로모터는, 동종의 프로모터이어도 상이한 종류의 프로모터 이어도 되고, 두 개의 독립적인 프로모터의 방향은 동방향이어도, 역방향이어도 된다. 본 발명의 벡터에 있어서의 두 개의 독립적인 프로모터는, 상이한 종류의 프로모터가 동방향으로 배치되는 것이 바람직하다.

프로모터로서는, 친주 세포에서 기능 할 수 있는 프로모터이면, 어떠한 것이라도 이용할 수 있고, 예를 들어, 동물 세포를 친주 세포로서 이용하는 경우에는, U6 프로모터, H1 프로모터, tRNA 프로모터 등의 폴리머라제 Ⅲ 계의 프로모터 등이 사용된다.

링커에 사용되는 염기 서열로서는, 2 개 사슬 RNA 의 형성에 사용되는 서열이면 어떠한 것이어도 되고, RNA 와 그 상보사슬 RNA 가 2∼10 염기 정도의 루프를 통해서 연결되어 2 개 사슬 RNA 가 형성되는, 헤어핀형 siRNA 를 발현시키는 것이 가능한 서열이 바람직하다.

α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 로서는, 구체적으로는, 서열 번호 90, 91, 94 및 95 로 각각 표시되는 염기 서열로부터 선택되는 DNA 를 들 수 있다.

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 로서는, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 가 바람직하다. GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 로서는, 구체적으로는, 서열 번호 92, 93 및 96 으로 각각 표시되는 염기 서열로부터 선택되는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명의 벡터로서는, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 및 그 상보 RNA 에 각각 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA 를 링커 서열로 연결한 DNA 는, 도입하는 친주 세포의 유래의 동물종 마다 유효한 조합을 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 친주 세포가 햄스터 유래인 경우에는, 서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 의 조합, 또는 서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 의 조합이 바람직하게 사용된다.

친주 세포가 마우스 유래인 경우에는, 서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 의 조합, 또는 서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 의 조합이 바람직하게 사용된다.

친주 세포가 인간 유래인 경우에는, 서열 번호 94 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 96 으로 표시되는 DNA 의 조합, 또는 서열 번호 95 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 96 으로 표시되는 DNA 의 조합 등을 들 수 있다.

본 발명의 벡터가 도입된 세포도, 본 발명의 세포에 포함된다.

또, 상기의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를, 각각 독립적인 2 종류의 벡터에 도입한 후, 이들 2 종류의 벡터가 공도입된 세포도, 본 발명의 세포에 포함된다.

본 발명의 세포는, 푸코오스 수식이 없는 당사슬 구조를 갖는, 생리 활성이 높은 당단백질을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명은, 친주 세포가 생산하는 당단백질보다 생리 활성이 높은 당단백질의 제조법을 제공할 수 있다.

푸코오스 수식이 없는 당사슬 구조를 가짐으로써 높은 생리 활성을 나타내는 대표적인 당단백질로서는, 푸코오스 수식이 없는 당사슬 구조를 가짐으로써 수용체와의 친화성이 향상하는 당단백질, 혈중의 반감기가 향상하는 당단백질, 혈중 투여 후의 조직 분포가 변화하는 당단백질, 약리 활성 발현에 필요한 단백질과의 상호 작용이 향상하는 당단백질 등을 들 수 있다.

따라서, 본 발명에 있어서 당단백질로서는, 친주 세포에서 생산했을 경우, 그 생성 단백질의 당사슬 구조에 푸코오스의 수식이 있는 당단백질이면, 어떠한 당단백질도 함유된다. 그 구체적인 예로서는, 항체, 에리스로포이에틴, 트롬보포 이에틴, 조직형 플라즈미노겐액티베이터, 프로우로키나아제, 트롬보모둘린, 안티트롬빈Ⅲ, 프로테인C, 혈액 응고 인자Ⅶ, 혈액 응고 인자Ⅷ, 혈액 응고 인자Ⅸ, 혈액 응고 인자Ⅹ, 성선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 표피 증식 인자 (EGF), 간세포 증식 인자 (HGF), 케라티노사이트 증식 인자, 악티빈, 뼈 형성 인자, 간세포 인자 (SCF), 인터페론α, 인터페론β, 인터페론γ, 인터루킨2, 인터루킨6, 인터루킨10, 인터루킨11, 가용성 인터루킨4수용체, 종양 괴사 인자α, DNaseI, 갈락토시다아제, α글루코시다아제, 글루코세레브로시다아제 등을 들 수 있다.

푸코오스 수식이 없는 당사슬 구조를 가짐으로써, 그 생리 활성이 큰 폭으로 상승하는 당단백질의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들어, 항체 조성물을 들 수 있다.

즉, 본 발명의 세포는, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체 조성물을 생산할 수 있다.

또, 본 발명의 세포는, 항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민과 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬의 비율이, 친주 세포보다 높은 항체 조성물을 생산할 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체 조성물이란, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 함유하는 조성물을 말한다.

항체는, 중사슬 및 경사슬 (이하, 각각「H 사슬」및「L 사슬」라고 표기한다) 의 2 종류의 폴리 펩티드사슬이 각각 2 분자씩 회합한 4 량체이다. H 사슬 의 N 말단측의 약 4 분의 1 과 L 사슬의 N 말단측의 약 2 분의 1 (각각 100여 아미노산) 은 가변 영역 (이하, V 영역」이라고 표기한다) 이라고 불리고, 다양성이 풍부하며, 항원과의 결합에 직접 관여한다. V 영역 이외의 부분의 대부분은 정상 영역 (이하,「C 영역」이라고 표기한다) 이라고 불린다. 항체 분자는 C 영역의 상동성에 의해 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 의 각 클래스로 분류된다.

또 IgG 클래스는 C 영역의 상동성에 의해, 다시 IgG1∼IgG4 의 서브 클래스로 분류된다.

H 사슬은 N 말단측으로부터 항체 H 사슬 V 영역 (이하, VH 라고 표기한다), 항체 H 사슬 C 영역 1 (이하, CH1 이라고 표기한다), 항체 H 사슬 C 영역 2 (이하, CH2 라고 표기한다), 항체 H 사슬 C 영역 3 (이하, CH3 이라고 표기한다) 의 4 개의 이뮤노글로블린 도메인으로 나뉘고, CH1 과 CH2 의 사이에는 힌지 영역이라고 불리는 가동성이 높은 펩티드 영역이 있어, CH1 과 CH2 가 구별된다. 힌지 영역 이후의 CH2 와 CH3 으로 이루어지는 구조 단위는 Fc 영역이라고 불리고, N-글리코시드 결합형 당사슬이 결합하고 있다. 또, 이 영역은, Fc 리셉터, 보체 등이 결합하는 영역이다 (면역학 일러스트레이티드 원서 제 5 판, 2000년 2월 10일 발행, 난코우토우판, 항체 공학 입문, 1994년 1월 25일 초판, 지인서관).

항체 등의 당단백질의 당사슬은, 단백질 부분과의 결합 양식에 의해, 아스파라긴과 결합하는 당사슬 (N-글리코시드 결합 당사슬) 와 세린, 트레오닌 등과 결합하는 당사슬 (O-글리코실 결합 당사슬) 의 2 종류로 크게 나뉜다. N-글리코시드 결합 당사슬은, 이하의 화학식 1 에 나타내는 구조식 (Ⅰ) 과 같은 기본이 되는 공통의 코어 구조를 갖는다 [생물 화학 실험법 23-당단백질 당사슬 연구법 (학회 출판 센터) 타카하시 레이코편 (1989년)].

[화학식 1]

상기 구조식 (I) 에 있어서, 아스파라긴과 결합하는 당사슬의 말단을 환원 말단, 반대측을 비환원 말단이라고 한다.

N-글리코시드 결합 당사슬로서는, 상기 구조식 (Ⅰ) 의 코어 구조를 갖는 것이면 어떠한 것이어도 되지만, 코어 구조의 비환원 말단에 만노오스만이 결합하는 하이만노오스형, 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토오스-N-아세틸글루코사민 (이하, Gal-GlcNAc 라고 표기한다) 의 가지를 병행하여 1 내지는 복수개 갖고, 또한 Gal-GlcNAc 의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등의 구조를 갖는 컴플렉스형 (복합형), 코어 구조의 비환원 말단측에 하이만노오스형과 컴플렉스형의 양쪽 모두의 가지를 갖는 하이브리드 (hybrid) 형 등을 들 수 있다.

항체 분자의 Fc 영역에는, N-글리코시드 결합 당사슬이 1 개소씩 결합하는 영역을 가지고 있기 때문에, 항체 1 분자 당 2 개의 당사슬이 결합하고 있다. 항체 분자에 결합하는 N-글루코시드 결합 당사슬로서는, 상기 구조식 (Ⅰ) 로 표시되는 코어 구조를 포함하는 어떠한 당사슬도 포함되므로, 항체에 결합하는 2 개의 N-글루코시드 결합 당사슬에는 다수의 당사슬의 조합이 존재하게 된다.

따라서, 본 발명에 있어서, GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포를 이용하여 제조한 항체 조성물, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포를 이용하여 제조한 항체 조성물은, 본 발명의 효과가 얻어지는 범위이면, 단일의 당사슬 구조를 갖는 항체 분자로부터 구성되어 있어도 되고, 복수의 상이한 당사슬 구조를 갖는 항체 분자로부터 구성되어 있어도 된다.

항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬의 비율 (이하,「본 발명의 당사슬의 비율」이라고 표기한다) 이란, 그 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 모든 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 합계수에 대해서, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬의 수가 차지하는 비율을 말한다.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬이란, 푸코오스가, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α 결합되어 있지 않은 당사슬을 말한다. 구체적으로는, 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 N-아세틸 글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당사슬을 들 수 있다.

본 발명의 당사슬의 비율이 높을수록, 항체 조성물의 ADCC 활성이 높아진다. ADCC 활성이 높은 항체 조성물로서는, 본 발명의 당사슬의 비율이, 바람직하게는 20％ 이상, 보다 바람직하게는 30％ 이상, 더욱 바람직하게는 40％ 이상, 특히 바람직하게는 50％ 이상, 가장 바람직하게는 100％ 의 항체 조성물을 들 수 있다.

또, 본 발명은, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 ADCC 활성이 높은 항체 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 당사슬의 비율이, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 높은 경우, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 높은 ADCC 활성을 갖는다.

ADCC 활성이란, 생체 내에서, 종양 세포 등의 세포 표면 항원 등에 결합한 항체가, 항체 Fc 영역과 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 Fc 리셉터의 결합을 통해서 이펙터 세포를 활성화하고, 종양 세포 등을 상해하는 활성을 말한다 [Monoc1onal Antibodies : Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc.,Capter2.1 (1995)]. 이펙터 세포로서는, 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 활성화된 매크로파지 등을 들 수 있다.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 함유하는 조성물 중에 포함되는, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬의 비율은, 항체 분자로부터 히드라진 분해나 효소 소화 등의 공지된 방법 [생물화학 실험법 23-당단백질 당사슬 연구법 (학회산판 센터) 타카하시 레이코 (1989)] 을 이용해서 당사슬을 유리시키고, 유리 시킨 당사슬을 형 광 표식 또는 동위 원소 표식하고, 표식한 당사슬을 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다. 또, 유리시킨 당사슬을 HPAED-PAD법 [(J.Liq.Chromatogr.), 6, 1577 (1983)] 에 의해 분석하는 것에 의해서도 결정할 수 있다.

항체 분자로서는, 항체의 Fc 영역을 포함하는 분자이면 어떠한 분자도 포함된다. 구체적으로는, 항체, 항체의 단편, Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 등을 들 수 있다.

항체로서는, 동물에 항원을 면역하고, 면역 동물의 비장 세포로부터 제작한 하이브리도마 세포가 분비하는 항체 외에도, 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 항체, 즉, 항체 유전자를 삽입한 항체 발현 벡터를, 숙주 세포로 도입함으로써 취득된 항체 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 하이브리도마가 생산하는 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 들 수 있다.

하이브리도마는, 인간 이외의 포유 동물에 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마우스, 래트 등에 유래하는 미에로마 세포를 세포 융합시켜 얻을 수 있는, 원하는 항원 특이성을 가진 모노클로널 항체를 생산하는 세포를 말한다.

인간화 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체 등을 들 수 있다.

인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물의 항체 VH 및 항체 L 사슬 V 영역 (이하, VL 라고 표기한다) 과 인간 항체의 H 사슬 C 영역 (이하, CH 라고 표기한다) 및 인간 항체의 L 사슬 C 영역 (이하, CL 이라고 표기한다) 으로 이루어지는 항체를 의미한다. 인간 이외의 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 이용할 수 있다.

인간형 키메라 항체는, 모노클로널 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL 을 코드하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 숙주 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

인간형 키메라 항체의 CH 로서는, 인간 이뮤노글로블린 (이하,「hIg」라고 표기한다) 에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, hIgG 클래스인 것이 바람직하고, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 인 서브 클래스 중의 모두를 이용할 수 있다. 또, 인간형 키메라 항체의 CL 로서는, hIg 에 속하면 어떠한 것이어도 되고, κ 클래스 또는 λ 클래스인 것을 이용할 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL 의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다.

인간형 CDR 이식 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열에 이식한 V 영역을 코드하는 cDNA 를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 인간 항체의 CL 을 코드하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 인간형 CDR 이식 항체를 발현시켜, 제조할 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체의 CH 로서는, hIg 에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, hIgG 클래스인 것이 바람직하고, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 라는 서브 클래스의 모두를 이용할 수 있다. 또, 인간형 CDR 이식 항체의 CL 로서는, hIg 에 속하면 어떠한 것이어도 되고, κ 클래스 또는 λ 클래스인 것을 이용할 수 있다

인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하는데, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리, 그리고 인간 항체 트랜스제닉 동물 또는 인간 항체 트랜스제닉 식물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.

인간 체내에 존재하는 항체는, 예를 들어, 인간 말초혈 임파구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화, 클로닝함으로써, 그 항체를 생산하는 임파구를 배양할 수 있고, 배양물 중으로부터 그 항체를 정제할 수 있다.

인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 바이러스 유전자에 삽입함으로써 Fab, 1 개 사슬 항체 등의 항체 단편을 파지 바이러스 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 그 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지 바이러스를 회수할 수 있다. 그 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 수법에 의해, 2 개의 완전한 H 사슬 및 2 개의 완전한 L 사슬로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.

인간 항체 트랜스제닉 비인간 동물은, 인간 항체 유전자가 세포내에 삽입된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 배아 간세포로 인간 항체 유전자를 도입 하고, 그 배아 간세포를 다른 마우스의 초기배로 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체를 생성하는 트랜스제닉 비인간 동물을 제작할 수 있다. 또, 동물의 수정란에 인간 항체 유전자를 도입하고, 그 수정란을 발생시키는 것에 인간 항체를 생성하는 트랜스제닉 비인간 동물을 제작할 수도 있다. 인간 항체를 생성하는 트랜스제닉 비인간 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상의 인간 이외의 포유 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 하이브리도마를 얻고, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 축적시킬 수 있다.

트랜스제닉 비인간 동물은, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이 또는 토끼 등을 들 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 항체가, 종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련하는 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련하는 항원을 인식하는 항체, 자기 면역 질환에 관련하는 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 관련하는 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하고, 항체의 클래스는 IgG 가 바람직하다.

항체의 단편은, 상기 항체의 Fc 영역을 포함한 단편을 말한다. 항체의 단편으로서는, 상기 항체의 Fc 영역을 포함한 단편이면 어떠한 것이어도 되지만, 구체적으로는, H 사슬의 단량체, H 사슬의 2 량체 등을 들 수 있다.

Fc 영역을 갖는 융합 단백질로서는, 항체의 Fc 영역을 포함한 항체 또는 항체 단편과 효소, 사이토카인 등의 단백질을 융합시킨 물질이면 어떠한 것이어도 된다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 본 발명의 세포의 제작

(1) GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포의 제작

본 발명의 GDP-만노오스 변환 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포는, 예를 들어, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다.

GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA 를 조제한다.

조제한 cDNA 또는 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정한 DNA 의 서열에 기초하여, GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 부분 또는 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 컨스트럭트를 설계한다.

그 RNAi 유전자를 세포내에서 발현시키기 위해서, 조제한 DNA 의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.

그 재조합 벡터를, 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.

도입한 GDP-만노오스 변환 효소의 활성, 또는 생성 항체 분자 또는 세포 표면 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표에 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 세포를 얻을 수 있다.

숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 GDP-만노오스 변환 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 어떠한 것도 이용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2. 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 폴리머라제 Ⅲ 에 의해 전사가 행해지는 타입의 발현 벡터 또는 후술하는 2. 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술하는 2. 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.

GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 및 게놈 DNA 를 취득하는 방법으로서는, 예를 들어, 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.

cDNA 의 조제 방법

각종 숙주 세포로부터 모든 RNA 또는 mRNA 를 조제한다.

조제한 모든 RNA 또는 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리을 제작한다.

GDP-만노오스 변환 효소의 이미 알려진 아미노산 서열, 예를 들어 인간의 그 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 디제너레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 법으로, GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득한다.

취득한 유전자 단편을 프로브로서 이용하고, cDNA 라이브러리을 스크리닝하여, GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 cDNA 를 취득할 수 있다.

각종 숙주 세포의 mRNA 는, 시판되는 제품 (예를 들어, C1ontech사 제조) 을 이용해도 되고, 이하와 같이 각종 숙주 세포로부터 조제해도 된다. 각종 숙주 세포로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로 아세트산 세슘법 [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], 산성 티오시안산구아니딘·페놀·클로로포름 (AGPC) 법 [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987) ; 실험 의학, 9, 1937 (1991)] 등을 들 수 있다.

또, 전체 RNA 로부터 poly(A)⁺RNA 로서 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 (몰레큘러·클로닝 제 2 판) 등을 들 수 있다.

또한, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 사 제조) 등의 키트를 이용함으로써 mRNA 를 조제할 수 있다.

조제한 각종 숙주 세포 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로는, 몰레큘러·클로닝 제 2 판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989) 등에 기재된 방법, 혹은 시판되는 키트, 예를 들어 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies 사 제조), ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE 사 제조) 를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로는, 대장균 K12 주 중에서 자립 복제할 수 있는 것이면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, ZAP Express [STRATAGENE 사 제조, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], Lambda ZAP Ⅱ (STRATAGENE 사 제조), λgt10, λgt11 [DNA cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], λTriplEx (Clontech 사 제조), λExCell (Pharmacia 사 제조), pT7T318U (Pharmacia 사 제조), pcD2 [Mol.Cell.Biol., 3, 280 (1983)] 및 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 숙주 미생물로는, 미생물이면 모두 이용할 수 있지만, 바람직하게는 대장균이 이용된다. 구체적으로는 Escherichia coli XL1-Blue MRF' [STRATAGENE 사 제조, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coliY1088 [Science, 222, 778(1983)], Escherichia coliY1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [J.Mol.Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J.Mol.Biol., 16, 118 (1966)] 및 Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 등이 이용된다.

이 cDNA 라이브러리를, 그대로 이후의 해석에 이용해도 되지만, 불완전 길이 cDNA 의 비율을 낮추고, 가능한 한 전체 길이 cDNA 를 효율적으로 취득하기 위해, 칸노 등이 개발한 올리고 캡법 [Gene, 138, 171 (1994) ; Gene, 200, 149 (1997) ; 단백질 핵산 효소, 41, 603 (1996) ; 실험 의학, 11, 2491 (1993) ; cDNA 클로닝 (요오도 사) (1996) ; 유전자 라이브러리의 제작법 (요오도 사) (1994)] 을 이용하여 조제한 cDNA 라이브러리를 이하의 해석에 이용해도 된다.

GDP-만노오스 변환 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 그 아미노산 서열을 코드하는 것을 예측할 수 있는 염기 서열의 5' 단 및 3' 단의 염기 서열에 특이적인 디제너레이티브 프라이머를 제작하고, 제작된 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 을 이용하여 DNA 의 증폭을 실시함으로써, GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.

취득된 유전자 단편이 GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 DNA 인 것은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어 생거 (Sanger) 들의 디데옥시법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74, 5463 (1977)] 혹은 ABI PRISM377 DNA 시퀀서 (PE Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 확인할 수 있다.

그 유전자 단편을 DNA 프로브로 하여, 각종 숙주 세포에 포함되는 mRNA 로부터 합성한 cDNA 혹은 cDNA 라이브러리에 대해 콜로니하이브리다이제이션이나 플라크하이브리다이제이션 (몰레큘러·클로닝 제 2 판) 을 실시함으로써, GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 를 취득할 수 있다.

또, GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득하기 위해 이용한 프라이머를 이용하고, 각종 숙주 세포에 포함되는 mRNA 로부터 합성한 cDNA 혹은 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR 법을 이용하여 스크리닝을 실시함으로써, GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 를 취득할 수도 있다.

취득된 GDP-만노오스 변환 효소를 코드하는 DNA 의 염기 서열을 말단부터, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어 생거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74, 5463 (1977)] 혹은 ABI PRISM 377DNA 시퀀서 (PE Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 그 DNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정된 cDNA 의 염기 서열을 기초로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 이용하여, GenBank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터 베이스를 검색함으로써, 데이터 베이스 중의 유전자 중에서 GDP-만노오스 변환 효소를 코드하고 있는 유전자를 결정할 수도 있다.

또한, 상기의 방법에서 얻어지는 GDP-만노오스 변환 효소를 코드하고 있는 유전자의 염기 서열로는, 예를 들어, 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

결정된 DNA 의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 퍼킨·엘머사의 DNA 합성기 model 392 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 를 취득할 수도 있다.

GDP-만노오스 변환 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.

게놈 DNA 의 조제 방법

게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 몰레큘러·클로닝 제 2 판이나 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 또, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사 제조) 이나 Universal GenomeWalker^TMKits (CLONTECH 사 제조) 등을 이용함으로써, GDP-만노오 스 변환 효소의 게놈 DNA 를 단리할 수도 있다.

GDP-만노오스 변환 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 이하의 방법을 들 수 있다.

형질 전화체를 선택하는 방법

GDP-만노오스 변환 효소의 활성이 저하된 세포를 선택하는 방법으로는, 문헌 [신생 화학 실험 강좌 3-당질 Ⅰ, 당단백질 (동경화학동인) 일본 생화학회편 (1988)], 문헌 [세포 공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글라이코바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질·당지질·프로테오그리칸 (슈준사 제조) 타니구치 나오유키·스즈키아키미·후루카와키요시·스가와라카즈유키 감수 (1996)], 몰레큘러·클로닝 제 2 판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 혹은 유전자 공학적인 방법 등을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로는, 예를 들어, 효소 특이적인 기질을 이용하여 효소 활성을 측정하는 방법을 들 수 있다. 유전자 공학적인 방법으로는, 예를 들어, GDP-만노오스 변환 효소의 유전자의 mRNA 량을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR 법 등을 들 수 있다.

또, GDP-만노오스 변환 효소의 활성이 저하된 결과 발생하는 형질의 변화를 지표에 세포를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 생산 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법이나, 세포 표면 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법 등을 들 수 있다. 생산 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 후술하는 5. 에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포 표면 상의 당단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 들 수 있다. 그 구체적인 예로는, Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986) 등에 기재된 렉틴을 이용한 방법을 들 수 있다.

렉틴으로는, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴이면 어느 렉틴이어도 이용할 수 있지만, 바람직하게는 렌즈콩 렉틴 LCA (Lensculinaris 유래의 Lentil Agglutinin) 완두콩 렉틴 PSA (Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA (Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuriaaurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 10㎍/ml∼10mg/ml, 바람직하게는 0.5∼2mg/ml 의 농도의 상기 기술한 렉틴을 함유하는 배지에 1 일∼2 주간, 바람직하게는 3 일∼1 주간 배양하고, 생존하고 있는 세포를 계대 배양 혹은 콜로니를 채취한 후, 다른 배양기로 옮겨, 더욱 계속하여 렉틴을 함유하는 배지에서 배양을 계속함으로써, 본 발명의 세포를 선택할 수 있다.

GDP-만노오스 변환 효소의 유전자의 mRNA 량을 억제하기 위한 RNAi 유전자는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다.

RNAi 유전자의 콘스트럭트는, [Nature, 391, 806 (1998) ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 15502 (1998) ; Nature, 395, 854 (1998) ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96, 5049 (1999) ; Cell, 95, 1017 (1998) ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96, 1451 (1999) ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 13959 (1998) ; Nature Cell Biol., 2, 70 (2000)] 등의 기재에 따라 설계할 수 있다.

또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, GDP-만노오스 변환 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 2 개 사슬 RNA 를, 직접 숙주 세포에 도입시킴으로써, 본 발명의 세포를 얻을 수도 있다.

2 개 사슬 RNA 는, 통상적인 방법 또는 RNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다. 구체적으로는, GDP-만노오스 변환 효소의 cDNA 및 게놈 DNA 의 상보 RNA 염기 서열 중, 10∼40 염기, 바람직하게는 10∼30 염기, 보다 바람직하게는 15∼30 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 그 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드 (안티센스올리고뉴클레오티드) 를 합성함으로써 조제할 수 있다. 그 올리고뉴클레오티드와 안티센스올리고뉴클레오티드는, 각각 독립적으로 합성해도 되고, 2 개 사슬 RNA 형성에 지장이 없는 스페이서뉴클레오티드로 연결되어 있어도 된다.

올리고뉴클레오티드로는, 올리고 RNA 및 그 올리고뉴클레오티드의 유도체 (이하, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 한다) 등을 들 수 있다.

올리고뉴클레오티드 유도체로는, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 프로필우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시트신이 C-5 프로필시트신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시트신이 페녹사딘 수식 시트신 (phenoxazine-modified cytosine) 으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 혹은 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다 [세포 공학, 16, 1463 (1997)].

(2) α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 GDP-푸코오스 합성 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포의 제작

본 발명의α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 GDP-푸코오스 합성 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포의 제작 방법을, α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 GDP-푸코오스 합성 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포를 예로서 이하에 설명하지만, α1,6-푸코오스 수식 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포도 동일하게 하여 제작할 수 있다.

α1,6-푸코오스 수식 효소 및 GDP-푸코오스 합성 효소의 cDNA 혹은 게놈 DN A 를 조제한다.

조제된 cDNA 혹은 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정된 DNA 의 서열에 기초하여, α1,6-푸코오스 수식 효소 및 GDP-푸코오스 합성 효소를 코드하는 부분 혹은 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 콘스트럭트를 설계한다.

그 RNAi 유전자를 세포 내에서 발현시키기 위해, 조제된 DNA 의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.

도입한 α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포 표면 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 세포를 얻을 수 있다.

숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 α1,6-푸코오스 수식 효소의 유전자와 GDP-푸코오스 합성 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 이용할 수 있다. 구체적으로는, 후술한 2. 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 또는 염색체 중으로의 삽입이 가능하며, 설계된 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 폴리머라제 Ⅲ 에 의해 전사되는 타입의 발현 벡터 혹은 후술하는 2. 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술하는 2. 에 기재된 각종 숙주 세포에 적절한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.

α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 cDNA 및 게놈 DNA 는, 예를 들어, 본항 (1) 에 기재된 방법과 동일하게 하여 취득할 수 있다.

α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 이하의 방법을 들 수 있다.

형질 전환체를 선택하는 방법

α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 활성이 저하된 세포를 선택하는 방법으로는, 상기 (1) 에 기재된 생화학적인 방법 혹은 유전자 공학적인 방법 등이 이용된다.

또한, α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 활성이 저하된 결과 발생하는 형질의 변화를 지표로 세포를 선택하는 방법으로는, 상기 (1) 에 기재된 방법 등이 이용된다.

α1,6-푸코오스 수식 효소 또는 GDP-푸코오스 합성 효소의 유전자의 mRNA 량을 억제하기 위한 RNAi 유전자는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다.

RNAi 유전자의 콘스트럭트는, 상기 (1) 의 기재된 방법과 동일하게 하여 설계할 수 있다.

또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, α1,6-푸코오스 수식 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 2 개 사슬 RNA 및 GDP-푸코오스 합성 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 2 개 사슬 RNA 를 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 세포를 얻을 수도 있다.

2 개 사슬 RNA 는, 상기 (1) 에 기재된 방법과 동일하게 하여 조제할 수 있다.

2. 항체 조성물을 예로 한 당단백질의 제조 방법

항체 조성물의 제조를 예로, 본 발명의 세포를 이용한 당단백질의 제조 방법을 나타낸다.

항체 조성물은, 몰레큘러·클로닝 제 2 판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (이하, 안티바디즈라고 한다), Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (이하, 모노클로날안티바디즈라고 한다), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (이하, 안티바디 엔지니어링이라고 한다) 등에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들어, 이하와 같이 본 발명의 세포 중에서 발현시켜 취득할 수 있다.

항체 분자의 cDNA 를 조제한다.

조제한 항체 분자의 전체 길이 cDNA 를 기초로 하여, 필요에 따라, 그 단백질을 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.

그 DNA 단편, 또는 전체 길이 cDNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.

그 재조합 벡터를 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입시킴으로써, 항체 분자를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체 조성물의 제조 방법에 이용되는 숙주 세포로는, 상기 1. 에서 제작한 본 발명의 세포로서, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있지만, 바람직하게는 동물 세포를 들 수 있다.

항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당사슬의 수식에 관계되는 효소를 유전자 공학적인 수법을 이용하여 도입한, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등의 세포를 숙주 세포로서 이용할 수도 있다.

발현 벡터로서는, 상기 각종 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 또는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 목적으로 하는 항체 분자를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다.

cDNA 는, 상기 1. 에 기재된 「cDNA 의 조제 방법」에 따라, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터, 목적으로 하는 항체 분자에 특이적인 프로브 프라이머를 이용하여 조제할 수 있다.

효모를 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들어, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 효모 균주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것을 이용해도 되고, 예를 들어, 헥소스키나아제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크 단백질 프로모터, MFα 1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로는, 사카로미세스속, 시조사카로미세스속, 클루이베로미세스속, 트리코스포론속, 슈와니오마이세스속 등에 속하는 효모, 예를 들어 Saccharomycescerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporonpullulans, Schwanniomycesalluvius 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예를 들어, 엘렉트로포레이션법 [Methods.Enzymol., 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 84, 1929 (1978)], 아세트산 리튬법 [J.Bacterio1ogy, 153, 163 (1983)], [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 75, 1929 (1978)] 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들어, pcDNAI, pcDM8 (후나코시사로부터 시판), pAGE107 [일본 공개특허공보 평3-22979 : Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 [일본 공개특허공보 평2-227075], pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [J.Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 동물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있 고, 예를 들어, 사이트메갈로바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용해도 된다.

숙주 세포로는, 인간의 세포인 나마르바 (Namalwa) 세포, NM-F9세포, PER.C6 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299), 래트 미에로마 세포, 마우스 미에로마 세포, 시리안 햄스터 신장 유래 세포, 배아 간세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 동물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예를 들어, 엘렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산 칼슘법 [일본 공개특허공보 평2-227075], 리포펙션법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 84, 7413 (1987)], 인젝션법 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (이하, 매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제 2 판이라고 한다)], 파티클암 (유전자총) 을 이용하는 방법 [특허 제 2606856, 특허 제 2517813], DEAE-덱스트란법 [바이오 매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법 (요오도사) 요코타 타카시·아라이 켄이치편 (1994)], 바이러스 벡터법 [매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제 2 판] 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 예를 들어 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H.Freeman and Company, New York (1992), 바이오/테크놀로지 (Bio/Technology), 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 따라, 단백질을 발현시킬 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큐로바이러스를 곤충 세포에 도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 게다가 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 발현시킬 수 있다.

그 방법에 있어서 이용되는 유전자 도입 벡터로는, 예를 들어, pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (Invitorogen 사 함께 제조) 등을 들 수 있다.

바큐로바이러스로는, 예를 들어, 야도충과 곤충에 감염되는 바이러스인 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 이용할 수 있다.

곤충 세포로는, Spodoptera frugiperda 의 난소 세포인 Sf9, Sf21 [커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Bacu1ovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H.Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusiani 의 난소 세포인 High 5 (Invitrogen 사 제조) 등을 이용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큐로바이러스의 공도입 방법으로는, 예를 들어, 인산 칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075), 리포펙션법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물 세포를 숙주 세포로 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 식물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것을 이용해도 되고, 예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 이네엑틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 소맥, 보리 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 식물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium) [일본 공개특허공보 소59-140885, 일본 공개특허공보 소60-70080, WO94/00977], 엘렉트로포레이션법 [일본 공개특허공보 소60-251887], 파티클건 (유전자총) 을 이용하는 방법 [일본 특허 제 2606856, 일본 특허 제 2517813] 등을 들 수 있다.

항체 유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에 몰레큘러·클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 실시할 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 분자를 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주 세포의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.

효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 그 생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지의 어느 것을 이용해도 된다.

탄소원으로는, 그 생물이 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 혹은 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 이용할 수 있다.

질소원으로는, 암모니아, 염화 암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 혹은 유기산의 암모늄염, 그 외의 함질소 화합물, 그리고, 펩톤, 육엑기스, 효모엑기스, 콘스팁 리커, 카제인 가수 분해물, 대두박 및 대두박 가수 분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 이용할 수 있다.

무기염류로는, 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화 나트륨, 황산 제 1 철, 황산만암, 황산구리, 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.

배양은, 통상 진탕 배양 또는 심부 환기 교반 범위 배양 등의 호기적 조건 하에서 실시한다. 배양 온도는 15∼40℃ 가 좋고, 배양 시간은, 통상 16 시간∼7 일간이다. 배양 중의 pH 는 3∼9 로 유지한다. pH 의 조제는, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 실시한다.

또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 효모를 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 이용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 효모를 배양할 때에는 이소프 로필-β-D-티오갈락토필라노시드 등을 trp 프로모터를 이용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 효모를 배양할 때에는 인돌 아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 개변 MEM 배지변 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)], Whitten 배지 [발생 공학 실험 매뉴얼-트랜스제닉·마우스의 제작 방법 (코단사) 카츠키모토야편 (1987)] 또는 이들 배지에 우태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.

배양은, 통상 pH 6∼8, 30∼40℃, 5% CO₂ 존재 하 등의 조건 하에서 1∼7 일간 실시한다. 페드 배치 배양, 홀로파이버 배양 등의 배양법을 이용하여 1 일∼수 개월 배양을 실시할 수도 있다.

또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (Pharmingen 사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies 사 제조), ExCell400, ExCell405 (모두 JRH Biosciences 사 제조), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 이용할 수 있다.

배양은, 통상 pH 6∼7, 25∼30℃ 등의 조건 하에서, 1∼5 일간 실시한다.

또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는, 세포로서 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양시킬 수 있다. 그 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게·앤드·스크그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이트카이닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.

배양은, 통상 pH5∼9, 20∼40℃ 의 조건 하에서 3∼60 일간 실시한다.

또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

상기와 같이, 항체 분자를 코드하는 DNA 를 삽입한 재조합체 벡터를 보유하는 효모, 동물 세포, 혹은 식물 세포 유래의 형질 전환체를 통상의 배양 방법에 따라 배양하고, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 그 배양물로부터 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다.

항체 조성물의 생산 방법으로는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법, 혹은 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 항체 분자의 구조를 바꿈으로써, 그 방법을 선택 할 수 있다.

항체 조성물이 숙주 세포 내 혹은 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴손 등의 방법 [J.Biol.Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86, 8227 (1989) ; Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평5-336963, 일본 공개특허공보 평6-823021 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 그 항체 조성물을 숙주 세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합의 수법을 이용하여, 발현 벡터에 항체 분자를 코드하는 DNA, 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후에 항체 분자를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 항체 분자를 숙주 세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또한, 일본 공개특허공보 평2-227075 에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 이용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.

또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들의 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조할 수도 있다.

형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우는, 통상의 방법에 따라, 사육 또는 재배하고, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 그 동물 개체 또는 식물 개체로부터 그 항체 조성물을 채취함으로써, 그 항체 조성물을 제조할 수 있다.

동물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 공지된 방법 [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996) ; American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996) ; 바이오/테크놀로지 (Bio/Technology), 9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 목적으로 하는 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.

동물 개체의 경우는, 예를 들어, 항체 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 항체 조성물을 그 동물 중에 생성·축적시키고, 그 동물 중으로부터 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 그 동물 중의 생성·축적 장소로는, 예를 들어, 그 동물의 밀크 (일본 공개특허공보 소63-309192), 알 등을 들 수 있다. 이때에 이용되는 프로모터로는, 동물로 발현될 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있지만, 예를 들어, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카제인 프로모터, β 카제인 프로모터, β 락토글로블린프 로모터, 호에산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 이용된다.

식물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 항체 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직 배양, 20 (1994) ; 조직 배양, 21 (1995) ; Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하고, 항체 조성물을 그 식물 중에 생성·축적시키고, 그 식물 중으로부터 그 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.

항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 항체 조성물이 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 그 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 유출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75 (미츠비시 화학 (주) 제조) 등 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등 전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독 혹은 조합하여 이용하여, 항체 조성물의 정제 표준품을 얻을 수 있다.

또한, 항체 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우는, 동일하게 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심 분리를 실시함으로써, 침전 획분으로 하여 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수된 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 그 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 그 항체 조성물을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 그 항체 조성물의 정제 표준품을 얻을 수 있다.

항체 조성물이 세포 외에 분비되었을 경우에는, 배양 상청에 그 항체 조성물을 회수할 수 있다. 즉, 그 배양물을 상기와 동일한 원심 분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 그 가용성 획분으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 이용함으로써, 항체 조성물의 정제 표준품을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 취득되는 항체 조성물로서, 예를 들어, 항체, 항체의 단편, 항체의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질 등을 들 수 있다.

이하에, 항체 조성물 취득의 보다 구체적인 예로서, 인간화 항체 및 Fc 융합 단백질의 조성물의 제조 방법에 대하여 기재하지만, 다른 항체 조성물 등의 당단백질에 대해서도 상기 서술한 방법 및 당해 방법에 준하여 취득할 수도 있다.

A. 인간화 항체 조성물의 제조

(1) 인간화 항체 발현용 벡터의 구축

인간화 항체 발현용 벡터란, 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자가 삽입된 동물세포용 발현 벡터이며, 동물세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.

인간 항체의 C 영역으로는, 임의의 인간 항체의 CH 및 CL 일 수 있고, 예를 들어, 인간 항체의 H사슬의 IgG1 서브클래스의 C 영역 (이하, 「hCγ1」이라고 표기한다) 및 인간 항체의 L사슬의 κ클래스의 C 영역 (이하, 「hCκ」라고 표기한다) 등을 들 수 있다.

인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자로는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA 를 사용할 수 있고, 또한, cDNA 를 사용할 수도 있다.

동물세포용 발현 벡터로는, 인간 항체의 C 영역을 코드하는 유전자를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J.Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990)] 등을 들 수 있다. 동물세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로는, SV40 의 초기 프로모터와 인 핸서 [J.Biochem. 101, 1307 (1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR [Biochem.Biophys.Res.Commun., 149, 960 (1987)], 면역 글로블린 H사슬의 프로모터 [Cell, 41, 479 (1985)] 와 인핸서 [Cell, 33, 717 (1983)] 등을 들 수 있다.

인간화 항체 발현용 벡터는, 항체 H사슬 및 L사슬이 각각의 벡터 상에 존재하는 타입 혹은 동일한 벡터 상에 존재하는 타입 (이하, 탠덤형이라고 표기한다) 의 어느 쪽이라도 사용할 수 있지만, 인간화 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물세포로의 도입의 용이함, 동물세포내에서의 항체 H사슬 및 L사슬의 발현량의 밸런스가 균형되는 등의 점으로부터 탠덤형의 인간화 항체 발현용 벡터가 바람직하다 [J.Immunol.Methods, 167, 271 (1994)].

구축한 인간화 항체 발현용 벡터는, 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 동물세포에서의 발현에 사용할 수 있다.

(2) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA 의 취득

인간 이외의 동물의 항체, 예를 들어, 마우스 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 는 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.

목적의 마우스 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA 를 추출하고, cDNA 를 합성한다. 합성한 cDNA 를 퍼지 혹은 플라스미드 등의 벡터로 클로닝 하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 그 라이브러리로부터, 기존의 마우스 항체의 C 영역 부분 혹은 V 영역 부분을 프로브로서 사용하고, VH 를 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 퍼지 혹은 재조합 플라스미드 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 퍼지 혹은 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 퍼지 혹은 재조합 플라 스미드 상의 목적의 마우스 항체의 VH 및 VL 의 전체 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정한다.

인간 이외의 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.

하이브리도마 세포로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산 세슘법 [Methods in Enzymol, 154, 3 (1987)], 또한 전체 RNA 로부터 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)] 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA 를 조제하는 키트로는, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.

cDNA 의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로는, 통상적인 방법 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989); Current Protocols in MolecularBiology, Supplement 1-34], 혹은 시판되는 키트, 예를 들어, Super Script^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL사 제조) 이나 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리의 제작시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA 를 주형으로서 합성한 cDNA 를 삽입하는 벡터는, 그 cDNA 를 삽입할 수 있는 벡터이면 어떠 한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(＋) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λZAPⅡ (Stratagene사 제조), λgt10, λgt11 [DNA Cloning: A Practical Approach, Ⅰ, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech사 제조), λExCell, pT7T3 18U (Pharmacia사 제조), pcD2 [Mol.Cell.Biol., 3, 280 (1983)] 및 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 등이 사용된다.

퍼지 혹은 플라스미드 벡터에 의하여 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는 그 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF’ [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J.Mol.Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J.Mol.Biol., 16, 118 (1966)] 및 JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 등이 사용된다.

cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 클론의 선택법으로는, 아이소토프 혹은 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법 또는 플라크·하이브리다이제이션법 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)] 에 의하여 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하고, mRNA 로부터 합성한 cDNA 혹은 cDNA 라이브러리을 주형으로 하여, Polymerase Chain Reaction [이하, PCR 법이라고 표기한다; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1- 34] 에 의하여 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 조제할 수도 있다.

상기 방법에 의하여 선택된 cDNA 를, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(－) (Stratagene사 제조) 등의 플라스미드로 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어, 생거 (Sanger) 의 디데옥시법 [Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 74, 5463 (1977)] 등의 반응을 실시하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예를 들어, A.L.F.DNA 시퀀서 (Pharmacia사 제조) 등을 사용하여 해석하는 것으로 그 cDNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 이미 알려진 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991)] 과 비교함으로써, 취득한 cDNA 가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.

(3) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 해석

분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 이미 알려진 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services, 1991] 과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL 의 각 CDR 의 아미노산 서열에 대해서도, 이미 알려진 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991)] 과 비교함으로써 알아낼 수 있다.

(4) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축

본 항 2 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자의 상류에, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를, 인간 이외의 동물의 항체 VH 및 VL 의 3’말단측의 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL 의 5’말단측의 염기 서열로 이루어지고, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA 와 각각 연결하고, 각각을 본 항 2 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자의 상류에 그들이 적절한 형태로 발현하도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.

(5) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA 의 구축

인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다. 먼저, 목적하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL 의 프레임워크 (이하, FR 이라고 표기한다) 의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열로는, 인간 항체 유래의 것이면, 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열 [Sequences of Proteins of Immunological lnterest, US Dept.Health and Human Services (1991)] 등을 들 수 있지만, 그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간형 CDR 이식 항체를 제작하기 위해서는, 목적하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열로 가능한 한 높은 상동성 (적어도 60％ 이상) 을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

다음에, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열에 목적하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하고, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보여지는 코돈의 사용 빈도 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services, 1991] 를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA 를 합성하고, 그들을 사용하여 PCR 법을 실시한다. 이 경우, PCR 에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA 의 길이로부터, H사슬, L사슬과도 6 개의 합성 DNA 를 설계하는 것이 바람직하다.

또한, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5’말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 2 의 (1) 에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(－) (Stratagene사 제조) 등의 플라스미드로 클로닝하고, 본 항 2 의 (2) 에 기재된 방법에 의하여, 염기 서열을 결정하고, 원하는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.

(6) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변

인간형 CDR 이식 항체는, 목적하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 만을 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 에 이식한 것 만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 인간 이외의 동물의 항체에 비하여 저하되는 것이 알려져 있다 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. 이 원인으로는, 원래의 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 에서는, CDR 뿐만 아니라, FR 의 몇 개의 아미노산 잔기가 직접적 혹은 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있고, 그들 아미노산 잔기가 CDR 의 이식에 수반하여, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 이 상이한 아미노산 잔기로 변화하는 것이 고려되고 있다. 이 문제를 해결하기 위하여, 인간형 CDR 이식 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR 의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그들을 원래의 인간 이외의 동물의 항체에서 발견되는 아미노산 잔기로 개변하고, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 실시되고 있다 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].

인간형 CDR 이식 항체의 제작에 있어서는, 그들 항원 결합 활성에 관련되는 FR 의 아미노산 잔기를 얼마나 효율적으로 동정하는지가, 가장 중요한 점이고, 그 때문에 X 선 결정 해석 [J.Mol.Biol., 112, 535 (1977)] 혹은 컴퓨터 모델링 [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 실시되고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는, 인간형 CDR 이식 항체 의 제작에 많은 유익한 정보를 가져왔지만, 한편, 모든 항체에 적응 가능한 인간형 CDR 이식 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않고, 현재 상태로서는 각각의 항체에 대하여 여러 종류의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지의 시행 착오가 필요하다.

인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA 를 사용하여 본 항 2 의 (5) 에 기재된 PCR 법을 실시함으로써, 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대하여 본 항 2 의 (2) 에 기재된 방법에 의하여, 염기 서열을 결정하고, 목적의 개변이 실시된 것을 확인한다.

(7) 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축

본 항 2 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자의 상류에, 본 항 2 의 (5) 및 (6) 에서 구축한 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 본 항 2 의 (5) 및 (6) 에서 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5’말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본항 2 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 를 코드하는 유전자의 상류에 그들이 적절한 형태로 발현하도록 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.

(8) 인간화 항체의 안정적 생산

본 항 2 의 (4) 및 (7) 에 기재된 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 동물세포 에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체 (이하, 아울러 인간화 항체라고 칭한다) 를 안정적으로 생산하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.

동물세포로의 인간화 항체 발현 벡터의 도입법으로는, 일렉트로포레이션법 [일본 공개특허공보 평2-257891호; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 등을 들 수 있다.

인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물세포로는, 상기 1. 에서 제작한, 본 발명의 세포로서, 인간화 항체를 생산시킬 수 있는 동물세포이면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.

구체적으로는, 마우스 골수종 세포인 NS0 세포, SP2/O 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO/dhfr-세포, CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/O 세포, IR983F 세포, 시리안 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 인간 골수종 세포인 나마르바 세포 등을 들 수 있지만, 바람직하게는, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/O 세포 등을 들 수 있다.

인간화 항체 발현 벡터의 도입 후, 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라, G418 sulfate (이하, G418 이라고 표기한다; SIGMA사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물세포 배양용 배지에 의하여 선택할 수 있다. 동물세포 배양용 배지로는, RPMI1640 배지 (닛스이 제약사 제조), GIT 배지 (니혼 제약사 제조), EX-CELL302 배지 (JRH사 제조), IMDM 배지 (GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM 배지 (GlBCO BRL사 제조), 또는 이들 배지에 우태아 혈청 (이하, FBS 라고 표기한다) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양하는 것으로 배양 상청 중에 인간화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법 [이하, ELISA 법 이라고 표기한다; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] 등에 의하여 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라, DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.

인간화 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]. 또한, 그 외에 통상적으로, 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 실시하여, 정제할 수 있다. 정제한 인간화 항체의 H사슬, L사슬 혹은 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드겔 전기 영동 [이하, SDS-PAGE 라고 표기한다; Nature, 227, 680 (1970)] 이나 웨스턴블로팅법 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoy, Chapter 12 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] 등으로 측정할 수 있다.

B. Fc 융합 단백질의 제조

(1) Fc 융합 단백질 발현용 벡터의 구축

Fc 융합 단백질 발현용 벡터란, 인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 단백질을 코드하는 유전자가 삽입된 동물세포용 발현 벡터이고, 동물세포용 발현 벡터에 인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 단백질을 코드하는 유전자를 클로닝함으로써 구축할 수 있다.

인간 항체의 Fc 영역으로는, CH2 와 CH3 영역을 포함하는 영역 외에, 힌지 영역, CH1 의 일부가 포함되는 것도 포함된다. 또한 CH2 또는 CH3 의 적어도 하나의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입되고, Fcγ 수용체로의 결합 활성을 갖는 것이면 어떠한 것이라도 된다.

인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 단백질을 코드하는 유전자로는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA 를 사용할 수 있고, 또한, cDNA 를 사용할 수도 있다. 그들 유전자와 Fc 영역을 연결하는 방법으로는, 각 유전자 서열을 주형으로 하여, PCR 법 (레큘러·클로닝 제 2 판; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이오로지, Supplement 1-34) 을 실시하는 것을 들 수 있다.

동물세포용 발현 벡터로는, 인간 항체의 C 영역을 코드하는 유전자를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J.Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990)] 등을 들 수 있다. 동물세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로는, SV40 의 초기 프로모터와 인 핸서 [J.Biochem., 101, 1307 (1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR [Biochem.Biophys.Res.Commun., 149, 960 (1987)], 면역 글로블린 H사슬의 프로모터 [Cell, 41, 479 (1985)] 와 인핸서 [Cell, 33, 717 (1983)] 등을 들 수 있다.

(2) 인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 단백질을 코드하는 DNA 의 취득

인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 단백질을 코드하는 DNA 는 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.

목적의 Fc 와 융합시키는 단백질을 발현하고 있는 세포나 조직으로부터 mRNA 를 추출하고, cDNA 를 합성한다. 합성한 cDNA 를 퍼지 혹은 플라스미드 등의 벡터로 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 그 라이브러리로부터, 목적의 단백질의 유전자 서열 부분을 프로브로서 사용하여, 목적의 단백질을 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 퍼지 혹은 재조합 플라스미드를 단리한다. 재조합 퍼지 혹은 플라스미드 상의 목적의 단백질의 전체 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 전체 아미노산 서열을 추정한다.

인간 이외의 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 세포나 조직을 적출하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.

세포나 조직으로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산 세슘법 [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], 또한 전체 RNA 로부터 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 (몰레큘러·클로닝 제 2 판) 등을 들 수 있다. 또한, 세포나 조직으로부터 mRNA 를 조제하는 키트로는, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.

cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로는, 통상적인 방법 (몰레큘러·클로닝 제 2판; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이오로지, Supplement 1-34), 혹은 시판되는 키트, 예를 들어, Super Script^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL사 제조) 이나 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리의 제작시, 세포나 조직에서 추출한 mRNA 를 주형으로 하여 합성한 cDNA 를 삽입하는 벡터는, 그 cDNA 를 삽입할 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(＋) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λZAPⅡ (Stratagene사 제조), λgt10, λgt11 [DNA Cloning: A Practical Approach, Ⅰ, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech사 제조), λExCell, pT7T3 18U (Pharmacia사 제조), pcD2 [Mol.Cell.Biol., 3, 280 (1983)] 및 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 등이 사용된다.

퍼지 혹은 플라스미드 벡터에 의하여 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는 그 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF’[Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J.Mol.Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J.Mol.Biol., 16, 118 (1966)] 및 JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 등이 사용된다.

cDNA 라이브러리로부터의 목적의 단백질을 코드하는 cDNA 클론의 선택법으로는, 아이소토프 혹은 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법 혹은 플라크·하이브리다이제이션법 (몰레큘러·클로닝 제 2 판) 에 의하여 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하고, mRNA 로부터 합성한 cDNA 혹은 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR 법에 의하여 목적의 단백질을 코드하는 cDNA 를 조제할 수도 있다.

목적의 단백질을 인간 항체의 Fc 영역과 융합시키는 방법으로는, PCR 법을 들 수 있다. 예를 들어, 목적의 단백질의 유전자 서열의 5’측과 3’측에 임의의 합성 올리고 DNA (프라이머) 를 설정하고, PCR 법을 실시하여 PCR 산물을 취득한다. 마찬가지로, 융합시키는 인간 항체의 Fc 영역의 유전자 서열에 대해서도 임의의 프라이머를 설정하고, PCR 산물을 얻는다. 이 때, 융합시키는 단백질의 PCR 산물의 3’측과 Fc 영역의 PCR 산물의 5’측에는 같은 제한 효소 부위 혹은 같은 유전자 서열이 존재하도록 프라이머를 설정한다. 이 연결 부분 주변의 아미노산 개변이 필요한 경우에는, 그 변이를 도입한 프라이머를 사용하는 것으로 변이를 도입한다. 얻어진 2 종류의 PCR 단편을 사용하여 추가로 PCR 을 실시하는 것으로, 양 유전자를 연결한다. 혹은, 동일한 제한 효소 처리를 한 후에 라이게이션하는 것으로도 연결할 수 있다.

