CN101023172A - 糖蛋白质组合物的制造方法 - Google Patents

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CN101023172A CNA2005800304608A CN200580030460A CN101023172A CN 101023172 A CN101023172 A CN 101023172A CN A2005800304608 A CNA2005800304608 A CN A2005800304608A CN 200580030460 A CN200580030460 A CN 200580030460A CN 101023172 A CN101023172 A CN 101023172A
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西谷春江
佐藤光男
森胜弘
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Kyowa Kirin Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种导入了能够抑制催化GDP－甘露糖转化为GDP－4－酮，6－脱氧－GDP－甘露糖的反应的酶功能的RNA的细胞；使用该细胞产生糖蛋白质的方法；一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA、和及能够抑制细胞内糖核苷酸GDP－岩藻糖合成相关酶蛋白质功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP－岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA，所述糖链中在复合型N－糖苷－连接糖链中岩藻糖的1－位与还原末端的N－乙酰氨基葡萄糖的6－位通过α－键连接；使用该细胞产生糖蛋白质组合物的方法等。

Description

糖蛋白质组合物的制造方法
技术领域
本发明涉及一种其中被导入了能够抑制酶功能的RNA的细胞，上述酶催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应；糖蛋白质的制造方法，该方法包括使用所述的细胞；用于制备该细胞的RNA；与RNA对应的DNA；和包括DNA及其互补DNA的载体。另外，本发明还涉及一种细胞，该细胞中被导入了能够抑制糖链(其中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)修饰相关酶的功能的RNA，以及能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶蛋白质功能的RNA，或者能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA；以及糖蛋白质的制造方法，该方法包括使用所述的细胞。而且，本发明涉及包括与能够抑制糖链(其中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA，和对应于能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶蛋白质功能的RNA或者能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA的DNA及其互补DNA；包括该DNA的载体；导入了该载体的细胞；导入了包括与能够抑制糖链(其中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体，和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶蛋白质功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体的细胞；和使用该细胞制造糖蛋白质组合物的方法。
背景技术
由于基因工程或细胞工程技术的迅速发展，在活体中以痕量存在的生理活性蛋白质可以大量地和稳定地提供至医疗部位，使得它们可以用于治疗许多患者。这些蛋白质药物可以作为基因工程药物或细胞培养药物来进行制造和销售。这些蛋白质药物可以分成简单蛋白质药物(其中糖链与其药理活性无关)和糖蛋白质药物(其中糖链在其生理活性中发挥重要的作用)。
促红细胞生成素是一个典型的糖蛋白质药物的例子，其中糖链在其药理活性中发挥重要的作用。促红细胞生成素证实有多种糖链结构，已知它有三种复合型N-糖苷-连接的四天线糖链(其中岩藻糖与三个核心结构相连)和一种O-糖苷-连接的糖链。糖链结构与促红细胞生成素的体内生理学活性密切相关，去除O-糖苷-连接的糖链不影响其生理活性(非专利参考文献1和2)，但是去掉N-糖苷-连接的糖链后则丧失其生理活性(非专利参考文献3)。而且，将唾液酸添加至N-糖苷-连接的糖链上和糖链结构的差异如支链结构均影响其药理活性(非专利参考文献4、5和6)。此外，还显示糖链结构中岩藻糖被修饰的蛋白质通常在血液中半衰期较短(非专利参考文献7)。
就抗体而言，已知药理活性极大地受糖链结构的影响。
在IgG型抗体分子的Fc区，存在两个N-糖苷-连接糖链结合位点。在血清IgG中，复合型糖链具有多个分支，其中唾液酸或平分型(bisecting)N-乙酰氨基葡萄糖以很低的比例结合在糖链结合位点上。在复合型糖链的非还原末端上添加半乳糖和在还原末端上添加N-乙酰氨基葡萄糖是相异的(非专利参考文献8)。糖链结构(即岩藻糖添加在与抗体Fc区结合的N-糖苷-连接糖链还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖上)在抗体的效应器功能中发挥着重要作用，例如依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性(下文中称为“ADCC活性”)和依赖补体的细胞毒性活性(下文中称为“CDC活性”)(专利参考文献1和2，和非专利参考文献9和10)。
许多被认为用作药物的糖蛋白质通过重组DNA技术来产生，通过使用动物细胞如CHO细胞(来源于中国仓鼠卵巢组织)作为宿主细胞来制造。但是，通过使用重组DNA技术产生的糖蛋白质的糖链结构取决于宿主细胞的不同而有所不同(非专利参考文献10和11)。因此，糖链常常不添加至由重组DNA技术产生的糖蛋白质上，以便发挥适当的药理活性。
已经考虑使用糖链修饰相关酶的抑制剂作为控制细胞中糖链修饰相关酶的活性和修饰所产生的糖蛋白质糖链结构的方法。但是，由于抑制剂的特异性很低，很难充分地抑制靶酶，因此确实很难控制所产生抗体的糖链结构。
而且，已经有人考虑通过导入编码糖链修饰相关酶的基因来修饰所产生的糖蛋白质的糖链结构(非专利参考文献12和13)。当使用导入了β1，4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)的CHO细胞来表达抗体时，抗体的ADCC活性比用亲代细胞表达的抗体高16倍(非专利参考文献11和专利参考文献3)。但是，由于已有报道称GnTIII或β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnTV)的过量表达显示出对CHO细胞的毒性，因此它不适合用于生产治疗用抗体。
已经报道了糖蛋白质的多个制造实施例，其中通过使用其中突变体作为宿主细胞改变所产生糖链的结构，上述突变体中编码糖链修饰相关酶的基因的活性被改变。已经获得了其中糖链修饰相关酶的活性被改变的突变体，例如，作为对凝集素如WGA(来源于百里香(T.vulgaris)的麦芽凝集素)、ConA(来源于矮生刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白质A)、RIC(来源于蓖麻(R.communis)的毒素)、L-PHA(来源于菜豆(P.vulgaris)的白细胞凝集素)、LCA(来源于兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素)、PSA(来源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)表现出抗性的克隆(非专利参考文献14)。已经报道了一种情形，其中通过使用这种糖链修饰相关酶的活性被改变的突变体作为宿主细胞来生成糖链结构被改变的糖蛋白质。具体例子包括一则报告，该报告关于使用其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)的活性被缺失的CHO细胞突变克隆来产生具有高甘露糖型糖链结构的抗体(非专利参考文献15)。另外，还有一则报道是关于使用CMP-唾液酸转运子-或UDP-半乳糖转运子缺陷克隆来表达具有其中唾液酸未添加到糖链非还原末端的糖链结构的抗体或其上未添加半乳糖的抗体，但是表达效应器的活性提高，适合用于药物应用的抗体尚未成功(非专利参考文献15)。
在这种情况下，最近有报道称适合用于医疗用途、ADCC活性高的抗体可以通过使用GDP-甘露糖4，6-脱水酶(下文中亦称“GMD”)活性降低的克隆作为宿主细胞来产生，上述的酶在细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的从头合成途径中催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应(专利参考文献1，和非专利参考文献9和10)。在这些报道中，使用对识别糖链结构(该糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)的凝集素有抗性的克隆作为宿主细胞，例如对AAL(来源于橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)的凝集素)有抗性的克隆CHO-AAL、对LCA(来源于兵豆的扁豆凝集素)有抗性的克隆CHO-LCA、或克隆Lec 13。除这些之外，也已经知道确定为小鼠白血病来源的克隆BW5147的PSA(来源于豌豆的豌豆凝集素)-抗性突变体的PLR1.3是GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性降低的克隆(非专利参考文献16)。
但是，由于这些克隆中的每一种均不是完全的基因缺陷克隆，因此很难使抗体携带导致抗体显示高ADCC活性的糖链结构，即，很难完全阻止岩藻糖添加到N-糖苷-连接糖链中还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上。另外，由于突变体如PLR1.3和Lec13也通过用诱变剂处理随机导入突变而获得，因此它们不适合用作生产药学制剂的克隆。
如上所述，对于在宿主细胞中控制糖链修饰相关酶或蛋白质的活性以便修饰所产生糖蛋白质的糖链结构，已经进行了许多的尝试。但是，由于糖链的修饰机制很多且很复杂，糖链的生理学功能也尚未完全揭晓，目前仍在反复进行试验。尤其是，尽管已经生成了已经获得催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶活性的克隆和效应器活性很高的抗体组合物，但是仍不能充分地控制活性。
作为在宿主细胞中仅控制糖链修饰相关酶或蛋白质活性的一个例子，已知有一种使用siRNA(小干扰RNA)控制特定基因功能的方法(专利参考文献4)。另外，有一则报道是设计用于抑制基因功能的RNA分子的方法(非专利参考文献17)。但是，通过这种方法设计的RNA分子并不一定是可以有效抑制靶基因功能的分子(非专利参考文献18)，设计对特定基因显示有效功能够抑制效应的RNA分子仍在反复试验中。
另外，也显示使用其中导入有能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA的细胞(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，可以控制对岩藻糖与添加到已产生的糖蛋白质上的糖链结合的修饰(专利参考文献2和4)。这些报道显示，通过将能够抑制α1，6-岩藻糖基转移酶功能的RNA导入产生抗体分子的细胞系中，可以增加结合已产生的抗体分子的糖链当中未结合岩藻糖的糖链的比例。
专利参考文献1：WO00/61739
专利参考文献2：WO02/31140
专利参考文献3：WO99/54342
专利参考文献4：WO03/85118
非专利参考文献1：Biochemistry， 31，9872(1992)
非专利参考文献2：J.Biol.Chem.， 267，7703(1992)
非专利参考文献3：J.Biol.Chem.， 265，12127(1990)
非专利参考文献4：Blood， 73，84，(1989)
非专利参考文献5：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 86，7819(1989)
非专利参考文献6：British J.Cancer， 84，3，(2001)
非专利参考文献7：Science， 295，1898(2002)
非专利参考文献8：Biochemistry， 36，130(1997)
非专利参考文献9：J.Biol.Chem.， 277，26733(2002)
非专利参考文献10：J. Biol.Chem.， 278，3466(2003)
非专利参考文献11：Glycobiology， 5，813，(1995)
非专利参考文献12：J.Biol.Chem.， 261，13848(1989)
非专利参考文献13：Science， 252，1668(1991)
非专利参考文献14：Somatic Cell Mol Genet.， 12，51(1986)
非专利参考文献15：J.Immunol.， 160，3393(1998)
非专利参考文献16：J.Biol.Chem.， 255，9900(1980)
非专利参考文献17：Nature Biotech.， 22，326(2004)
非专利参考文献18：Current Opinion in Molecular Therapeutics， 6，129(2004)
发明内容
本发明要解决的问题：
本发明的一个目的是提供一种细胞，其中导入了能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶的功能的RNA；使用该细胞制造蛋白质组合物的方法；用于制备该细胞的RNA；与该RNA对应的DNA；和包括所述DNA及其互补DNA的载体。
另外，本发明的一个目的是提供一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶蛋白质的功能的RNA，或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体相关蛋白质的功能的RNA；以及使用该细胞制造糖蛋白质组合物的方法。
而且，本发明的一个目的是提供一种DNA，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(其中上述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA，或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA；包括该DNA的载体；导入该载体的细胞；导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(其中上述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)的载体，和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶蛋白质的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA，或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体的细胞；和使用该细胞制造糖蛋白质组合物的方法。
解决问题的方式：
本发明涉及下列的(1)至(71)：
(1)一种细胞，其中导入了包括选自下列(a)或(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的活性的RNA。
(2)根据(1)的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖脱水反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
(3)根据(2)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下列(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(4)根据(2)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
(5)一种双链RNA，其包括选自下列(a)或(b)的RNA及其互补RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的活性的RNA。
(6)与(5)中所述的RNA对应的DNA及其互补DNA。
(7)一种载体，其包括与(5)中所述的RNA对应的DNA。
(8)一种细胞，其中导入了(7)中所述的载体。
(9)一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶的功能的RNA，或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA。
(10)一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA。
(11)根据(9)或(10)的细胞，其中所述的细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶是催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶。
(12)根据(9)至(11)中任意一项的细胞，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
(13)根据(12)的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
(14)根据(12)的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至(1)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(1)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
(15)根据(9)至(14)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)至(d)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
(16)根据(9)至(14)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
(17)根据(11)至(16)中任意一项的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
(18)根据(17)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
(19)根据(17)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
(20)根据(11)至(19)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)至(c)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
(21)根据(11)至(19)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
(22)一种DNA，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA，或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA。
(23)一种DNA，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA。
(24)根据(22)或(23)的DNA，其中所述的细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶是催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶。
(25)根据(22)至(24)中任意一项的DNA，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
(26)根据(25)的DNA，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
(27)根据(25)的DNA，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下面(a)至(l)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(1)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
(28)根据(22)至(27)中任意一项的DNA，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是选自下列(a)至(d)的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
(29)根据(22)至(27)中任意一项的DNA，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是选自下列(a)和(b)的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
(30)根据(24)至(29)中任意一项的DNA，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
(31)根据(30)的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
(32)根据(30)的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
(33)根据(24)至(32)中任意一项的DNA，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是选自下列(a)至(c)的RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
(34)根据(24)至(32)中任意一项的DNA，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是选自下面(a)和(b)的RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
(35)一种载体，其包括(22)至(34)中任意一项中所述的DNA。
(36)根据(35)的载体，其包括SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ ID NO：92所示的DNA。
(37)根据(35)的载体，其包括SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ ID NO：92所示的DNA。
(38)根据(35)的载体，其包括SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA。
(39)根据(35)的载体，其包括SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA。
(40)一种细胞，其中导入了(35)至(39)中任意一项的载体。
(41)一种细胞，其中导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体，或包括与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体。
(42)一种细胞，其中导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体。
(43)根据(41)或(42)的细胞，其中所述的能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶蛋白质功能的RNA是能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA。
(44)根据(41)至(43)中任意一项的细胞，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
(45)根据(44)的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
(46)根据(44)的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至(1)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(l)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
(47)根据(41)至(46)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)至(d)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
(48)根据(41)至(46)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
(49)根据(43)至(48)中任意一项的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
(50)根据(49)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
(51)根据(49)的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
(52)根据(43)至(51)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)至(c)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
(53)根据(43)至(51)中任意一项的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
(54)根据(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(53)中任意一项的细胞，其对识别如下糖链结构的凝集素有抗性：在N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
(55)根据(54)的细胞，其中所述的凝集素选自下列(a)至(d)：
(a)兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(来源于兵豆的扁豆凝集素)；
(b)豌豆(P.sativum)凝集素PSA(来源于豌豆的豌豆凝集素)；
(c)蚕豆(Vicia faba)凝集素VFA(来源于蚕豆的凝集素)；
(d)橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(来源于橙黄网胞盘菌的凝集素)。
(56)根据(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(55)中任意一项的细胞，其为选自酵母、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞的细胞。
(57)根据(56)的细胞，其中所述的动物细胞选自下列(a)至(k)：
(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)产生抗体的杂交瘤细胞；
(g)人白血病细胞系Namalwa细胞；
(h)人白血病细胞系NM-F9细胞；
(i)人胚胎视网膜细胞系PER.C6细胞；
(j)胚胎干细胞；
(k)受精卵细胞。
(58)根据(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(57)中任意一项的细胞，其包括编码糖蛋白质的基因。
(59)根据(58)的细胞，其中所述的糖蛋白质是抗体分子。
(60)根据(59)的细胞，其中所述的抗体分子选自下列(a)至(d)：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区的融合蛋白质。
(61)根据(59)或(60)的细胞，其中所述的抗体分子属于IgG型。
(62)一种糖蛋白质组合物的制造方法，其包括使用(58)中所述的细胞。
(63)一种糖蛋白质组合物的制造方法，其包括将(58)中所述的细胞在培养基中培养，在培养物形成并积聚糖蛋白质组合物；和从培养物中回收和纯化糖蛋白质组合物。
(64)一种抗体组合物的制造方法，其包括使用(59)至(61)中任意一项中所述的细胞。
(65)一种抗体组合物的制造方法，其包括将(59)至(61)中任意一项所述的细胞在培养基中培养，在培养物形成和积聚抗体组合物；和从培养物中回收和纯化抗体组合物。
(66)根据(64)或(65)的方法，其中所述的抗体组合物是依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性高于其亲代细胞产生的抗体组合物的抗体组合物。
(67)根据(66)的方法，其中所述的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性较高的抗体组合物中，糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的糖链在与抗体组合物Fc区结合的全部复合型N-糖苷-连接糖链当中的比例高于其亲代细胞产生的抗体组合物。
(68)根据(67)的方法，其中所述的未结合岩藻糖的糖链是在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位不与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合的糖链。
(69)通过(62)或(63)中所述的方法产生的糖蛋白质组合物。
(70)通过(64)至(68)中任意一项所述的方法产生的抗体组合物。
(71)一种药物，其包括(69)或(70)所述的组合物作为活性成分。
本发明的效果
本发明提供一种其中被导入了能够抑制酶功能的RNA的细胞，上述酶催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应；使用所述细胞制造糖蛋白质的方法；用于制备该细胞的RNA；与该RNA对应的DNA；和包括该DNA及其互补DNA的载体。另外，本发明还提供一种细胞，该细胞中导入了能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，以及能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶蛋白质功能的RNA，或者能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA；以及使用所述细胞制造糖蛋白质的方法。而且，本发明提供一种包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和对应于能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA或者能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA的DNA及其互补DNA；包括该DNA的载体；导入了该载体的细胞；导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接的糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体的细胞；和使用所述细胞制造糖蛋白质组合物的方法。
下面对本发明进行详细说明。本申请要求于2004年8月5日提交的日本专利申请第2004-228928号、于2004年8月31日提交的日本专利申请第2004-252682号和于2005年5月9日提交的日本专利申请第2005-136410号的优先权，在此引入这些申请的说明书和附图作为参考。
附图说明
图1显示了质粒pBS-U6term的构建。
图2显示了质粒pPUR-U6term的构建。
图3显示了质粒pPUR/GMDshB的构建。
图4显示了每个克隆中GMD mRNA的量。横坐标表示假设亲代克隆32-05-12的量为100时GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色条表示未导入siRNA的亲代克隆，空心条表示单独导入GMD-靶向siRNA表达载体的克隆。
图5显示了克隆32-05-12AF(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)、和抗凝集素克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF(通过无血清流加式培养向其中导入了GMD-靶向siRNA表达质粒)活细胞密度的变化。横坐标和纵坐标分别表示培养天数和活细胞密度。在图中，实心三角、空心圆圈和实心圆圈分别表示克隆32-05-12AF、克隆12-GMDB-2AF和克隆12-GMDB-5。
图6显示了克隆32-05-12AF(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)、和导入GMD-靶向siRNA表达质粒的抗凝集素克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF的无血清流加式培养的培养上清液中积累的抗体数量的变化。横坐标和纵坐标分别表示培养天数和所积累抗体的量。在图中，实心三角、空心圆圈和实心圆圈分别表示克隆32-05-12AF、克隆12-GMDB-2AF和克隆12-GMDB-5。
图7显示了质粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR和FUT8shRNA/lib3/pPUR的构建。
图8显示了质粒FT8libB/pBS和FT8lib3/pBS的构建。
图9显示了质粒FT8libB/pAGE和FT8lib3/pAGE的构建。
图10显示了在导入GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体或者单独导入GMD-靶向siRNA表达载体的每个克隆中以及亲代克隆中GMD mRNA的量。横坐标表示当假设亲代克隆32-05-12的量为100时GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示没有导入siRNA的亲代克隆和单独导入GMD-靶向siRNA表达载体的克隆。
图11显示了在导入GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体或者单独导入GMD-靶向siRNA表达载体的每个克隆中以及亲代克隆中FUT8 mRNA的量。横坐标表示当假设亲代克隆32-05-12的量为100时FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示没有导入siRNA的亲代克隆和单独导入GMD-靶向siRNA表达载体的克隆。
图12显示了克隆32-05-12AF(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)、和在无血清流加式培养中导入GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的抗凝集素克隆Wi23-5AF活细胞密度的变化。横坐标和纵坐标分别表示培养天数和活细胞密度。在图中，虚线和实线分别表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
图13显示了克隆32-05-12AF(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)、和导入GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的抗凝集素克隆Wi23-5AF的无血清流加式培养培养上清液中积累的抗体的量的变化。横坐标和纵坐标分别表示培养天数和所积累抗体的量。在图中，虚线和实线分别表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
图14显示了标准样品的shFcγRIIIa结合活性，该标准品中抗CCR4嵌合抗体的岩藻糖(-)％是已知的。横坐标和纵坐标分别表示岩藻糖(-)％和显示shFcγRIIIa结合活性的490nm处的吸光度。
图15显示了由克隆32-05-12AF(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)或导入GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的抗凝集素Wi23-5AF克隆的无血清流加培养基中培养上清液中所含抗CCR4嵌合抗体的shFcγRIIIa结合活性计算的岩藻糖(-)％。横坐标和纵坐标分别表示培养天数和岩藻糖(-)％。在图中，虚线和实线分别表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
图16显示了质粒pCR/GMDshB和pCR/GMDmB的构建。
图17显示了质粒FT8libB_GMDB/pAGE、FT8lib3_GMDB/pAGE、FT8libB_GMDmB/pAGE和FT8lib3_GMDmB/pAGE的构建。
图18显示了通过将GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆32-05-12(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的GMD mRNA的相对量。横坐标表示当假设亲代克隆32-05-12的量为100时GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆32-05-12的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的GMD mRNA的相对量。
图19显示了通过将GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆32-05-12(其为来源于CHO/DG44细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的FUT8 mRNA相对量。横坐标表示当假设亲代克隆32-05-12的量为100时，FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的FUT8 mRNA的相对量。
图20显示了质粒pPUR/GMDmB的构建。
图21显示了通过将小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆KM968(其为来源于SP2/0细胞的产生抗GM2抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的GMD mRNA的相对量。横坐标表示当假设亲代克隆KM968的量为100时，GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆KM968的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的GMD mRNA的相对量。
图22显示了通过将小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆KM968(其为来源于SP2/0细胞的产生抗GM2抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的FUT8 mRNA的相对量。横坐标表示当假设亲代克隆KM968的量为100时，FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆KM968的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的FUT8 mRNA的相对量。
图23显示了通过将小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆NS0/2160(其为来源于NS0细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的GMD mRNA的相对量。横坐标表示当假设亲代克隆NS0/2160的量为100时，GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆NS0/2160的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的GMD mRNA的相对量。
图24显示了通过将小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入克隆NS0/2160(其为来源于NS0细胞的产生抗CCR4抗体的克隆)获得的每个克隆中表达的FUT8 mRNA的相对量。横坐标表示当假设亲代克隆NS0/2160的量为100时，GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，纵坐标表示每个克隆。在图中，黑色和空心条分别表示当假设亲代克隆NS0/2160的量为100时，亲代克隆和通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的每个克隆的FUT8 mRNA的相对量。
具体实施方式
在本发明中，细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶(下文中亦称为“GDP-岩藻糖合成酶”)可以是任何酶，只要它是与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶，在细胞中为糖链提供岩藻糖来源。另外，本发明中的GDP-岩藻糖合成酶还包括对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有影响的酶和类似物。
细胞内GDP-岩藻糖由从头合成途径或补救(salvage)合成途径提供。因此，所有与合成途径相关的酶和蛋白质均包括在GDP-岩藻糖合成酶中。
与从头合成途径有关的GDP-岩藻糖合成酶包括催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶、催化GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖转化为GDP-岩藻糖的反应的酶、和类似物。
在本发明中，作为催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶，优选使用催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的脱水反应的酶。催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖脱水反应的酶包括GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
在本发明中，催化GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖转化为GDP-岩藻糖的反应的酶包括催化GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-岩藻糖的反应的酶、催化GDP-酮-6-脱氧-GDP-岩藻糖4-位的还原反应的酶、和类似酶。具体的例子包括GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶、具有催化GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-岩藻糖的反应和催化GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-岩藻糖4-位上的还原反应的酶活性的4-还原酶、和类似酶。
与补救合成途径有关的GDP-岩藻糖合成酶包括GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖激酶(fucokinase)和类似酶。
作为对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有影响的酶，也包括对上述GDP-岩藻糖合成酶的活性有影响的酶和对作为酶底物的物质的结构有影响的酶。
在本发明中，与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体有关的蛋白质可以是任何蛋白质，只要它涉及细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运。具体例子包括GDP-岩藻糖转运子和类似物。
在本发明中导入了能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA的细胞可以是任何细胞，只要它是被导入了能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶(下文中亦称为“GDP-甘露糖转化酶”)的活性或表达的RNA的细胞。
在本发明中，GDP-甘露糖4，6-脱水酶优选地用作GDP-甘露糖转化酶。
在本发明中，GDP-甘露糖4，6-脱水酶包括由下面(a)至(f)中的DNA编码的蛋白质、下列(g)至(o)中的蛋白质和类似物：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(g)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(h)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(i)包括由SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(j)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(k)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(l)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(m)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(n)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(o)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
另外，编码GDP-甘露糖4，6-脱水酶氨基酸序列的DNA还包括：包括SEQ ID NO：8至10中任意一个所示的核苷酸序列的DNA、在严格性条件下与SEQ ID NO：8至10中任意一个所示的核苷酸序列组成的DNA杂交并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的氨基酸序列的DNA和类似物。
另外，本发明还涉及一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA，或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA。
在本发明中，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA、或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞可以是任何细胞，只要它是导入了能够抑制糖链修饰相关酶的活性或表达的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的活性或表达的RNA、或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的活性或功能的RNA的细胞。优选导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶的活性或表达的RNA、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的活性或表达的RNA的细胞，更优选导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶活性或表达的RNA、和能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶(GDP-甘露糖转化酶)活性或表达的RNA的细胞。
在本发明中，α1，6-岩藻糖修饰酶包括任何酶，只要它是糖链修饰相关酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
α1，6-岩藻糖修饰酶的具体例子包括α1，6-岩藻糖基转移酶、α-L-岩藻糖苷酶和类似物。
α1，6-岩藻糖基转移酶包括由下列(a)至(h)中的DNA编码的蛋白质、下列(i)至(t)中的蛋白质、和类似物：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(i)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(j)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(k)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(l)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(m)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(n)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(o)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(p)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(q)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(r)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(s)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(t)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
另外，编码α1，6-岩藻糖基转移酶氨基酸序列的DNA还包括：包括SEQ ID NO：1至4中任意一个所示核苷酸序列的DNA、在严格条件下与由SEQ ID NO：1至4中任意一个所示核苷酸序列组成的DNA杂交并且编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的氨基酸序列的DNA、和类似物。