상기 방법에 의하여 연결된 유전자 서열을, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(－) (Stratagene사 제조) 등의 플라스미드로 클로닝하고, 통상 적으로 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어 생거 (Sanger) 의 디데옥시법 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74, 5463 (1977)] 혹은 ABI PRISM 377DNA 시퀀서 (PE Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 그 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 염기 서열로부터 Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 목적의 아미노산 서열과 비교함으로써, 취득한 cDNA 가 분비 시그널 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.

(3) Fc 융합 단백질의 안정적 생산

본 항 2 의 B(1) 항에 기재된 Fc 융합 단백질 발현 벡터를 적당한 동물세포에 도입함으로써 Fc 융합 단백질을 안정적으로 생산하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.

동물세포로의 Fc 융합 단백질 발현 벡터의 도입법으로는, 일렉트로포레이션 [일본 공개특허공보 평2-257891호; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 등을 들 수 있다.

Fc 융합 단백질 발현 벡터를 도입하는 동물세포로는, 상기 1. 에서 제작한, 본 발명의 세포로서, Fc 융합 단백질을 생산시킬 수 있는 동물세포이면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.

구체적으로는, 마우스 골수종 세포인 NS0 세포, SP2/O 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO/dhfr-세포, CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리안 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 인간 골수종 세포인 나마르바 세포 등을 들 수 있지만, 바람직하게는, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포 등을 들 수 있다.

Fc 융합 단백질 발현 벡터의 도입 후, Fc 융합 단백질을 안정적으로 생산하는 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라, G418 등의 약제를 포함하는 동물세포 배양용 배지에 의하여 선택할 수 있다. 동물세포 배양용 배지로는, RPMI1640 배지 (닛스이 제약사 제조), GIT 배지 (니혼 제약사 제조), EX-CELL302 배지 (JRH사 제조), IMDM 배지 (GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM 배지 (GIBCO BRL사 제조), 또는 이들 배지에 우태아 혈청 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양하는 것으로 배양 상청 중에 Fc 융합 단백질을 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 Fc 융합 단백질의 생산량 및 항원 결합 활성은 ELISA 법 등에 의하여 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라, dhfr 유전자 증폭계 등을 이용하여 Fc 융합 단백질의 생산량을 상승시킬 수 있다.

Fc 융합 단백질은, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼이나 프로테인 G 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다 (안티바디즈, Chapter 8, 모노클로널·안티바디즈). 또한, 그 외에 통상적으로, 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 실시하여, 정제할 수 있다. 정제한 Fc 융합 단백질 분자 전체의 분자량은, SDS-PAGE [Nature, 227, 680 (1970)] 나 웨스턴블로팅법 (안 티바디즈, Chapter 12, 모노클로널·안티바디즈) 등으로 측정할 수 있다.

이상, 동물세포를 숙주로 한 항체의 제조 방법을 나타냈지만, 상기 서술한 바와 같이, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 혹은 식물 개체에 있어서도 제조할 수 있다.

이미, 숙주 세포가 항체 분자 등의 당단백질을 발현하는 능력을 갖고 있는 경우에는, 상기 1. 에 기재된 방법을 사용하여 숙주 세포를 조제한 후에, 그 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 목적으로 하는 당단백질을 정제함으로써, 당단백질을 제조할 수 있다.

3. 당단백질의 활성 평가

정제한 당단백질의 단백량, 수용체와의 친화성, 혈액 중에서의 반감기, 혈액 투여 후의 조직으로의 분포, 혹은 약리 활성 발현에 필요한 단백질 상호작용의 변화를 측정하는 방법으로는, Current Protocols In Protein Science, John Wiley ＆ Sons Inc., (1995), 일본 생화학회편 신생화학 실험 강좌 19 동물 실험법, 토쿄 화학 동인 (1991), 일본 생화학회편 신생화학 실험 강좌 8 세포내 정보와 세포 응답, 토쿄 화학 동인 (1990), 일본 생화학회편 신생 화학 실험 강좌 9 호르몬 Ⅰ 펩티드 호르몬, 토쿄 화학 동인 (1991), 실험 생물학 강좌 3 아이소토프 실험법, 마루젠 주식회사 (1982), Monoclonal Antibodies, Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995), 효소 면역 측정법 제 3 판, 의학서원 (1987), 개정판 효소 항체법, 학제기획 (1985) 등에 기재된 공지의 방법을 사용할 수 있다.

그 구체적인 예로는, 정제한 당단백질을 라디오아이소토프 등의 화합물에서 표지하고, 표지한 당단백질의 수용체 혹은 상호작용을 하는 단백질과의 결합 반응의 강도를 정량적으로 측정하는 방법을 들 수 있다. 또한, Biacore사의 BIAcore 시리즈 등의 각종 장치를 사용하여, 단백질 단백질 상호작용을 측정할 수도 있는 [J.Immnunol.Methods, 145, 229 (1991), 실험 의학 별책 바이오 매뉴얼 UP 시리즈 단백질의 분자간 상호작용 실험법, 요도사 (1996)].

표지한 당단백질을 체내에 투여하는 것으로, 혈액 중에서의 반감기 혹은 혈액 투여 후의 조직으로의 분포를 알 수 있지만, 표지체의 검출에는, 표지 물질을 검출하는 방법과 검출의 대상이 되는 당단백질 특이적인 항체 항원 반응을 조합한 계가 바람직하다.

4. 항체 조성물의 활성 평가

정제한 항체 조성물의 단백량, 항원과의 결합성 혹은 이펙터 기능을 측정하는 방법으로는, 모노클로널 안티바디즈 혹은 안티바디 엔지니어링 등에 기재된 공지의 방법을 사용할 수 있다.

그 구체적인 예로는, 항체 조성물이 인간화 항체인 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA 법 및 형광 항체법 [Cancer Immunol.Immunother., 36, 373 (1993)] 등에 의하여 측정할 수 있다. 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 장해 활성은, CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써, 평가할 수 있다 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].

또한, 항체 조성물의 인간에서의 안전성, 치료 효과는, 게잡이원숭이 등의 사람에 비교적 가까운 동물종의 적당한 모델을 사용하여 평가할 수 있다.

5. 당단백질의 당사슬의 분석

각종 세포에서 발현시킨 당단백질의 당사슬 구조는, 통상적인 당단백질의 당사슬 구조의 해석에 준하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물의 경우, IgG 분자에 결합하고 있는 당사슬은 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스 등의 중성당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노당, 시알산 등의 산성당으로 구성되어 있고, 당조성 분석 및 2차원 당사슬맵법 등을 사용한 당사슬 구조 해석 등의 수법을 사용하여 실시할 수 있다.

이하에, 항체 조성물의 당사슬의 분석 방법을 구체적으로 나타내지만, 다른 당단백질도 동일하게 분석할 수 있다.

(1) 중성당·아미노당 조성 분석

항체 분자의 당사슬의 조성 분석은, 트리플루오로아세트산 등으로, 당사슬의 산 가수분해를 실시함으로써, 중성당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.

구체적인 방법으로서, Dionex사 제조 당조성 분석 장치 (BioLC) 를 사용하는 방법을 들 수 있다. BioLC 는 HPAEC-PAD (high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection) 법 [J.Liq.Chromatogr., 6, 1577 (1983)] 에 의하여 당조성을 분석하는 장치이다.

또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 공지된 방법 [Agruc.Biol.Chem., 55(1), 283-284 (1991)] 에 따라 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하고, HPLC 분석하 여 조성비를 산출할 수 있다.

(2) 당사슬 구조 해석

항체 분자의 당사슬의 구조 해석은, 2차원 당사슬맵법 [Anal.Biochem., 171, 73 (1988), 생물 화학 실험법 23-당단백질 당사슬 연구법 (학회 출판 센터) 타카하시 레이코편 (1989년)] 에 의하여 실시할 수 있다. 2차원 당사슬맵법은, 예를 들어, X축에는 역상 크로마토그래피 당사슬의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y 축에는 순상 크로마토그래피에 의한 당사슬의 유지 시간 또는 용출 위치를, 각각 플롯하고, 이미 알려진 당사슬의 각 결과와 비교함으로써, 당사슬 구조를 추정하는 방법이다.

구체적으로는, 항체를 히드라진 분해하여, 항체로부터 당사슬을 유리하고, 2-아미노피리딘 (이하, PA 라고 약기한다) 에 의한 당사슬의 형광 표지 [J.Biochem., 95, 197 (1984)] 를 실시한 후, 겔 여과에 의하여 당사슬을 과잉의 PA화 시약 등과 분리하고, 역상 크로마토그래피를 실시한다. 이어서, 분취한 당사슬의 각 피크에 대하여 순상 크로마토그래피를 실시한다. 이들 결과를 기초로, 2차원 당사슬맵 상에 플롯하고, 당사슬 스탠다드 (TaKaRa사 제조), 문헌 [Anal.Biochem., 171, 73 (1988)] 과의 스폿의 비교로부터 당사슬 구조를 추정할 수 있다. 또한 각 당사슬의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 실시하여, 2차원 당사슬맵법에 의하여 추정되는 구조를 확인할 수 있다.

6.도입한 RNA 의 부작용의 해석

도입한 RNA 는, 목적으로 한 효소의 기능을 억제하는 것 이외에 상동성이 높 은 서열을 갖는 유전자의 발현량이나 번역 등의 영향 [Nature Biotechnol., 21, 635 (2003), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 101, 1892 (2004)] 이 고려되기 때문에, 항체 조성물 등의 당단백질을 제조하는 경우에는, RNA 의 도입에 의한 부작용으로 형질 전환주의 생육 또는 제조하는 당단백질의 발현에 영향을 미치지 않는 것을 해석할 필요가 있다.

구체적으로는, 항체 조성물 등의 당단백질의 발현 세포에 있어서, 본 발명의 RNA 가 도입되어 있지 않은 친주 세포와 도입 세포를 동시에 배양하고, 세포의 증식 곡선 및 당단백질의 발현량에 변화가 없고, 제조된 당단백질의 여러 가지의 성질을 해석함으로써, 제조된 당단백질의 당사슬 구조 및 당사슬 구조의 차이에 기인하는 생물 활성 이외에 차이가 없다는 것을 확인한다.

제조된 당단백질의 당사슬 구조는 상기 5. 방법으로 해석할 수 있다. 당단백질의 여러 가지의 성질은, 임의의 공지된 단백질의 해석 방법으로 해석할 수 있다. 단백질의 해석 방법으로서는, 전기 영동, 겔 여과, 등전점 또는 아미노산 서열 해석 등의 물리 화학적 해석, 제조된 당단백질이 항체인 경우에는 항원에 대한 결합성, 제조된 당단백질이 효소인 경우에는 효소 활성, 그리고 당단백질이 리간드 또는 수용체인 경우에는 각각의 리간드 또는 수용체에 대한 결합성 등을 들 수 있다.

7. 당단백질의 사용

항체 조성물 등의 당단백질은, 푸코오스 수식이 없는 당사슬 구조를 가지고 있고, 예를 들어, 수용체와의 친화성의 향상, 혈중 반감기의 향상, 혈중 투여 후의 조직 분포의 개선, 또는 약리 활성 발현에 필요한 단백질과의 상호 작용의 향상 등의 효과를 기대할 수 있고 높은 생리 활성을 나타낸다. 특히, 항체 조성물은, 높은 음향 처리 장치 기능, 즉 항체 의존성 세포 장해 활성을 가지고 있다. 이들 생리 활성이 높은 당단백질, 혹은 높은 ADCC 활성을 갖는 항체 조성물은, 암, 염증 질환, 자기 면역 질환, 알레르기 등의 면역 질환, 순환기 질환, 또는 바이러스 혹은 세균 감염을 비롯한 각종 질환의 예방 및 치료에 있어서 유용하다.

암, 즉 악성 종양에서는 암 세포가 증식하고 있다. 통상의 항암제는 암 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체는, 살세포 효과에 의해 암 세포를 상해함으로써 암을 치료할 수 있기 때문에 통상의 항암제보다 치료약으로서 유효하다. 특히, 암의 치료약에 있어서, 현재 형상으로서는 항체 의약 단독의 항종양 효과는 불충분한 경우가 많고 화학 요법과의 병용 요법을 실시하고 있지만 [Science, 280, 1197, (1998)], 항체 조성물 단독으로의 보다 강한 항종양 효과가 인정되면, 화학 요법에 대한 의존도가 낮아지고, 부작용의 저감으로도 연결된다.

염증 질환, 자기 면역 질환, 알레르기 등의 면역 질환에 있어서, 그들 질환에서의 생체내 반응은, 면역 세포에 의한 메디에이터 분자의 방출에 의해 야기되기 때문에, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체를 사용하여 면역 세포를 제거함으로써, 알레르기 반응을 억제할 수가 있다.

순환기 질환으로서는, 동맥 경화 등을 들 수 있다. 동맥 경화는, 현재 발론 카테테에 의한 치료를 실시하지만, 치료 후의 재협착에서의 동맥 세포의 증식 을 높은 ADCC 활성을 갖는 항체를 사용하여 억제함으로써, 순환기 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

바이러스 또는 세균에 감염된 세포의 증식을, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체를 사용하여 억제함으로써, 바이러스 또는 세균 감염을 비롯한 각종 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 혹은 염증에 관한 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관한 항원을 인식하는 항체, 자기 면역 질환에 관한 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 혹은 세균 감염에 관한 항원을 인식하는 항체의 구체예를 이하에 진술한다.

종양 관련 항원을 인식하는 항체로서는, 항CA125항체, 항17-1A항체, 항인테그린αvβ3항체, 항CD33항체, 항CD22항체, 항HLA항체, 항HLA-DR항체, 항CD20항체, 항CD19항체, 항EGF수용체 항체[Immunology Today, 21, 403 (2000)], 항CD10항체[American Journal of Clinical Pathology, 113, 374(2000) ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, 4386(1982)], 항GD₂항체[Anticancer Res, 13, 331(1993)], 항GD₃ 항체[Cancer Immunol.Immunother, 36, 260(1993)], 항GM₂ 항체[Cancer Res,], 54, 1511(1994)], 항HER2 항체[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 4285(1992)], 항CD52 항체 [Nature, 332, 323 (1988)], 항 MAGE 항체[British J.Cancer, 83, 493 (2000)], 항HM1.24 항체[Molecular Immunol, 36, 387(1999)], 항부갑상선 호르몬 관련 단백(PTHrP) 항체[Cancer, 88, 2909(2000)], 항FGF8 항 체[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, 9911(1989)], 항염기성 섬유 아세포 증식 인자 항체, 항FGF8 수용체 항체[J.Biol.Chem, 265, 16455(1990)], 항염기성 섬유 아세포 증식 인자 수용체 항체, 항인슐린 유사 증식 인자 항체, 항인슐린 유사 증식 인자 수용체 항체[J.Neurosci.Res, 40, 647(1995)], 항PMSA항체[J.Urology, 160, 2396(1998)], 항혈관 내피 세포 증식 인자 항체[Cancer Res, 57, 4593 (1997)] 또는 항혈관 내피 세포 증식 인자 수용체 항체[Oncogene, 19, 2138(2000)] 등을 들 수가 있다.

알레르기 혹은 염증에 관한 항원을 인식하는 항체로서는, 항IgE 항체), 항CD23항체, 항CD11a 항체[Immunology Today, 21, 403 (2000)], 항CRTH2 항체[J.Immunol, 162, 1278(1999)], 항CCR8 항체(WO99/25734), 항CCR3 항체(US6207155), 항인터루킨6 항체[Immunol.Rev, 127, 5(1992)], 항인터루킨 6 수용체 항체[Molecular Immunol, 31, 371(1994)], 항인터루킨 5 항체[Immunol.Rev, 127, 5(1992)], 항인터루킨5 수용체 항체, 항인터루킨4항체[Cytokine, 3, 562 (1991)], 항인터루킨 4 수용체 항체[J.Immunol.Meth, 217, 41(1998)], 항종양괴사 인자 항체[Hybridoma, 13, 183 (1994)], 항종양괴사 인자 수용체 항체[Molecular Pharmacol, 58, 237(2000)], 항CCR4 항체[Nature, 400, 776(1999)], 항케모카인 항체[J.Immunol.Meth.174, 249 (1994)] 또는 항케모카인 수용체 항체[J.Exp.Med, 186, 1373 (1997)] 등을 들 수가 있다.

순환기 질환에 관한 항원을 인식하는 항체로서는, 항GpⅡb/Ⅲa 항체[J.Immunol, 152, 2968(1994)], 항혈소판 유래 증식 인자 항체[Science, 253, 1129(1991)], 항혈소판 유래 증식 인자 수용체 항체[J.Biol.Chem, 272, 17400(1997)] 또는 항혈액 응고 인자 항체[Circulation, 101, 1158(2000)] 등을 들 수가 있다.

자기 면역 질환, 예를 들어, 건선, 관절 류머티즘, 크론병, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 낭창, 다발성 경화증에 관한 항원을 인식하는 항체로서는, 항자기 DNA항체[Immunol.Letters, 72, 61(2000)], 항CDⅡa 항체, 항ICAM3 항체, 항CD80 항체, 항CD2 항체, 항CD3 항체, 항CD4 항체, 항인테그린α4β7 항체, 항CD40L 항체, 항IL-2 수용체 항체[Immunology Today, 21, 403 (2000)] 등을 들 수가 있다.

바이러스 혹은 세균 감염에 관한 항원을 인식하는 항체로서는, 항gp120항체 [Structure, 8, 385(2000)], 항CD4 항체[J.Rheumatology, 25, 2065(1998)], 항CCR5항체 또는 항베로 독소 항체[J.Clin.Microbiol, 37, 396(1999)] 등을 들 수가 있다.

상기 항체는, ATCC (The American Type Culture Conllection), 이화학 연구소 세포 개발 은행, 공업기술원 생명 공업 기술 연구소 등의 공적인 기관, 혹은 다이닛폰 세이야쿠 주식회사, R&D SYSTEMS사, PharMingen사, 코스모바이오사, 후나코시 주식회사 등의 민간 시약 판매 회사로부터 입수할 수 있다.

이하에, 본 발명의 Fc 영역 융합 단백질의 구체예를 진술한다.

염증 질환, 자기 면역 질환, 알레르기 등의 면역 질환에 관한 결합성 단백질과 항체 Fc 영역의 융합 단백질의 구체예로서는, sTNFRⅡS 와 Fc 영역과의 융합 단백질인 etanercept (USP5605690), 항원 제시 세포상에 발현하고 있는 LFA-3 과 Fc 영역과의 융합 단백질인 alefacept (USP5914111), Cytotoxic T Lymphocyte-associa ted antigen-4(CTLA-4) 와 Fc 영역과의 융합 단백질[J.Exp.Med, 181,1869(1995)], 인터루킨-15 와 Fc 영역과의 융합 단백질[J.Immunol, 160, 5742 (1998)], 팩터-Ⅶ 와 Fc 영역과의 융합 단백질[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 98, 12180(2001)], 인터루킨 10 와 Fc 영역과의 융합 단백질[J.Immunol, 154, 5590(1995)], 인터루킨 2 와 Fc 영역과의 융합 단백질[J.Immunol, 146, 915(1991)], CD40 과 Fc 영역과의 융합 단백질[Surgery, 132, 149(2002)], Flt-3 (fms-like tyrosine kinase) 과 항체 Fc 영역과의 융합 단백질[Acta.Haemato, 95, 218(1996)] 및 OX40 과 항체 Fc 영역과의 융합 단백질[J.Leu.Biol, 72, 522 (2002)] 등을 들 수가 있다. 이들 외에도, 각종 인간 CD 분자[CD2, CD30(TNFRSF8), CD95(Fas), CD106(VCAM-1), CD137] 이나 접착 분자 [ALCAM(Activated leukocyte cell adhesion molecule), Cadherins, ICAM(Intercellular adhesion molecule)-1, ICAM-2, ICAM-3], 사이트카인 수용체(이하, 수용체를 R 이라 표기한다) (인터루킨-4R, 인터루킨-5R, 인터루킨-6R, 인터루킨-9R, 인터루킨-10R, 인터루킨-12R, 인터루킨-13Rα1, 인터루킨-13Rα2, 인터루킨-15R, 인터루킨-21R), 케모카인, 세포사 유도 시그널 분자[B7-H1, DR6(Death receptor 6), PD-1(Programmed death-1), TRAIL R1], 공자극 분자[B7-1, B7-2, B7-H2, ICOS(Inducible costimulator)], 증식 인자 (ErbB2, ErbB3, ErbB4, HGFR) 혹은 분화 유도 인자 (B7-H3), 활성화 인자 (NKG2D), 시그널 전달분자 (gp130) 및 그 결합 단백질의 수용체나 리간드 등과 항체 Fc 영역과의 융합 단백질은 다수 보고되어 있다.

항체 조성물 등의 당단백질을 함유하는 의약은, 치료약으로서 단독으로 투여할 수도 있으나, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 혹은 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.

투여 경로는, 치료에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수가 있고, 당단백질 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수가 있다.

투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.

경구 투여에 적당한 제제로서는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제등을 들 수 있다.

유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 콩기름등의 유류, p-히드록시 벤조산 에스테르류 등의 방부제, 스트로베리플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.

주사제는, 염용액, 포도당용액, 혹은 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제된다. 또는, 당단백질을 통상적인 방법에 따라 동결 건조하여, 이것에 염화 나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.

좌제는 카카오지방, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.

또, 분무제는 그 당단백질 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 그 당단백질을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제된다.

담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 그 당단백질 및 사용하는 담체의 성질에 의해, 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또, 이들의 비경구제에서도 경구제로 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 의해 상이하나, 통상 성인 1일당 10㎍/kg∼20mg/kg 이다.

또, 항체 조성물의 경우, 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은, 인비트로 실험으로서는, CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있고, 인비보 실험으로서는, 마우스 등의 실험동물에서의 종양계를 사용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.

CDC 활성, ADCC 활성, 항종양 실험은 문헌 [Cancer Immunology Immunotherapy, 36, 373 (1993) ; Cancer Research, 54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수가 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 지나지 않고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

GMD 를 표적으로 한 small interfering RNA(siRNA) 발현 플라스미드 도입에 의한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 제작

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 구축

(1) 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트의 클로닝

이하의 순서로, 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트를 취득했다 (도 1).

우선, 인간 U6 프로모터 서열 [GenBank Acc.No.M14486] 에 결합하는 염기 서열의 5' 말단에 제한 효소 HindIII 및 EcoRV 의 인식 서열을 부가한 포워드 프라이머 (이하 hU6p-F-Hind3/EcoRV 라고 칭하고, 서열 번호 59 에 나타낸다) 및, 인간 U6 프로모터 서열에 결합하는 염기 서열의 5'말단에, 제한효소 XbaI 및 EcoRV 의 인식 서열, 터미네이터 서열에 상당하는 연속한 6염기의 아데닌, 추가로 다른 합성 올리고 DNA 삽입을 위한 제한 효소 KpnI 및 ScaI 의 인식 서열을 부가한 리버스 프라이머 (이하 hU6p-R-term-XbaI/EcoRV 라고 칭하고, 서열 번호 6O 에 나타낸다) 를 각각 설계했다.

다음으로, DNA 폴리머라제 KOD polymerase (토요 방적사 제조) 를 사용하여, 주형으로서 WO03/085118 실시예 12 에 기재된 플라스미드 U6_FUT8_B_puro 를 40 ng 함유하는 50μL 의 반응액 [KOD Buffer#1 (토요 방적사 제조), 0.1mmol/L dNTPs, 1mmol/L MgCl₂, 0.4μmol/L 프라이머 hU6p-F-Hind3/EcoRV, 0.4μmol/L프라이머 hU6p-R-term-Xba1/EcoRV] 를 조제하고, 폴리머라제 연쇄 반응 (이하, PCR 이라고 표기한다) 을 실시했다. PCR 은, 94℃ 에서 2분간의 가열 후, 94℃ 에서 15초간, 65℃ 에서 5초간, 74℃ 에서 30초간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 30 사이클의 조건으로 실시했다.

PCR 후, 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 약 300bp 의 특이적 증폭 단편을 회수하였다. 그 DNA 단편을 NEBuffer2 (New England Biolabs사 제조) 30μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 XbaI (New England Biolabs사 제조) 및 10단위의 제한 효소 HindⅢ (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 2시간 소화 반응을 실시했다. 그 반응액에 대해, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 제한 효소 소화된 DNA 단편을 회수하고, 멸균수 20μL 에 용해했다.

한편, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+)(STRATAGENE 사 제조) 1㎍ 을 100㎍/ml BSA (New England Biolabs사 제조) 를 함유하는 NEBuffer2 (New England Biolabs사 제조) 30μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 HindⅢ 및 XbaI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 8시간 소화 반응을 실시했다. 소화 반응 후, 그 반응액에 멸균수 22μL, 10×Alkaline Phosphatase Buffer 6μL 및 Alkaline Phosphatase E. coli C75(다카라 바이오사 제조) 1단위를 첨가하고, 37℃ 에서 1시간 탈인산화 반응을 실시하였다. 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 약 2.9Kb 의 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 유래의 HindⅢ-XbaI 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 DNA 단편 (약 300bp) 8μL, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 유래의 HindⅢ-XbaI 단편 (약 2.9Kb) 2μL, Ligation High (토요보사 제조) 10μL 를 혼합하여, 16℃ 에서 2시간 반응시켰다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요 방적사 제조) 를 형질 전환하여, 얻어진 암피실린 내성 클론에서 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 플라스미드를 단리했다. 그 플라스미드를 이하 pBS-U6term 이라고 칭한다.

(2) 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트의 pPUR 로의 연결

이하의 순서에서, 본 항 (1) 에서 얻은 플라스미드 pBS-U6term 에 함유되는 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트를 절단하여, 발현 벡터 pPUR (Clontech사 제조) 에 연결했다 (도 2).