在本发明中，可以在严格条件下杂交的DNA是指使用例如具有SEQ ID NO：1-4和4-8中任意一个所示核苷酸序列的DNA或其部分片段作为探针，通过诸如集落杂交、噬菌斑杂交、或DNA印记杂交的方法获得的DNA，具体地，包括通过进行下列杂交鉴定的DNA：在存在0.7至1.0mol/L氯化钠的情况下，使用其上固定有来自集落或噬菌斑的DNA的滤膜，然后在65℃下用0.1至2×SSC溶液(1×SSC溶液包括：150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)洗涤滤膜。可以根据下列文献所述的方法进行杂交：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition(分子克隆，实验手册，第二版)，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)(下文称为“Molecular Cloning，第二版”)、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)，John Wiley & Sons，1987-1997(下文称为“Current Protocols in MolecularBiology”)；DNA Cloning 1： Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition(DNA克隆1：核心技术，实践方法，第二版)，OxfordUniversity(1995)；和类似文献。可杂交的DNA包括与SEQ ID NO：1-4和8-10中任意一个所示核苷酸序列的同源性为至少60％或更高、优选70％或更高、更优选80％或更高、进一步优选90％或更高、尤其优选95％或更高、最优选98％或更高的DNA。
在本发明中，包括SEQ ID NO：5-7和84中任意一个所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质，或者包括SEQ ID NO：11-13中任意一个所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质，均可以通过下列方法获得：例如，通过位点定点诱变将位点定点突变引入编码具有SEQ ID NO：5-7和84中任意一个或SEQ IDNO：11-13中任意一个所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，其描述可参见：例如，Molecular Cloning，第二版；Current Protocols in MolecularBiology；Nucleic Acids Research， 10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 79，6409(1982)；Gene， 34，315(1985)；NucleicAcids Research， 13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 82，488(1985)等。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的数目是一个或多个，不进行具体限定，但是在通过已知方法如位点定向诱变可能实现的缺失、取代或添加的数目。例如，它为1至数十个，优选1至20，更优选1至10，进一步优选1至5。
在本发明中，包括与SEQ ID NO：11至13中任意一个所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质是与SEQ ID NO：11至13中任意一个所示氨基酸序列的同源性为至少80％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、进一步优选为95％或更高、特别优选为97％或更高、最优选为99％或更高、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
另外，在本发明中，包括与SEQ ID NO：5-7和48中任意一个所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质是与SEQ ID NO：5-7和48中任意一个所示氨基酸序列的同源性为至少80％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、进一步优选为95％或更高、特别优选为97％或更高、最优选为99％或更高、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
除非另外说明，本发明中所述的同源性数目可以是通过已知的同源性搜索程序计算的数目。就核苷酸序列而言，可以通过在BLAST[J.Mol.Biol.， 215，403(1990)]或类似程序中使用缺省参数来计算该数目，就氨基酸序列而言，可以通过在BLAST2[Nucleic Acids Res.， 25，3389(1997)；Genome Res.， 7，649(1997)； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]或类似程序中使用缺省参数来计算该数目。
作为缺省参数，核苷酸序列的G[起始开放空位(cost to open gap)]为5，氨基酸序列的G为11；核苷酸序列的-E[起始延伸空位(cost toextend gap)]为2，氨基酸序列的-E为1；-q(核苷酸错配罚分)为-3；-r(核苷酸匹配补偿)为1；-e(期望值)为10；核苷酸序列的-W(字长)是11个残基，氨基酸序列的-W是3个残基；blastn的-y[blast延伸的X阈值(dropoff)，以位计算]为20，blastn之外的程序为7；-X[空位联配X阈值(dropoff value)，以位计算]为15；blastn的-Z[最终的空位联配X阈值(dropoff value)，以位计算]为50，blastn之外的程序为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。另外，氨基酸序列的分析软件还包括FASTA[Methods in Enzymology， 183，63(1990)]和类似程序。
在本发明中使用的细胞可以是任何细胞，只要它可以表达糖蛋白质如抗体分子。例子包括酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞以及类似物，优选为动物细胞。动物细胞中的优选实施例包括来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞、大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞、小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14细胞、来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞、产生抗体的杂交瘤细胞、人白血病细胞系Namalwa细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞、以及类似细胞。
在本发明中，其中导入了能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA的细胞，或者其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞(下文中统称为“本发明的细胞”)对识别糖链结构的凝集素有抗性，所述糖链结构中在N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接的糖链结构。其中未导入RNA的亲代细胞对凝集素没有抗性。
因此，在本发明中，本发明的细胞包括可以产生糖蛋白质组合物、并对识别糖链结构的凝集素有抗性的细胞(所述糖链结构中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，例如酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。例子包括杂交瘤细胞、产生人抗体或人源化抗体的宿主细胞、产生转基因非人动物(其生成人抗体)的胚胎干细胞和受精卵细胞、产生转基因植物(其生成人抗体)的植物愈伤组织细胞、骨髓瘤细胞、来源于转基因非人动物的细胞和对识别糖链结构的凝集素有抗性的类似细胞(所述糖链结构中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)。骨髓瘤细胞可以用作产生杂交瘤细胞的融合细胞。另外，杂交瘤细胞还可通过用抗原对转基因非人动物进行免疫，使用产生抗体的细胞如动物脾细胞来产生。
对凝集素有抗性的细胞是向培养基中加入有效浓度的凝集素来进行细胞培养时，其生长不受抑制的细胞。
在本发明中，不抑制生长的凝集素有效浓度可以取决于用作亲代细胞的细胞系进行调节，其通常为10μg/ml至10.0mg/ml，优选为0.5至2.0mg/ml。当能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA被导入亲代细胞时，或者当能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质的功能的RNA被导入亲代细胞时，凝集素的有效浓度是亲代细胞不能正常生长的浓度或比其高的浓度，该浓度优选为与亲代细胞不能正常生长的浓度相同，更优选为比亲代细胞不能正常生长的浓度高2至5倍、进一步更优选至少10倍、最优选至少20倍。
亲代细胞是指在导入能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA之前的细胞，或者是在导入能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA之前的细胞。
尽管亲代细胞没有具体限定，仍以下列细胞作为例子。
NS0细胞的亲代细胞包括下列文献所述的NS0细胞：例如BIO/TECHNOLOGY， 10，169(1992)和Biotechnol.Bioeng.， 73，261(2001)。另外，它还包括登记于RIKEN Cell Bank，The Institute of Physical andChemical Research的细胞系NS0(RCB 0213)、通过将这些细胞系在各种其可生长的培养基中适应性生长得到的亚系(sub-line)以及类似物。
SP2/0-Ag14细胞的亲代细胞包括下列文献所述的SP2/0-Ag14细胞：例如，J.Immunol.， 126，317(1981)；Nature， 276，269(1978)和Human Antibodies and Hybridomas， 3，129(1992)所述的。而且，其还包括登记于ATCC的SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL-1581)、通过将这些细胞系在各种其可以生长的培养基中适应性生长得到的亚系(ATCCCRL-1581.1)以及类似物。
来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞的亲代细胞包括下列文献所述的CHO细胞：例如，Journal of Experimental Medicine， 108，945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 60，1275(1968)；Genetics， 55，513(1968)；Chromosoma，41，129(1973)；Methods in Cell Science， 18，115(1996)、Radiation Research， 148，260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)；Proc.Natl.AcadSci.USA， 60，1275(1968)；Cell， 6，121(1975)；和Molecular Cell Genetics，附录I，II(第883-900页)。而且，其还包括登记于ATCC的细胞系CHO-K1(ATCC CCL-61)、细胞系DUXB11(ATCC CRL-9096)和细胞系Pro-5(ATCC CRL-1781)、市售的细胞系CHO-S(Lifetechnologies的Cat#11619)，将这些细胞系在其可生长的各种培养基中适应性生长得到的亚系及类似物。
大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞的亲代细胞包括从Y3/Ag1.2.3细胞建立的细胞系(ATCC CRL-1631)，例如文献例如J.CellBiol.， 93，576(1982)和Methods Enzymol.， 73B，1(1981)所述的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞。而且，其包括登记于ATCC的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL-1662)、将这些细胞系在各种其可生长的培养基中适应性生长得到的亚系、及类似物。
除上述细胞之外，用于本发明中的亲代细胞包括人白血病细胞系NM-F9细胞(DSM ACC2605，WO05/17130)、人胚胎视网膜细胞系PER.C6细胞(ECACC No.96022940，US6855544)、将这些细胞系在各种其可生长的培养基中适应性生长得到的亚系、及类似物。
识别其中在复合型N-糖苷连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接的糖链结构的凝集素可以是任何凝集素，只要其可以识别该糖链结构。具体的例子包括兵豆(Lensculinaris)凝集素LCA(来源于兵豆的扁豆凝集素)、豌豆(Pisumsativum)凝集素PSA(来源于豌豆的豌豆凝集素)、蚕豆(Vicia faba)凝集素VFA(来源于蚕豆的凝集素)和橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(来源于橙黄网胞盘菌的凝集素)、和类似物。
在本发明中，能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA、或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA可以是任何RNA，只要它包括RNA及其互补RNA，分别是能够降低α1，6-岩藻糖修饰酶mRNA的量的双链RNA、和能够降低细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的mRNA的量或者将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体相关的蛋白质mRNA的量的双链RNA。就RNA的长度而言，其例子为10至40、优选10至30、更优选15至30的连续RNA。
能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA、或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA优选为能够降低GDP-甘露糖转化酶的mRNA的量的RNA。
例子包括：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
优选的例子包括：
(1)包括SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的RNA；
(2)由在SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖转化酶功能的活性的RNA；
(1)包括SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的RNA；
(2)由在SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖转化酶功能的活性的RNA；
(3)包括SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列的RNA；
(4)由在SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖转化酶功能的活性的RNA；
(5)包括SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列的RNA；
(6)由在SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖转化酶功能的活性的RNA。
在上述(a)至(c)和(1)至(6)的RNA中，优选(a)、(1)和(2)中的RNA用于来源于仓鼠的亲代细胞，(b)、(3)和(4)中的RNA用于来源于人的亲代细胞，(c)、(5)和(6)中的RNA用于来源于小鼠的亲代细胞，作为能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA。
在本发明中，能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA优选为能够降低α1，6-岩藻糖修饰酶mRNA数量的RNA。RNA的长度为，例如，10至40、优选10至30、更优选15至30。
例子包括：
(d)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(e)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(f)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(g)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
优选的例子包括：
(7)包括SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列的RNA；
(8)由在SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(9)包括SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的RNA；
(10)由在SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(11)包括SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的RNA；
(12)由在SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(13)包括SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的RNA；
(14)由在SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(15)包括SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的RNA；
(16)由在SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(17)包括SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的RNA；
(18)由在SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(19)包括SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的RNA；
(20)由在SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(21)包括SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的RNA；
(22)由在SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(23)包括SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列的RNA；
(24)由在SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(25)包括SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的RNA；
(26)由在SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(27)包括SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的RNA；
(28)由在SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(29)包括SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列的RNA；
(30)由在SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(31)包括SEQ IDNO：26所示的核苷酸序列的RNA；
(32)由在SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(33)包括SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列的RNA；
(34)由在SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(35)包括SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列的RNA；
(36)由在SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(37)包括SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列的RNA；
(38)由在SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(39)包括SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列的RNA；
(40)由在SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(41)包括SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列的RNA；
(42)由在SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(43)包括SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列的RNA；
(44)由在SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(45)包括SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的RNA；
(46)由在SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(47)包括SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列的RNA；
(48)由在SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(49)包括SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列的RNA；
(50)由在SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(51)包括SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列的RNA；
(52)由在SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(53)包括SEQ ID NO：86所示的核苷酸序列的RNA；
(54)由在SEQ ID NO：86所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(55)包括SEQ ID NO：87所示的核苷酸序列的RNA；
(56)由在SEQ ID NO：87所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(57)包括SEQ ID NO：88所示的核苷酸序列的RNA；
(58)由在SEQ ID NO：88所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA；
(59)包括SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列的RNA；
(60)由在SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的活性的RNA。
在上述(d)至(g)和(7)至(60)的RNA中，优选地，(d)和(7)至(26)的RNA用作来源于仓鼠的亲代细胞，(e)、(11)、(12)、(23)至(28)、(33)至(39)、(41)、(42)、(45)、(46)、(51)、(52)、(57)和(58)的RNA用作来源于小鼠的亲代细胞，(f)、(7)、(8)、(11)、(12)、(19)、(20)、(23)至(26)、(33)、(34)、(39)至(42)、(49)、(50)、(55)和(56)的RNA用作来源于大鼠的亲代细胞，(g)、(23)至(26)、(29)至(34)、(37)、(38)、(43)、(44)、(47)、(48)、(53)、(54)、(59)和(60)的RNA用作来源于人的亲代细胞，作为能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA。
其中一个或多个核苷酸被缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列是，例如，在SEQ ID NO：14-37、57、58和85-89中任意一个所示核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列。通过缺失、取代、插入和/或添加核苷酸形成的双链RNA可以是仅在一条链上缺失、取代、插入和/或添加核苷酸的RNA。即，双链RNA并不一定是完全互补的链，只要其能获得本发明的效果。
另外，本发明还涉及一种载体，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA；和包括该DNA的载体。
在本发明中，包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA可以是任何DNA，只要它是包括与能够抑制糖链修饰相关酶活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA。优选为包括与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶的活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA，更优选为包括与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶的活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA、和与能够抑制GDP-甘露糖转化酶活性或表达的RNA对应的DNA及其互补DNA的DNA。
本发明的载体可以是任何载体，只要它是包括本发明中上述DNA的载体，所述DNA包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA。
本发明的载体可以通过下列方法构建：例如，将上述DNA插入市售的siRNA表达载体，所述的DNA包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA。
本发明的载体可以通过以下方法构建成一个载体：将与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA插入载体(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)，以便被各自独立的启动子转录，将与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA插入载体，以便被各自独立的启动子转录。但是，为了容易形成双链RNA，优选地，制备其中与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA，将DNA插入载体，以便被独立的启动子转录，制备其中与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关的酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA、或其中与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA，将该DNA插入载体，以便被独立的启动子转录，从而将本发明的载体构建成一个载体。
而且，其中与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA、和其中与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA或其中与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA可以在一个启动子的控制下插入载体，以便转录成一条连续的RNA。
两个独立的启动子是相同类型的启动子或不同类型的启动子。两个独立启动子的方向是相同的方向或相反的方向。作为本发明载体中的两个独立启动子，优选不同类型启动子的位置朝着相同的方向。
启动子可以是任何启动子，只要它是能够在亲代细胞中发挥作用的启动子。例如，当使用动物细胞作为亲代细胞时，可以使用聚合酶III启动子，如U6启动子、H1启动子和tRNA启动子。
用作连接子的核苷酸序列可以是任何序列，只要它是用于形成双链RNA的序列。优选能够表达发夹型(hairpin-type)siRNA的序列，其中RNA及其互补RNA通过大约2至10个核苷酸的环连接，从而形成双链RNA。
其中与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA通过连接子序列连接的DNA包括选自SEQ ID NO：90、91、94和95所示核苷酸序列的DNA。
其中与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA优选是其中与能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA。其中与能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA是选自SEQ ID NO：92、93和96所示核苷酸序列的DNA。
在本发明的载体中，其中与能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA，和其中与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA，或其中与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA及其互补RNA对应的DNA及其互补DNA分别通过连接子序列连接的DNA，优选地根据要导入的亲代细胞的动物种属选择成有效的组合。具体地，当亲代细胞来源于仓鼠时，优选使用SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ IDNO：92所示的DNA的组合，或者SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ IDNO：92所示的DNA的组合。
当亲代细胞来源于小鼠时，优选使用SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA的组合，或者SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA的组合。
当亲代细胞来源于人时，优选使用SEQ ID NO：94所示的DNA和SEQ ID NO：96所示的DNA的组合，或者SEQ ID NO：95所示的DNA和SEQ ID NO：96所示的DNA的组合。
其中导入了本发明载体的细胞包括在本发明的细胞中。
另外，本发明的细胞还包括通过下列方法获得的细胞：将上述与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA插入两种独立的载体，将两种独立的载体共同导入细胞。
本发明的细胞能够产生具有无岩藻糖的糖链结构、且生理学活性很高的糖蛋白质。即，本发明可以提供生理学活性高于它的亲代细胞所产生的糖蛋白质的糖蛋白质的制造方法。
由于具有无岩藻糖的糖链结构而生理学活性很高的糖蛋白质的例子包括由于具有无岩藻糖的糖链结构而与受体的亲合性提高的糖蛋白质、血液中半衰期提高的糖蛋白质、给药至血液中后组织分布改变的糖蛋白质、和表达药学活性所必须的蛋白质相互作用提高的糖蛋白质。
因此，本发明中的糖蛋白质可以是任何糖蛋白质，只要它是当由亲代细胞产生时，所产生的蛋白质具有与岩藻糖结合的糖链结构的糖蛋白质。例子包括抗体、促红细胞生成素、血小板生成素、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶原、血栓调节蛋白质、抗凝血酶III、C蛋白质、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、促性腺激素、促甲状腺激素、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质形成细胞生长因子、激活蛋白质、骨形态发生因子、干细胞因子(SCF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-11、可溶性白细胞介素-4受体、肿瘤坏死因子-α、DNase I、半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶和类似物。
由于不结合岩藻糖的糖链结构而生理学活性显著提高的糖蛋白质的例子包括抗体组合物。
即，本发明的细胞可以产生ADCC活性高于亲代细胞所产生抗体组合物的抗体组合物。
而且，本发明的细胞可以产生一种抗体组合物，所述抗体组合物中，抗体组合物中与Fc区结合的全部复合型N-糖苷-连接糖链中，岩藻糖不与糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例高于亲代细胞产生的抗体组合物。
在本发明中，抗体组合物是包括Fc区具有复合型N-糖苷-连接糖链的抗体分子的组合物。
抗体是四聚体，其中两条多肽链每一条的两个分子重链和轻链(下文中分别称为“H链”和“L链”)分别连接在一起。每条H链N-端大约四分之一和L链N-端的一半(均多于100个氨基酸)称为可变区(下文中称为“V区”)，其变异很大，且与抗原结合直接相关。V区之外较大的部分称为恒定区(下文中称为“C区”)。根据与C区的同源性，抗体分子分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。
另外，IgG类进一步根据C区的同源性分成IgG1至IgG4的子类。
H链分成四个免疫球蛋白质功能区，从其N-末端为抗体H链V区(下文中称为“VH”)、抗体H链C区1(下文中称为“CH1”)、抗体H链C区2(下文中称为“CH2”)和抗体H链C区3(下文中称为“CH3”)，可高度变形的肽区称为铰链区(hinge region)，铰链区存在于CH1和CH2之间，以分隔CH1和CH2。在铰链区下游包括CH2和CH3的结构单位称为Fc区，该区与复合型N-糖苷-连接糖链结合。Fc区是Fc受体、补体和类似物结合的区域(Immunology Illustrated，the Original，第5版，2000年2月10日出版，Nankodo；Handbook of AntibodyTechnology(Kotai Kogaku Nyumon)，第一版，1994年1月25日，ChijinShokan)。
根据与蛋白质部分的结合形式将糖蛋白质如抗体的糖链大致分为两类，即与天冬酰胺结合的糖链(N-糖苷-连接糖链)和与丝氨酸、苏氨酸或类似物结合的糖链(O-糖苷-连接糖链)。N-糖苷-连接糖链具有下式(I)所示的基本通用核心结构[Biochemical Experimentation Method23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化学实验方法23-糖蛋白质糖链的研究方法)(Gakujutsu Shuppan Center)，ReikoTakahashi主编(1989)]：
式(I)
Figure A20058003046000701
在式(I)中，与天冬酰胺结合的糖链末端称为还原末端，相反的一侧称为非还原末端。
N-糖苷-连接糖链可以是任何N-糖苷-连接糖链，只要它包括式(I)的核心结构。例子包括高甘露糖型(其中甘露糖单独与核心结构的非还原末端结合)；复合型(其中核心结构的非还原末端侧包括一个或多个半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(下文中称为“Gal-GlcNAc”)平行分支，Gal-GlcNAc的非还原末端侧还包括唾液酸、平分型N-乙酰氨基葡萄糖或类似的结构)；杂合型(其中核心结构的非还原末端侧包括高甘露糖型和复合型两种类型的分支)；和类似类型。
由于抗体分子中的Fc区包括与N-糖苷-连接糖链单独结合的区域，因此每一个抗体分子结合两条糖链。由于与抗体分子结合的N-糖苷-连接糖链包括任何具有式(I)所示核心结构的糖链，因此与抗体结合的两条N-糖苷-连接糖链有许多种糖链的组合。
因此，在本发明中，通过使用其中导入了能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA的细胞而制备的抗体组合物，或通过使用导入了能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞而制备的抗体组合物可包括糖链结构相同的抗体分子或糖链结构不同的抗体分子，只要其可以获得本发明的效果。
在与抗体组合物中所含的Fc区结合的全部复合型N-糖苷-连接糖链当中，糖链中还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链比例(下文中称为“本发明的糖链比例”)是其中岩藻糖不与糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链数目与结合于组合物中所含Fc区的复合型N-糖苷-连接糖链总数目的比例。
复合型N-糖苷-连接糖链中还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链是在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖不与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链。具体来说，提到了在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖不与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链。
本发明的糖链比例越高，则抗体组合物的ADCC活性越高。ADCC活性较高的抗体组合物包括本发明的糖链比例优选为20％或更高、更优选30％或更高、再优选40％或更高、特别优选50％或更高、最优选100％的抗体组合物。
而且，本发明涉及ADCC活性高于其亲代细胞产生的抗体组合物的制造方法。
当本发明的糖链比例高于其亲代细胞产生的抗体组合物时，抗体组合物的ADCC活性高于其亲代细胞产生的抗体组合物。
ADCC活性是一种细胞毒活性(其中抗体与活体中肿瘤细胞上细胞表面抗原结合)，其通过抗体Fc区与效应细胞表面上存在的Fc受体结合来活化效应细胞，从而损伤肿瘤细胞和类似物[MonoclonalAntibodies：Principles and Applications(单克隆抗体：原理和应用)，Wiley-Liss，Inc.，Chapter 2.1(1995)]。效应细胞包括杀伤细胞、天然杀伤细胞、活化的巨噬细胞和类似细胞。
组合物(其包括在Fc区具有复合型N-糖苷-连接糖链的抗体分子)中所含的糖链中，还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链的比例可以通过下列方法测定：用已知的方法如肼解作用和酶解作用从抗体分子中释放出糖链[Biochemical Experimentation Methods23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化学实验方法23-研究糖蛋白质糖链的方法)(Japan Scientific Societies Press)，ReikoTakahashi主编(1989)]，对释放出的糖链进行荧光标记或放射性同位素标记，通过色谱分离出标记的糖链。另外，释放的糖链可通过HPAED-PAD法进行分析确定[J.Liq.Chromatogr.， 6，1577(1983)]。
抗体分子可以是任何抗体分子，只要它包括抗体Fc区。例子包括抗体、抗体片段、包括Fc区的融合蛋白质、和类似物。
抗体的例子包括有以抗原免疫的动物脾细胞制备的杂交瘤细胞分泌的抗体；通过基因工程技术制备的抗体(即将插入抗体基因的抗体表达载体导入宿主细胞获得的抗体)；和类似物。具体的例子包括杂交瘤产生的抗体、人源化抗体、人抗体和类似物。
杂交瘤是一种通过用抗原免疫非人哺乳动物获得的B细胞和来源于小鼠、大鼠或类似动物的骨髓瘤细胞之间进行细胞融合获得的细胞，其可以产生具有目标抗原特异性的单克隆抗体。
人源化抗体包括人嵌合抗体、人CDR-移植抗体和类似物。
人嵌合抗体是一种包括抗体VH和抗体L链V区(下文中称为“VL”)(两者都是非人动物的抗体)、人抗体H链C区(下文中亦称为“CH”)和人抗体L链C区(下文中亦称为“CL”)的抗体。非人动物可以是任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔，只要可以从其制备杂交瘤。
人嵌合抗体可以通过下列方法产生：从产生单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将其插入包括编码人抗体CH和人抗体CL的基因的宿主细胞表达载体，从而构建人嵌合抗体表达载体，然后将载体导入宿主细胞中，表达抗体。
可以使用任何CH作为人嵌合抗体的CH，只要它属于人免疫球蛋白质(下文中称为“hIg”)，优选使用属于hIgG的类型，可以使用属于hIgG类型的任何一种亚型，例如，可以使用hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。可以使用任何CL作为人嵌合抗体的CL，只要它属于hIg类型，可以使用属于κ类或λ类的CL。
人CDR-移植抗体是将非人动物抗体VH和VL的CDR氨基酸序列移植于人抗体VH和VL适当位置的抗体。
人CDR-移植抗体可以通过下列方法产生：构建编码V区的cDNA(其中将非人动物抗体VH和VL的CDR氨基酸序列移植到人抗体VH和VL的CDR氨基酸序列中)，将其插入包括编码人抗体CH和人抗体CL的基因的宿主细胞表达载体中，从而构建人CDR-移植抗体表达载体，然后将表达载体导入宿主细胞，表达人CDR-移植抗体。
可以使用任何CH作为人CDR-移植抗体的CH，只要它属于hIg，优选hIg类，优选使用属于hIgG的类型，可以使用属于hIgG类型的任何一种亚型，例如，可以使用hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。可以使用任何CL作为人CDR-移植抗体的CL，只要它属于hIg类型，可以使用属于κ类或λ类的CL。
人抗体最初是人体中天然存在的抗体，但是它还包括从人抗体噬菌体文库、产生人抗体的转基因动物、或产生人抗体的转基因植物获得的抗体(其根据遗传工程、细胞工程和胚胎学工程技术的最新进展而制备)。
人体中存在的抗体可以通过下列方法制备：例如，分离人外周血淋巴细胞，通过用EB病毒或类似物感染使其无限增值化(永生化)，然后将其克隆，从而获得能够产生抗体的淋巴细胞，培养由此获得的淋巴细胞，从培养物中纯化抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将从人B细胞制备的抗体的编码基因插入噬菌体基因中、抗体片段如Fab和单链抗体在噬菌体表面上表达的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体可以使用其与固定抗原底物结合的活性作为标记从文库中回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变成包括两条完整H链和两条完整L链的人抗体分子。
产生人抗体的转基因非人动物是将人抗体基因导入细胞的动物。具体来说，产生人抗体的转基因非人动物可以通过以下方法制备：将人抗体基因导入小鼠的ES细胞，将ES细胞移植到其它小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。通过将人抗体基因导入受精卵并使其发育，也可以制备产生人抗体的转基因非人动物。从产生人抗体的转基因非人动物中制备人抗体可以通过以下方法进行：通过在非人哺乳动物中通常实施的杂交瘤制备法获得产生人抗体的杂交瘤，将获得的杂交瘤培养，在培养物中积累人抗体。
转基因非人动物包括牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔和类似动物。
在本发明中，作为抗体，优选识别肿瘤相关抗原的抗体、识别变态反应或炎症相关抗原的抗体、识别心血管疾病相关抗原的抗体、识别自身免疫疾病相关抗原的抗体、或识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体，优选属于IgG类的人抗体。
抗体片段是包括抗体Fc区的片段。抗体片段可以是任何片段，只要它包括上述抗体的Fc区。抗体片段包括H链单体、H链二聚体和类似物。
包括Fc区的融合蛋白质是将包括抗体或抗体片段Fc区的抗体与蛋白质(如酶或细胞因子)融合而得到的蛋白质。
以下对本发明进行详述。
1.本发明的细胞的制备
(1)制备导入了能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA的细胞
本发明中导入了能够抑制GDP-甘露糖转化酶功能的RNA的细胞，例如，可以通过以下方法制备。
制备GDP-甘露糖转化酶的cDNA或基因组DNA。
确定所制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。
根据已确定的DNA序列，设计长度合适的包括GDP-甘露糖转化酶编码区或非编码区的RNAi基因的构建物。
为了在细胞中表达RNAi基因，通过以下方法制备重组载体：将已制备的DNA的片段或全长插入合适的表达载体的启动子下游。
通过将重组载体导入适用于表达载体的宿主细胞，获得转化体。
本发明的细胞可以通过根据被导入GDP-甘露糖转化酶的活性或所产生抗体分子或细胞表面上糖蛋白质的糖链结构选择转化体而获得。
可以使用任何细胞作为宿主细胞，如酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，只要它具有酶向GDP-甘露糖转化酶的基因。实例包括下面第2项中描述的宿主细胞。
可以使用如下载体作为表达载体：在宿主细胞内可自主复制的载体，或者可以整合到染色体中、并在设计的RNAi基因可被转录的位置处包括启动子的载体。实例包括由聚合酶III转录的表达载体、或下面第2项中描述的表达载体。
作为将基因导入各种宿主细胞的方法，可以使用下面第2项中所述的导入适合于各种宿主细胞的重组载体的方法。
作为获得GDP-甘露糖转化酶的cDNA或基因组DNA的方法，下列的方法作为实例。
cDNA的制备方法：
从各种宿主细胞中制备全RNA或mRNA。
从已制备的全RNA或mRNA中制备cDNA文库。
根据GDP-甘露糖转化酶的已知氨基酸序列(如人类酶的氨基酸序列)产生简并引物，使用所制备的cDNA文库作为模板，通过PCR获得编码GDP-甘露糖转化酶的基因片段。
使用所得到的基因片段作为探针，对cDNA文库进行筛选，得到GDP-甘露糖转化酶的cDNA。
各种宿主细胞的mRNA可以是市售产品(例如，由Clontech制造)，或者如下从各种宿主细胞中制备。从各种宿主细胞中制备总mRNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸铯法[Methods in Enzymology， 154，3(1987)]、酸性硫氰酸胍酚氯仿(AGPC)法[Analytical Biochemistry，162，156(1987)；Experimental Medicine(Jikken Igaku)， 9，1937(1991)]和类似方法。
而且，从全RNA制备poly(A)+RNA的mRNA的方法包括oligo(dT)固定纤维素柱法(Molecular Cloning，第二版)。
另外，可以使用试剂盒如Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)或Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)制备mRNA。
从已制备的各种宿主细胞的mRNA制备cDNA库。制备cDNA库的方法包括Molecular Cloning，第二版；Current Protocols in MolecularBiology；A Laboratory Manual，第二版(1989)等文献中所述的方法，以及使用市售试剂盒的方法，如cDNA合成和质粒克隆用的SuperscriptPlasmid System(Life Technologies制造)和ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE制造)。
可以使用任何载体作为制备cDNA库的克隆载体，如噬菌体载体和质粒载体，只要它们可以在大肠杆菌(Escherichia coli)K12中进行自主复制。例子包括ZAP Express[STRATAGENE制造；Strategies， 5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research， 17，9494(1989)]、Lambda ZAP II(STRATAGENE制造)、λgt10、λgt11[DNACloning，A Practical Approach， 1，49(1985)]、λTriplEx(Clontech制造)、λExCell(Pharmacia制造)、pT7T318U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol CellBiol， 3，280(1983)]和pUC18[Gene， 33，103(1985)]、和类似载体。
可以使用任何微生物作为制备cDNA库用的宿主微生物，优选使用大肠杆菌。例子包括大肠杆菌XLl-Blue MRF′[STRATAGENE制造；Strategies， 5，81(1992)]、大肠杆菌C600[Genetics， 39，440(1954)]、大肠杆菌Y1088[Science， 222，778(1983)]、大肠杆菌Y1090[Science，222，778(1983)]、大肠杆菌NM522[J.Mol. Biol.， 166，1(1983)]、大肠杆菌K802[J.Mol.Biol. 16，118(1966)]和大肠杆菌JM105[Gene，38，275(1985)]、和类似物。
cDNA库还可以用于下列分析。另外任选地，为了通过降低不完整cDNA的比例而有效地获得全长cDNA，下列分析中可以使用采用Sugano等人
cDNA文库可以在随后的分析中使用，但是为了通过降低非全长cDNA的比例而尽可能有效地获得全长cDNA，下列分析中可以使用根据Sugano等人发展的oligo cap法制备的cDNA库[Gene， 138，171(1994)；Gene， 200，149(1997)；Protein，Nucleic Acid，Koso(Tanpakushitu，Kakusan，Koso)， 41，603(1996)；Experimental Medicine(Jikken Igaku)， 11，2491(1993)；eDNA Cloning(Yodo-sha)(1996)；Methods for Preparing Gene Libraries(Yodo-sha)(1994)]。
根据GDP-甘露糖转化酶的氨基酸序列，制备对预测编码氨基酸序列的核苷酸序列的5’-端和3’-端核苷酸序列有特异性的简并引物，使用已制备的cDNA文库作为模板，通过PCR扩增DNA[PCR Protocols，Academic Press(1990)]，获得编码GDP-甘露糖转化酶的基因片段。