우선, 상기 (1) 에서 제작한 플라스미드 pBS-U6term 1㎍ 을 100㎍/mL BSA (New England Biolabs사 제조) 를 함유하는 NEBuffer2 (New England Biolabs사 제조) 20μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 EcoRV (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 2시간 소화 반응을 실시했다. 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 약 350bp 의 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트를 함유하는 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 플라스미드 pPUR (Clontech사 제조) 6㎍ 을 NEBuffer2 (New England Biolabs사 제조) 20μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 PvuⅡ (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 2시간 소화 반응을 실시했다. 반응 후, 그 반응액에 멸균수 5μL, 10×Akaline Phosphatase Buffer 3μL 및 Alkaline Phosphatase E. coli C75 (다카라 바이오사 제조) 1단위를 첨가하여, 37℃ 에서 1시간탈인산화 반응을 실시했다. 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 약 4.3Kb 의 플라스미드 pPUR 유래의 PvuⅡ 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트를 함유하는 약 350bp 의 DNA 단편 8μL, 플라스미드 pPUR 유래의 약 4.3kb 의 PvuⅡ 단편 2μL, Ligation High (토요보사 제조) 10μL 를 혼합하고, 16℃ 에서 3시간 반응시켰다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요 방적사 제조) 를 형질 전환하여, 얻어진 암피실린 내성 클론에서 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 단리했다. 그 플라스미드 DNA 약 0.5㎍ 을 NEBuffer2 (New England Biolabs사 제조) 10μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 SacI 및 HindⅢ (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 2시간 소화 반응을 실시했다. 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, 목적으로 하는 삽입 단편의 유무 및 삽입 방향을 확인했다. 또한, 각 플라스미드에 삽입된 DNA 의 염기 서열을, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer사 제조) BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems사 제조) 를 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라 결정했다. 시퀀스 해석의 프라이머에는, pPUR PvuⅡ-seq-F (서열 번호 61 에 나타낸다) 및 pPUR PvuⅡ-seq-R (서열 번호 62 에 나타낸다) 를 사용하여 삽입 DNA 의 인간 U6 프로모터 영역의 서열이 GenBank Acc.No.M14486 의 서열과 일치하고, 인간 U6 프로모터-클로닝 사이트-터미네이터 서열 발현 카셋트의 증폭에 사용된 프라이머 영역의 서열 및 각 연결부의 서열에 착오가 없다는 것을 확인하고, 얻어진 플라스미드 중, 삽입한 hU6 프로모터의 방향이, 퓨로마이신 내성 유전자 발현 유닛과 동일 방향인 플라스미드를 선택했다. 이하, 그 플라스미드를 pPUR-U6term 으로 칭한다.

(3) 표적 서열의 선정 및 합성 올리고 DNA 의 설계

이하와 같은, 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포의 GMD 유전자에 대한 siRNA 의 표적 서열을 함유하는 2 개 사슬 DNA 카셋트를 형성하는 합성 올리고 DNA 를 제작했다.

우선, 차이니즈 햄스터 유래 GMD cDNA 서열 (GenBank Acc.No.AF525364 ; 서열 번호 8 에 나타낸다) 로부터, 이하의 조건을 충족하는 표적 서열을 7개소 선정했다. 선정한 표적 서열을 서열 번호 36∼42 에 나타냈다.

조건 1 「NAR(N17)YNN」으로 이루어지는 컨센서스 서열을 함유한다. N 은 A, G, U 또는 C 를, R 은 A 또는 G, Y 는 U 또는 C 를 각각 나타낸다.

조건 2 조건 1 을 충족하고, 3염기 이상의 동일 염기가 연속한 서열을 포함하지 않는다.

조건 3 조건 1∼2 를 충족하고, GC 함량이 보다 바람직하게는 35∼45%, 바람직하게는 45∼55% 이다.

조건 4 조건 1∼3 을 충족한 23염기의 서열의 전후로 6 염기 추가된 29염기의 서열이 조건 2 를 충족한다.

조건 5 조건 4 를 충족하고, GC 함량이 보다 바람직하게는 35∼45%, 바람직하게는 45∼55% 이다.

또한, 선정한 표적 서열에 대하여 이하의 순서로 2 개 사슬 DNA 카셋트를 설계했다. 2 개 사슬 DNA 카셋트는 5' 말단으로부터 순서대로, 제한 효소 SacI 절단에 의해 발생하는 3' 돌출 말단, 서열 번호 36∼42 에 대응하는 센스 코드 DNA, 인간 miR-23-precursor-19 micro RNA (GenBank Acc.No.AF480558) 의 10 염기의 루프 서열, 서열 번호 36∼42 에 대응하는 DNA 서열에 상보적인 안티센스 코드 DNA 및 제한 효소 KpnI 절단에 의해 발생하는 3' 돌출 말단을 갖는다. 그 2 개 사슬 DNA 의 5' 말단은 인산화했다.

서열 번호 36 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-A-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 43, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-A-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 44 에, 서열 번호 37 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-B-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 45, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-B-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 46 에, 서열 번호 38 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-C-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 47, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-C-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 48 에, 서열 번호 39 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-D-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 49, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-D-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 50 에, 서열 번호 40 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-E-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 51, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-E-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 52 에, 서열 번호 41 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-F-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 53, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-F-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 54 에, 서열 번호 42 에 나타내는 표적 서열에 대하여 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-F-F 라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 55, 안티센스사슬 (이하 GMD-dsRNA-F-R 이라고 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 56 에 각각 나타냈다. 설계한 합성 올리고 DNA 의 합성은 정법 (몰레큘러ㆍ클로닝 제 2판) 에 따라 실시했다.

(4) 합성 올리고 DNA 의 플라스미드 pPUR-U6term 에 대한 삽입

본 항 (2) 에서 취득한 pPUR-U6term의 클로닝 사이트에, 본 항 (3) 에서 합 성한 합성 올리고 DNA 의 삽입을 실시했다 (도 3).

우선, 합성 올리고 DNA 의 어닐링을 이하의 순서로 실시했다. 합성 올리고 DNA 센스사슬 및 안티센스사슬 각 200pmol 을, 어닐링 버퍼 [10mmol/L Tris (pH7.5)-50mmol/L NaCl-1mmol/L EDTA] 10μL 에 용해하고, 2분간 자비했다. 그 후, 서랭하고 약 3시간 걸쳐 실온까지 냉각했다. 그 후, 어닐링한 합성 올리고 DNA 를 멸균수로 15배 희석했다.

한편, 플라스미드 pPUR-U6term 3㎍ 을 100㎍/mL BSA(New England Biolabs사 제조) 를 함유하는 NEBuffer1 (New England Biolabs사 제조) 40μL 에 용해하고, 20단위의 제한 효소 KpnI 및 SacI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 4시간 소화 반응을 실시했다. 소화 반응 후, 그 반응액에 멸균수 12μL, 10×Alkaline Phosphatase Buffer 6μL 및 Alkaline Phosphatase E. coli C75 (다카라 바이오사 제조) 1단위를 첨가하고, 37℃ 에서 1시간 탈인산화 반응을 실시했다. 그 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 약 4.5Kb 의 플라스미드 pPUR-U6term 유래의 KpnI-SacI 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 2 개 사슬 합성 올리고 용액 1μL, 플라스미드 pPUR-U6term 유래의 KpnI-SacI 단편 1μL, 및 멸균수 8μL, Ligation High (토요보사 제조) 10μL 를 혼합하여, 16℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요 방적사 제조) 를 형질 전환하여, 얻어진 암피실린 내성 클론에 대하여, QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 단리했다.

각 플라스미드에 삽입된 DNA 의 염기 서열을, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer사 제조) 및 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems사 제조) 를 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라 결정했다. 시퀀스 해석의 주형에는, 약 1분간 자비한 후, 급냉한 플라스미드 DNA 를, 프라이머에는, pPUR PvuⅡ-seq-F (서열 번호 61), hU6p Tsp45I/seq-F (서열 번호 63) 및 pPUR PvuⅡ-seq-R(서열 번호 62) 를 사용하여 삽입된 합성 올리고 DNA 의 서열 및 연결부에 착오가 없다는 것을 확인했다. 이하, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-A-F 및 GMD-dsRNA-A-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshA, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-B-F 및 GMD-dsRNA-B-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshB, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-C-F 및 GMD-dsRNA-C-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshC, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-D-F 및 GMD-dsRNA-D-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshD, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-E-F 및 GMD-dsRNA-E-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshE, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-F-F 및 GMD-dsRNA-F-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshF, 합성 올리고 DNA GMD-dsRNA-G-F 및 GMD-dsRNA-G-R 로 이루어지는 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDshG 라고 칭한다.

2. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 도입에 의한 렉틴 내성주의 취득 및 배양

(1) GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 도입에 의한 렉틴 내성주의 취득

WO03/85118 의 참고예 1 에 기재된 방법과 동일하게 하여 취득한 CHO/DG44 세포 유래 항 CCR4 키메라 항체 생산주 32-05-12 주 (이하, 32-05-12 주라고 표기한다) 에, 본 실시예의 1. 에 있어서 구축된 플라스미드 pPUR/GMDshA, pPUR/GMDshB, pPUR/GMDshC, pPUR/GMDshD, pPUR/GMDshE, pPUR/GMDshF 혹은 pPUR/GMDshG 를 각각 도입하고, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 6위치와 푸코오스의 1위치가 α결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴인 렌즈콩 렉틴 (이하, LCA 라고 표기한다.) 내성주를 이하와 같이 하여 취득했다.

각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드의 32-05-12 주로의 유전자 도입은 엘렉트로 폴레이션법[Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 준하여 이하의 순서로 실시했다. 우선, 각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드 10㎍ 을, NEBuffer4 (New England Biolabs사 제조) 30μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 FspI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응시켜 선상화했다. 그 반응액의 일부를 아가로스겔 전기 영동에 의해, 그 플라스미드가 선상화되어 있다는 것을 확인한 후, 나머지의 반응액에 대해, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하여, 회수한 선상화 플라스미드를 멸균수 10μL 에 용해했다.

한편, 32-05-12 주를 K-PBS 완충액 [137mmol/L KCl, 2.7mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na₂HPO4, 1.5mmol/L KH₂PO₄, 4.0mmol/L MgCl₂] 에 현탁하여 8×10⁶개/mL 로 했다. 세포 현탁액 200μL (1.6×10⁶개) 를 상기 선상화 플라스미드 용액 10μL 와 혼화한 후, 세포 -DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2 mm)(BIO-RAD사 제조) 로 이동하고, 세포 융합 장치 Gene Pulser (BIO-RAD사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250μF 의 조건으로 유전자 도입을 실시했다. 유전자 도입한 후, 세포 현탁액을 기본 배지 [10% 소 태아 투석 혈청 (Invitrogen사 제조), 50㎍/mL 겐타마이신 (나카라이테스크사 제조), 및 500 nmol/L MTX(SlGMA사 제조) 를 함유하는 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (이하, IMDM 라고 칭한다 ; Invitrogen사 제조)] 에 현탁하여, 접착 세포 배양용 10cm 디쉬(팔콘사 제조) 4매로 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건하에서 24시간 배양한 후, 배양상청을 제거하고, 12㎍/mL 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 주입하고, 추가로 7일간 배양했다. 그 후, 디쉬 1매에 대해, 배양상청을 제거하고, 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 주입하고, 추가로 6∼8일간의 배양한 후, 출현한 퓨로마이신 내성 콜로니수를 계수했다. 한편, 나머지의 디쉬에 대해, 배양상청을 제거하고, 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 및 0.5mg/mL 의 농도로 LCA (VECTOR사 제조) 를 함유하는 기본 배지를 첨가하고, 추가로 7일간 배양했다. 그 결과, pPUR/GMDshB 를 도입했을 경우에 있어서 렉틴 내성주가 취득되었다.

(2) 렉틴 내성주의 확대 배양

본 항 (1) 에서 pPUR/GMDshB 도입에 의해 얻어진 렉틴 내성주를 이하의 순서 로 확대 배양했다.

우선, 각 디쉬에 출현한 코로니 수의 계수를 실시했다. 그 후, 렉틴 내성 콜로니를, 실체 현미경 관찰하에서 피펫멘 (GlLSON사 제조) 을 사용하여 긁어내어 흡수하고, 접착 세포용 U 바닥 96 웰 플레이트 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 채취했다. 트리프신 처리를 실시한 후, 접착 세포용 평저 96 웰 플레이트 (Greiner사 제조) 에 각 클론을 파종하고, 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 의 조건하에서 일주간 배양했다. 배양 후, 10클론에 대하여, 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 사용하여 확대 배양을 실시했다. 확대 배양에 제공한 세포주를, 각각 12-GMDB-1, 12-GMDB-2, 12-GMDB-3, 12-GMDB-4, 12-GMDB-5, 12-GMDB-6, 12-GMDB-7, 12-GMDB-8, 12-GMDB-9, 12-GMDB-10 이라고 명명하고, 이하의 3.에 기재된 해석에 제공했다. 또한, 12-GMDB-5 주는, 2004년 7월 1일부로 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라키현 츠쿠바시동 1-1-1 중앙 제 6) 에 FERM BP-10051 로서 기탁되어 있다.

3. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주에서의 GMD mRNA 량의 정량

(1) total RNA 의 조제

32-05-12 주 및 본 실시예의 2.에서 취득한 렉틴 내성주로부터의 tolal RNA 조제는 이하의 순서로 실시했다. 32-05-12 주는 기본 배지, 렉틴 내성주는 12 ㎍/mL 퓨로마이신 (SlGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 사용하여, 각각 3×10⁵ cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 6cm 디쉬 (팔콘사 제조) 에 4mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건하에서 3일간 정치 배양하고, 트리프신 처리에 의해 각 세포 현탁액을 회수하고, 현탁액에 대하여 1000rpm, 4℃ 의 조건으로 5분간의 원심 분리를 실시하여 상청을 제거했다. 세포를 달베크 PBS 완충액 (Invitrogen사 제조) 에 현탁하고, 재차 1000rpm, 4℃ 의 조건으로 5분간의 원심 분리를 실시하여 상청을 제거한 후, RNeasy (QIAGEN사 제조) 를 사용하여 total RNA 조제를 추출했다. 방법은 첨부된 설명서에 따라, total RNA 조제를 40μL 의 멸균수에 용해하였다.

(2) single strand cDNA 합성

본 항 (1) 에 있어서 얻어진 각각의 total RNA 3㎍ 에 대해, SUPERSCRIP^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen사 제조) 를 사용하여 첨부된 설명서에 따라, 올리고 (dT) 를 프라이머로 한 20μL 계로 역전사반응을 실시함으로써, 1 개 사슬 cDNA 를 합성했다. 그 후, RNase 처리를 실시하여, 최종 반응액 양을 40μL 로 했다. 추가로, 그 반응액을 각각, 멸균수를 사용하여 50배 희석하고, 이하에 기재된 유전자 전사량의 해석에 제공했다.

(3) SYBR-PCR 에 의한 유전자 전사량의 정량

GMD 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 이하의 순서로 실시했다.

또한, GMD 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 15 에 기재된 CHO 세포 유래 GMD cDNA 를 함유하는 플라스미드 pAGE249GMD 를 0.0512fg/μL, 0.256fg/μL, 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것을, β-엑틴 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 9 에 기재된 β-엑틴 스탠다드 플라스미드를 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL, 800fg/μL, 4000fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것을 사용했다. 또, PCR 프라이머로서는, GMD 의 증폭에는 서열 번호 64 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 65 에 나타내는 리버스 프라이머를, β-엑틴의 증폭에는 서열 번호 66 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 67 에 나타내는 리버스 프라이머를 각각 사용했다.

For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여, 본 항 (2) 에 있어서 조제한 single strand cDNA 용액 혹은 각 농도의 내부 컨트롤 플러스미드 용액을 각각 5μL 함유하는 20μL 의 반응액 [R-PCR buffer (다카라 바이오사 제조), 2.5mmol/L Mg² ⁺Solution for R-PCR (다카라 바이오사 제조), 0.3mmol/L dNTPmixture (다카라 바이오사 제조), 0.3μmol/L 포워드프라이머, 0.3μmol/L 리버스 프라이머, 2×10^-5희석 SYBR GreenI, 1 단위 TaKaRa Ex TaqR-PCR] 를 조제했다. 조제한 반응액을 96-wel1 Polypropylene PCR reaction Plate (팔콘사 제조) 의 각 웰로 분주하고, Plate Sealer (Edge Biosystems) 를 사용하여 플레이트를 시일했다. PCR 반응 및 해석에는, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System 을 사용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 GMD mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량의 측정을 실시했다.

내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하고, GMD mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량을 수치화했다. 추가로, 세포주 사이에서의 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량은 균일하다고 생각되고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 CMD mRNA 량의 상대치를 산출하여, 그 값을 비교한 결과를 도 4 에 나타냈다.

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, 친주의 8% 에서 50% 까지 GMD mRNA 량이 저하되어 있다는 것을 나타냈다.

실시예 2

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포를 사용한 항체 조성물의 생산

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 취득

실시예 1 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주 12-GMDB-2 주, 12-GMDB-5 주가 생산하는 항CCR4 키메라 항체를 이하의 순서로 취득했다.

32-05-12 주는 기본 배지, 12-GMDB-2 주, 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 사용하여, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 15mL 씩 파 종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건하에서 6일간 배양 후, 배양상청을 제거하고, 10mL 의 달베크 PBS (인비트로젠사 제조) 에서 2회 세정을 행한 후, EXCELL301 배지 (JRH Bioscience사 제조) 를 20mL 주입했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건하에서 7일간 배양 후, 배양상청을 회수하고, MabSelect (아마시얌바이오사이엔스사 제조) 칼럼을 사용하여, 첨부된 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체를 정제하였다. 각종 세포주의 배양 상청으로부터 정제한 항 CCR4 키메라 항체는, Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE 사 제조) 를 이용하여 여과 멸균하였다.

2. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 단당 조성 분석

본 실시예 제 1 항에서 취득한, 항 CCR4 키메라 항체에 대해, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)] 에 따라 단당 조성 분석을 행하였다.

세포주명	푸코오스를 갖지 않는 당사슬의 비율
32-05-12	3%
12-GMDB-2	78%
12-GMDB-5	79%

표 1 에 각 항체의 단당 조성비로 계산되는, 전체 복합형 당사슬에 차지하는 푸코오스를 가지지 않는 복합형 당사슬의 비율을 나타내었다. GMD 에 대한 siRNA 발현 벡터의 도입에 제공한 친주 32-05-12 주를 생산하는 항체 조성물의 푸코오스를 가지지 않는 당사슬의 비율이 3% 이었던 것에 대해, siRNA 도입 렉틴 내성주 12-GMDB-2 주, 12-GMDB-5 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스를 가지지 않는 당사슬의 비율은 각각 78%, 79% 이며, 친주와 비교하여 푸코오스를 가지지 않는 당사슬의 비율이 큰 폭으로 상승하고 있는 것이 나타났다.

이상의 결과에서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 의 도입에 의해, 숙주 세포가 생산하는 항체인 α1,6-푸코오스의 함량을 제어할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 3

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 무혈청 페드 배치 배양

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 무혈청 배지로의 순화

벡터 도입 전의 친주인 32-05-12 주, 실시예 1 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내주 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주의 무혈청 배지로의 순화를, 이하의 순서로 행하였다.

32-05-12 주는 기본 배지를, 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 이용하여, 각각 3×10⁵ cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 15mL 씩 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양하고, 트립신 처리에 의해 각 세포 현탁액을 회수하고, 1000rpm, 5 분간의 원심 분리를 실시하여 세포를 회수하였다. 32-05-12 주는, MTX (SIGMA 사 제조) 를 500nmol/L 의 농도로, L 글루타민 (인비트로젠사 제조) 을 6mmol/L 의 농도로, 겐타마이신 (나카라이테스크사 제조) 을 50㎍/mL 의 농도로, 3,3,5-Triiodo-L-thyronine (SIGMA 사 제조) 를 100nmol/L 의 농도로 함유하는 EX-CELL302 배지 (JRH 사 제조 ; 이하, 무혈청 배지로 칭한다) 를, 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SlGMA 사 제조) 을 첨가한 무혈청 배지를 이용하고, 각각 회수한 세포를 5×10⁵cells/mL 의 밀도로 현탁하여, 그 세포 현탁액 15mL 를 125mL 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 에 파종하였다. 배양 용기의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 통기하여 플라스크 내의 공기를 치환한 후에 밀전하고, 35℃, 90∼100rpm 으로 부유 선회 배양을 실시하였다. 3∼4 일 간격으로 계대를 반복하고, 최종적으로는 무혈청 배지에서 증식 가능한 세포주를 취득하였다. 이하, 무혈청 배지로 순화한 32-05-12 주를 32-05-12AF, 무혈청 배지로 순화한 12-GMDB-2 주를 12-GMDB-2AF, 무혈청 배지로 순화한 12-GMDB-5 주를 12-GMDB-5AF 로 각각 칭한다.

2. 무혈청 배지로 순화한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 도입 렉틴 내성 CHO/DG44 세포를 이용한 무혈청 페드 배치 배양

(1) 삼각 플라스크 무혈청 페드 배치 배양

본 실시예의 1. 에서 무혈청 배지로 순화한 32-05-12AF 주, 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주를 이용하여, 이하의 순서로 무혈청 페드 배치 배양을 실시하였다.

페드 배치 배양에는, MTX (SIGMA 사 제조) 를 500nmol/L 의 농도로, L-글루타민 (인비트로젠사 제조) 을 6mmol/L 의 농도로, 3,3,5-Triiodo-L-thyronine (SlGMA 사 제조) 를 100nmol/L 의 농도로, Pluronic F-68 (인비트로젠사 제조) 을 0.1% 의 농도로, D(+)-글루코오스 (나카라이테스크사 제조) 를 5000mg/L 의 농도로 함유하는 EX-CELL302 배지 (JRH 사 제조 ; 이하, 무혈청 페드 배치 배양 배지로 칭한다) 를, 피드용의 배지로는, 통상의 첨가 농도보다 고농도로 조제한 아미노산 (L-알라닌 0.177g/L, L-아르기닌 1 염산 0.593g/L, L-아스파라긴 1 수화물 0.177g/L, L-아스파르트산 0.212g/L, L-시스틴 2 염산 0.646g/L, L-글루타민산 0.530g/L, L-글루타민 5.84g/L, 글리신 0.212g/L, L-히스티딘 1 염산 2 수화물 0.297g/L, L-이소로이신 0.742g/L, L-로이신 0.742g/L, L-리신 1 염산 1.031g/L, L-메티오닌 0.212g/L, L-페닐알라닌 0.466g/L, L-프롤린 0.283g/L, L-세린 0.297g/L, L-트레오닌 0.671g/L, L-트립토판 0.113g/L, L-티로신 2 나트륨 2 수화물 0.735g/L, L-발린 0.664g/L), 비타민 (d-비오틴 0.0918mg/L, D-판토텐산 칼슘 0.0283g/L, 염화콜린 0.0283g/L, 엽산 0.0283g/L, myo-이노시톨 0.0509g/L, 니아신아미드 0.0283g/L, 피리독살 염산 0.0283g/L, 리보플라빈 0.00283g/L, 티아민 염산 0.0283g/L, 시아노코발라민 0.0918mg/L), 인슐린 0.314g/L 로 구성된 배지 (이하, 피드 배지로 칭한다) 를 이용하였다.

32-05-12AF 주, 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주를, 3×10⁵cells/mL 의 밀도로 무혈청 페드 배치 배양 배지에 현탁하고, 그 세포 현탁액을 250mL 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 에 40mL 씩 파종하였다. 배양 용기의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 통기시켜 플라스크 내의 공기를 치환한 후에 밀전하고, 35℃, 90∼100rpm 으로 부유 선회 배양을 행하였다. 배양 개시 후 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째에, 아미노산 등의 소비량을 보충하는 목적에서 피드 배지를 3.3mL 첨가하고, 글루코오스 농도를 제어하는 목적에서 20% (w/v) 글루코오스 용액을 완료 농도 5000mg/L 가 되도록 첨가하였다. 배양 개시 후 0 일째, 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째, 14 일째에 배양액을 2∼4mL 씩 채취하여, 본 항 (2)∼(4) 에 기재된 해석에 이용하였다. 또, 배양 개시 후 14 일째에 페드 배치 배양을 종료하고, 배양액을 전체량 회수하여, 본 항 (4) 에 기재된 해석에 이용하였다.

(2) 생세포 밀도의 측정

본 항 (1) 에서 채취한 배양 개시 후 0 일째, 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째, 14 일째의 배양액에 대해, 생세포 밀도와 세포 생존률을 트리판블루 염색에 의해 측정하였다. 32-05-12AF 주, 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주의 배양 개시 후의 각 시점에 있어서의 생세포 밀도의 결과를 도 5 에 나타내었다. 12-GMDB-2 주는, 32-05-12AF 주와 비교하여 증식 속도가 늦고, 배양 14 일째에 있어서도 세포 생존률이 높은 상태가 유지되어 있었다. 한편, 12-GMDB-5AF 주는, 배양 개시 후의 각 시점에 있어서의 생세포 밀도는 32-05-12 주와 동일하였다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 의 표적 서열은, 세포의 증식성에는 큰 영향을 미치지 않는 서열인 것이 나타났다.

(3) 항체 농도의 정량

본 항 (1) 에서 채취한 배양 개시 후 0 일째, 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째, 14 일째의 배양액의 상청 중에 함유되는 항체 농도의 정량을 이하의 순서로 행하였다.

1mL 의 항 인간 IgG (H+L) 항체 (American Qualex 사 제조) 를 둘베코 PBS (인비트로젠사 제조) 750mL 에 용해하고, 50μL 씩 ELISA 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 4℃ 에서 하룻밤 방치한 후, 용액을 제거하고, 1% BSA (Bovine Serum Albumin) 를 함유하는 PBS (이하, BSA-PBS 라고 기술한다) 를 100μL 씩 각 웰에 첨가하여, 실온에 약 1 시간 방치한 후, -20℃ 에서 보존하였다. 항체량 측정시에 플레이트를 실온에서 용해하고 웰 중의 BSA-PBS 를 제거한 후에, BSA-PBS 를 이용하여 희석한 배양 상청 용액을 50μL 씩 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 1∼2시간 방치하고, 0.05% 의 농도로 Tween20^TM 을 함유하는 PBS (이하, Tween-PBS 라고 기술한다) 로 세정하였다. 세정액의 수분을 제거한 후, BSA-PBS 를 이용하여 2000 배 희석한 Goat anti-humanIgG (H&L)-HRP (American Qualex 사 제조) 를 2 차 항체로서 50μL 씩 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 1∼2 시간 방치하여, Tween-PBS 로 세정한 후, 추가로 레진수(RESIN水) 에 의해 세정하였다. 세정 후 0.1% H₂O₂ 를 첨가한 ABTS 기질액 [2,2'-아디노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄의 0.55g 을 1L 의 0.1mol/L 시트르산 완충액 (pH 4.2) 에 용해하고, 사용 직전에 과산화 수소수를 1μL/mL 로 첨가한 용액] 을 50μL 씩 각 웰에 첨가하여 발색시켰다. 실온에서 약 15 분간 방치하고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서 5% SDS 용액을 50μL 씩 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 파장 415nm 에 있어서의 흡광도를 대조로 하여, 파장 49Onm 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 각 희석 시료의 항체 농도의 산출은, 표준 항체 정제 표준품을 이용하여 제작한 검량선 시그모이드 커브의 직선 영역을 사용하여 행해졌다. 얻어진 희석 시료의 항체 농도에 희석률을 곱하여, 배양 상청의 항체 농도를 각각 산출하였다. 32-05-12AF 주, 12-GMDB-2AF 주 12-GMDB-5AF 주의 배양 개시 후의 각 시점에 있어서의 배양 상청 중의 항체 농도의 정량 결과를 도 6 에 나타내었다. 32-05-12AF 주와 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주는, 배양 개시 후의 각 시점에 있어서의 배양 상청 중의 항체 조성물 농도는 동일하였다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 의 표적 서열은, 세포의 항체 생산성에는 영향을 미치지 않는 서열인 것이 나타났다.

(4) 항체 조성물의 당사슬 구조 해석

본 항 (1) 에서 채취한 32-05-12AF 주의 무혈청 페드 배치 배양 14 일째의 배양 상청, 및, 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주의 무혈청 페드 배치 배양 6 일째, 12 일째, 14 일째의 배양 상청으로부터, MabSelect (아마샴바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 각각 정제하였다. 정제된 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE 사 제조) 를 이용하여 여과 멸균하였다. 각각의 무혈청 순화주의 배양 상청으로부터 얻어진 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물에 대해, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577 (1983)] 에 따라 각각 단당 조성 분석을 행하였다. 각 항체 조성물의 단당 조성비로 계산되는, 전체 복합 당사슬에 차지하는 푸코오스를 가지지 않는 복합형 당사슬의 비율 (이하, 푸코오스(-)% 등으로 칭한다) 을 표 2 에 나타내었다.

세포주명	배양 일수	푸코오스(-)%
32-05-12AF	14	7%
12-GMDB-2AF	6	88%
	12	87%
	14	85%
12-GMDB-5AF	6	84%
	12	82%
	14	81%

배양 종료시인 배양 14 일째에 있어서, 32-05-12AF 주를 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 7% 인 것에 반해, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주인 12-GMDB-2AF 주 12-GMDB-5AF 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 81∼85% 이었다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내성주는, 무혈청 페드 배치 배양에 있어서도, 친주와 비교하여 푸코오스(-)% 가 높은 항체 조성물의 생산이 가능하다는 것을 나타낸다. 또한, 배양 6 일째, 12 일째, 14 일째에 있어서의 12-GMDB-2AF 주 및 12-GMDB-5AF 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는, 일정한 값을 나타내었다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드의 도입에 의한 항체 조성물의 복합형 당사슬로의 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 효과는, 무혈청 페드 배치 배양의 과정에 있어서 안정하다는 것이 나타났다.

실시예 4

α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 라이브러리를 이용한 렉틴 내성주 취득에 유효한 siRNA 표적 서열의 탐색 및 FUT8 을 표적으로 한 유효 siRNA 발현 벡터의 구축

1. α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 라이브러리 FUT8shRNAlib/pPUR 의 제작

(1) CHO 세포 유래 α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) cDNA 서열의 취득

WO00/61739 의 기재에 따라, 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포로 조제한 1 개 사슬 cDNA 로, 이하의 순서로 차이니즈 햄스터 유래 α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 코드하는 cDNA 를 클로닝하였다.

우선, 마우스 FUT8 의 cDNA 염기 서열 [GenBank Acc.No.AB025198] 에서, 5'측 비번역 영역에 특이적인 포워드 프라이머 (서열 번호 68 에 나타낸다) 및 3'측 비번역 영역에 특이적인 리버스 프라이머 (서열 번호 69 에 나타낸다) 를 설계하였다.

다음으로 DNA 폴리머라제 ExTaq (타카라 주조사 제조) 를 이용하여, CHO/DG44 세포 유래의 1 개 사슬 cDNA 1μL 를 함유하는 25μL 의 반응액 [ExTaq buffer (타카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 4% DMSO, 0.5μmol/L 상기 특이적 프라이머 (서열 번호 68 및 서열 번호 69)] 을 조제하여, PCR 을 행하였다. PCR 은, 94℃ 에서 1 분간 가열시킨 후, 94℃ 에서 30 초간, 55℃ 에서 30 초간, 72℃ 에서 2 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 하여 30 사이클을 행한 후,추가로 72℃ 에서 10 분간 반응시켰다.

PCR 후, 그 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, 특이적 증폭 단편 약 2Kb 를 회수하였다. 그 DNA 단편을, TOPO TA cloning Kit (Invitrogen 사 제조) 이용하여, 첨부된 설명서에 따라 플라스미드 pCR2.1 과 연결 반응을 실시하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α 주를 형질 전환하였다. 얻어진 카나마이신 내성 콜로니 중 cDNA 가 삽입된 8 클론으로부터, 공지된 방법에 따라 각각플라스미드 DNA 를 단리하였다.

각 플라스미드에 삽입된 cDNA 의 염기 서열은, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosytems 사 제조) 를 이용하여 첨부된 설명서에 따라, 반응 후, 동 회사의 DNA 시퀸서 ABI PRISM 377 을 이용하여 해석하였다. 본 법에 의해, 모든 플라스미드에 삽입되어 있던 cDNA 가, 차이니즈 햄스터의 FUT8 의 ORF 전체 길이를 코드하는 cDNA 인 것을 확인하였다. 서열을 결정한 플라스미드 DNA 의 삽입 cDNA 중, PCR 에 수반하는 염기의 오독(誤讀)을 포함하지 않는 플라스미드 DNA 를 선택하였다. 이하, 본 플라스미드를 CHfFUT8-pCR2.1 로 칭한다. 이와 같이 하여 결정된 차이니즈 햄스터의 FUT8cDNA 의 염기 서열을 서열 번호 1 에 나타내었다.

(2) FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 라이브러리의 조제

본 항 (1) 에서 취득한 CHfFUT8-pCR2.1 을 이용하여, WO03/46186 실시예 13에 기재된 방법에 기초하여, FUT8 을 표적으로 한 인간 tRNA-val 프로모터형 siRNA 발현 벡터 라이브러리를 제작하였다. 또한, 안티센스 코드 DNA 와 센스 코드 DNA 사이의 Loop 서열로는 제한 효소 BamHI 의 인식 서열을 이용하여, pPUR (CLONTECH 사 제조) 을 벡터로서 이용하였다. 이하, 제작한 라이브러리를 FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B 로 칭한다.

siRNA 발현 벡터 라이브러리 FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B 를 증폭하여, 플라스미드 벡터를 조제하였다. 멸균 샬레 [243mm×243mm×18mm (Nalgenunc 사 제조)] 를 이용하여 100㎍/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지를 제작하고, 거기에, 샬레 1 매 당 50μL 의 FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B 의 글리세롤 스톡을 파종하였다. 37℃ 에서 하룻밤 정치 배양한 후, 플레이트 상의 균체를 멸균수에 현탁하여 회수하고, 공지된 방법에 따라 플라스미드 DNA 를 회수하였다. 이하, 회수한 플라스미드를 FUT8shRNAlib/pPUR 로 칭한다.

2. α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 표적으로 한 siRNA 발현 라이브러리를 도입한 렉틴 내성주의 취득

본 실시예의 1. 에서 얻은 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 라이브러리 플라스미드 FUT8shRNAlib/pPUR 을, 32-05-12 주에 도입하고, α1,6-푸코오스를 특이적으로 인식하는 렉틴인 LCA 에 내성을 갖는 주를, 이하와 같이 하여 취득하였다.

본 실시예의 1. 에서 얻은 플라스미드 FUT8shRNAlib/pPUR 을 제한 효소 FspRI (New England Biolabs 사 제조) 로 소화하여 선상화하고, 선상화한 10㎍ 의 플라스미드 FUT8shRNAlib/pPUR 를 1.6×10⁶ 개의 32-05-12 주에 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3,133 (1990)] 으로 도입한 후, 기본 배지 [1% 소 태아 투석 혈청 (lnvitrogen 사 제조), 50㎍/mL 겐타마이신 (나카라이테스크사 제조), 및 500nmol/L MTX (SIGMA 사 제조) 를 함유하는 IMDM (Invitrogen 사제조)] 에 현탁하고, 접착 세포 배양용 10cm 디쉬 (Falcon 사 제조) 3 매에 8mL 씩 파종하였다. 이 때, 동일한 조건에서 10 회의 유전자 도입을 행하여, 합계 30 매의 배양용 10cm 디쉬에 있어서 배양을 실시하였다. 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 24 시간 배양 후, 퓨로마이신 (SlGNlA 사 제조) 을 12㎍/mL 의 농도로 함유하는 기본 배지 8mL 에 배지 교환하였다. 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 7 일간 배양시킨 후, 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 12㎍/mL 의 농도로, 및 LCA (VECTOR 사 제조) 를 0.5mg/mL 의 농도로 함유하는 기본 배지 8mL 에 배지 교환하고, 추가로 6∼8 일간의 배양을 실시하여, 렉틴 내성 클론을 취득하였다.

3. α,1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드의 표적 서열의 해석

(1) 렉틴 내성주 게놈 DNA 상의 siRNA 발현 카셋트의 단리

본 실시예의 2. 에서 얻어진 렉틴 내성주에 대해, 이하와 같이 하여 게놈 DNA 로 siRNA 발현 카셋트의 단리를 행하였다 (도 7).

렉틴 내성 클론을, 공지된 방법 [Gene Targeting, Oxford University Press, (1993)] 에 따라 접착 세포용 평저 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 채취하고, 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 12㎍/mL 의 농도로 함유하는 기본 배지를 이용하여 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 1 주간 배양하였다.

배양 후, 상기 플레이트의 각 클론에 대해 트립신 처리를 행하고, 2 매의 접착 세포용 평저 96 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 파종하였다. 이 중 1 매의 플레이트를 레플리카 플레이트로 하는 한편, 나머지의 1 매의 플레이트를 마스터 플레이트로 하여 동결 보존에 제공하였다. 레플리카 플레이트는, 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 12㎍/mL 의 농도로 함유하는 기본 배지를 이용하여 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 1 주간 배양한 후, 공지된 방법 [Analytical Biochemistry, 201, 331 (1992)] 에 따라 각 클론의 게놈 DNA 를 조제하고, 각각 30μL 의 TE-RNase 완충액 (pH 8.0) [10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, 200㎍/mL RNase A] 에 하룻밤 용해한 후, 0.05㎍/μL 의 농도가 되도록 멸균수로 희석하였다.

또, FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 FUT8shRNAlib/pPUR 의, siRNA 발현 카셋트의 tRNA-val 프로모터 영역의 상류에 결합하는 포워드 프라이머(서열 번호 70) 및 siRNA 발현 카셋트의 터미네이터 서열의 하류에 결합하는 리버스 프라이머 (서열 번호 71) 를 각각 설계하였다.

DNA 폴리머라제 KOD polymerase (토요 방적사 제조) 를 이용하여, 상기에서 조제한 각 클론의 게놈 DNA 를 주형으로 한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 을 행하였다. PCR 은, 각 클론에 대해, 상기의 게놈 DNA 용액을 5μL 함유하는 50μL 의 반응액 [KOD Buffer 1 (토요 방적사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 1mmol/L MgCl₂, 0.4μmol/L 상기 프라이머 (서열 번호 70 및 서열 번호 71)] 을 조제하고, 94℃ 에서 1 분간 가열한 후, 97℃ 에서 10 초간, 68℃ 에서 30 초간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 25 사이클의 조건에서 행하였다. PCR 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, siRNA 발현 카셋트를 포함하는 영역의 증폭 단편 약 300bp 를 회수하였다.

한편, 플라스미드 pPUR (CLONTECH 사 제조) 2㎍ 를 제한 효소 PvuⅡ (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응을 실시하였다. 소화 반응 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 4.3Kb 의 DNA 소화 단편을 회수하였다.

상기에서 얻어진 PCR 증폭 단편 (약 300bp) 을 Ligation High (토요 방적사 제조) 을 이용하여 플라스미드 pPUR 유래의 PvuⅡ 단편과 연결 반응을 행하였다. 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α 주를 형질 전환하였다. 얻어진 복수의 암피실린 내성 콜로니로 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA 를 단리하였다.

(2) siRNA 발현 유닛에 포함되는 표적 서열의 해석

본 항 (1) 에서 얻어진 플라스미드 중의 siRNA 발현 카셋트에 포함되는 FUT8에 대한 표적 서열의 해석을 실시하였다.

우선, 본 항 (1) 에서 얻은 각 플라스미드 DNA 에 삽입된 siRNA 발현 카셋트의 염기 서열을, BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems 사 제조) 를 이용하여 첨부된 설명서에 따라, 반응 후, 동 회사의 DNA 시퀸서 ABI PRISM 377 를 이용하여 해석하였다. 결정된 159 클론의 염기 서열 중, FUT8 에 대한 표적 서열에 대해, CHO 세포 FUT8cDNA 서열 (서열 번호 1) 과의 상동성을 비교하여, 각 표적 서열의 서열 번호 1 에 대응하는 개시점 및 종지점을 표 3에 나타내었다.

159 클론의 표적 서열 중, 대표적이었던 표적 부위에 대응하는 RNA 서열을 서열 번호 14∼23 에 나타내었다.

(3) siRNA 발현 유닛에 포함되는 표적 서열의 마우스, 래트 및 인간의 호모 로그 서열의 검색

본 항 (2) 에서 얻어진 서열 번호 14∼23 에서 나타나는 표적 서열에 상당하는 서열을 마우스, 래트 및 인간의 FUT8 의 서열 중에서, 이하와 같이 하여 검색하였다.

서열 번호 2 는 마우스의 FUT8 을, 서열 번호 3 은 래트의 FUT8 을, 서열 번호 4 는 인간 FUT8 의 서열을 각각 나타낸다. 그 서열 중에서, 본 항 (2) 에서 얻어진 서열 번호 14∼23 으로 나타나는 표적 서열에 상당하는 서열을 검색하였다. 이 때, 완전하게 일치하는 서열을 제외하였다.

이하에, 선택한 서열의 서열 번호를 각각 나타낸다. 서열 번호 14 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 85, 서열 번호 14 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 86, 서열 번호 15 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 24, 서열 번호 15 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 25, 서열 번호 15 에 대응하는 래트 FUT8 의 서열은 서열 번호 87, 서열 번호 16 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 26, 서열 번호 17 에 대응하는 인간, 마우스 및 래트 FUT8 의 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 18 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 28, 서열 번호 18 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 29, 서열 번호 18 에 대응하는 래트 FUT8 의 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 19 에 대응하는 마우스 및 래트 FUT8 의 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 19 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 32, 서열 번호 20 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 33, 서열 번호 20 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 34, 서열 번호 21 에 대응하는 마우스 FUT8 의 서열은 서열 번호 88, 서열 번호 21 에 대응하는 인간 FUT8 의 서열은 서열 번호 89, 서열 번호 22 에 대응하는 래트 FUT8 의 서열은 서열 번호 35 에 각각 나타낸다.

4. α1,6-푸코실트랜스페라아제 (FUT8) 를 표적으로 한 유효 siRNA 발현 벡터의 구축

본 실시예의 3. 에서 얻어진 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 표적 부위 중, 서열 번호 15 혹은 서열 번호 16 에 포함되는 서열을 표적 서열로 하는 siRNA 발현 벡터를 이하의 순서로 구축하였다 (도 7, 도 8 및 도 9).

본 실시예의 3. (1) 에서 얻은 siRNA 발현 카셋트를 포함하는 플라스미드 중, 표 1 에 나타내는 클론 번호 31 에 상당하는 서열 번호 15 에 포함되는 표적 서열인 서열 번호 72 로 나타나는 DNA 서열을 센스 코드 DNA 로서, 서열 번호 72 로 나타나는 DNA 서열에 상보적인 염기 서열을 안티센스 코드 DNA 로서 함유하는 플라스미드 (이하 FUT8shRNA/lib2B/pPUR 로 칭한다), 및, 표 3 에 나타내는 클론 번호 72 에 상당하는 서열 번호 16 에 대응하는 DNA 서열을 센스 코드 DNA 로서, 서열 번호 16 에 대응하는 DNA 서열에 상보적인 염기 서열을 안티센스 코드 DNA 로서 함유하는 플라스미드 (이하 FUT8shRNA/lib3/pPUR 로 칭한다) 를 선택하였다 (도 7).

먼저, 플라스미드 FUT8shRNA/lib2B/pPUR 혹은 FUT8shRNA/lib3/pPUR 1㎍ 를 NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 사 제조) 30μL 에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 XhoI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 3 시간 소화 반응을 행한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 약 250bp 의 인간 tRNA-val 프로모터 - 쇼트 헤어핀형 RNA-터미네이터 서열 발현 카셋트를 포함하는 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 1.0㎍ 를 NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 사 제조) 30μL 에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 XhoI (New England Biolabs 사 제조) 을 첨가하여 37℃ 에서 2 시간 소화 반응을 실시하였다. 반응 후, 그 반응액에 멸균수 13μL, 10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL 및 Alkaline Phosphatase E.coli C75 (다카라 바이오사 제조) 1 단위를 첨가하여, 37℃ 에서 1 시간 탈인산화 반응을 행한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 약 2.9Kb 의 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 유래의 EcoRI-XhoI 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 DNA EcoRI-XhoI 단편 (약 250bp) 8μL, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 유래의 EcoRI-XhoI 단편 (약 2.9Kb) 2μL, Ligation High (토요보사 제조) 10μL 를 혼합하여, 16℃ 에서 2 시간 반응하였다. 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α 주 (인비트로젠사 제조) 를 형질 전환하여, 얻어진 암피실린 내성 클론으로 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 이용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드 중, 플라스미드 FT8libB/pPUR 유래의 약 250bp 의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 이하 FT8libB/pBS, 플라스미드 FT8lib3/pPUR 유래의 약 250bp 의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 이하 FT8lib3/pBS 로 각각 칭하였다.

플라스미드 FT8libB/pBS 혹은 FT8lib3/pBS 1㎍ 을 NEBuffer 4 (New England Biolabs 사 제조) 20μL 에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 SmaI (New England Bio1abs 사 제조) 를 첨가하여 25℃ 에서 5 시간 소화 반응을 행한 후, 65℃, 20 분간의 가열에 의한 제한 효소 SmaI 의 불활화 처리를 행하였다. 그 반응액에 멸균수 14.6μL, 10×NEBuffer 2 (New England Biolabs 사 제조) 4μL, 100×BSA (New England Biolabs 사 제조) 0.4μL, 10 단위의 제한 효소 XhoI (New England Biohbs 사 제조) 를 각각 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응을 실시한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을이용하여 약 250bp 의 인간 tRNA-val 프로모터 - 쇼트 헤어핀형 RNA-터미네이터 서열 발현 카셋트를 포함하는 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 플라스미드 pAGE249 1㎍ 를 NEBuffer 1 (New England Biolabs 사 제조) 30μL 에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 NaeI 및 XhoI (New England Biolabs 사 제조) 을 첨가하여 37℃ 에서 6 시간 소화 반응을 실시하였다. 소화 반응 후, 그 반응액에 멸균수 22μL, 10×Alkaline Phosphatase Buffer 6μL 및 Alkaline Phosphatase E.coli C75 (다카라 바이오사 제조) 1 단위를 첨가하여, 37℃ 에서 1시간 탈인산화 반응을 행하였다. 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 약 4.4Kb 의 플라스미드 pAGE249 유래의 NaeI-XhoI 단편을 회수하였다. 또한, pAGE249 는, pAGE248 [J.Biol.Chem., 269, 14730 (1994)] 의 유도체이고, pAGE248 로 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 (dhfr) 발현 유닛을 포함하는, 제한 효소 SphI 로 절단되는, 2.7Kb 의 단편을 제거한 벡터이다.

상기에서 얻은 약 250bp 의 DNA 단편 10μL, 플라스미드 pAGE249 유래의 약 4.4Kb 의 NaeI-XhoI 단편 5μL 및 Ligation High (토요보사 제조) 15μL 를 혼합하여, 16℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α 주 (인비트로젠사 제조) 를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 이용하여 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 각 플라스미드에 삽입된 DNA 의 염기 서열을, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer 사 제조) 및 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems 사 제조) 를 이용하여, 첨부 매뉴얼에 따라 결정하였다. 시퀀스 해석의 프라이머에는, pAGE249-seq FW (서열 번호 73) 및 pAGE249-seq RV (서열 번호 74) 를 이용하여, 삽입 DNA 의 서열이, 플라스미드 FUT8shRNA/lib2B/pPUR 혹은 플라스미드 FUT8shRNA/lib3/pPUR 에 포함되는 인간 tRNA-val 프로모터 - 쇼트 헤어핀 RNA 발현 유닛인 EcoRI-XhoI 단편에 상당하는 서열과 모순되지 않는 것을 확인하였다. 본 플라스미드 중, 플라스미드 FUT8shRNA/lib2B/pPUR 유래의 약 250bp 의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 이하 FT8libB/pACE, 플라스미드 FUT8shRNA/lib3/pPUR 유래의 약 250bp 의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 이하 FT8lib3/pAGE 로 각각 칭한다.

실시예 5

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 도입 렉틴 내성주로의 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 공도입에 의한 L-푸코오스 존재 조건 하 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 제작

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주로의 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 도입에 의한 L-푸코오스 존재 하에 있어서의 렉틴 내성주의 취득 및 배양

(1) FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 도입에 의한 L-푸코오스 존재하에 있어서의 렉틴 내성주의 취득

실시예 1 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 도입 렉틴 내성주 12-GMDB-2 주 또는 12-GMDB-5 주에, 실시예 2 에 있어서 구축한 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 를 도입하고, L-푸코오스 첨가 배양 조건에 있어서의 렉틴 내성주를 취득하였다.

플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 의 12-GMDB-2 주 혹은 12-GMDB-5 주로의 유전자 도입은 상기 실시예 1 의 2. (1) 과 동일하게 행하였다.

유전자 도입 후, 세포 현탁액을 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 함유하는 기본 배지에 현탁하고, 접착 세포 배양용 10cm 디쉬 (파르콘사 제조) 4 매에 파종하였다. 37℃, 5% CO₂ 의 존재 하에서 24 시간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코 순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 각각 함유하는 기본 배지를 주입하여, 추가로 8 일간 배양하였다. 그 후, 디쉬 1 매에 대해, 배양 상청을 제거하고, 400㎍/mL 하이그로마이신 (와코 순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신(SlGMA 사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 주입하여, 추가로 6∼8 일간 배양한 후, 출현한 하이그로마이신 내성 콜로니 수를 계수하였다. 한편, 나머지 디쉬에 대해, 배양 상청을 제거하고, 400㎍/mL 하이그로마이신 (와코 순약사 제조), 3㎍/mL퓨로마이신 (SIGMA 사 제조), 100μmol/L 의 농도로 L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 0.5mg/mL 의 농도로 LCA (VECTOR 사 제조) 를 각각 함유하는 기본 배지를 주입하여, 추가로 9 일간 배양하여, 100μmol/L 의 L-푸코오스 존재 하에서의 렉틴 내성 클론, 즉 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 공도입 렉틴 내성주를 취득하였다.

(2) 렉틴 내성주의 확대 배양

본 항 (1) 에서 취득한 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 공도입 렉틴 내성주를, 이하의 순서로 확대 배양하였다.

먼저, 각 디쉬에 출현한 콜로니 수의 계수를 행하였다. 그 후, 렉틴 내성 콜로니를, 실체 현미경 관찰 하에서 피펫만 (GILSON 사 제조) 을 이용하여 긁어내어 흡입하고, 접착 세포용 U 바닥 96 웰 플레이트 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 채취하였다. 트립신 처리를 행한 후, 접착 세포용 평저 96 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 각 클론을 파종하고, 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코 순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 배양 상청을 제거하고, 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코 순약사 제조), 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조), 100μmol/L 의 농도로 L-푸코오스 (나카라이테스크사) 및 0.5mg/㎖ 의 농도로 LCA (VECTOR 사 제조) 를 함유하는 기본 배지를 이용하여, 추가로 6 일간 배양하였다. 배양 후, 상기 플레이트의 각 클론에 대해, 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코 순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 함유하는 기본 배지를 이용하여 확대 배양을 실시하였다. 이하, 확대 배양을 실시한 세포주 중, 12-GMDB-2 주에 FT8libB/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 12-GB2/FB-1, 12-GB2/FB-2, 12-GB2/FB-3, 12-GB2/FB-4, 12-GB2/FB-5 와, 12-GMDB-2 주에 FT8lib3/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 12-GB2/F3-1, 12-GB2/F3-2, 12-GB2/F3-3, 12-GB2/F3-4, 12-GB2/F3-5 와, 12-GMDB-5 주에 FT8libB/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 12-GB5/FB-1, 12-GB5/FB-2, 12-GB5/FB-3, 12-GB5/FB-4, 12-GB5/FB-5 와, 12-GMDB-5 주에 FT8lib3/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 12-GB5/F3-1, 12-GB5/F3-2, 12-GB5/F3-3, 12-GB5/F3-4, 12-GB5/F3-5 로 각각 칭한다. 또한, 12-GB5/FB-1주 및 12-GB5/F3-2 주는, 2004 년 7 월 1 일부로 독립 행정 법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 번지 1 중앙 제 6) 에 12-GB5/FB-1 주는 FERM BP-10049 로서, 12-GB5/F3-2 주는 FERM BP-10050 으로서 각각 기탁되어 있다.

2. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 L-푸코오스 존재 하 렉틴 내성주에 있어서의 GMD 및 FUT8 mRNA 양의 정량

(1) total RNA 의 조제

벡터 도입 전의 친주인 32-05-12 주, 실시예 1 에서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주인 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주, 그리고 본 실시예의 1. 에서 취득한 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 공도입한 렉틴 내성주로부터의 total RNA 조제는 이하의 순서로 행했다.

32-05-12 주는 기본 배지를, 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 포함하는 기본 배지를, GMD 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주는 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 포함하는 기본 배지를 이용하고, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하여, 접착 세포용 6㎝ 디쉬 (팔콘사 제조) 에 4mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양하고, 트립신 처리에 의해 각 세포 현탁액을 회수하고, 1000rpm, 4℃ 에서 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 둘베코 PBS 완충액 (Invitrogen사 제조) 에 현탁하고, 재차 1000rpm, 4℃ 에서 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수한 후, RNeasy (QIAGEN사 제조) 를 사용하여 total RNA 를 추출했다. 방법은 첨부된 설명서에 따라, 조제한 total RNA 를 40μL 의 멸균수에 용해했다.