通过采用的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 74，5463(1977)]，或者使用例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(PE Biosystems制造)的核苷酸测序仪对核苷酸进行分析，可以确认所得到的基因片段是编码GDP-甘露糖转化酶的DNA。
编码GDP-甘露糖转化酶的DNA可从cDNA或cDNA文库获得，所述cDNA或cDNA文库是使用上述基因片段作为探针通过集落杂交或噬菌斑杂交从各种宿主细胞中所含的mRNA合成的(MolecularCloning，第二版)。
另外，还可以用从多种宿主细胞中所含mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，使用获得编码GDP-甘露糖转化酶的基因片段用的引物，通过PCR进行筛选，获得编码GDP-甘露糖转化酶的cDNA。
所得到的编码GDP-甘露糖转化酶的DNA的核苷酸序列从其末端进行分析，通过通常采用的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 74，5463(1977)]，或者使用例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(PE Biosystems制造)的核苷酸测序仪进行测定。
使用同源性搜索程序如BLAST，根据测出的cDNA核苷酸序列对核苷酸序列数据库如GenBank、EMBL或DDBJ进行搜索，也可以从数据库中的基因中确定编码GDP-甘露糖转化酶的基因。
通过上述方法得到的编码GDP-甘露糖转化酶的基因的核苷酸序列包括由SEQ ID NO：8-10中任意一个所示的核苷酸序列。
还可以根据测出的DNA序列，采用phosphoamidite法用392型DNA合成仪(Perkin Elmer制造)通过化学合成来得到GDP-甘露糖转化酶的cDNA。
作为GDP-甘露糖转化酶基因组DNA制备方法的例子，下述方法作为实例。
基因组DNA的制备方法：
基因组DNA的制备方法包括Molecular Cloning，第二版；CurrentProtocols in Molecular Biology等文献所述的已知方法。另外，GDP-甘露糖转化酶的基因组DNA还可以使用Genomic DNA Library ScreeningSystem(Genome Systems制造)或Universal Genome WalkerTM试剂盒(CLONTECH制造)或类似试剂盒来分离。
下面的方法作为例子说明根据GDP-甘露糖转化酶的活性选择转化体的方法。
选择转化体的方法：
其中的GDP-甘露糖转化酶活性降低的细胞的选择方法包括下列文献所述的生物化学方法或基因工程技术：New BiochemicalExperimentation Series 3-Saccharides I，Glycoprotein(Tokyo KagakuDojin)，Japanese Biochemical Society编著(1988)；Cell Engineering，Supplement，Experimental Protocol Series，Glycobiology ExperimentalProtocol，Glycoprotein，Glycolipid and Proteoglycan(Shujun-sha)，Naoyuki Taniguchi，Akemi Suzuki，Kiyoshi Furukawa和KazuyukiSugawara编著(1996)；Molecular Cloning第二版；Current Protocols inMolecular Biology；及类似文献。生物化学方法包括使用酶特异性底物评价酶活性的方法。基因工程技术包括Northern分析、RT-PCR和类似技术，其中对编码GDP-甘露糖转化酶的基因的mRNA的量进行测定。
而且，根据GDP-甘露糖转化酶活性降低所引起的形态变化来选择细胞的方法包括根据所产生糖蛋白质分子的糖链结构选择转化体的方法、根据细胞表面上糖蛋白质的糖链结构选择转化体的方法、和类似方法。使用所产生糖蛋白质分子的糖链结构选择转化体的方法包括下面第5项中所述的方法。使用细胞表面上糖蛋白质糖链结构选择转化体的方法包括选择对识别糖链结构的凝集素有抗性的克隆的方法(所述糖链中在N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)。例子包括Somatic Cell Mol.Genet.， 12，51(1986)中所述的使用凝集素的方法。
可以使用任何凝集素作为上述凝集素，只要其为识别其中在复合型N-糖苷连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接的糖链结构的凝集素。例子包括兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(来源于兵豆的扁豆凝集素)、豌豆(Pisum sativum)凝集素PSA(来源于豌豆的豌豆凝集素)、蚕豆(Vicia faba)凝集素VFA(来源于蚕豆的凝集素)和橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(来源于橙黄网胞盘菌的凝集素)、和类似物。
具体来说，本发明的细胞可以通过以下方法选择：在含有浓度为10μg/ml至10mg/ml浓度、优选0.5至2mg/ml的上述凝集素的培养基中将细胞培养1天至2周、优选3天至1周，将存活的细胞继代培养或将集落挑出，将其转移至培养容器中，随后继续在含有凝激素的培养基中培养。
抑制编码GDP-甘露糖转化酶的基因的mRNA数量的RNAi基因可以通过通用方法或使用DNA合成仪进行制备。
RNAi基因的构建可以根据下列文献中的描述进行设计：Nature，391，806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95，15502(1998)；Nature，395，854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 96，5049(1999)；Cell， 95，1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 96，1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95，13959(1998)；Nature CellBiol.， 2，70(2000)和类似文献。
另外，本发明的细胞还可以不使用表达载体、通过直接将根据GDP-甘露糖转化酶核苷酸序列设计的双链RNA导入宿主细胞而获得。
双链RNA可以采用通用方法或通过使用DNA合成仪而制备。具体来说，可以基于GDP-甘露糖转化酶cDNA和基因组DNA的互补RNA核苷酸序列当中具有10至40个碱基、优选10至30个碱基、更优选15至30个碱基的相应序列的寡核苷酸的序列信息，通过合成与寡核苷酸互补序列对应的寡核苷酸(反义寡核苷酸)对其进行制备。寡核苷酸和反义寡核苷酸可以单独合成，或者可以通过不妨碍双链RNA形成的间隔区核苷酸连接起来。
寡核苷酸包括寡聚RNA和寡核苷酸的衍生物(下文中称为“寡核苷酸衍生物”)。
寡核苷酸衍生物包括寡核苷酸中磷酸二酯键转变成磷酸硫酯键(phosophorothioate bond)的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中磷酸二酯键转变为N3′-P5′磷酸酰胺键(phosphoamidate bond)的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖-磷酸二酯键转变为肽-核酸键的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5噻唑基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被吩嗪修饰的胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖被2′-O-丙基核糖取代的寡核苷酸衍生物、和寡核苷酸中核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的寡核苷酸衍生物[Cell Technology(Saibo Kogaku)， 16，1463(1997)]。
(2)制备其中导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA和能够抑制GDP-岩藻糖合成酶功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞
下文说明其中导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA和能够抑制GDP-岩藻糖合成酶功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞的产生方法，以下述细胞作为例子：其中导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA、和能够抑制GDP-岩藻糖合成酶功能的RNA。类似地，可以制备其中导入了能够抑制α1，6-岩藻糖修饰酶功能的RNA、和能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA的细胞。
制备α1，6-岩藻糖修饰酶和GDP-岩藻糖合成酶的每一种的cDNA或基因组DNA。
确定已制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。
根据已确定的DNA序列，设计长度合适的包括α1，6-岩藻糖修饰酶和GDP-岩藻糖合成酶的编码区或非编码区的RNAi基因的构建物。
为了在细胞中表达RNAi基因，通过如下方法制备重组载体：将所制备DNA的片段或全长插入合适的表达载体的启动子的下游。
通过将重组载体导入适于表达载体的宿主细胞，获得转化体。
本发明的细胞可以通过如下方法获得：根据被导入的α1，6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖合成酶的活性或所产生抗体分子或细胞表面上糖蛋白质的糖链结构，对转化体进行选择。
可以使用任何细胞作为宿主细胞，如酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，只要其具有靶向α1，6-岩藻糖修饰酶和GDP-岩藻糖合成酶的基因。例子包括下面第2项中所述的细胞。
可以使用如下载体作为表达载体：在宿主细胞内可自主复制的载体，或者可以整合到染色体中、并在设计的RNAi基因可被转录的位置处包括启动子的载体。例子包括由聚合酶III转录的表达载体、或下面第2项中描述的表达载体。
作为将基因导入各种宿主细胞的方法，可以使用下面第2项中所述的导入适合于各种宿主细胞的重组载体的方法。
例如，可以采用与(1)中所述的方法相同的方式获得α1，6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖合成酶的cDNA和基因组DNA。
作为根据α1，6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖合成酶的活性选择转化体的方法，以下列方法作为例子。
转化体的选择方法
选择其中α1，6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖合成酶的活性降低的细胞的方法包括上文(1)中所述的生物化学法和遗传工程法。
另外，根据由α1，6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖合成酶活性降低引起的形态改变选择细胞的方法包括上文(1)中所述的方法。
抑制α1，6-岩藻糖修饰酶基因或GDP-岩藻糖合成酶基因的mRNA数量的RNAi基因可以通过通用方法或使用DNA合成仪进行制备。
可以采用与上文(1)中所述方法相同的方式设计RNAi的构建物。
另外，本发明的细胞还可以不使用表达载体、直接通过将根据α1，6-岩藻糖修饰酶核苷酸序列设计的双链RNA、和根据GDP-岩藻糖合成酶核苷酸序列设计的双链RNA导入宿主细胞而获得。
双链RNA可以采用与上文(1)中所述方法相同的方式制备。
2.糖蛋白质的制造方法(以抗体组合物为例)。
下文参考抗体组合作为例子，说明使用本发明的细胞制造糖蛋白质的方法。
抗体组合物可以在本发明的细胞中表达，通过下列文献中所述的方法获得：例如，Molecular Cloning，第二版；Current Protocols inMolecular Biology；Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988(下文中称为“Antibodies”)；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第三版，Acad.Press，1993(下文中称为“Monoclonal Antibodies”)；或Antibody Engineering，A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press(下文中称为“AntibodyEngineering”)，如下文。
制备编码抗体分子的cDNA。
根据已制备的抗体分子的全长cDNA，如果需要，制备长度合适的包括蛋白质编码区的DNA片段。
通过将DNA片段或全长cDNA插入合适表达载体启动子的下游而制备重组载体。
通过将重组载体导入适合于表达载体的宿主细胞，可以获得产生抗体分子的转化体。
在本发明中，可以使用任何细胞作为产生抗体组合物的宿主细胞，如酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，只要其为上文第1项中制备的本发明的细胞、可以表达目标基因。优选动物细胞。
通过遗传工程技术导入了与抗体分子Fc区结合的N-糖苷-连接糖链修饰相关酶的细胞如酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞也可以用作宿主细胞。
可以使用如下载体作为表达载体：在宿主细胞内可自主复制的载体，或者可以整合到染色体中、并在编码抗体分子的基因可被转录的位置处包括启动子的载体。
根据上文第1项中描述的“cDNA的制备方法”，可以使用对目标抗体分子具有特异性的探针引物从人或非人动物组织或细胞中制备cDNA。
使用酵母作为宿主细胞时，表达载体包括YEP13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)或类似物。
可以使用任何启动子作为启动子，只要其可以在酵母中发挥作用。启动子的例子包括糖酵解途径基因如己糖激酶的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克蛋白质启动子、MFαt1启动子和CUP 1启动子和类似物。
宿主细胞包括属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属和许旺酵母(Schwanniomyces)属、和类似属的酵母，例如，为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、alluvius许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)。
可以使用任何方法作为导入重组载体的方法，只要其可以将DNA导入酵母。例子包括电穿孔法[Methods Enzymol.， 194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl Acad.Sci.USA， 84，1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriology， 153，163(1983)]、和Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 75，1929(1978)所述的方法。
当使用动物细胞作为宿主细胞时，表达载体包括pcDNAI、pcDM8(可获自Funakoshi)、pAGE107[日本公开未审查专利申请第22979/91号；Cytotechnology， 3，133(1990)]、pAS3-3(日本公开未审查专利申请第227075/90号)、pCDM8[Nature， 329，840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen制造)、pREP4(Invitrogen制造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210、和类似表达载体。
可以使用启动子作为启动子，只要其可以在动物细胞中发挥作用。例子包括巨细胞病毒(CMV)IE(极早期)基因启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白质启动子、热休克启动子、SRα启动子、和类似启动子。另外，人CMV的IE基因增强子可以与启动子结合使用。
宿主细胞包括人的细胞(例如Namalwa细胞、NM-F9细胞和PER.C6细胞)、猴细胞(如COS细胞)、中国仓鼠细胞(如CHO细胞、HBT5637)(日本公开未审查专利申请第299/88号)、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠骨髓瘤细胞、来源于叙利亚仓鼠肾的细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞和类似细胞。
可以使用任何方法作为导入重组载体的方法，只要其可以将DNA导入进动物细胞中。例子包括电穿孔法[Cytotechnology， 3，133(1990)]、磷酸钙法(公开未审查的日本专利第227075/90号)、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84，7413(1987)]、注射法(Manipulating the MouseEmbryo，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1994)，下文中亦称为“Manipulating the Mouse Embryo，ALaboratory Manual，第二版”)、使用粒子枪的方法(基因枪)(日本专利第2606856号、日本专利第2517813号)、DEAE-葡聚糖法[Biomanual Series 4 Gene Transfer and Expression Analysis(Yodosha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主编(1994)]、病毒载体法(Manipulatingthe Mouse Embryo，第二版)、和类似方法。
当使用昆虫细胞作为宿主细胞时，可以通过Current Protocols inMolecular Biology，Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual.W.H.Freeman and Company，New York(1992)；Bio/Technology， 6，47(1988)或类似文献中所述的方法来表达蛋白质。
即，将重组的基因导入载体和杆状病毒共同导入昆虫细胞，在昆虫细胞的培养物上清液中得到重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞，从而可以对蛋白质进行表达。
该方法中使用的基因导入载体包括pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII(均由Invitrogen制造)、和类似载体。
杆状病毒包括感染夜蛾(Barathra)科昆虫的病毒——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)。
昆虫细胞包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵母细胞Sf9和Sf21[Current Protocols in Molecular Biology，Baculovirus ExpressionVectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)]和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)卵母细胞High 5(Invitrogen)、和类似细胞。
制备重组病毒用的将上述重组基因导入载体和上述杆状病毒共同导入昆虫细胞的方法包括磷酸钙法(公开未审查的日本专利申请第227075/90号)、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84，7413(1987)]和类似方法。
使用植物细胞作为宿主细胞时，表达载体包括Ti质粒、烟草花叶病毒载体或类似物。
可以使用任何启动子作为启动子，只要其可以在植物细胞中发挥作用。例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、水稻actin1启动子、和类似启动子。
宿主细胞包括诸如烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、紫花苜蓿、水稻、小麦、大麦、和类似物的植物细胞。
可以使用任何方法作为导入重组载体的方法，只要其可以将DNA导入植物细胞。例子包括使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法(公开未审查的日本专利申请第140885/84号和公开未审查的日本专利申请第70080/85号，WO94/00977)、电穿孔法(公开未审查的日本专利申请第251887/85号)和使用粒子枪(基因枪)的方法(日本专利第2606856号和第2517813号)、和类似方法。
作为表达抗体基因的方法，除直接表达之外，还可以根据MolecularCloning第二版或类似文献中所述的方法，进行分泌性生产、融合蛋白质的表达和类似过程。
在培养基中对由此获得的转化体进行培养，在培养物中形成并积累抗体分子，从培养物中回收抗体组合物，可以产生抗体组合物。培养转化体的方法可以通过常规的宿主细胞培养方法来进行。
对于使用真核生物如酵母作为宿主得到的转化体的培养，可以使用任何天然培养基或合成培养基，只要该培养基包括可被生物体吸收、并能有效地对转化体进行培养的物质，如碳源、氮源、无机盐和类似物。
可以使用可被生物体吸收的碳源作为碳源。例子包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖及含有它们的糖浆、淀粉和淀粉水解产物；有机酸，如醋酸和丙酸；醇，如乙醇和丙醇；以及类似物。
氮源包括氨水、无机酸或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其它含氮化合物；胨；肉汁；酵母提取物；玉米浆；酪蛋白质水解产物；大豆饼；大豆饼水解产物；各种发酵细胞及其水解产物；以及类似物。
无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙和类似物。
通常在通气条件下进行培养，例如通过摇瓶培养或通风条件下的浸没旋动培养。培养温度优选为15至40℃，培养时间通常为16小时至7天。培养过程中pH保持在3至9。使用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水等进行pH调节。
如果需要的话，培养过程中培养基中可以加入抗生素，如氨苄青霉素或四环素。
当对用诱导型启动子作为启动子获得的重组载体转化的酵母进行培养时，如果需要的话，培养基中可以加入诱导物。例如，当对用lac启动子获得的重组载体转化的酵母进行培养时，培养基中可以加入异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷，当对用trp启动子得到的重组载体转化的酵母进行培养时，可以向培养基中加入吲哚丙烯酸。
当培养使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体时，培养基包括通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation， 199，519(1967)]、Eagle′s MEM培养基[Science， 122，501(1952)]、Dulbecco’s改良MEM培养基[Virology， 8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine， 73，1(1950)]、和Whitten培养基[Developmental Engineering ExperimentationManual-Preparation of Transgenic Mice(Kodansha)，Motoya Katsuki主编(1987)]，以及通过在这些培养基中加入胎牛血清得到的培养基，和类似培养基。
培养通常在pH为6至8、温度为30至40℃、存在5％CO2的条件下进行1至7天。也可使用诸如流加培养或中空纤维培养的方法培养1天至数月。
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如卡那霉素或青霉素。
使用昆虫细胞作为宿主细胞获得的转化体的培养中使用的培养基包括通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen制造)、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologie制造)、ExCell 400和ExCell 405(均由JRHBiosciences制造)、Grace′s昆虫培养基[Nature， 195，788(1962)]、和类似培养基。
培养通常在pH6至7、温度25至30℃的条件下培养1至5天。
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如庆大霉素。
使用植物细胞作为宿主细胞得到的转化体可以细胞形式培养，也可以在分化成植物细胞或植物器官后培养。用于培养转化体的培养基包括通常使用的Murashige-Skoog(MS)培养基和White培养基，以及通过在这些培养基中加入植物激素如生长素和细胞分裂素得到的培养基、以及类似培养基。
培养通常在pH为5至9、温度20至40℃的条件下培养3至60天。
另外，如果需要的话，培养过程中培养基中可以加入抗生素，如卡那霉素和潮霉素。
因此，可以通过如下方法产生抗体组合物：根据常用的培养方法培养来源于酵母、动物细胞或植物细胞的转化体(上述转化体包括插入有编码抗体分子的DNA的重组载体)，从而产生并积累抗体组合物，然后从培养物中回收抗体组合物。
产生抗体组合物的方法包括在宿主细胞中进行细胞内表达的方法、从宿主细胞进行细胞外分泌的方法、和在宿主细胞外包膜上产生的方法。通过改变所用宿主细胞的种类或所产生抗体分子的结构，可以对方法进行选择。
当抗体组合物在宿主细胞中或在宿主细胞外膜上产生时，可以根据如下方法，使其肯定被分泌至细胞外：Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.， 264.17619(1989)]；Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)；Genes Develop.， 4，1288(1990)]；公开未审查的日本专利申请第336963/93号；公开未审查的日本专利申请第823021/94号中所述的方法；和类似方法。
即，可以通过下列方法目标抗体分子肯定被分泌至细胞外：使用基因重组技术将编码抗体分子的DNA和编码适于表达抗体分子的信号肽的DNA插入到表达载体中，将表达载体导入宿主细胞，表达抗体分子。
另外，还可以根据公开未审查的日本专利申请第227075/90号中所述的方法，使用二氢叶酸还原酶基因或类似物，采用基因扩增系统增加产量。
此外，抗体组合物还可以使用导入了基因的动物或植物细胞的再分化构建的导入了基因的动物个体(非人转基因动物)或植物个体(转基因植物)来产生。
当转化体是动物个体或植物个体时，抗体组合物可以通过下列方法产生：以通常的方法对其进行饲养或培育，从而产生并积累抗体组合物，然后从动物或植物个体中回收抗体组合物。
使用动物个体产生抗体组合物的方法包括如下方法：根据已知方法[American Journal of Clinical Nutrition， 63，639S(1996)；AmericanJournal of Clinical Nutrition， 63，627S(1996)；Bio/Technology，9，830(1991)]在导入基因构建的动物中产生目标抗体组合物。
在动物个体的情况下，抗体组合物可以通过下列方法产生：饲养导入了编码抗体分子的DNA的转基因非人动物，从而在动物中产生并积累抗体组合物，然后从动物中回收抗体组合物。抗体组合物形成和积累的部位包括动物的乳汁(日本公开未审查专利申请第309192/88)、卵。在这种情况下，可以使用任何启动子作为启动子，只要其可以在动物中发挥功能。优选的例子包括乳腺细胞特异性启动子，如α-酪蛋白质启动子、β-酪蛋白质启动子、β-乳球蛋白质启动子和乳清酸性蛋白质启动子、和类似启动子。
使用植物个体制造抗体组合物的方法包括如下方法：培养根据已知方法导入了编码抗体分子的DNA的转基因植物[Tissue Culture(Soshiki Baiyo)， 20(1994)；Tissue Culture(Soshiki Baiyo)， 21(1995)；Trends in Biotechnology， 15，45(1997)]，使抗体组合物在植物中形成并积累，然后从植物中回收抗体组合物。
关于其中导入了编码抗体分子的基因的转化体所产生的抗体组合物的纯化，例如，当抗体组合物在细胞中以溶解状态表达时，通过离心回收培养后的细胞，将其悬浮在缓冲水溶液中，之后使用超声波破碎机、弗式高压细胞破碎机(French press)、Manton Gaulin匀浆器、戴诺磨(Dynomill)或类似装置将其破碎，得到无细胞提取物，对其进行离心，获得上清液，对上清液通过常用的酶分离和纯化技术进行处理拉，获得抗体组合物的纯化制剂，上述技术例如溶剂提取、用硫酸铵等进行盐析、脱盐、用有机溶剂沉淀、使用树脂如二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖和DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical)的阴离子交换色谱、使用树脂如S-琼脂糖FF(Pharmacia制造)的阳离子交换树脂、使用树脂如丁基琼脂糖或苯基琼脂糖的疏水色谱、使用分子筛的凝胶过滤、亲合力色谱、色谱聚焦和电泳如等电聚焦；和可以单独使用或结合使用的类似方法。
当抗体组合物在细胞内通过形成包涵体表达时，以相同的方式对细胞进行回收、破碎和离心，回收作为沉淀部分的抗体组合物包涵体。将回收的抗体组合物包涵体用蛋白质变性剂溶解。将溶解的抗体溶液稀释或透析，从而使抗体组合物具有正常的三维结构，然后通过与上文所述相同的分离纯化步骤得到抗体组合物的纯化制剂。
当抗体组合物分泌在细胞外时，可以从培养物上清液中回收抗体组合物。即，通过与上述相同的技术(如离心)对培养物进行处理，得到可溶部分，通过与上文所述相同的分离和纯化方法，可以从可溶部分中获得抗体组合物的纯化制剂。
由此获得的抗体组合物包括抗体、抗体片段、包括抗体Fc区的融合蛋白质和类似物。
当宿主细胞已经具有表达抗凝血酶III分子的能力时，可以采用上述1的方法制备能够表达抗凝血酶III分子的细胞，培养细胞，从培养液中提纯目标抗凝血酶III组合物，从而制备抗凝血酶III组合物。
作为获得抗体组合物的例子，下文对人源化抗体组合物和Fc融合蛋白质的产生方法进行详细描述，但是根据上文提及的方法和所述本发明的方法也可获得其它的抗体组合物。
A.制备人源化抗体组合物
(1)构建表达人源化抗体的载体
表达人源化抗体的载体是其中插入了编码人抗体CH和CL的基因的动物细胞表达载体，其通过将编码人抗体CH和CL的每条基因克隆到动物细胞表达载体中而构建。
人抗体的C区可以是任何人抗体的CH或CL。例子包括人抗体H链中属于IgG1亚型的C区(下文中称为“hCγ1”)、人抗体L链中属于κ型的C区(下文中称为“hCκ”)、和类似物。
作为编码人抗体CH和CL的基因，可以使用包括外显子和内含子的染色体DNA，也可使用cDNA。
可以使用任何载体作为动物细胞的表达载体，只要可以向其中插入编码人抗体C区的基因并使其在其中表达。例子包括pAGE107[Cytotechnology， 3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.， 101，1307(1987)]、pHSG274[Gene， 22，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.AcadSci.USA， 78，1527(1981)、pSG1βd2-4[Cytotechnology， 4，173(1990)]和类似载体。动物细胞表达载体中的启动子和增强子包括SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.， 101，1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.， 149，960(1987)]、免疫球蛋白质H链启动子[Cell， 41，479(1985)]和增强子[Cell， 33，717(1983)]和类似物。
人源化抗体的表达载体可以是编码抗体H链和L链的基因存在于不同载体上的类型，也可以是两条基因存在于相同载体上的类型(下文中称为“串联型”)。就构建人源化抗体表达载体的容易度、导入动物细胞的容易度、和抗体H和L链在动物细胞中的表达量而言，更优选串联型人源化抗体表达载体[J.Immunol.Methods， 167，271(1994)]。
可以使用构建的人源化抗体表达载体在动物细胞中表达人嵌合抗体和人CDR-移植抗体。
(2)获得编码非人动物抗体V区的cDNA
通过以下方式可以获得编码非人动物抗体(如小鼠抗体)VH和VL的cDNA。
由产生目标小鼠抗体的杂交瘤细胞中提取的mRNA合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体(如噬菌体或质粒)中，得到cDNA文库。使用现有小鼠抗体的C区部分或V区部分作为探针，将各个包括编码VH的cDNA的重组噬菌体或重组质粒和包括编码VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒从文库中分离。确定重组噬菌体或重组质粒上目标小鼠抗体VH和VL的全核苷酸序列，从核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列。
可以使用任何动物作为非人动物，只要可以由此制备杂交瘤细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔。
从杂交瘤细胞制备全RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology， 154，3(1987)]和类似方法，从全RNA制备mRNA的方法包括oligo(dT)固相纤维素柱法(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press New York(1989)和类似方法。此外，用于从杂交瘤细胞制备mRNA的试剂盒包括FastTrack mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)、Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)、和类似试剂盒。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常用的方法[MolecularCloning g，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press NewYork(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34]，以及使用市售试剂盒如cDNA合成和质粒克隆用的Superscript PlasmidSystem(GIBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)的方法和类似方法。
在cDNA文库的制备中，其中插入了使用从杂交瘤细胞中提取的mRNA作为模板合成的cDNA的载体可以是任何载体，只要可以插入cDNA。例子包括ZAP Express[Strategies， 5，58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research， 17，9494(1989)]、λZAP II(Stratagene制造)、λgt10和λgt11[DNA Cloning，APracticalApproach， 1，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol Cell Biol， 3，280(1983)]、pUC18[Gene， 33，103(1985)]、和类似物。
可以使用任何大肠杆菌作为其中导入了从噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要cDNA文库可以得以导入、表达和保留。例子包括XLl-Blue MRF′[Strategies， 5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088和Y1090[Science， 222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.， 166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol， 16，118(1966)]、JM105[Gene， 38，275(1985)]、和类似物。
作为从cDNA文库选择编码非人动物抗体VH和VL的cDNA克隆的方法，可以使用采用同位素-或荧光-标记探针的菌落杂交或噬菌斑杂交[Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press New York(1989)]。还可以使用从mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，通过制备引物并进行聚合酶链式反应(下文中称为“PCR”；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLab.，Press New York(1989)；Current protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)来制备编码VH和VL的cDNA。
可以通过如下方法确定cDNA的核苷酸序列：用合适的限制性内切核酸酶对消化选择的cDNA，将片段克隆到质粒如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)中，进行通常用于氨基酸序列分析方法的反应(例如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 74，5463(1977)]或类似方法)，然后使用自动核苷酸序列分析仪如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)或类似物对克隆进行分析。
从测定的核苷酸序列推导VH和VL的全长氨基酸序列，并将其与已知抗体VH和VL的全长氨基酸序列进行比较，可以确认所得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体VH和VL全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。
(3)分析非人动物抗体V区的氨基酸序列
就包括分泌性信号序列的抗体VH和VL的全长氨基酸序列而言，通过将其与已知抗体VH和VL的全长氨基酸序列进行比较，可以推导出分泌性信号序列和N-端氨基酸序列的长度，也可以发现其所属的亚型[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。此外，通过与已知抗体VH和VL的氨基酸序列进行比较，还可以发现VH和VL每个CDR的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。
(4)人嵌合抗体表达载体的构建
在第2(1)项中所述的人源化抗体的表达载体中，通过将编码非人动物抗体VH和VL的cDNA克隆到编码人抗体CH和CL的基因上游，可以构建人嵌合抗体表达载体。例如，通过将编码非人动物抗体VH和VL的每个cDNA与合成DNA(其包括非人动物抗体VH和VL的3′-端核苷酸序列、人抗体CH和CL的5′-端核苷酸序列、还有两端均具有适当限制性内切酶识别序列)连接在一起，并以使之可以合适的形式得以表达的方式，将其克隆到第2(1)项中所述的人源化抗体表达载体中所含的人抗体CH和CL编码基因的上游，从而构建人嵌合抗体表达载体。
(5)编码人CDR-移植抗体V区的cDNA的构建
可以如下构建编码人CDR-移植抗体VH和VL的cDNA。首先，选择人抗体VH和VL框架的氨基酸序列(下文中称为“FR”)，用于移植目标非人动物抗体VH和VL的CDR。可以使用任何氨基酸序列作为人抗体VH和VL的FR氨基酸序列，只要其来源于人抗体。例子包括登记于数据库如Protein Data Bank的人抗体VH和VL的FR氨基酸序列、人抗体VH和VL的每个FR亚组中常见的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]和类似序列。为了产生具有足够活性的人CDR-移植抗体，优选地，选择与目标非人动物抗体VH和VL的氨基酸序列的同源性尽可能高(至少为60％或更高)的氨基酸序列。
下一步，将目标非人动物抗体VH和VL的CDR氨基酸序列移植到所选择的人抗体VH和VL的FR氨基酸序列上，设计人CDR-移植抗体VH和VL的氨基酸序列。考虑抗体基因核苷酸序列中发现的密码子使用频率，将设计的氨基酸序列转变成DNA序列[Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(1991)]，设计编码人CDR-移植抗体VH和VL的氨基酸序列的DNA序列。基于设计的DNA序列，合成长度为大约100个碱基的数种合成DNA，使用它们进行PCR。在这种情况下，考虑到PCR的反应效率和要被合成的DNA的长度，在每条H链和L链中优选设计6种合成DNA。
另外，通过将适当限制性酶的识别序列导入两个末端上存在的合成DNA的5′-端，也可以很容易地将它们克隆到载体中以表达第2(1)项中所述的人源化抗体。PCR后，将扩增产物克隆到质粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene制造)中，通过第2(2)项中的方法确定核苷酸序列，从而获得具有编码所需人CDR-移植抗体VH和VL氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(6)人CDR-移植抗体V区氨基酸序列的修饰
已知当仅简单地将非人动物抗体VH和VL中的CDR移植至人抗体VH和VL的FR中制备人CDR移植抗体时，其抗原结合活性低于原始非人动物的抗体[BIO/TECHNOLOGY， 9，266(1991)]。考虑其原因在于是FR而不是CDR的几个氨基酸残基与原始非人动物抗体VH和VL中的抗原活性直接或间接相关，它们被改变成人抗体VH和VL中FR的几个不同氨基酸残基。为了解决该问题，在人CDR-移植抗体中，在人抗体VH和VL的FR氨基酸序列当中，鉴定出与抗原结合直接相关的氨基酸残基或者与抗原结合间接相关(通过与CDR中的氨基酸残基相互作用、或保持抗体的三维结构)的氨基酸残基，将其修饰成原始非人动物抗体中发现的氨基酸残基，从而增加已经被降低的抗原结合活性[BIO/TECHNOLOGY， 9，266(1991)]。
在人CDR-移植抗体的制备中，最重要的是有效鉴定FR中与抗原结合活性相关的氨基酸残基。为了鉴定与抗体-抗原结合活性相关的FR氨基酸残基，构建抗体的三维结构，并通过X-射线晶体学[J.Mol.Biol.，112，535(1977)]、计算机模拟[Protein Engineering， 7，1501(1994)]或类似方法进行分析。尽管抗体的三维结构信息已经用于人CDR-移植抗体的产生，但是仍然没有建立可用于所有抗体的产生人CDR-移植抗体的方法。因此，目前必须进行各种尝试，例如产生每种抗体的数种修饰抗体，并考察各种修饰抗体与其抗体结合活性之间的关系。
采用第2(5)项中所述的PCR方法，使用多种用于修饰的合成DNA，可以修饰人抗体VH和VL中的FR氨基酸序列。对于通过PCR获得的扩增产物，根据第2(2)项中所述的方法测定核苷酸序列，从而证实是否已经进行了目标修饰。
(7)人CDR-移植抗体表达载体的构建
将第2(5)和(6)项中构建的编码人CDR-移植抗体VH和VL的cDNA克隆至第2(1)项中所述的人源化抗体表达载体中编码人抗体CH和CL的基因上游，可以构建人CDR-移植抗体表达载体。例如，人CDR-移植抗体表达载体可以通过如下方法构建以被克隆：将合适的限制性酶的识别序列导入第2(5)项中使用的用于构建人CDR-移植抗体VH和VL的合成DNA当中位于两个末端处的合成DNA的5′-端，使得它们以适当的形式在第2(1)项中所述的人源化抗体表达载体中编码人抗体CH和CL的基因的上游进行表达。
(8)人源化抗体的稳定产生
通过将2(4)和(7)中所述的人源化抗体表达载体导入合适的动物细胞，可以获得能够稳定地产生人嵌合抗体和人CDR-移植抗体(下文中将二者均称为“人源化抗体”)的转化体。
将人源化抗体表达载体导入动物细胞的方法包括电穿孔法[已公开未审查的日本专利申请第257891/90号，Cytotechnology， 3，133(1990)]和类似方法。
可以使用任何细胞作为导入了人源化抗体表达载体的动物细胞，只要它是上文第1项中产生的本发明的细胞和可以产生人源化抗体的动物细胞。
例子包括小鼠骨髓瘤细胞如NS0细胞和SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢细胞如CHO/dhfr-细胞和CHO/DG44细胞、大鼠骨髓瘤细胞如YB2/0细胞和IR983F细胞、来源于叙利亚仓鼠肾的BHK细胞、人骨髓瘤细胞如Namalwa细胞和类似细胞。优选中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞和大鼠骨髓瘤YB2/0细胞。
导入人源化抗体表达载体后，根据已公开未审查的日本专利申请第257891/90号公开的方法，使用包括如G418硫酸盐(下文中称为“G418”；SIGMA制造)的试剂和类似物的用于动物细胞培养的培养基，可以选择能够稳定地产生人源化抗体的转化体。培养动物细胞的培养基包括RPMI 1640培养基(Nissui Pharmaceutical制造)、GIT培养基(Nihon Pharmaceutical制造)、EX-CELL 302培养基(JRH制造)、IMDM培养基(GIBCO BRL制造)、杂交瘤-SFM培养基(GIBCO BRL制造)、向这些培养基中加入各种添加物如胎牛血清(下文中称为“FBS”)获得的培养基、以及类似培养基。将获得的转化体在培养基中培养，可以在培养上清液产生并积聚人源化抗体。在培养上清液中人源化抗体的生成量和抗原结合活性可以通过诸如酶联免疫吸附测定法[下文中称为“ELISA”；Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Chapter 14(1988)；Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，Academic Press Limited(1996)]或类似方法进行测定。另外，根据已公开未审查的日本专利申请第257891/90号公开的方法，可以使用DHFR基因扩增系统增加转化体产生的人源化抗体的量。
使用蛋白质A柱，可以从转化体培养上清液中纯化人源化抗体[Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 8(1988)；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited(1996)]。此外，还可以使用纯化蛋白质通用的纯化方法。例如，可以通过凝胶过滤、离子交换色谱、超滤和类似方法的组合进行纯化。经纯化的人源化抗体H链、L链或整个抗体分子的分子量可以通过如下方法测定：例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳[下文中称为“SDS-PAGE”；Nature， 227，680(1970)]、蛋白质印迹法[Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 12(1988)；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited(1996)]、或类似方法。
B.Fc融合蛋白质的制备
(1)Fc融合蛋白质表达载体的构建
Fc融合蛋白质表达载体是其中插入了编码人抗体Fc区和待融合蛋白质的基因的动物细胞表达载体，其可以通过将编码人抗体Fc区和待融合蛋白质的基因克隆到动物细胞表达载体中构建。
人抗体Fc区除包含CH2和CH3区的区域之外，还包括包含部分铰链区和/或CH1的区域。另外，它可以是任何Fc区，只要CH2或CH3的至少一个氨基酸可被缺失、取代、添加或插入，并基本具有结合Fcγ受体的活性。
作为编码人抗体Fc区和待融合蛋白质的基因，可以使用包括外显子和内含子的染色体DNA，也可以使用cDNA。将这些基因与Fc区连接的方法包括使用这些基因序列的每一种作为模板的PCR法(Molecular Cloning，Second Edition；Current Protocols in MolecularBiology，Supplement 1-34)。
可以使用任何载体作为动物细胞表达载体，只要编码人抗体C区的基因可以插入其中并在其中表达。例子包括pAGE107[Cytotechnology， 3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.， 101，1307(1987)]、pHSG274[Gene， 27，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78，1527(1981)、pSG1βd2-4[Cytotechnology， 4，173(1990)]和类似物。动物细胞表达载体中的启动子和增强子包括SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.， 101，1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR启动子[Biochem.Biophys.Res.Commun.， 149，960(1987)]、免疫球蛋白质H链启动子[Cell， 41，479(1985)]和增强子[Cell， 33，717(1983)]、和类似物。
(2)制备编码人抗体Fc区和待融合蛋白质的DNA
可以通过以下方法获得编码人抗体Fc区和待融合蛋白质的DNA。
由从表达待与Fc融合的目标蛋白质的细胞或组织中提取的mRNA合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体(如噬菌体或质粒)中，得到cDNA文库。使用目标蛋白质一部分的基因序列作为探针，将包括编码目标蛋白质的cDNA的重组噬菌体或重组质粒从文库中分离。测定重组噬菌体或重组质粒上目标蛋白质的全核苷酸序列，从核苷酸序列推导出全长氨基酸序列。
可以使用任何动物作为非人动物，只要从其可以分离细胞获组织，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔。
从细胞或组织制备全RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology， 154，3(1987)]和类似方法，从全RNA制备mRNA的方法包括oligo(dT)固相纤维素柱法(Molecular Cloning，Second Edition)和类似方法。此外，用于从细胞或组织制备mRNA的试剂盒包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)、Quick PrepmRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)、和类似试剂盒。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常用的方法[MolecularCloning，Second Edition；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34]，以及使用市售试剂盒如cDNA合成和质粒克隆用的Plasmid System SuperscriptTM(GIBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)的方法和类似方法。