(2) single strand cDNA 합성

본항 (1) 에서 얻어진 각각의 total RNA 3㎍ 에 대하여, SUPERSCRIPT^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen사 제조) 를 이용하여 첨부하는 설명서에 따라, 올리고 (dT) 를 프라이머로 한 20μL 의 계에서 역전사 반응을 행함으로써 1 개 사슬 cDNA 를 합성했다. 그 후, RNase 처리하여, 최종 반응액 양을 40μL 로 했다. 추가로 그 반응액을 각각, 멸균수를 이용하여 50 배로 희석하고, 이하에 기재하는 유전자 전사량의 해석에 제공했다.

(3) SYBR-PCR 에 의한 GMD 유전자 전사량의 정량

GMD 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 이하의 순서로 행했다. 또한, GMD 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 15 에 기재된 CHO 세포 유래 GMD cDNA 를 포함하는 플라스미드 pAGE249GMD 를 0.0512fg/μL, 0.256fg/μL, 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것을, β-엑틴 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 9에 기재된 β-엑틴 스탠다드 플라스미드를 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL, 800fg/μL, 4000fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것을 각각 사용했다. 또, PCR 프라이머로서는, GMD 의 증폭에는 서열 번호 64 로 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 65 로 나타내는 리버스 프라이머를, β-엑틴의 증폭에는 서열 번호 66 으로 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 67 로 나타내는 리버스 프라이머를 각각 사용했다.

For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (다카라 바이오사 제조) 를 이용하고, 본항 (2) 에서 조제한 single strand cDNA 용액 혹은 각 농도의 내부 컨트롤 플라스미드 용액을 각각 5μL 포함하는 20μL 의 반응액 [R-PCR buffer (다카라 바이오사 제조), 2.5mmol/L Mg² ⁺Solution for R-PCR (다카라 바이오사 제조), 0.3mmol/L dNTPmixture (다카라 바이오사 제조), 0.3㎛ol/L 포워드 프라이머, 0.3㎛ol/L 리버스 프라이머, 2×10^-5희석 SYBR GreenI, 1 단위 TaKaRa Ex Taq R-PCR] 을 조제했다. 조제한 반응액을 96-well Polypropylene PCR reaction Plate (팔콘사 제조) 의 각 웰에 분주하고, Plate Sealer (Edge Biosystems) 를 이용하여 플레이트를 시일했다. PCR 반응 및 해석에는, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System 을 이용하여 첨부 매뉴얼에 따라 GMD mRNA 양 및 β-엑틴 mRNA 양을 측정했다.

내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, GMD mRNA 양 및 β-엑틴 mRNA 양을 수치화했다. 추가로 세포주 간에서의 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량은 균일한 것으로 생각하고, β-엑틴 mRNA 양에 대한 GMD mRNA 양의 상대치를 산출하여, 그 값을 비교한 결과를 도 10 에 나타냈다. 친주인 32-05-12 주의 GMD mRNA 양과 비교하여, FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 공도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, GMD mRNA 양이 약 10% 로 저하되어 있었다.

(4) SYBR-PCR 에 의한 FUT8 유전자 전사량의 정량

FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 이하의 순서로 행했다. 또한, FUT8 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 9 에 기재된 FUT8 스탠다드 플라스미드를 0.0512fg/μL, 0.256fg/μL, 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것을, β-엑틴 정량의 내부 컨트롤로서는, WO02/31140 실시예 9 에 기재된 β-엑틴 스탠다드 플라스미드를 1.28fg/μL, 6.4fg/μL, 32fg/μL, 160fg/μL, 800fg/μL, 4000fg/μL 의 농도로 각각 희석한 것 각각을 사용했다. 또, PCR 프라이머로서는, FUT8 의 증폭에는 서열 번호 75 로 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 76 으로 나타내는 리버스 프라이머를, β-엑틴의 증폭에는 서열 번호 66 으로 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 67 로 나타내는 리버스 프라이머를 각각 사용했다.

For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여, 본항 (2) 에서 조제한 single strand cDNA 용액 혹은 각 농도의 내부 컨트롤 플라스미드 용액을 각각 5μL 포함하는 20μL 의 반응액 [R-PCR buffer (다카라 바이오사 제조), 2.5mmol/L Mg² ⁺ Solution for R-PCR (다카라 바이오사 제조), 0.3mmol/L dNTPmixture (다카라 바이오사 제조), 0.3μmol/L 포워드 프라이머, 0.3μmol/L 리버스 프라이머, 2×10^-5 희석 SYBR GreenI, 1 단위 TaKaRa Ex Taq R-PCR] 을 조제했다. 조제한 반응액을 96-well Polypropylene PCR reaction Plate (팔콘사 제조) 의 각 웰에 분주하고, Plate Sealer (Edge Biosystems) 를 이용하여 플레이트를 시일했다. PCR 반응 및 해석에는, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System 을 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 GMD mRNA 양 및 β-엑틴 mRNA 양을 측정했다.

내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하고, FUT8 mRNA 양 및 β-엑틴 mRNA 양을 수치화했다. 추가로 세포주 간에서의 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량은 균일한 것으로 생각하고, β-엑틴 mRNA 양에 대한 FUT8 mRNA 양의 상대치를 산출하여, 그 값을 비교한 결과를 도 11 에 나타냈다. 친주인 32-05-12 주의 FUT8 mRNA 양과 비교하여, FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터의 공도입에 의해 얻어진 세포주에서는 어느 것이든, EUT8 mRNA 양이 약 10% 저하되어 있었다.

실시예 6

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 CHO/DG44 세포를 이용한 항체 조성물의 생산

1. L-푸코오스 비첨가 배양 하에서의 항체 조성물의 취득

벡터 도입 전의 친주인 32-05-12 주, 실시예 1 에서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내주 12-GMDB-2 주, 12-GMDB-5 주, 그리고 실시예 3 에서 취득한 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 공도입한 렉틴 내주 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주, 12-GB5/F3-4 주가 생산하는 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 이하의 순서로 취득했다.

32-05-12 주는 기본 배지를, 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 포함하는 기본 배지를, 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주는 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 포함하는 기본 배지를 이용하고, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 15mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 6 일간 배양 후, 배양 상청을 제거하고, 10mL 의 둘베코 PBS (인비트로젠사 제조) 로 세정한 후, EXCELL301 배지 (JRH Bioscience사 제조) 를 20mL 주입했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 7 일간 배양 후, 배양 상청을 회수하고, MabSelect (아마샴 바이오 사이언스사 제조) 칼럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 정제했다. 정제한 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE사 제조) 를 이용하여 여과 멸균했다.

2. L-푸코오스 첨가 배양하에서의 항체 조성물 취득

벡터 도입 전의 친주인 32-05-12 주, 실시예 1 에서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내주 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주, 그리고 실시예 3 에서 취득한 GMD 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 플라스미드를 도입한 렉틴 내주 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주가, L-푸코오스 첨가 배양 조건에 있어서 생산하는 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 이하의 순서로 취득했다.

32-05-12 주는 기본 배지를, 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주는 12㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를, 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주는 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 이용하고, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 15mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양 후, 배양 상청을 제거하고, 32-05-12 주는 500μmol/L L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 를 첨가한 기본 배지에, 12-GMDB-2 주, 및 12-GMDB-5 주는 500μmol/L L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 및 12㎍/mL 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지에, 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주, 12-GB5/F3-4 주는 500μmol/L 의 농도로 L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조), 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지로 각각 교환했다. 추가로 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양 후, 배양 상청을 제거하고, 10mL 의 둘베코 PBS (인비트로젠사 제조) 로 세정한 후, 500μmol/L 의 농도로 L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 를 첨가한 EXCELL301 배지 (JRH Bioscience사 제조) 를 20mL 주입했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양 후, 각 플라스크에 10mmol/L L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 를 1mL 첨가하고, 추가로 4 일간 배양했다. 배양 후, 배양 상청을 회수하고, MabSelect (아마샴 바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체를 각각 정제했다. 정제한 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE사 제조) 를 이용하여 여과 멸균했다.

3.항체 조성물의 단당 조성 분석

본 실시예의 1. 및 2. 에서 취득한 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물에 대하여, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)] 에 의하여 각각 단당 조성을 분석했다. 각 항체 조성물의 단당 조성비로부터 계산되는, 푸코오스(-)% 를 표 4 에 나타냈다.

L-푸코오스 비첨가 배양 하에서는, GMD 에 대한 siRNA 발현 벡터의 도입에 제공한 친주 32-05-12 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 3% 인 것에 대하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 도입 렉틴 내성주 12-GMDB-2 주, 12-GMDB-5 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 각각 78%,79% 이며, GMD 를 표적으로 한 siRNA 를 도입함으로써, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 와 비교하여 푸코오스(-)% 가 상승되어 있다. 또한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 공도입 렉틴 내성주 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주에서는, 이들 세포가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 각각 91% 에서 98% 이며, GMD 를 표적으로 한 siRNA 를 단독으로 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 와 비교하여, 푸코오스(-)% 는 더욱 상승하였다.

또, L-푸코오스 첨가 배양 하에서는, GMD 에 대한 siRNA 발현 벡터의 도입에 제공한 친주 32-05-12 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 6% 인 것에 대하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 도입 렉틴 내성주 12-GMDB-2 주 및 12-GMDB-5 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 각각 6%, 8% 였다. 한편, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 공도입 렉틴 내성주 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주에서는, 이들 세포가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 각각 66% 에서 81% 사이의 값이고, GMD 를 표적으로 한 siRNA 를 단독으로 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 와 비교하여, 푸코오스(-)% 는 큰폭으로 상승했다.

따라서, L-푸코오스 비첨가 혹은 첨가 배양 하의 어느 경우에 있어서도, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 를 공도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는, GMD 를 표적으로 한 siRNA 를 단독으로 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 보다 높았으므로, L-푸코오스의 존재 유무에 따르지 않으며, GMD 를 표적으로 한 siRNA 단독의 도입에 의한 세포가 생산하는 항체의 복합형 당사슬에 대한 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 효과보다, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 공도입에 의한 세포가 생산하는 항체 조성물의 복합형 당사슬에 대한 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 효과가 높다는 것이 나타나 있다.

또, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 를 공도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가, GMD 를 표적으로 한 siRNA에 의한 푸코오스(-)% 의 상승 효과가 소실되는 L-푸코오스 첨가 배양 하보다, L-푸코오스 비첨가 배양 하인 편이 높았으므로, FUT8 을 표적으로 한 siRNA 단독의 도입에 의한 세포가 생산하는 항체의 복합형 당사슬에 대한 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 효과보다, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 공도입에 의한 세포가 생산하는 항체 조성물의 복합형 당사슬에 대한 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 효과가 높다는 것이 나타내어졌다.

실시예 7

GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 CHO/DG44 세포의 무혈청 페드 배치 배양

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 CHO/DG44 세포의 무혈청 배지에 대한 순화

벡터 도입 전의 친주인 32-05-12 주, 실시예 3 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 렉틴 내주 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주, 12-GB5/F3-4 주의 무혈청 배지에 대한 순화를, 이하의 순서로 행했다.

32-05-12 주는 기본 배지를, 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, I2-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주는 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SlGMA사 제조) 을 첨가한 기본 배지를 이용하고, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 15mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양하고, 트립신 처리에 의해 각 세포 현탁액을 회수하고, 1000rpm, 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 32-05-12 주는, MTX (SIGMA사 제조) 를 500nmol/L 의 농도로, L-글루타민 (인비트로젠사 제조) 을 6mmol/L 의 농도로, 겐타마이신 (나카라이테스크사 제조) 을 50㎍/mL 의 농도로, 3,3,5-Triiodo-L-thyronine (SIGMA사 제조) 을 100nmol/L 의 농도로 포함하는 EX-CELL302 배지 (JRH사 제조) (이하, 무혈청 배지라고 칭한다) 를, 12-GB2/FB-1 주, 12-GB2/FB-3 주, 12-GB2/F3-3 주, 12-GB2/F3-5 주, 12-GB5/FB-1 주, 12-GB5/FB-2 주, 12-GB5/F3-2 주 및 12-GB5/F3-4 주는 400㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 및 3㎍/mL 의 농도로 퓨로마이신 (SIGMA사 제조) 을 첨가한 무혈청 배지를 이용하여, 각각 회수한 세포를 5×10⁵ cells/mL 의 밀도로 현탁하고, 그 세포 현탁액 15mL 를 125mL 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 에 파종했다. 배양 용기의 4 배량 이상의 5% CO₂를 통기하여 플라스크 내의 공기를 치환한 후에 밀전하고, 35℃, 90∼100rpm 으로 부유 선회 배양했다. 3∼4 일 간격으로 계대를 반복하여, 최종적으로는 무혈청 배지에서 증식할 수 있는 세포주를 취득했다. 이하, 무혈청 배지에 순화된 32-05-12 주를 32-05-12AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB2/FB-1 주를 Wi2B-1AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB2/FB-3 주를 Wi2B-3AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB2/F3-3 주를 Wi23-3AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB2/F3-5 주를 Wi23-5AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB5/FB-1 주를 Wi5B-1AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB5/FB-2 주를 Wi5B-2AF, 무혈청 배지에 순화된 12-GB5/F3-2 주를 Wi53-2AF, 12-GB5/F3-4 주를 Wi53-4AF 라고 각각 칭한다.

2. 무혈청 배지에 순화된 GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 도입한 CHO/DG44 세포를 이용한 무혈청 페드 배치 배양

본 실시예의 1. 에서 무혈청 배지에 순화된 32-05-12AF 주, Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주, 및 Wi5B-1AF 주를 이용하여, 이하의 순서로 무혈청 페드 배치를 배양했다.

페드 배치 배양에는, 무혈청 페드 배치 배양 배지 및 피드 배지를 이용했다.

32-05-12AF 주, Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주, 및 Wi5B-1AF 주를, 3×10⁵ cells/mL 의 밀도로 무혈청 페드 배치 배양 배지에 현탁하고, 그 세포 현탁액을 250mL 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 에 40mL 씩 파종했다. 배양 용기의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 통기하여 플라스크 내의 공기를 치환한 후에 밀전하고, 35℃, 90∼100rpm 으로 부유 선회 배양했다. 배양 개시 후 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째에, 아미노산 등의 소비량을 보충할 목적으로 피드 배지를 3.3mL 첨가하고, 글루코오스 농도를 제어할 목적으로 20% (w/v) 글루코오스 용액을 최종농도 5000㎎/L 가 되도록 첨가했다. 배양 개시 후 0 일째, 3 일째, 6 일째, 9 일째, 12 일째, 14 일째에 배양액을 2∼4mL 채취하고, 생세포 밀도와 세포 생존률을 트리판블루 염색에 의해, 각 배양 상청 중에 포함되는 항체 농도를 본 실시예의 3. (1) 에 기재된 ELISA 에 의한 항체 농도 정량법에 의해 각각 측정했다. 32-05-12AF 주 및 Wi23-5AF 주에 대한 배양 개시 후의 각 시점에 있어서의 생세포 밀도 및 배양 상청 중의 항체 조성물 농도의 결과를 도 12 및 도 13 에 각각 나타내었다. 32-05-12AF 주와 Wi23-5AF 는 배양 개시 후의 각 시점의 생세포 밀도, 및 배양 상청 중의 항체 조성물 농도는 각각 동등했다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 표적 서열은, 세포의 증식성이나 항체의 생산성에는 큰 영향을 미치지 않는 서열인 것이 나타내어졌다.

3. 가용성 인간 FcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 지표로 한, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 6 위치에 푸코오스 1 위치가 α 결합되어 있지 않은 당사슬을 가지는 항체의 정량

본 실시예의 2. 에서 취득한 32-05-12AF 주, Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주 및 Wi5B-1AF 주의 무혈청 페드 배치 배양 상청 중에 포함되는 항 CCR4 키메라 항체 조성물의 푸코오스(-)% 를, WO03/85119의 실시예 10 에 기재된 가용성 인간 FcγRⅢa (이하, shFcγRⅢa 로 표기) 에 대한 결합 활성을 지표로 하여 이하의 순서로 측정했다.

(1) ELISA 에 의한 항체 농도의 정량

배양 상청 중의 항체 농도의 정량은, 상기 실시예 3 의 2. (3) 과 동일하게 하여 행했다.

각 희석 시료의 항체 농도 산출은, 표준 항체 정제 표준품을 이용하여 제작한 검량선 시그모이드커브의 직선 영역을 사용하여 행하고, 얻어진 희석 시료의 항체 농도에 희석율을 곱하여, 배양 상청의 항체 농도를 각각 산출했다.

(2) 푸코오스(-)% 의 상이한 표준품 조제

WO03/85119 의 실시예 4 에 기재된, YB2/0 세포 유래의 항 CCR4 키메라 항체 KM2760-1 및 CHO/DG44 세포 유래의 KM3060 을 이용하여 푸코오스(-)% 가 상이한 표준품을 조제했다. KM2760-1, KM3060, 그리고 KM2760-1 과 KM3060 을 혼합하여 조제한 9 샘플의 표준품의 합계 11 샘플의 표준품에 대하여, 실시예 4 의 3.에 기재된 단당 조성 분석에 의해 푸코오스(-)% 를 측정 한 결과, KM2760-1 은 90%, KM3060 은 10% 이며, 그리고 조제한 9 샘플의 표준품은 각각 82%, 74%, 66%, 58%, 50%, 42%, 34%, 26%, 18% 였다.

(3) 항체의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성 평가

항 CCR4 키메라 항체가 반응하는 서열 번호 77 로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 인간 CCR4 세포외 영역 펩티드의 BSA 컨쥬게이트는 WO03/85119 의 실시예 4 의 2. 에 기재된 방법과 동일하게 하여 제작했다.

제작한 인간 CCR4 세포외 영역 펩티드의 BSA 컨쥬게이트를, 1㎍/mL 의 농도로 96 웰 ELISA 용 플레이트 (그라이너사 제조) 에 50μL/웰로 분주하고, 4℃ 에서 하룻밤 방치해 흡착시켰다. PBS 로 세정한 후, BSA-PBS 를 100μL/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록했다. 각 웰을 Tween-PBS 로 세정 후, 본항 (1) 에 기재된 ELISA 로 측정한 항체 농도를 기초로 2.5㎍/mL 가 되도록 BSA-PBS 로 희석한 각 항 CCR4 키메라 항체 샘플을 50μL/웰로 각각 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 각 웰을 Tween-PBS 로 세정 후, BSA-PBS 로 5㎍/mL 로 희석한 shFcγRⅢa 용액을 50μL/웰로 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. Tween-PBS 로 세정 후, BSA-PBS 를 이용하여 0.1㎍/mL 로 조제한 HRP 표식 마우스 항체 Penta-His HRP Conjugate (QIAGEN사 제조) 를 50μL/웰로 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. Tween-PBS 로 세정 후, 본항 (2) 와 동일하게 하여 ABTS 기질액을 50μL/웰로 분주, 발색시켜, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 파장 415㎚ 에 있어서의 흡광도를 대조로 하여 파장 490㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정했다.

도 14 에, 본항 (2) 에서 조제한, 푸코오스(-)% 를 알고 있는 각 항 CCR4 키메라 항체 표준품의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 각각 나타내었다. 푸코오스(-)% 에 비례하여 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성은 상승하며, 이에 기초하여 검량선이 얻어졌다. 또한, 각 측정시에 있어서, 검량선은 96 웰 ELISA 플레이트별로 제작했다.

본 실시예의 2. 에서 채취한 무혈청 페드 배치 배양 상청 중에 포함되는 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 나타내는 파장 490㎚ 에 있어서의 흡광도로부터, 각 배양 상청 중에 포함되는 항 CCR4 키메라 항체 조성물의 푸코오스(-)% 를, 검량선을 이용하여 구했다. 32-05-12AF 주 및 Wi23-5AF 주에 대한 결과를 도 15 에 나타냈다.

32-05-12AF 주의 배양 상청 중에 포함되는 항체 조성물은, 배양 기간을 통해서 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성은 낮고, 그 푸코오스(-)% 는 약 10% 였다. 한편, Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주 및 Wi5B-1AF 주의 배양 상청 중에 포함되는 항체 조성물은, 배양 기간을 통해서 shFcγRⅢa 에 대한 강한 결합 활성을 나타내며, 그 푸코오스(-)% 는 75∼90% 이상이었다. 따라서, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 의 표적 서열은, 세포의 증식성이나 항체의 생산성에는 영향을 미치지 않고, 안정적으로 푸코오스(-)% 가 높은 항체 조성물의 생산이 가능한 서열인 것이 나타내어졌다.

4. 무혈청 페드 배치 배양 종료시의 생성 항체 조성물의 당사슬 구조 해석

(1) 무혈청 페드 배치 배양 종료시의 정제 항체 취득

본 실시예의 2. 에서 채취한 32-05-12AF 주, Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주 및 Wi5B-1AF 주의 무혈청 페드 배치 배양 14 일째의 배양 상청으로부터, MabSelect (아마샴 바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 각각 정제했다. 정제한 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22μm 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE사 제조) 를 이용하여 여과 멸균했다.

(2) 항체 조성물의 단당 조성 분석

본항 (1) 에서 취득한, 각각의 무혈청 순화주의 배양 상청으로부터 얻어진 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물에 대하여, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography), 6, 1577, (1983)] 에 의해 각각 단당 조성을 분석했다.

각 항체 조성물의 단당 조성비로부터 계산되는, 푸코오스(-)% 를 표 5 에 나타내었다.

세포주명	푸코오스(-)%
32-05-12AF	7%
Wi23-3AF	87%
Wi23-5AF	81%
Wi5B-1AF	81%

32-05-12AF 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 7% 인 것에 대하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 공도입한 렉틴 내성주인 Wi23-3AF 주, Wi23-5AF 주 및 Wi5B-2AF 주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 80∼90% 정도이며, 친주와 비교하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 발현 벡터 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 발현 벡터를 공도입한 렉틴 내성주에서는, 항체 조성물의 복합형 당사슬에 대한 α1,6-푸코오스 부가를 억제하는 상태가 배양 종료시에도 유지되고 있다는 것이 나타내어졌다.

실시예 8

GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 CHO/DG44 세포를 이용한 항체 조성물의 생산

1. GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 구축

(1) 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 유닛의 취득

실시예 1 의 1. 에서 구축한 pPUR/GMD shB 를 이용하여, 이하의 순서로, 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트를 취득했다 (도 16).

우선, pPUR/GMD shB 의 인간 U6 프로모터 서열의 상류에 결합하는 서열에 제한 효소 XhoI 의 인식 서열을 부가시킨 포워드 프라이머 PUR-FW-XhoI (서열 번호 78) 및 siRNA 발현 카셋트의 터미네이터 서열의 하류에 결합하는 리버스 프라이머 PUR-RV-XhoI (서열 번호 79) 를 각각 설계했다.

DNA 폴리머라제 KOD polymerase (토요보사 제조) 를 이용하여, pPUR/GMDshB 를 주형으로 한 PCR 을 행했다. PCR 은, pPUR/GMDshB 를 10ng 포함하는 20μL 의 반응액 [KOD Buffer 1 (토요 방적사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 1mmol/L MgCl₂, 0.4μmol/L 상기 프라이머 (서열 번호 78 및 서열 번호 79), 1U KOD polymerase] 를 조제하여, 98℃ 에서 1 분간 가열한 뒤, 98℃ 에서 15 초간, 65℃ 에서 5 초간, 74℃ 에서 30 초간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 25 사이클의 조건으로 행했다. PCR 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하여, 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트를 포함하는 영역의 증폭 단편 약 600bp 를 회수하였다.

상기에서 얻어진 PCR 증폭 단편 (약 600bp) 을 Ligation High (토요 방적사 제조) 를 이용하여 pCR-BluntⅡ-TOPO (인비트로젠사 제조) 와 연결 반응을 행했다. 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α 주를 형질 전환시켰다. 얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니로부터 QIAprep spin Mini prep kit (키아겐사 제조) 를 이용하여 플라스미드 DNA 를 단리했다. 이하, 본 플라스미드를 pCR/GMDshB 라고 칭한다.

(2) GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 구축

본항 (1) 에서 구축한 플라스미드 pCR/GMDshB 및 실시예 4 의 4. 에 있어서 구축한 플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 를 이용하여, 이하의 순서로, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 구축했다 (도 17).

우선, 플라스미드 pCR/GMDshB 를 100㎍/mL BSA (New England Biolabs사 제조) 를 포함하는 NEBuffer 2 (New England Biolabs사 제조) 40μL 에 용해시키고, 10 단위의 제한 효소 XhoI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응을 행했다. 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 약 600bp 의 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트를 포함하는 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 1㎍ 을 100㎍/mL BSA (New England Biolabs사 제조) 를 포함하는 NEBuffer 2 (New England Biolabs사 제조) 40μL 에 용해시키고, 10 단위의 제한 효소 XhoI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응을 행했다. 반응 후, 그 반응액 20μL 에 멸균수 15μL, 10×Alkaline Phosphatase Buffer 4μL 및 Alkaline Phosphatase E. coli C75 (다카라 바이오사 제조) 1 단위를 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간 탈인산화 반응을 행했다. 그 반응액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하고, RECOCHIP (다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 약 4.7Kb 의 플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 유래의 XhoI 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트를 포함하는 약 600bp 의 DNA 단편 5μL, 플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 유래의 약 4.7kb 의 XhoI 단편 5μL 및 Ligation High (토요 방적사 제조) 10μL 를 혼합하고, 16℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α주 (토요 방적사 제조) 를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 을 이용하여 플라스미드 DNA 를 단리했다. 각 플라스미드에 대하여, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer사 제조) 및 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems사 제조) 을 이용하여, 첨부 매뉴얼에 따라 염기 서열을 확인했다. 시퀀스 해석의 프라이머에는, pPUR PvuⅡ-seq-F (서열 번호 61 로 나타낸다), pPUR PvuⅡ-seq-R (서열 번호 62 로 나타낸다), hU6pTsp45I/seq-F (서열 번호 63), pAGE249-seqFW (서열 번호 73) 및 pAGE249-seqRV (서열 번호 74) 를 이용했다. 서열 해석의 결과, siRNA 발현력 세트의 서열에 오류가 없고, 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트와 인간 tRNA-val 프로모터 하 FUT8 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 동일 방향인 클론을 선택했다. 이하, FT8libB/pAGE 에 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 삽입된 플라스미드를 FT8libB_GMDB/pAGE 및 FT8lib3/pAGE 에 인간 U6 프로모터 하 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 삽입된 플라스미드를 FT8lib3_GMDB/pAGE 라고 각각 칭한다.

2. GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 도입에 의한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주의 취득 및 배양

(1) GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 도입에 의한 렉틴 내성주의 취득

32-05-12 주에, 본 실시예의 1. 에 있어서 구축한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 FT8libB_GMDB/pAGE 혹은 FT8lib3_GMDB/pAGE 를 도입하여, 이하의 순서로, 렉틴 내성주를 취득했다.