在cDNA文库的制备中，其中插入了使用从细胞或组织中提取的mRNA作为模板合成的cDNA的载体可以是任何载体，只要可以插入cDNA。例子包括ZAP Express[Strategies， 5，58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research， 17，9494(1989)]、λZAP II(Stratagene制造)、λgt10和λgt11[DNA Cloning，A PracticalApproach， 1，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol Cell Biol， 3，280(1983)]、pUC18[Gene， 33，103(1985)]、和类似物。
可以使用任何大肠杆菌作为其中导入了从噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要cDNA文库可以得以导入、表达和保留。例子包括XLl-Blue MRF′[Strategies， 5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088和Y1090[Science， 222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.， 166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol， 16，118(1966)]、JM105[Gene， 38，275(1985)]、和类似物。
作为从cDNA文库选择编码目标蛋白质的cDNA克隆的方法，可以使用采用同位素-或荧光-标记探针的菌落杂交或噬菌斑杂交[Molecular Cloning，Second Edition]。还可以通过制备引物并以从mRNA合成的cDNA或cDNA文库为模板，根据PCR来制备编码目标蛋白质的cDNA。
将所关注的蛋白质与人抗体Fc区融合的方法包括PCR法。例如，在所关注蛋白质编码基因序列的5′-端和3′-端设计任何合成的寡DNA(引物)，进行PCR，制备PCR产物。以相同的方式，为待融合的人抗体Fc区的编码基因序列设计任何引物，以制备PCR产物。此时，以下列方式设计引物：待融合蛋白质PCR产物的3′-端和Fc区PCR产物的5′-端之间存在相同的限制性酶位点或相同的基因序列。当需要连接位点周围对氨基酸进行修饰时，使用其中导入突变的引物来导入突变。使用获得的两种PCR片段进一步进行PCR，将基因连接起来。另外，还可以通过在用相同的限制性酶处理后进行连接，将它们连接起来。
可以通过如下方法测定dNA的核苷酸序列：用合适的限制性酶消化通过上述方法连接的基因序列，将这些片段克隆到质粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene制造)中，使用通用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 74，5463(1977)]或自动核苷酸序列分析仪如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)进行分析。
从测定的核苷酸序列推算Fc融合蛋白质的全长氨基酸序列，并将其与目标氨基酸序列进行比较，可以确认得到的cDNA是否编码包含分泌性信号序列的Fc融合蛋白质的全长氨基酸序列。
(3)Fc融合蛋白质的稳定产生
通过将2.B.(1)中所述的Fc融合蛋白质表达载体导入合适的动物细胞，可以获得能够稳定地产生Fc融合蛋白质的转化体。
将Fc融合蛋白质表达载体导入动物细胞的方法包括电穿孔法[已公开未审查的日本专利申请第257891/90号，Cytotechnology， 3，133(1990)]和类似方法。
可以使用任何细胞作为导入了融合蛋白质表达载体的动物细胞，只要它是上文第1项中产生的本发明的细胞和可以产生Fc融合蛋白质的动物细胞。
例子包括小鼠骨髓瘤细胞如NS0细胞和SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢细胞如CHO/dhfr-细胞和CHO/DG44细胞、大鼠骨髓瘤细胞如YB2/0细胞和IR983F细胞、来源于叙利亚仓鼠肾的BHK细胞、人骨髓瘤细胞如Namalwa细胞和类似细胞。优选中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞和大鼠骨髓瘤YB2/0细胞。
导入Fc融合蛋白质表达载体后，根据已公开未审查的日本专利申请第257891/90号公开的方法，使用包括如G418硫酸盐和类似物的试剂的用于动物细胞培养的培养基，可以选择能够稳定地产生Fc融合蛋白质表达载体的转化体。培养动物细胞的培养基包括RPMI 1640培养基(Nissui Pharmaceutical制造)、GIT培养基(Nihon Pharmaceutical制造)、EX-CELL 302培养基(JRH制造)、IMDM培养基(GIBCO BRL制造)、杂交瘤-SFM培养基(GIBCO BRL制造)、向这些培养基中加入各种添加物如胎牛血清获得的培养基、以及类似培养基。将获得的转化体在培养基中培养，可以在培养上清液产生并积聚Fc融合蛋白质。培养上清液中Fc蛋白质的生成量和抗原结合活性可以通过诸如ELISA法的方法进行测定。另外，根据已公开未审查的日本专利申请第257891/90号公开的方法，可以使用dhfr基因扩增系统增加转化体产生的Fc融合蛋白质的量。
使用蛋白质A柱或蛋白质G柱，可以从培养转化体的培养上清液中纯化Fc融合蛋白质[Antibodie，Chapter 8；Monoclonal Antibodies]。此外，还可以使用纯化蛋白质通用的纯化方法。例如，可以通过凝胶过滤、离子交换色谱、超滤和类似方法的组合进行纯化。经纯化的Fc融合蛋白质分子的整体分子量可以通过SDS-PAGE[Nature， 227，680(1970)]、蛋白质印迹法[Antibodie，Chapter 12；Monoclonal Antibodies]或类似方法测定。
因此，使用动物细胞作为宿主细胞产生抗体组合物的方法已经如上进行了描述，但是，抗体组合物也可以如上所述由酵母、昆虫细胞、植物细胞、动物个体或植物个体产生。
当宿主细胞具有能够在宿主细胞中表达糖蛋白质如抗体分子的基因时，根据第1项所述的方法制备宿主细胞，培养细胞，从培养物中纯化目标糖蛋白质，获得糖蛋白质。
3.糖蛋白质活性评价
通过如下文献所述的已知方法测定纯化糖蛋白质的量、其受体亲和性、血液内半衰期、给药至血液中的组织内分布、和表达药理学活性所需蛋白质之间相互作用的变化：Current Protocols In Protein Science，John Wiley & Sons Inc.，(1995)；New Biochemical Experimentation Series19-Animal Experimental Test，Tokyo Kagaku Dojin，Japanese BiochemicalSociety编著(1991)；New Biochemical Experimentation Series8-Intracellular Information and Cell Response，Tokyo Kagaku Dojin，Japanese Biochemical Society编著(1990)；New BiochemicalExperimentation Series 9-Hormone I，Peptide hormone，Tokyo KagakuDojin，Japanese Biochemical Society编著(1991)；Experimental BiologicalCourse 3-Isotope Experimental Test，Maruzen(1982)；MonoclonalAntibodies：Principes and Applications，Wiley-Liss，Inc.，(1995)；Enzyme-Linked Immuno Adsorbent Assay，第三版，Igaku Shoin(1987)；Revised Enzyme Immunoassay，Gakusai Kikaku(1985)；和类似文献。
具体的例子包括如下方法：将纯化的糖蛋白质用诸如放射性同位素的化合物标记，定量测定标记糖蛋白质或相互作用蛋白质的受体结合活性。而且，还通过使用多种仪器如Biacore制造的BIAcore Series测定蛋白质间相互作用[J.Immnunol.Methods， 145，229(1991)；Experimental Medicine Supplement，Biomanual UP Series，ExperimentalTest of Intermolecular Interaction Experimental Test，Yodo-sha(1996)]。
通过将标记的糖蛋白质给予活体，可以观察给予活体后的血液内半衰期和组织内分布。优选地，通过一定的检测方法对标记体进行检测，在所述检测方法中，标记物质检测方法与使用对待检测糖蛋白质有特异性的抗体的抗原-抗体反应结合使用。
4.抗体组合物活性评价
作为测定蛋白质量、抗原亲和性、和纯化抗体组合物效应器功能的方法，可以使用Monoclonal Antibodies，Antibody Engineering和类似文献中所述的已知方法。
作为例子，当抗体组合物为人源化抗体时，可以通过ELISA、免疫荧光法或类似方法测定与抗原结合的活性和与抗原阳性培养细胞克隆结合的活性[Cancer Immunol.Immunother.， 36，373(1993)]。对抗原阳性培养细胞克隆的细胞毒活性可以通过测定CDC活性、ADCC活性和类似测定来评价[Cancer Immunol.Immunother.， 36，373(1993)]。
此外，抗体组合物在人体中的安全性和治疗作用可以使用合适的与人相近的动物种属模型如食蟹猴(Macaca fascicularis)进行评价。
5.糖蛋白质中糖链的分析
宿主细胞中表达的糖蛋白质的糖链结构可以根据糖蛋白质糖链结构的常规分析方法进行分析。例如，与IgG分子结合的糖链包括中性糖如半乳糖、甘露糖、或岩藻糖；氨基糖如N-乙酰氨基葡萄糖；和酸性糖如唾液酸，通过糖组成分析、二维糖链作图法、或类似方法，可以根据例如糖链结构分析法的方法进行分析。
下文中对抗体组合物中糖链的分析方法进行具体说明，但是通过相同的方式也可以分析其它糖蛋白质。
(1)中性糖和氨基糖的组成分析
抗体组合物中糖链的组成可以通过用酸(如三氟乙酸)酸水解释放出中性糖或氨基糖并分析组成比例来进行分析。
例子包括使用Dionex制造的糖组成分析仪(BioLC)的方法。BioLC是通过HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱-脉冲电流检测)分析糖组成的仪器[J.Liq.Chromatogr.， 6，1577(1983)]。
组成比例也可以通过使用2-氨基吡啶的荧光标记法进行分析。具体地说，组成比例可以根据以下已知方法计算：将酸水解样品用2-氨基吡啶化进行荧光标记，然后通过HPLC来分析组成[Agric.Biol.Chem.，55(1)283-284(1991)]。
(2)糖链结构分析
抗体分子中糖链的结构可以通过二维糖链作图法进行分析[Anal.Biochem.， 171，73(1988)；Biochemical Experimentation Methods 23-Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains，(Japan ScientificSocieties Press)Reiko Takahashi主编(1989)]。二维糖链作图法是一种推断糖链结构的方法，例如，分别以反相色谱中糖链的保留时间或洗脱位置为X轴、以正相色谱中糖链的保留时间或洗脱位置为Y轴作图，并将它们与已知糖链的结果进行比较。
具体地说，通过对抗体进行肼解，从抗体中释放出糖链，用2-氨基吡啶(下文称为PA)对其进行荧光标记[J.Biochem.， 95，197(1984)]，然后通过凝胶过滤将其从过量PA处理试剂中分离，对其进行反相色谱。然后，对糖链的每个峰进行正相色谱。将得到的结果在二维糖链图谱上作图，并将其与糖链标准物(Takara Shuzo)的点或文献中的数据进行比较，可以推断糖链的结构[Anal.Biochem.， 171.73(1988)]。
通过二维糖链作图推断的结构可以通过对每个糖链进行质谱分析如MALDI-TOF-MS来进一步确认。
6.导入的RNA的副作用分析
导入的RNA除抑制靶酶的功能之外，还可能影响到同源性很高的基因的表达、翻译等水平[Nature Biotechnol.， 21，635(2003)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 101，1892(2004)]。因此，当产生糖蛋白质如抗体组合物时，应当分析转化体的生长或所产生糖蛋白质的表达是否受到RNA导入副作用的影响。
具体来说，就糖蛋白质如抗体组合物的表达细胞而言，同时培养未导入本发明RNA的亲代细胞和导入RNA的细胞，以确认细胞生长曲线和糖蛋白质表达水平没有变化。通过分析所产生糖蛋白质的各种特性，确认了除由于糖链结构不同引起的生物学活性之外，所产生的糖蛋白质没有差异。
通过上文第5项中所述的方法可以分析所产生糖蛋白质的糖链结构。通过任何已知的蛋白质分析方法可以分析糖蛋白质的各种特性。蛋白质分析方法包括物理化学分析如电泳、凝胶过滤、等电点和氨基酸序列分析、抗原亲和性(当所产生的糖蛋白质是抗体时)、酶活性(当所产生的糖蛋白质是酶时)、和分别的配体或受体亲和性(当糖蛋白质是配体或受体时)。
7.糖蛋白质的应用
糖蛋白质如抗体组合物具有岩藻糖未修饰的糖链结构，并且生物活性很高，使得预计其具有如下作用：例如，与其受体的亲和性提高、血液内半衰期提高、给药至血液后组织内分布改善、以及表达药理学活性所需蛋白质之间的相互作用改善。特别是，抗体组合物的效应器功能很高，即，依赖抗体的细胞介导细胞毒活性很高。生理活性很高的糖蛋白质或ADCC活性很高的抗体组合物可用于预防和治疗多种疾病，所述疾病包括癌症、炎性疾病、免疫疾病如自身免疫性疾病和变态反应、心血管疾病和病毒或细菌感染。
在癌症即恶性肿瘤的情况下，癌细胞大量生长。通常的抗肿瘤药抑制癌细胞的生长。相反，ADCC活性很高的抗体可以通过其细胞杀伤作用损伤癌细胞来治疗癌症，因此，它是一种较一般抗肿瘤药更有效的治疗药物。目前，在癌症的治疗药物中，抗体药物单独的抗肿瘤作用在许多情况下并不充分，因此已经进行了与化疗结合的治疗[Science， 280，1197(1998)]。如果发现单独使用本发明抗体组合物的抗肿瘤作用更高，则对化疗的依赖性将降低，副作用将减少。
在免疫疾病如炎性疾病、自身免疫性疾病和变态反应中，免疫细胞释放的介质分子诱发疾病的体内反应，因此，使用ADCC活性很高的抗体消灭免疫细胞可以抑制变态反应。
心血管疾病包括动脉硬化和类似疾病。目前使用气囊式导管来治疗动脉硬化，但是在使用ADCC活性很高的抗体后，可以通过抑制再狭窄部位中动脉细胞的生长来预防和治疗心血管疾病。
使用ADCC活性很高的抗体，可以通过抑制被病毒或细菌感染的细胞的增殖来预防和治疗包括病毒和细菌感染的多种疾病。
以下举例说明识别肿瘤相关抗原的抗体、识别变态反应-或炎症-相关抗原的抗体、识别心血管疾病相关抗原的抗体、识别自身免疫性疾病相关抗原的抗体、或识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体。
识别肿瘤相关抗原的抗体包括抗-CA125抗体、抗-17-1A抗体、抗整联蛋白质αvβ3抗体、抗-CD33抗体、抗-CD22抗体、抗-HLA抗体、抗-HLA-DR抗体、抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-EGF受体抗体[Immunology Today， 21，403(2000)]、抗-CD 10抗体[American Journalof Clinical Pathology， 113，374(2000)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 79，4386(1982)]、抗-GD2抗体[Anticancer Res.， 13，331(1993)]、抗-GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.， 36，260(1993)]、抗-GM2抗体[Cancer Res.， 54，1511(1994)]、抗-HER2抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，4285(1992)]、抗-CD52抗体[Nature， 332，323(1988)]、抗-MAGE抗体[British J.Cancer， 83，493(2000)]、抗-HM1.24抗体[MolecularImmunol， 36，387(1999)]、抗-甲状旁腺激素相关蛋白质(PTHrP)抗体[Cancer， 88，2909(2000)]、抗-FGF8抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，9911(1989)]、抗碱性成纤维细胞生长因子抗体、抗-FGF8受体抗体[J.Biol.Chem.， 265，16455(1990)]、抗碱性成纤维细胞生长因子受体抗体、抗胰岛素样生长因子抗体、抗胰岛素样生长因子受体抗体[J.Neurosci.Res.， 40，647(1995)]、抗-PMSA抗体[J.Urology， 160，2396(1998)]、抗血管内皮细胞生长因子抗体[Cancer Res.， 57，4593(1997)]、抗血管内皮细胞生长因子受体抗体[Oncogene， 19，2138(2000)]和类似抗体。
识别变态反应-或炎症-相关抗原的抗体包括抗-IgE抗体、抗-CD23抗体、抗-CD11a抗体[Immunology Today， 21，403(2000)]、抗-CRTH2抗体[J.Immunol， 162，1278(1999)]、抗-CCR8抗体(WO99/25734)、抗-CCR3抗体(US6207155)、抗白细胞介素6抗体[Immunol.Rev.， 127，5(1992)]、抗白细胞介素6受体抗体[Molecular Immunol， 31，371(1994)]、抗白细胞介素5抗体Immunol.Rev.， 127，5(1992)]、抗白细胞介素5受体抗体、抗白细胞介素4抗体[Cytokine， 3，562(1991)]、抗白细胞介素4受体抗体[J.Immunol.Meth.， 217，41(1998)]、抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma， 13，183(1994)]、抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular Pharmacol， 58，237(2000)]、抗-CCR4抗体[Nature， 400，776(1999)]、抗趋化因子抗体[J.Immuno.Meth.， 174，249(1994)]、抗趋化因子受体抗体[J.Exp.Med， 186，1373(1997)]和类似抗体。
识别心血管疾病相关抗原的抗体包括抗-GpIIb/IIIa抗体[J.Immunol.， 152，2968(1994)]、抗血小板衍生生长因子抗体[Science， 253，1129(1991)]、抗血小板衍生生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.， 272，17400(1997)]、抗凝血因子抗体[Circulation， 101，1158(2000)]和类似抗体。
识别自身免疫性疾病(如银屑病、类风湿性关节炎、克隆氏病、溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮和多发性硬化症)相关抗原的抗体包括抗自身-DNA抗体[Immunol.Letters， 72，61(2000)]、抗CD11a抗体、抗-ICAM 3抗体、抗-CD80抗体、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗整联蛋白质α4β7抗体、抗-CD40L抗体、抗-IL-2受体抗体[Immunology Today， 21，403(2000)]和类似抗体。
识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体包括抗-gp120抗体[Structure，8，385(2000)]、抗-CD4抗体[J.Rheumatology， 25，2065(1998)]、抗-CCR5抗体和抗-Vero毒素抗体[J.Clin.Microbiol.， 37，396(1999)]和类似抗体。
这些抗体可以获自公共机构如ATCC(The American Type CultureCollection)、The Institute of Physical and Chemical Research and NationalInstitute of Bioscience and Human Technology(物理和化学研究协会和国家生物科学和人类科技协会)的RIKEN基因库、Agency of IndustrialScience and Technology(工业科学技术研究院)或私人试剂销售公司如Dainippon Pharmaceutical、R&D SYSTEMS、PharMingen、Cosmo Bio和Funakoshi。
下面对本发明的Fc区融合蛋白质的例子进行描述。
炎性疾病和免疫疾病如自身免疫性疾病和变态反应的相关结合蛋白质与抗体Fc区的融合蛋白质的例子包括etanercept(USP5605690，其为sTNFRII与Fc区的融合蛋白质)、alefacept(USP5914111，其为抗原递呈细胞上表达的LFA-3与Fc区的融合蛋白质)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)与Fc区的融合蛋白质[J.Exp.Med， 181，1869(1995)]、白细胞介素15与Fc区的融合蛋白质[J.Immunol， 160，5742(1998)]、VII因子与Fc区的融合蛋白质[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 98，12180(2001)]、白细胞介素10与Fc区的融合蛋白质[J.Immunol， 154，5590(1995)]、白细胞介素2与Fc区的融合蛋白质[J.Immunol， 146，915(1991)]、CD40与Fc区的融合蛋白质[Surgery， 132，149(2002)]、Flt-3蛋白质(fms样酪氨酸激酶)与抗体Fc区的融合蛋白质[Acta.Haemato.， 95，218(1996)]、OX40与抗体Fc区的融合蛋白质[J.Leu.Biol，72，522(2002)]、和类似蛋白质。另外，已经报道了许多融合蛋白质，如多种人CD分子[CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD 106(VCAM-1)、CD137]、粘附分子[ALCAM(活化的白细胞细胞粘附分子)、钙粘着蛋白质、ICAM(细胞间粘附分子)-1、ICAM-2、ICAM-3]、细胞因子受体(下文中“受体”称为“R”)、(白细胞介素-4R、白细胞介素-5R、白细胞介素-6R、白细胞介素-9R、白细胞介素-10R、白细胞介素-12R、白细胞介素-13Rα1、白细胞介素-13Rα2、白细胞介素-15R、白细胞介素-21R)、趋化因子、细胞死亡诱导信号分子[B7-H1、DR6(死亡受体6)、PD-1(程序性死亡因子-1)、TRAIL R1]、共刺激分子[B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(可诱导的共刺激分子)]、生长因子(ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化诱导因子(B7-H3)、活化因子(NKG2D)、信号转移分子(gp130)、或这些结合蛋白质与抗体Fc区的受体或配体。
包括糖蛋白质如抗体组合物的药物可以作为治疗药物单独给药，但通常优选将其通过药剂学技术领域中公知的合适方法与至少一种药学可接受的载体混合制成药物剂型。
优选选择在治疗中最为有效的给药途径。例子包括口服给药和胃肠外给药，如口内给药、气管内给药、直肠内给药、皮下给药、肌肉内给药或静脉内给药。在糖蛋白质制剂的情况下，优选静脉内给药。
剂型包括喷雾剂、胶囊、片剂、颗粒剂、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂、胶带和类似剂型。
适于口服给药的药物制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂和类似剂型。
液体制剂如乳剂和糖浆可以使用水；糖类如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇如聚乙二醇和丙二醇；油类如芝麻油、橄榄油和豆油；防腐剂如对羟基苯甲酸酯；香料如草莓香料、薄荷油和类似物作为添加剂而制造。
胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或类似剂型可以使用填料如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇；崩解剂如淀粉和藻酸钠；润滑剂如硬脂酸镁和滑石；粘合剂如聚乙稀醇、羟丙基纤维素和明胶；表面活性剂如脂肪酸酯；增塑剂如甘油和类似物作为添加剂而制造。
适于胃肠外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂、和类似剂型。
注射剂可以使用例如盐溶液、葡萄糖溶液或其二者混合物的载体而制备。另外，还可以通过根据常规方法冻干糖蛋白质并向其中加入氯化钠而制成粉末注射剂。
栓剂可以使用载体如可可脂、氢化油脂、或羧酸而制备。