플라스미드 FT8libB_GMDB/pAGE 혹은 FT8lib3_GMDB/pAGE 의 32-05-12 주에 대한 유전자 도입은 실시예 1 의 2. (1) 과 동일하게 행했다.

유전자 도입 후, 세포 현탁액을 기본 배지에 현탁하여, 접착 세포 배양용 1 0㎝ 디쉬 (팔콘사 제조) 10매에 파종했다. 37℃, 5% CO₂의 존재 하에서 24시간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 500㎍/mL 의 농도로 하이그로마이신 (와코우순약사 제조) 을 포함하는 기본 배지 (이하, Hyg500-IMDM 배지라고 칭한다) 를 주입하고, 추가로 8 일간 배양하여, 출현한 하이그로마이신 내성 콜로니수를 계수했다. 추가로 일부의 디쉬에 대하여, 배양 상청을 제거하고, LCA-IMDM 배지 [5% 소태아 투석 혈청 (Invitrogen사 제조), 50㎍/mL 겐타마이신 (나카라이테스크사 제조), 500㎚ol/L MTX (SIGMA사 제조), 1mmol/L L-Fucose (나카라이테스크사 제조), 및 500㎍/mL LCA (VECTOR사 제조) 를 포함하는 IMDM 배지 (Invitrogen사 제조)] 를 주입하고, 추가로 7 일간 배양했다. 그 결과, 플라스미드 FT8libB_GMDB/pAGE 혹은 FT8lib3_GMDB/pAGE 중 어느 하나를 유전자 도입한 경우에도, 높은 빈도로 렉틴 내성주가 취득되었다.

(2) 렉틴 내성주의 확대 배양

본항 (1) 에서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성주를, 이하의 순서로 확대 배양했다.

우선, 각 디쉬에 출현한 콜로니수를 계수했다. 그 후, 렉틴 내성 콜로니를, 실체 현미경 관찰 하에서 피펫트만 (GILSON사 제조) 을 이용하여 긁어내 어 빨아들여, 접착 세포용 U 바닥 96 웰 플레이트 (아사히 테크노 글래스사 제조) 헤 채취했다. 트립신 처리한 후, 접착 세포용 평저 96 웰 플레이트 (Greiner사 제조) 에 각 클론을 파종하고, LCA-IMDM 배지를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 배양 상청을 제거하고, 새롭게 Hyg500-IMDM 배지를 주입하고, 추가로 9 일간 배양했다. 배양 후, 상기 플레이트의 각 클론에 대하여, Hyg500-IMDM 배지를 이용하여 확대 배양했다. 이하, 확대 배양한 세포주 가운데, 32-05-12 주에 FT8libB_GMDB/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 iBcho-H1 주, iBcho-H2 주, iBcho-H3 주, iBcho-H4 주, iBcho-H5 주와 32-05-12 주에 FT8lib3_GMDB/pAGE 를 도입하여 얻어진 렉틴 내성주를 i3cho-H1 주, i3cho-H2 주, i3cho-H3 주, i3cho-H4 주, i3cho-H5 주, i3cho-H6 주, i3cho-H7 주 및 i3cho-H8 주라고 각각 칭한다.

3. GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주에 있어서의 GMD mRNA 양 및 FUT8 mRNA 양의 정량

(1) total RNA 의 조제

32-05-12 주, 그리고 본 실시예의 2. 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성주인 iBcho-H1 주, iBcho-H2 주, iBcho-H3 주, iBcho-H4 주, iBcho-H5 주, i3cho-H1 주, i3cho-H2 주, i3cho-H3 주, i3cho-H4 주, i3cho-H5 주, i3cho-H6 주, i3cho-H7 주 및 i3cho-H8 주로부터의 total RNA 조제는 이하의 순서로 행했다.

32-05-12 주는 기본 배지를, iBcho-H1 주, iBcho-H2 주, iBcho-H3 주, iBcho-H4 주, iBcho-H5 주, i3cho-H1 주, i3cho-H2 주, i3cho-H3 주, i3cho-H4 주, i3cho-H5 주, i3cho-H6 주, i3cho-H7 주 및 i3cho-H8 주는 Hyg500-IMDM 배지를 이용하여, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 6 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 2mL 씩 파종했다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3 일간 배양하고, 트립신 처리에 의해 각 세포 현탁액을 회수하고, 현탁액에 대하여 1000rpm, 4℃ 에서 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포를 둘베코 PBS 완충액 (Invitrogen사 제조) 에 현탁하고, 재차 1000rpm, 4℃ 에서 5분간의 원심 분리를 실시하여 세포를 회수한 후, 회수한 세포로부터 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사 제조) 를 사용하여 첨부의 설명서에 따라, 각각 total RNA 를 추출하였다. 조제한 total RNA 는 40μL 의 멸균수에 용해하였다.

(2) single strand cDNA 의 합성

본항 (1) 에 있어서 얻어진 각각의 total RNA 3㎍ 에 대해, SuperScriptⅢ First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen사 제조) 를 사용하여 첨부의 설명서에 따라, 올리고 (dT) 를 프라이머로 한 20μL 의 계로 역전사 반응을 실시함으로써, 1 개 사슬 cDNA 를 각각 합성하였다. 합성한 1 개 사슬 cDNA 는 각각 RNase 처리를 실시하여, 최종 반응액 양을 40μL 로 하였다. 또한, 그 반응액은 각각 멸균수를 사용하여 50배로 희석하고, 이하에 기재하는 유전자 전사량의 해석에 제공하였다.

(3) SYBR-PCR 에 의한 GMD 유전자 전사량의 정량

GMD 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 실시예 5 의 2.(3) 에 기재된 순서로 실시하였다. 또한, PCR 프라이머로서는, GMD 의 증폭에는 서열 번호 80 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 81 에 나타내는 리버스 프라이머를, β-엑틴의 증폭에는 서열 번호 66 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 67 에 나타내는 리버스 프라이머를 각각 사용하였다. 내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, GMD mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량을 수치화하였다. 32-05-12 주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 100 으로 하고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 18 에 나타내었다. 친주인 32-05-12 주의 GMD mRNA 량과 비교하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, GMD mRNA 량이 약 10% 로 저하하고 있었다.

(4) SYBR-PCR 에 의한 FUT8 유전자 전사량의 정량

FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 실시예 5 의 2.(4) 에 기재된 순서로 실시되었다. 또한, PCR 프라이머로서는, FUT8 의 증폭에는 서열 번호 75 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 76 에 나타내는 리버스 프라이머를, β-엑틴의 증폭에는 서열 번호 66 에 나타내는 포워드 프라이머 및 서열 번호 67 에 나타내는 리버스 프라이머를 각각 사용하였다. 내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, FUT8 mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량을 수치화하였다.

32-05-12 주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 100 으로 하고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 FUT8 mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 19 에 나타내었다. 친주인 32-05-12 주의 FUT8 mRNA 량과 비교하여, GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 를 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, FUT8 mRNA 량이 약 5% 로 저하하고 있었다.

4. GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주를 이용한 항체 조성물의 생산과 해석

(1) GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주의 생성 항체 조성물의 생산

32-05-12 주, 그리고 본 실시예의 2. 에 있어서 취득한 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성주인 iBcho-H2 주, iBcho-H3 주, i3cho-H1 주, i3cho-H2 주, i3cho-H3 주, i3cho-H4 주, i3cho-H5 주, i3cho-H6 주, i3cho-H7 주 및 i3cho-H8 주가 생산하는 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 이하의 순서로 취득하였다.

32-05-12 주는 기본 배지를, iBcho-H2주, iBcho-H3주, i3cho-H1주, i3cho-H2주, i3cho-H3주, i3cho-H4주, i3cho-H5주, i3cho-H6주, i3cho-H7주 및 i3cho-H8주는 Hyg500-IMDM 배지를 이용하여, 각각 3×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 접착 세포용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 에 10mL 씩 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 5일간 배양 후, 배양 상청을 제거하여, 10mL 의 둘베코 PBS (인비트로젠사 제조) 로 2회 세정을 실시한 후, EXCELL301 배지 (JRH Bioscience사 제조) 를 24mL 주입하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 7일간 배양 후, 배양 상청을 각각 회수하여, MabSelect (아마샴바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하고, 첨부의 설명서에 따라, 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 각각 정제하였다. 각종 세포주의 배양 상청으로부터 정제한 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MlLLIPORE사 제조) 를 이용하여 여과 멸균하였다.

(2) 항체 조성물의 단당 조성 분석

본 실시예의 4.(1) 에서 취득한, 항 CCR4 키메라 항체 조성물에 대해, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)] 에 따라 각각 단당 조성 분석을 실시하였다.

각 항체의 단당 조성비에 의해 계산되는, 푸코오스(-)% 를 표 6 에 나타내었다. 또한, 푸코오스 유래의 피크가 검출되지 않았던 경우에는, 푸코오스(-)% 를 100% 로서 나타내었다.

세포주명	푸코오스(-)%
32-05-12	4%
iBcho-H2	100%
iBcho-H3	99%
i3cho-H1	100%
i3cho-H2	100%
i3cho-H3	100%
i3cho-H4	98%
i3cho-H5	100%
i3cho-H6	98%
i3cho-H7	100%
i3cho-H8	100%

벡터를 도입하기 전의 친주 세포인 32-05-12 주의 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 4% 인 것에 대해, 32-05-12 주를 친주로서 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 98∼100% 이며, 친주와 비교하여 현저히 상승하고 있었다. 이 결과로부터, CHO/DG44 세포에 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입함으로써, 푸코오스 함량이 적은 항체 조성물을 생산하는 세포로 변환할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 9

마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 SP2/0 세포를 이용한 항체 조성물의 생산

1. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 구축

(1) 인간 U6 프로모터 하 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 벡터의 구축

이하의 순서로, 마우스 GMD 유전자에 대한 siRNA 발현 벡터를 구축하였다 (도 20).

먼저, 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포에 있어서 유효한 GMD 에 대한 siRNA 발현 벡터 pPUR/GMDshB 의 표적 서열인 서열 번호 37 에 대응하는 마우스 서열 (서열 번호 58 에 나타낸다) 을 표적 서열로서 선정하였다. 또한, 선정한 표적 서열에 대해, 실시예 1 의 1.(3) 과 동일하게 2 개 사슬 DNA 카셋트를 설계하였다. 설계한 합성 올리고 DNA 의 센스사슬 (이하 mGMD-B-F 로 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 82, 안티센스사슬 (이하 mGMD-B-R 로 칭한다) 의 염기 서열을 서열 번호 83 에 각각 나타내었다.

또한, 실시예 1 의 1.(4) 와 동일하게, 실시예 1 의 1.(2) 에 있어서 취득한 pPUR-U6term 에, 상기의 합성 올리고 DNA 를 어닐링시켜 얻어진 2 개 사슬 DNA 를 삽입하여 얻어진 플라스미드 DNA 의 염기 서열을, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer사 제조) 및 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems사 제조) 를 이용하여, 첨부 매뉴얼에 따라 결정하였다. 시퀀스 해석의 프라이머에는, pPUR PvuⅡ-seq-F (서열 번호 61) 및 pPUR PvuⅡ-seq-R (서열 번호 62) 를 사용하여, 삽입된 합성 올리고 DNA 의 서열 및 연결부에 실수가 없는 것을 확인하였다. 이하, 합성 올리고 DNAm GMD-B-F 및 mGMD-B-R 을 어닐링시켜 얻어진 2 개 사슬 DNA 가 삽입된 플라스미드를 pPUR/GMDmB 로 칭한다.

(2) 인간 U6 프로모터 하 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 유닛의 취득

본항 (1) 에 있어서 구축한 pPUR/GMDmB 를 이용하여, 실시예 6 의 1.(1) 과 동일한 순서로, 인간 U6 프로모터 하 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트를 취득하였다 (도 16).

얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니에 의해 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 이용하여 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 이하, 본 플라스미드를 pCR/GMDmB 로 칭하였다.

(3) 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 구축

본항 (2) 에서 구축한 플라스미드 pCR/GMDmB 및 실시예 2 의 4. 에 있어서 구축한 플라스미드 FT8libB/pAGE 혹은 FT8lib3/pAGE 를 이용하여, 실시예 6 의 1.(2) 와 동일한 순서로, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 구축하였다 (도 17).

얻어진 암피실린 내성 클론에 의해 QIAprep spin Mini prep Kit (키아겐사 제조) 를 이용하여 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 각 플라스미드에 대해, DNA 시퀀서 377 (Parkin Elmer사 제조) 및 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems사 제조) 를 이용하여, 첨부 매뉴얼에 따라 염기 서열의 확인을 실시하였다. 시퀀스 해석의 프라이머에는, pPUR PvuⅡ-seq-F (서열 번호 61 로 나타낸다), pPUR PvuⅡ-seq-R (서열 번호 62 에 나타낸다), hU6pTsp45I/seq-F (서열 번호 63), pAGE249-seqFW (서열 번호 73) 및 pAGE249-seqRV (서열 번호 74) 를 이용하였다.

서열 해석의 결과, siRNA 발현 카셋트의 서열에 실수가 없고, 인간 U6 프로모터 하의 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트와 인간 tRNA-val 프로모터 하의 FUT8 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 동일한 방향으로 삽입된 클론을 선택하였다. 이하, FT8libB/pAGE 에 인간 U6 프로모터 하 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 삽입된 플라스미드를 FT8libB_GMDmB/pAGE, FT8lib3/pACE 에 인간 U6 프로모터 하 마우스 GMD 에 대한 siRNA 발현 카셋트가 삽입된 플라스미드를 H8lib3_GMDmB/pAGE 로 각각 칭한다.

2. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터의 도입에 의한 렉틴 내성 SP2/0 세포주의 취득 및 배양

일본 공개특허공보 평6-205694 의 실시예 1 에 기재된 항 GM₂ 키메라 항체를 생산하는 마우스 미에로마 SP2/0 세포 (ATCC CRL-1581) 의 형질 전환 세포주 KM968 주 (이하, KM968 주라고 기재한다) 에, 본 실시예의 1. 에 있어서 구축한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 FT8libB_GMDmB/pAGE 혹은 FT8lib3_GMDmB/pAGE 를 도입하여, 이하의 순서로, 렉틴 내성주를 취득하였다.

각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드의 KM968주로의 유전자 도입은 일렉트로포레이션법 [Cytotechno1ogy, 3, 133 (1990)] 에 기준하여 이하의 순서로 실시하였다.

먼저, 각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드 10㎍ 를, NEBuffer4 (New England Biolabs사 제조) 30μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 FspI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응시켜 선상화하였다. 그 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동에 의해, 그 플라스미드가 선상화되어 있는 것을 확인한 후, 나머지의 반응액에 대해, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하여, 회수한 선상화 플라스미드를 멸균수 10μL 에 용해하였다.

한편, KM968 주를 K-PBS 완충액에 현탁하고 1.6×10⁷cells/mL 로 하였다. 세포 현탁액 200μL (3.2×10⁶cells) 를 상기 선상화 플라스미드 용액 10μL 와 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전체량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm)(BIO-RAD사 제조) 에 옮기고, 세포 융합 장치 Gene Pulser (BIO-RAD사 제조) 를 이용하여 펄스 전압 200V, 전기 용량 250μF 의 조건에서 유전자 도입을 실시하였다.

유전자 도입 후, 세포 현탁액을 RPMI-FBS(10)-MTX(500) 배지 [소 태아 혈청 (Invitrogen사 제조) 를 10%, MTX (SIGMA사 제조) 를 500nmol/L 로 포함한 RPMI1640 배지 (Invitrogen사 제조)] 에 현탁하고, 부유 배양용 T75 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 1 개로 파종하였다. 37℃, 5% CO₂ 의 존재 하에서 24시간 배양한 후, 하이그로마이신 (와코준야꾸사 제조) 을 최종농도가 500㎍/mL 가 되도록 첨가하여, 추가로 3일간 배양하였다. 배양 후, 80Orpm, 5분간의 원심 분리에 의해 세포를 회수하고, 생세포수가 0.5∼1×10⁴cel1s/mL 가 되도록 하이그로마이신 (와코준야꾸사 제조) 을 500㎍/mL 로 포함한 RPMI-FBS(10)-MTX(500) 배지 (이하, RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지로 칭한다) 에 현탁하고, 96 웰 배양용 플레이트 (그라이너사 제조) 에 100μL 씩 파종하였다. 그 후, 2∼3일에 한 번, 배양 상청의 반량을 신선한 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지에 교환하는 조작을 반복하면서, 2주간 배양하였다.

배양 후, 96 웰 배양용 플레이트의 각 웰의 세포를, 2매의 96 웰 배양용 플레이트에 분할하고, 1매를 마스터 플레이트, 또 1매를 레플리카 플레이트로 하였다. 마스터 플레이트는 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지로, 레플리카 플레이트는, L-푸코오스 (나카라이테스크사 제조) 를 1mmol/L 로, LCA (VECTOR사 제조) 를 500㎍/mL 로 포함한 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지로, 각각 3일간 배양하였다. 그 결과, 마스터 플레이트에 있어서 양호한 증식이 인정된 웰에 대응하는 레플리카 플레이트의 웰의 약 3할에 있어서, LCA 존재 하에서도 양호한 증식이 인정되었다.

레플리카 플레이트에 있어서 양호한 증식이 인정된 웰에 대응하는 마스터 플레이트의 세포에 대해, RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지를 이용하여 확대 배양을 실시하였다. 이하, 확대 배양에 제공한 세포주 중, FT8libB_GMDmB/pAGE 를 도입하여 얻어진 세포주를 968iB-1 주, 968iB-2 주, 968iB-3 주, 968iB-4 주, 968iB-5 주, 968iB-6 주, 968iB-7 주와, FT8lib3_GMDmB/pAGE 를 도입하여 얻어진 세포주를 968i3-1 주, 968i3-2 주, 968i3-3 주, 968i3-4 주, 968i3-5 주, 968i3-6 주, 968i3-7 주, 968i3-8 주, 968i3-9 주, 968i3-10 주로 각각 칭한다.

3. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 SP2/0 세포주에 있어서의 GMD mRNA 량 및 FUT8 mRNA 량의 정량

(1) total RNA 의 조제

KM968주, 그리고 본 실시예의 2. 에 있어서 취득한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성 SP2/0 세포주인 968iB-1주, 968iB-2주, 968iB-3주, 968iB-4주, 968iB-5주, 968iB-6주, 968iB-7주, 968i3-1주, 968i3-2주, 968i3-3주, 968i3-4주, 968i3-5주, 968i3-6주, 968i3-7주, 968i3-8주, 968i3-9주 및 968i3-10주로부터의 total RNA 조제는 이하의 순서로 실시하였다.

KM968주는 RPMI-FBS(10)-MTX(500) 배지를, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성 SP2/0 세포주는RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지를 이용하여, 각각 1×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 부유 배양용 T75 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3일간 배양하고, 세포수를 계수 후, 각 5×10⁵cells 상당량을 분취하였다. 800rpm, 5분간의 원심 분리를 실시하고 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 둘베코 PBS 완충액 (Invitrogen사 제조) 에 현탁하고, 재차 800rpm, 5분간의 원심 분리를 실시하여 세포를 회수한 후, RNeasy Micro Kit (QIAGEN사 제조) 를 사용하고 방법은 첨부의 설명서에 따라, total RNA 를 각각 추출하였다. 조제한 total RNA 는 14μL 의 멸균수에 각각 용해하였다.

(2) single strand cDNA 의 합성

본항 (1) 에 있어서 얻어진 각각의 total RNA 3㎍ 에 대해, Super ScriptⅢ First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen사 제조) 를 사용하여 첨부의 설명서에 따라, 올리고 (dT) 를 프라이머로 한 20μL 의 계로 역전사 반응을 실시함으로써, 1 개 사슬 cDNA 를 각각 합성하였다. 합성한 1 개 사슬 cDNA 는 각각 RNase 처리를 실시하여, 최종 반응액 양을 40μL 로 하였다. 또한, 그 반응액은 각각 멸균수를 사용하여 50배로 희석하고, 이하에 기재하는 유전자 전사량의 해석에 도움을 주었다.

(3) SYBR-PCR 에 의한 GMD 유전자 전사량의 정량

GMD 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 실시예 8 의 3.(3) 에 기재된 방법으로 실시하였다. 내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, GMD mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량을 수치화하였다.

KM968주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 100 으로 하고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 21 에 나타내었다. 친주인 KM968주의 GMD mRNA 량과 비교하여, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, GMD mRNA 량이 약 10% 로 저하하고 있었다.

(4) SYBR-PCR 에 의한 FUT8 유전자 전사량의 정량

FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 β-엑틴 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은, 실시예 8 의 3.(4) 에 기재된 방법으로 실시하였다. 내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, FUT8 mRNA 량 및 β-엑틴 mRNA 량을 수치화하였다.

KM968주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 FUT8 mRNA 량의 상대치를 100 으로 하고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 FUT8 mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 22 에 나타내었다. 친주인 KM968 의 FUT8 mRNA 량과 비교하여, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포주에서는 모두, FUT8 mRNA 량이 약 10% 로 저하하고 있었다.

4. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 SP2/0 세포주를 이용한 항체 조성물의 생산과 해석

(1) 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성 SP2/0 세포주의 항체 조성물의 생산

KM968주, 및 본 실시예의 2. 에 있어서 취득한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 렉틴 내성 SP2/0 세포주인 968i3-2주 및 968i3-3주가 생산하는 항 GM₂ 키메라 항체 조성물을, 이하의 순서로 각각 취득하였다.

KM968주는, SP-HSFM 배지 [UltraLow-IgG FBS (Invitrogen사 제조) 를 5%, MTX (SIGMA사 제조) 를 500nmol/L 의 농도로 포함한 Hybridoma-SFM 배지 (Indtrogen사 제조)] 를, 968i3-2주 및 968i3-3주는, 하이그로마이신 (와코준야꾸사 제조) 을 500㎍/mL 의 농도로 포함한 SP-HSFM 배지를 이용하여, 각각 1×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 부유 배양용 T225 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 50mL 씩 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 7일간 배양 후, 배양 상청을 각각 회수하여, MabSelect (아마샴바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하고, 첨부의 설명서에 따라, 각 항 GM₂ 키메라 항체 조성물을 정제하였다. 정제한 각 항 GM₂ 키메라 항체는, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼에 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MILLIPORE사 제조) 를 이용해 여과 멸균하였다.

(2) 항체 조성물의 단당 조성 분석

본 실시예의 4.(1) 에서 취득한, 각 항 GM₂ 키메라 항체 조성물에 대해, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)] 에 따라 단당 조성 분석을 실시하였다.

각 항체의 단당 조성비에 의해 계산되는, 푸코오스(-)% 를 표 7 에 나타내었다.

세포주명	푸코오스(-)%
KM968	3%
968i3-2	64%
968i3-3	62%

KM968주의 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 3% 인 것에 대해, KM968주를 친주로 하여 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 렉틴 내성주인 968i3-2주 및 968i3-3주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 60% 정도이며, 친주인 KM968 의 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 와 비교하여 현저히 상승하고 있었다. 이 결과로부터, SP2/0 세포에 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입함으로써, 푸코오스 함량의 적은 항체를 생산하는 세포로 변환할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 10

마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 NS0 세포를 이용한 항체 조성물의 생산

1. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 NS0 세포주의 취득 및 배양

WO03/85118 의 실시예 1 의 (2) 에 기재된 방법과 동일하게 하여 취득한 마우스 미에로마 NS0 세포 (RCB0213) 유래 항CCR4 키메라 항체 생산주 NS0/2160주 (이하, NS0/2160 주라고 기재한다) 에, 실시예 7 의 1. 에 있어서 구축한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 FT8libB_GMDmB/pAGE 혹은 FT8lib3_GMDmB/pAGE 를 도입하여, 이하의 순서로, 형질 전환 세포를 취득하였다.

각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드의 NS0/2160주로의 유전자 도입은 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 기준하여 이하의 순서로 실시하였다.

먼저, 각종 siRNA 발현 벡터 플라스미드 l0㎍ 를, NEBuffer 4 (New England Biolabs사 제조) 30μL 에 용해하고, 10단위의 제한 효소 FspI (New England Biolabs사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 소화 반응시켜 선상화하였다. 그 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동에 의해, 그 플라스미드가 선상화되어 있는 것을 확인한 후, 나머지의 반응액에 대해, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하여, 회수한 선상화 플라스미드를 멸균수 10μL 에 용해하였다.

한편, NS0/2160주를 K-PBS 완충액에 현탁하고 1.0×10⁷cells/mL 로 하였다. 세포 현탁액 200μL (2.0×10⁶cells) 를 상기 선상화 플라스미드 용액 10μL 와 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전체량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD사 제조) 에 옮기고, 세포 융합 장치 Gene Pulser (BIO-RAD사 제조) 를 이용하여 펄스 전압 200V, 전기 용량 250μF 의 조건에서 유전자 도입을 실시하였다.

유전자 도입 후, 세포 현탁액을 RPMI-FBS(10)-MTX(500) 배지에 현탁하고, 부유 배양용 T75 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 1 개로 파종하였다. 37℃, 5% CO₂ 의 존재 하에서 24시간 배양한 후, 하이그로마이신 (와코준야꾸사 제조) 을 최종농도가 500㎍/mL 가 되도록 첨가하고, 추가로 2일간 배양하였다. 배양 후, 800rpm, 5분간의 원심 분리에 의해 세포를 회수한 후, 생세포의 밀도가 0.5∼1×10⁴cells/mL 가 되도록 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지에 현탁하고, 96 웰 배양용 플레이트 (그라이너사 제조) 에 100μL 씩 파종하였다. 그 후, 2∼3일 마다, 배양 상청의 반량을 신선한 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지로 교환하는 조작을 반복하면서, 2∼3주간 배양하였다.

배양 후, 96 웰 배양용 플레이트의 각 웰의 배양 상청을 각각 회수하고, 실시예 7 의 3. 에 기재된 방법으로, 각각의 배양 상청 중에 포함되는 항 CCR4 키메라 항체 조성물의 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성을 평가하였다. 벡터마다 80웰 에 대해 해석한 결과, 9할 이상의 웰의 배양 상청에 포함되는 항체 조성물에 있어서, 친주인 NS0/2160주가 생성하는 항체 조성물과 비교하여 shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성의 상승이 인정되고, 각 웰의 세포가 유전자 도입의 결과, 푸코오스 함량의 적은 항체 조성물의 생산 세포로 변환되고 있었다.

shFcγRⅢa 에 대한 결합 활성의 상승이 인정된 웰 중 각 5 웰의 세포에 대해, RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지를 이용하여 확대 배양을 실시하였다. 이하, 확대 배양에 제공한 세포주 중, FT8libB_GMDmB/pAGE 를 도입하여 얻어진 세포주를 NS0/2160iB-1 주, NS0/2160iB-2 주, NS0/2160iB-3 주, NS0/2160iB-4 주 및 NS0/2160iB-5주와, FT8lib3_GMDmB/pAGE 를 도입하여 얻어진 세포주를 NS0/2160i3-1주, NS0/2160i3-2주, NS0/2160i3-3주, NS0/2160i3-4주 및 NS0/2160i3-5주로 각각 칭한다.

2. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 마우스 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 NS0 세포주에 있어서의 GMD mRNA 량 및 FUT8 mRNA 량의 정량

(1) total RNA 의 조제

NS0/2160주, 그리고 본 실시예의 1. 에 있어서 취득한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 NS0 세포주인 NS0/2160iB-1주, NS0/2160iB-2주, NS0/2160iB-3주, NS0/2160iB-4주, NS0/2160iB-5주, NS0/2160i3-1주, NS0/2160i3-2주, NS0/2160i3-3주, NS0/2160i3-4주, 및 NS0/2160i3-5주로부터의 total RNA 의 조제는, 이하의 순서로 실시하였다.

NS0/2160주는 RPMI-FBS(10)-MTX(500) 배지를, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 NS0 세포주는 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500) 배지를 이용하고, 각각 1×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 부유 배양용 T75 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 3일간 배양하고, 세포수를 계수 후, 각 5×10⁵cells 상당량을 분취하였다. 800rpm, 5분간의 원심 분리를 실시하여 상청을 제거하였다. 세포를 둘베코 PBS 완충액 (Invitrogen사 제조) 에 현탁하고, 재차 800rpm, 5분간의 원심 분리를 실시하여 세포를 회수한 후, RNeasy Micro Kit (QIACEN사 제조) 를 사용하여 방법은 첨부의 설명서에 따라, total RNA 를 각각 추출하였다. 조제한 total RNA 는 14μL 의 멸균수에 용해하였다.

(2) single strand cDNA 의 합성

(3) SYBR-PCR 에 의한 GMD 유전자 전사량의 정량

NS0/2160주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 100 으로 하고, β-엑틴 mRNA 량에 대한 GMD mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 23 에 나타내었다. 친주인 NS0/2160주의 GMD mRNA 량과 비교하여, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포에서는 모두, GMD mRNA 량이 약 20% 로 저하하고 있었다

(4) SYBR-PCR 에 의한 FUT8 유전자 전사량의 정량

FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량 및 β-엑틴 유전자 유래의 mRN 전사량의 정량은, 실시예 8 의 3.(4) 에 기재된 방법으로 실시하였다. 내부 컨트롤 플라스미드에서의 측정 결과로부터 검량선을 작성하여, FUT8 mRNA 량 β-엑틴 mRNA 량을 수치화하였다.

NS0/2160주에 대한 β-엑틴 mRNA 량에 대한 FUT8 mRNA 량의 상대치를 100 으로 하여 β-엑틴 mRNA 량에 대한 FUT8 mRNA 량의 상대치를 비교한 결과를 도 24 에 나타내었다. 친주인 KM968주의 FUT8 mRNA 량과 비교하여, 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입에 의해 얻어진 세포에서는 모두, FUT8 mRNA 량이 약 10% 로 저하하고 있었다.

3. 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 NS0 세포주를 이용한 항체 조성물의 생산과 해석

(1) 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 저푸코오스 항체 생성 NS0 세포주의 항체 조성물의 생산

NS0/2160주, 그리고 본 실시예의 1. 에 있어서 취득한 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터 도입 NS0 세포주인 NS0/2160iB-3주, NS0/2160iB-5주, NS0/2160i3-1주, NS0/2160i3-4주, 및 NS0/2160i3-5주가 생산하는 항 CCR4 키메라 항체 조성물을, 이하의 순서로 취득하였다.

NS0/2160주는, NS-HSFM 배지 [Bovine Serum Albumin (Invitrogen사 제조) 를 0.2%, MTX (SIGMA사 제조) 를 500nmol/L 의 농도로 포함한 Hybridoma-SFM 배지 (Invitrogen사 제조)], NS0/2160iB-3주, NS0/2160iB-5주, NS0/2160i3-1주, NS0/2160i3-4주 및 NS0/2160i3-5주는, 하이그로마이신 (와코준야꾸사 제조) 을 500㎍/mL 의 농도로 포함한 NS-HSFM 배지를 이용하여, 각각 2×10⁵cells/mL 의 세포 밀도로 현탁하고, 부유 배양용 T225 플라스크 (아사히 테크노 글래스사 제조) 에 40mL 씩 파종하였다. 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 7일간 배양 후, 배양 상청을 각각 회수하고, MabSelect (아마샴바이오사이언스사 제조) 칼럼을 이용하여, 첨부의 설명서에 따라, 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물을 정제하였다. 정제한 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물은, 각각 Econo-Pac 10DG (바이오래드사 제조) 를 이용하여 10mmol/L KH₂PO₄ 버퍼로 치환하고, 0.22㎛ 구멍 직경 Millex GV (MlLLIPORE사 제조) 를 이용하여 여과 멸균하였다.

(2) 항체 조성물의 단당 조성 분석

본 실시예의 3.(1) 에서 취득한, 각 항 CCR4 키메라 항체 조성물에 대해, 공지된 방법 [Journal of liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)] 에 따라 단당 조성 분석을 실시하였다.

각 항체 조성물의 단당 조성비에 의해 계산되는, 푸코오스(-)% 를 표 8 에 나타내었다.

세포주명	푸코오스(-)%
NS0/2160	28%
NS0/2160iB-3	93%
NS0/2160iB-5	92%
NS0/2160i3-1	93%
NS0/2160i3-4	93%
NS0/2160i3-5	92%

NS0/2160주의 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 가 28% 인 것에 대해, NS0/2160주를 친주로서 마우스 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 마우스 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입한 NS0/2160iB-3주, NS0/2160iB-5주, NS0/2160i3-1주, NS0/2160i3-4주, 및 NS0/2160i3-5주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 는 90% 정도이며, 친주가 생산하는 항체 조성물의 푸코오스(-)% 와 비교하여 현저히 상승하고 있었다. 이 결과로부터, NS0 세포로 GMD 를 표적으로 한 siRNA 및 FUT8 을 표적으로 한 siRNA 공발현 벡터를 도입함으로써, 푸코오스 함량의 적은 항체를 생산하는 세포로 변환할 수 있는 것이 나타났다.

본 발명에 의하면, GDP-만노오스를 GDP-4-케토, 6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포 및 그 세포를 이용하는 당단백질 조성물의 제조 방법 등이 제공된 다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체 조성물은 높은 이펙터 처리 장치 활성을 갖고 있어, 의약품으로서 유용하다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 14-인공 서열의 설명 : 합성 RNA

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서열 번호 90-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

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서열 번호 96-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> Process for producing the glycoprotein composition <130> 11708WO1 <150> P2004-228928 <151> 2004-08-05 <150> P2004-252682 <151> 2004-08-31 <150> P2005-136410 <151> 2005-05-09 <160> 96 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2008 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60 tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120 tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180 catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240 gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300 cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360 gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat 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aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat 651 Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr 160 165 170 cca agg tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta 699 Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val 175 180 185 190 gtg aac ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc 747 Val Asn Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu 195 200 205 ttc aat cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa 795 Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys 210 215 220 att agc cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc 843 Ile Ser Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe 225 230 235 agt ttg gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac 891 Ser Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp 240 245 250 tat gtc gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac 939 Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp 255 260 265 270 ttt gtc ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag 987 Phe Val Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu 275 280 285 aaa tca ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat 1035 Lys Ser Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn 290 295 300 gaa aat gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act 1083 Glu Asn Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr 305 310 315 gtg gat ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga 1131 Val Asp Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly 320 325 330 gac tgc tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc 1179 Asp Cys Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala 335 340 345 350 ttt gac gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg 1227 Phe Asp Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met 355 360 365 aga acc aac ccc aac gcc tgagc acctctacaa aaaattcgcg agacatggac 1280 Arg Thr Asn Pro Asn Ala 370 tatggtgcag agccagccaa 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ctg gag aaa 328 Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys 35 40 45 ggc tat gag gtc cat gga att gta cgg cgg tcc agt tca ttt aat acg 376 Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr 50 55 60 ggt cga att gag cat ctg tat aag aat ccc cag gct cac att gaa gga 424 Gly Arg Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly 65 70 75 aac atg aag ttg cac tat ggc gat ctc act gac agt acc tgc ctt gtg 472 Asn Met Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val 80 85 90 aag atc att aat gaa gta aag ccc aca gag atc tac aac ctt gga gcc 520 Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala 95 100 105 110 cag agc cac gtc aaa att tcc ttt gac ctc gct gag tac act gcg gac 568 Gln Ser His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp 115 120 125 gtt gac gga gtt ggc act cta cga ctt cta gat gca gtt aag act tgt 616 Val Asp Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys 130 135 140 ggc ctt atc aac tct gtg aag ttc tac caa gcc tca aca 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aat gat gag ccg gag gac 1000 Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp 255 260 265 270 ttc gtt ata gct act ggg gag gtc cat agt gtc cgg gaa ttt gtc gag 1048 Phe Val Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu 275 280 285 aaa tca ttc ttg cac att gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag aat 1096 Lys Ser Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn 290 295 300 gaa aat gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg act 1144 Glu Asn Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr 305 310 315 gtg gat ctc aag tac tac cgg cca act gaa gtg gac ttt ctg cag ggc 1192 Val Asp Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly 320 325 330 gac tgc acc aaa gcg aaa cag aag ctg aac tgg aag ccc cgg gtc gct 1240 Asp Cys Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala 335 340 345 350 ttc gat gag ctg gtg agg gag atg gtg cac gcc gac gtg gag ctc atg 1288 Phe Asp Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met 355 360 365 agg aca aac ccc aat gcc tgag cagcgcctcg gagcccggcc cgccctccgg 1340 Arg Thr Asn Pro Asn Ala 370 ctacaatccc cgcagagtct ccggtgcaga cgcgctgcgg ggatggggag cggcgtgcca 1400 atctgcgggt cccctgcggc ccctgctgcc gctgcgctgt cccggccgca agagcggggc 1460 cgccccgccg aggtttgtag cagccgggat gtgaccctcc agggtttggg tcgctttgcg 1520 tttgtcgaag cctcctctga atggctttgt gaaatcaaga tgttttaatc acattcactt 1580 tacttgaaat tatgttgtta cacaacaaat tgtggggcct tcaaattgtt tttctctttt 1640 catattaaaa atggtctttc tgtgaactag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1698 <210> 10 <211> 1529 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (62)..(1177) <400> 10 ggcccgcggc tcgttccact ccgccttcct cttggccgca cgctcacccg cctgaggcga 60 c atg gct caa gct ccc gct aag tgc ccg agc tac ccg ggc tcc 103 Met Ala Gln Ala Pro Ala Lys Cys Pro Ser Tyr Pro Gly Ser 1 5 10 ggg gat ggc gag atg ggc aag ctc agg aag gtg gct ctc atc act ggc 151 Gly Asp Gly Glu Met Gly Lys Leu Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly 15 20 25 30 atc acc gga cag gat ggt tcg tac ttg gca gaa ttc ctg ttg gag aaa 199 Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys 35 40 45 ggg tac gag gtc cat gga ata gta cgg cga tct agt tca ttt aat aca 247 Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr 50 55 60 ggt cga att gaa cat tta tat aag aat cct cag gct cat att gaa gga 295 Gly Arg Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly 65 70 75 aac atg aag ttg cac tat ggt gac ctc act gac agc acc tgc cta gtg 343 Asn Met Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val 80 85 90 aaa atc atc aat gaa gtc aag cct aca gag atc tat aat ctt gga gcc 391 Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala 95 100 105 110 cag agc cat gtc aag atc tcc ttt gac tta gct gag tac acc gca gat 439 Gln Ser His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp 115 120 125 gtt gat ggc gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aaa act tgt 487 Val Asp Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys 130 135 140 ggc ctt ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca aca agt gaa ctt 535 Gly Leu Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu 145 150 155 tat gga aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc aca cct ttc tat 583 Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr 160 165 170 ccg agg tca ccc tat gga gca gcc aaa ctc tat gcc tat tgg att gtg 631 Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val 175 180 185 190 gtg aat ttc cgt gaa gct tat aat ctc ttt gca gtg aat gga att ctc 679 Val Asn Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu 195 200 205 ttc aat cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa 727 Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys 210 215 220 att agc cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc 775 Ile Ser Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe 225 230 235 agc ttg gga aat ctg gat gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac 823 Ser Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp 240 245 250 tat gta gag gct atg tgg ctc atg ttg cag aat gat gag 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gcccctctgc agagactcga ggggcatggt 1210 Arg Thr Asn Pro Asn Ala 370 gacagtgcag agccagggaa ccagagtcca gtaactcctg ccaaccatgg accctcgacc 1270 tcctgtgctg tccctgtatc cagagctggg ccacagaggt ttgtagagcc tgggacagga 1330 cacaccagag ctaaggccgc attgcttttg tcaaagtctc ctcctctgac tggtttcagg 1390 aaatcaagaa gtttgaatca catactcatt ttacttgaaa ttatgtcact agacaactta 1450 tattttggag tcttgagatt gtttttctct tttcttatta aataatcttt ctataaccca 1510 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1529 <210> 11 <211> 372 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 11 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 14 gaagggaguu gaaacucuga aaaugcgggc auggacuggu 40 <210> 15 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 15 gaggagaaug gcugagucuc uccgaauacc a 31 <210> 16 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 16 ccaaagacau gcagaugaaa uucuuuugga uuu 33 <210> 17 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 17 ucuuggaauc ucagaauugg cgcuaugcua cugga 35 <210> 18 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 18 auacacagaa aauucacuuc ggggcgugau cc 32 <210> 19 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 19 ucaucccagg ucuguagggu ugcuuaugaa auca 34 <210> 20 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 20 caucuacuau uuuggaggcc aaaaugccca caacca 36 <210> 21 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 21 ugcacuggug gaacgccucu uugugaaggg c 31 <210> 22 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 22 caagaagcuu ggcuucaaac auccaguuau ugga 34 <210> 23 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 23 uauggcaccc agcgaacacu caucuuggaa ucuca 35 <210> 24 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 24 gaggcgaaug gcugagucuc uccgaauacc a 31 <210> 25 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 25 gaggcgaaug gccgaaucuc uccggauacc a 31 <210> 26 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 26 ccaaagacau gcagaugaau uucuuuugga uuu 33 <210> 27 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 27 ucuuggaauc ucagaauugg cgcuaugcua cuggu 35 <210> 28 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 28 guacacagaa aauucacuuc ggggugugau cc 32 <210> 29 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 29 auacacagaa aauucacuuc guggagugau cc 32 <210> 30 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 30 guacacagaa aauucacuuc ggggcgugau cc 32 <210> 31 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 31 ucaucccagg ucugucgggu ugcuuaugaa auca 34 <210> 32 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 32 ucaucccagg ucugucgagu ugcuuaugaa auua 34 <210> 33 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 33 caucuacuau uuuggaggcc aaaaugccca caauca 36 <210> 34 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 34 caucuacuau uuugggggcc agaaugccca caauca 36 <210> 35 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 35 caagaagcuu ggcuucaaac auccagucau ugga 34 <210> 36 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 36 cauggaauug uacggcgauc caguucauu 29 <210> 37 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 37 uauaagaauc cacaggcuca uauugaagg 29 <210> 38 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 38 acaugaaguu gcacuauggu gaccucacc 29 <210> 39 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 39 gcagaguaca cugcagaugu ugauggagu 29 <210> 40 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 40 ugugaaguuc uaccaggccu caacuagug 29 <210> 41 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 41 ucaugagagu ccuagaagag gagcuaauu 29 <210> 42 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 42 augccaagga cuaugucgag gcuaugugg 29 <210> 43 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 43 ccatggaatt gtacggcgat ccagttcatt cttcctgtca aatgaactgg atcgccgtac 60 aattccatgg gtac 74 <210> 44 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 44 ccatggaatt gtacggcgat ccagttcatt tgacaggaag aatgaactgg atcgccgtac 60 aattccatgg agct 74 <210> 45 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 45 ctataagaat ccacaggctc atattgaagg cttcctgtca ccttcaatat gagcctgtgg 60 attcttatag gtac 74 <210> 46 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 46 ctataagaat ccacaggctc atattgaagg tgacaggaag ccttcaatat gagcctgtgg 60 attcttatag agct 74 <210> 47 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 47 cacatgaagt tgcactatgg tgacctcacc cttcctgtca ggtgaggtca ccatagtgca 60 acttcatgtg gtac 74 <210> 48 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 48 cacatgaagt tgcactatgg tgacctcacc tgacaggaag ggtgaggtca ccatagtgca 60 acttcatgtg agct 74 <210> 49 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 49 cgcagagtac actgcagatg ttgatggagt cttcctgtca actccatcaa catctgcagt 60 gtactctgcg gtac 74 <210> 50 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 50 cgcagagtac actgcagatg ttgatggagt tgacaggaag actccatcaa catctgcagt 60 gtactctgcg agct 74 <210> 51 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 51 ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg cttcctgtca cactagttga ggcctggtag 60 aacttcacag gtac 74 <210> 52 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 52 ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg tgacaggaag cactagttga ggcctggtag 60 aacttcacag agct 74 <210> 53 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 53 ctcatgagag tcctagaaga ggagctaatt cttcctgtca aattagctcc tcttctagga 60 ctctcatgag gtac 74 <210> 54 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 54 ctcatgagag tcctagaaga ggagctaatt tgacaggaag aattagctcc tcttctagga 60 ctctcatgag agct 74 <210> 55 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 55 catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg cttcctgtca ccacatagcc tcgacatagt 60 ccttggcatg gtac 74 <210> 56 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 56 catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg tgacaggaag ccacatagcc tcgacatagt 60 ccttggcatg agct 74 <210> 57 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 57 uauaagaauc cccaggcuca cauugaagg 29 <210> 58 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 58 uauaagaauc cucaggcuca uauugaagg 29 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 59 cccaagcttg atatcaaggt cgggcaggaa gagggcctat 40 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 60 gctctagaga tatcaaaaaa ggtaccgagc tcggtgtttc gtcctttcca ca 52 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 61 agcgcctgat gcggtatt 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 62 ggactttcca cacctggt 18 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 63 gtgacgtaga aagtaataat 20 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 64 catgagagtc ctagaagagg agc 23 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 65 agtttctgct gcgccttg 18 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 66 gatatcgctg cgctcgtcgt cgac 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 67 caggaaggaa ggctggaaga gagc 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 68 gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 69 gtgagtacat tcattgtact gtg 23 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 70 ttcccagtca cgacgtt 17 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 71 caggaaacag ctatgac 17 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 72 agaatggctg agtctctccg aatacc 26 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 73 gagttggtag ctcttgat 18 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 74 atacccacgc cgaaacaa 18 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 75 atcctcgtcc tccttactta cc 22 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 76 tccagctgac caagaaatag ag 22 <210> 77 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys 1 5 10 15 Pro Cys <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 78 ccgctcgaga gcgcctgatg cggtatt 27 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 79 ccgctcgagg gactttccac acctggt 27 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 80 aagcccagga aggtggcgct catcac 26 <210> 81 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 81 cactagttga ggcctggtag aacttcac 28 <210> 82 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 82 ctataagaat cctcaggctc atattgaagg cttcctgtca ccttcaatat gagcctgagg 60 attcttatag gtac 74 <210> 83 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 83 ctataagaat cctcaggctc atattgaagg tgacaggaag ccttcaatat gagcctgagg 60 attcttatag agct 74 <210> 84 <211> 575 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 84 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Leu Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 His Lys Pro Arg Thr Asp Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 85 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 85 ggacagaguu gaaacucuga aaaugcgggc auggacuggu 40 <210> 86 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 86 gaagugaguu gaaaaucuga aaaugcggcc auggacuggu 40 <210> 87 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 87 gaggcgaaug gcugagucuc uacgaauacc a 31 <210> 88 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 88 ugcacuggug gaacgccucu uuaugaaggg c 31 <210> 89 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 89 ucaauuggug gaauuccucu uuaacaaggg c 31 <210> 90 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 90 agaatggctg agtctctccg aataccggat ccggtattcg gagagactca gccattct 58 <210> 91 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 91 aaatccaaaa gaatttcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaaat 60 tcttttggat tt 72 <210> 92 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 92 tataagaatc cacaggctca tattgaaggc ttcctgtcac cttcaatatg agcctgtgga 60 ttcttata 68 <210> 93 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 93 tataagaatc ctcaggctca tattgaaggc ttcctgtcac cttcaatatg agcctgagga 60 ttcttata 68 <210> 94 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 94 cgaatggccg aatctctccg gataccggat ccggtatccg gagagattcg gccattcg 58 <210> 95 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 95 aaatccaaaa gaaattcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaatt 60 tcttttggat tt 72 <210> 96 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 96 tataagaatc cccaggctca cattgaaggc ttcctgtcac cttcaatgtg agcctgggga 60 ttcttata 68

Claims

이하의 (a) 또는 (b) 에서 선택되는 RNA 및 그 상보(相補) RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 를 세포내에 도입한 세포 ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 1 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 탈수 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 세포.
제 2 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 2 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산 이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.
이하의 (a) 또는 (b) 에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA.

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/ 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노 오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 5 항에 기재된 RNA 에 대응하는 DNA 및 그 상보 DNA.
제 5 항에 기재된 RNA 에 대응하는 DNA 를 함유하는 벡터.
제 7 항에 기재된 벡터를 세포에 도입한 세포.
N-글리코시드 결합 복합형 당(糖)사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포.
N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 를 도입한 세포.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소인 세포.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 세포.
제 12 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(e) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(g) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(h) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 12 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(e) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산 이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(j) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(k) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(l) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.
제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/ 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 세포.
제 17 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 17 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노 산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.
제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA.
N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 DNA.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소인 DNA.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 DNA.
제 25 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 DNA ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(e) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(g) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(h) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 25 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 DNA ;

(a) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(e) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(j) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백 질 ;

(k) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(l) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.
제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 DNA ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 DNA ;

(a) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 24 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 DNA.
제 30 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 DNA ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 30 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 DNA ;

(a) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노 오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.
제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택 되는 RNA 인 DNA ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 인 DNA ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 22 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 함유하는 벡터.
제 35 항에 있어서,

서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 벡터.
제 35 항에 있어서,

서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 92 로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 벡터.
제 35 항에 있어서,

서열 번호 90 으로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 벡터.
제 35 항에 있어서,

서열 번호 91 로 표시되는 DNA 및 서열 번호 93 으로 표시되는 DNA 를 함유하여 이루어지는 벡터.
제 35 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 도입한 세포.
N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치 에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터를 도입한 세포.
N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터, 및 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 에 대응하는 DNA 와 그 상보 DNA 를 함유하는 벡터를 도입한 세포.
제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,

세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 단백질의 기능을 억제하는 RNA 가 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 인 세포.
제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치 에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가, α1,6-푸코실트랜스페라아제인 세포.
제 44 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(h) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(e) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(g) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(h) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 44 항에 있어서,

α1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a)∼(l) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(e) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산 이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(j) 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(k) 서열 번호 7 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(l) 서열 번호 84 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.
제 41 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(d) 서열 번호 4 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 41 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 14∼35 또는 85∼89 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, α1,6-푸코실트랜스페라아제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 43 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제인 세포.
제 49 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제 49 항에 있어서,

GDP-만노오스 4,6-데히드라타제가, 이하의 (a)∼(i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포 ;

(a) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(g) 서열 번호 11 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타제 활성을 갖는 단백질.
제 43 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a)∼(c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 8 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(b) 서열 번호 9 로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 표시되는 염기 서열 중 연속된 10∼40 의 염기 서열로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 대응하는 RNA.
제 43 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,

GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 기능을 억제하는 RNA 가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선 택되는 RNA 및 그 상보 RNA 로 구성되는 2 개 사슬 RNA 인 세포 ;

(a) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 RNA ;

(b) 서열 번호 37, 57 또는 58 로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제의 기능을 억제하는 활성을 갖는 RNA.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 8 항 내지 제 21 항 및 제 40 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,

세포가, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 세포인 세포.
제 54 항에 있어서,

렉틴이, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 렉틴인 세포 ;

(a) 렌즈콩 렉틴 LCA (Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin) ;

(b) 완두콩 렉틴 PSA (Pisumsativum 유래의 Pea Lectin) ;

(c) 잠두콩 렉틴 VFA (Viciafaba 유래의 Agglutinin) ;

(d) 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuria aurantia 유래의 Lectin).
제 1 항 내지 제 4 항, 제 8 항 내지 제 21 항 및 제 40 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,

세포가, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 세포.
제 56 항에 있어서,

동물 세포가, 이하의 (a)∼(k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 세포 ;

(a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포 ;

(b) 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 ;

(c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포 ;

(d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포 ;

(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포 ;

(f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 ;

(g) 인간 백혈병 세포주 나마르바 세포 ;

(h) 인간 백혈병 세포주 NM-F9 세포 ;

(i) 인간 배아 망막 세포주 PER.C6 세포 ;

(j) 배아 줄기 세포 ;

(k) 수정란 세포.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 8 항 내지 제 21 항 및 제 40 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,

당단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 세포.
제 58 항에 있어서,

당단백질이 항체 분자인 세포.
제 59 항에 있어서,

항체 분자가, 이하의 (a)∼(d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 세포 ;

(a) 인간 항체 ;

(b) 인간화 항체 ;

(c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편 ;

(d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
제 59 항 또는 제 60 항에 있어서,

항체 분자의 클래스가 IgG 인 세포.
제 58 항에 기재된 세포를 사용하는 당단백질 조성물의 제조 방법.
제 58 항에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 당단백질 조성물을 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 당단백질 조성물을 채취 정제하는 공정을 포함하는 당단백질 조성물의 제조 방법.
제 59 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물의 제조 방법.
제 59 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 항체 조성물을 채취 정제하는 공정을 포함하는 항체 조성물의 제조 방법.
제 64 항 또는 제 65 항에 있어서,

항체 조성물이, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 상해 활성이 높은 항체 조성물인 방법.
제 66 항에 있어서,

항체 의존성 세포 상해 활성이 높은 항체 조성물이, 그 항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬의 비율이, 친주 세포가 생산하는 항체 조성물보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
제 67 항에 있어서,

푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬이, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당사슬인 방법.
제 62 항 또는 제 63 항에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 당단백질 조성물.
제 64 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 항체 조성물.
제 69 항 또는 제 70 항에 기재된 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.