喷雾剂可以使用糖蛋白质或将其与不刺激患者口腔或气道粘膜的载体一起使用而制备，可以通过将糖蛋白质分散成细粒而促进其吸收。
载体包括乳糖、甘油和类似物。根据糖蛋白质和载体的特性，可以制造例如气雾剂和干粉的制剂。此外，制备胃肠外制剂时，也可加入上述的口服制剂添加剂。作为口服制剂添加剂例举的成分也以加入到胃肠外制剂中。
尽管给药的剂量和频率根据目标治疗效果、给药方法、治疗周期、年龄、体重和类似情况而改变，但是，其通常为每个成人每天10μg/kg至20mg/kg。
另外，作为考察抗体组合物对各种肿瘤细胞的抗肿瘤作用的方法，体外试验包括CDC活性检测法、ADCC活性检测法和类似方法，体内试验包括使用试验动物如小鼠的肿瘤系统的抗肿瘤试验。
CDC活性、ADCC活性和抗肿瘤试验可以根据文献中描述的方法[Cancer Immunology Immunotherapy， 36，373(1993)；Cancer Research，54，1511(1994)]和类似方法进行。
以下基于实施例对本发明进行详细描述；但是这些实施例仅仅用来进行描述，本发明的范围不限于此。
                         实施例1
通过导入GMD-靶向小干扰RNA(siRNA)表达质粒制备凝集素抗性CHO/DG44细胞：
1.构建GM D-靶向siRNA表达载体
(1)克隆“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒(cassette)
根据以下方法获得“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒(图1)。
首先，设计正向引物和反向引物，正向引物中限制性酶HindIII和EcoRV的识别序列加入到与人U6启动子序列[GenBank Acc.No.M14486]结合的核苷酸序列的5′-端(下文中称为“hU6p-F-HindIII/EcoRV”，表示为SEQ ID NO：59)，反向引物中限制性酶XbaI和EcoRV的识别序列(与终止子序列对应的6个连续腺嘌呤碱基)和用于插入不同合成寡核苷酸DNA的限制性酶KpnI和SacI的识别序列加入至与人U6启动子序列结合的核苷酸序列5′-端(下文中称为“hU6p-R-term-XbaI/EcoRV”，表示为SEQ ID NO：60)。
然后，制备50μL含有40ng U6_FUT8_B_puro质粒(WO03/085118的实施例12中说明)作为模板的反应溶液[KOD缓冲液#1(TOYOBO制造)，0.1mmol/L dNTPs、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L引物hU6p-F-HindIII/EcoRV、和0.4μmol/L引物hU6p-R-term-XbaI/EcoRV]之后，使用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO制造)进行聚合酶链式反应(下文中称为“PCR”)。在94℃下加热2分钟后，进行30次PCR循环，一个循环为：94℃下反应15秒、65℃下反应5秒、74℃下反应30秒。
PCR之后，反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHIP(TAKARABIO制造)回收特异性扩增的片段(大约300bp)。将DNA片段溶解在30μL NEBuffer 2(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶XbaI(New England Biolabs制造)和HindIII(New EnglandBiolabs制造)在37℃下消化2小时。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化反应溶液，用限制性酶消化回收的DNA片段溶解在20μL无菌水中。
另外，将1μg质粒pBluescript II KS(+)(STRATAGENE制造)溶解在30μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs制造)的NEBuffer 2(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶HindIII和XbaI(New England Biolabs制造)在37℃下消化8小时。消化反应后，向反应溶液中加入22μL无菌水、6μL 10×碱性磷酸酶缓冲液和1单位碱性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收来自质粒pBluescript II KS(+)的HindIII-XbaI片段(大约2.9 kb)。
然后，将如上获得的8μL DNA片段(大约300 bp)和2μL来自质粒pBluescript II KS(+)的HindIII-XbaI片段(大约2.9 kb)与10μLLigation High(TOYOBO制造)混合，在16℃下反应2小时。将E.coliDH5α(TOYOBO制造)用反应溶液进行转化，使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒。下文中质粒称为“pBS-U6term”。
(2)“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒与pPUR的连接
将上文(1)中获得的质粒pBS-U6term中的“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒切断，并根据如下方法将其与表达载体pPUR(CLONTECH制造)连接(图2)。
首先，将1μg上文(1)中制备的质粒pBS-U6term溶解在20μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs制造)的NEBuffer 2(NewEngland Biolabs制造)中，并用10单位限制性酶EcoRV(New EnglandBiolabs制造)在37℃下消化2小时。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHIP(TAKARABIO制造)回收含有“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒的DNA片段(大约350bp)。
另外，将6μg质粒pPUR(CLONTECH制造)溶解在20μL NEBuffer2(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶PvuII(NewEngland Biolabs制造)在37℃下消化2小时。反应后，向反应溶液中加入5μL无菌水、3μL 10×碱性磷酸酶缓冲液、和1单位碱性磷酸酶E.coli C75(TAKARABIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收来自质粒pPUR的PvuII片段(大约4.3 kb)。
然后，将8μL如上得到的含有人U6启动子-克隆位点-终止子序列表达盒的DNA片段(大约350 bp)和2μL来自质粒pPUR的PvuII片段(大约4.3 kb)与10μL Ligation High(TOYOBO制造)混合，在16℃下反应3小时。将E.coli DH5α(TOYOBO制造)用反应溶液进行转化，使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。将大约0.5μg质粒DNA溶解在10μL NEBuffer 2(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶SacI和HindIII(New England Biolabs制造)在37℃下消化2小时。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以确认所插入目标片段的存在和插入方向。此外，使用377型DNA测序仪(Perkin Elmer制造)和BigDyeTerminator v3.0循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，根据生产厂商的说明书测定插入到每个质粒中的DNA的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO：61)和pPUR PvuII-seq-R(SEQ IDNO：62)作为序列分析引物，以确认插入的DNA片段具有与GenBankAcc.No.M14486相同的人U6启动子序列，并且用于扩增“人U6启动子-克隆位点-终止子”序列表达盒的引物位点序列和连接位点序列是正确的，从得到的质粒中选择其中插入的hU6启动子与嘌呤霉素抗性基因表达单位方向相同的质粒。下文中该质粒称为“pPUR-U6term”。
(3)选择靶序列、设计合成寡DNA
形成含有针对中国仓鼠卵巢CHO/DG44细胞GMD基因的siRNA靶序列的双链DNA盒的合成寡DNA如下进行制备。
首先，从来源于中国仓鼠的GMD cDNA序列(GenBank Acc.No.AF525364；SEQ ID NO：8)中选择符合下述条件的7条靶序列。选择的靶序列表示为SEQ ID NO：36-42。
条件1：包括由“NAR(N17)YNN”组成的共有序列，其中分别地，N代表A、G、U或C；R代表A或G，Y代表U或C。
条件2：满足条件1，且不包括连续3个或更多个相同碱基的序列。
条件3：满足条件1和2，GC含量更优选35-45％，优选45-55％。
条件4：29个碱基的序列(其中6个碱基添加到满足条件1-3的23个碱基的5′-或3′-端)满足条件2。
条件5：满足条件4，GC含量更优选35-45％，优选45-55％。
此外，根据如下方法为所选择的靶序列设计双链DNA盒。从5’-端，双链DNA盒依次具有用限制性酶SacI消化产生的3′-粘性末端、与SEQ ID NO：36-42对应的有义DNA、由10个碱基组成的人miR-23-前体-19微小RNA的环状序列(loop sequence)(GenBank Acc.No.AF480558)、与SEQ ID NO：36-42的DNA序列互补的反义DNA、和限制性酶KpnI产生的3′-粘性末端。双链DNA的5’-端被磷酸化。
根据SEQ ID NO：36所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链(sense strand)的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-A-F”)由SEQ ID NO：43表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-A-R”)由SEQ ID NO：44表示；根据SEQ ID NO：37所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-B-F”)由SEQ ID NO：45表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-B-R”)由SEQ ID NO：46表示；根据SEQ ID NO：38所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-C-F”)由SEQ ID NO：47表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-C-R”)由SEQ ID NO：48表示；根据SEQ IDNO：39所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-D-F”)由SEQ ID NO：49表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-D-R”)由SEQ ID NO：50表示；根据SEQ ID NO：40所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-E-F”)由SEQ ID NO：51表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-E-R”)由SEQ ID NO：52表示；根据SEQ ID NO：41所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-F-F”)由SEQ ID NO：53表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-F-R”)由SEQ ID NO：54表示；根据SEQ ID NO：42所示的靶序列设计的合成寡DNA有义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-F-F”)由SEQ ID NO：55表示；反义链的核苷酸序列(下文中称为“GMD-dsRNA-F-R”)由SEQ IDNO：56表示。根据常规方法合成设计的合成寡DNA(Moleculer Cloning，Second Edition)。
(4)将合成的寡DNA插入质粒pPUR-U6term
将上文(3)中合成的合成寡DNA插入上文(2)中获得的pPUR-U6term的克隆位点(图3)。
首先，根据如下方法将合成寡DNA退火。在10μL退火缓冲液[10mmol/L Tris(pH7.5)-50mmol/L NaCl-1mmol/L EDTA]中，溶解200pmol合成寡DNA的每条正义和反义链，然后煮沸2分钟。然后，在大约3小时的时间内逐渐冷却至室温。随后，将退火的合成寡DNA用无菌水稀释15倍。
另外，将3μg质粒pPUR-U6term溶解在40μL含有100μg/mLBSA(New England Biolabs制造)的NEBuffer 1(New England Biolabs制造)中，用20单位限制性酶KpnI和SacI(New England Biolabs制造)在37℃下消化4小时。消化反应后，向反应溶液中加入12μL无菌水、6μL 10×碱性磷酸酶缓冲液和1单位碱性磷酸酶E.coli C75(TAKARABIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHEP(TAKARA BIO制造)回收来自质粒pPUR-U6term的KpnI-SacI片段(大约4.5kb)。
然后，将如上获得的1μL双链合成寡聚溶液和1μL来自质粒pPUR-U6term的KpnI-SacI片段与8μL无菌水和10μL Ligation High(TOYOBO制造)混合，并在16℃下反应过夜。将E.coli DH5α(TOYOBO制造)用反应溶液转化，用QIAprep spin Mini prep试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。
使用377型DNA测序仪(Perkin Elmer制造)和BigDye Terminatorv3.0循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，根据生产厂商的说明书，测定插入每个质粒中的DNA的核苷酸序列。将质粒DNA煮沸大约1分钟，迅速冷却后用作模板，使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ IDNO：61)、hU6p Tsp45I/seq-F(SEQ ID NO：63)和pPUR PvuII-seq-R(SEQID NO：62)作为序列分析引物，以确认插入的合成寡DNA的序列和连接位点。在下文中，其中导入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-A-F和GMD-dsRNA-A-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshA”；其中导入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-B-F和GMD-dsRNA-B-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshB”；其中导入了由合成寡DNAGMD-dsRNA-C-F和GMD-dsRNA-C-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshC”；其中导入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-D-F和GMD-dsRNA-D-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshD”；其中导入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-E-F和GMD-dsRNA-E-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshE”；其中导入了由合成寡DNAGMD-dsRNA-F-F和GMD-dsRNA-F-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshF”；其中导入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-G-F和GMD-dsRNA-G-R组成的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDshG”。
2.通过导入GMD-靶向siRNA表达载体获得和培养凝集素抗性克隆
(1)通过导入GMD-靶向siRNA表达载体获得凝集素抗性克隆
将本实施例第1项中构建的每个质粒pPUR/GMDshA、pPUR/GMDshB、pPUR/GMDshC、pPUR/GMDshD、pPUR/GMDshE、pPUR/GMDshF和pPUR/GMDshG导入来源于CHO/DG44细胞的产生抗-CCR4嵌合抗体的克隆——克隆35-02-12(下文中称为“克隆32-05-12”)，该克隆通过与WO03/85118的参考实施例1中所述相同的方法获得，如下文所述获得识别糖链结构且对凝集素扁豆凝集素(下文中称为“LCA”)有抗性的克隆(所述糖链结构中在N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)。
根据以下方法通过电穿孔法将多个siRNA表达载体质粒转染到克隆32-05-12中[Cytotechnology， 3，133(1990)]。首先，将10μg各种siRNA表达载体质粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶FspI(New England Biolabs制造)在37℃下消化过夜进行线性化。使用一部分反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳确认被线性化的质粒后，将剩余反应溶液通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化，回收的线性化质粒溶解在10μL无菌水中。
另外，将克隆32-05-12以8×106细胞/mL溶解在K-PBS缓冲液(137mmol/L KC 1、2.7mmol/L NaCl、8.1mmol/L Na2HPO4、1.5mmol/KH2PO4和4.0mmol/L MgCl2)中。将200μL细胞悬液(1.6×106)与10μL上述线性化的质粒溶液混合后，将所有的细胞/DNA混合物转移至GenePulser Cuvette(电极间隔：2mm)(BIO-RAD制造)，在脉冲电压350V、电容250μF的条件下使用细胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD制造)进行转染。转染后，将细胞悬液悬浮在基础培养基[Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(下文中称为“IMDM”，Invitrogen制造)，其含有10％胎牛透析血清(Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(Nacalai Tesque制造)和500nmol/L MTX(SIGMA制造)]中，并接种到4个10cm-培养皿中进行粘附细胞培养(Falcon制造)。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时后，去掉培养上清液，向其中加入补充有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基，然后继续培养7天。随后，从其中一皿中去除培养上清液，向其中加入含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基，然后继续培养6至8天，对出现的嘌呤霉素抗性集落进行计数。另外，从剩余的培养皿中去掉培养上清液，向其中加入添加了12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR制造)的基础培养基，然后继续培养7天。结果，当导入pPUR/GMDshB时，获得了凝集素抗性克隆。
(2)凝集素抗性克隆的扩大培养
根据以下方法对上文(1)中通过导入pPUR/GMDshB获得的凝集素抗性克隆进行扩大培养。
首先，对每个培养皿中出现的集落数目进行计数。然后，将凝集素抗性集落刮下，在立体显微镜的观察下用pipetteman(GILSON制造)吸取，收集在用于粘附细胞的U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS制造)上。进行胰蛋白质酶处理后，将每个克隆分配至用于粘附细胞的平底96孔板(Greiner制造)上，在5％CO2和37℃的条件下在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中培养1周。培养后，将10个克隆在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中进行扩大培养。扩大培养中使用的克隆分别命名为“12-GMDB-1”、“12-GMDB-2”、“12-GMDB-3”、“12-GMDB-4”、“12-GMDB-5”、“12-GMDB-6”、“12-GMDB-7”、“12-GMDB-8”、“12-GMDB-9”和“12-GMDB-10”，并用于下文第3项中说明的分析。克隆12-GMDB-5也已经于2004年7月1日保藏专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，编号为FERMBP-10051。
3.测定导入了GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆中GMDmRNA的量
(1)制备全RNA
根据以下方法从克隆32-05-12和本实施例第2项中获得的凝集素抗性克隆中制备全RNA。以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将凝集素抗性克隆悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将它们以4ml接种在6cm-粘附细胞用培养皿(Falcon制造)中。将细胞在5％CO2和37℃的条件下静置培养3天，胰蛋白质酶处理后收集各种细胞悬液，以1,000rpm在4℃下离心5分钟，去掉上清液。将细胞悬浮在Dulbecco′s PBS缓冲液(Invitrogen制造)、并再次在1,000rpm和4℃下离心5分钟去掉上清液之后，使用RNeasy(QTAGEN制造)提取全RNA。根据生产厂商的说明书实施该方法，将制备的全RNA溶解在40μL无菌水中。
(2)合成单链cDNA
采用SUPERSCRIPTTM Preamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen制造)，根据生产厂商的说明书，使用寡(dT)引物在20μL反应系统中通过逆转录反应从第(1)项中获得的各种全RNA合成单链cDNA。随后，将反应溶液用RNase处理，最终的反应体积调整至40μL。另外，各种反应溶液用无菌水稀释50倍，并用于下述基因转录量的测定。
(3)通过SYBR-PCR测定基因转录量
根据以下方法使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCRVersion(TAKARA BIO制造)测定从GMD基因和β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。
关于这一点，使用WO02/31140的实施例15所述的含有来源于CHO细胞的GMD cDNA的质粒pAGE249GMD(各稀释为0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL的浓度)作为GMD测定的内参照；使用WO02/31140的实施例9所述的β-肌动蛋白质标准质粒(各稀释为1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作为β-肌动蛋白质测定的内参照。作为PCR引物，使用SEQ ID NO：64和65分别所示的正向和反向引物来扩增GMD，使用SEQ ID NO：66和67分别所示的正向和反向引物来扩增β-肌动蛋白质基因。
然后，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO制造)制备含有5μL(2)中制备的单链cDNA或各种浓度的内参照质粒溶液的20μL反应溶液[R-PCR缓冲液(TAKARABIO制造)、用于R-PCR的2.5mmol/L Mg2+溶液(TAKARABIO制造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARABIO制造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀释SYBR GreenI、1单位TaKaRa Ex TaqR-PCR]。将制备的反应溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon制造)上的每孔中，并将板用Plate Sealer(Edge Biosystems制造)密封。使用ABI PRISM 7700型序列检测系统进行PCR和分析，根据生产厂商的说明书测定GMD mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量。
根据内参照质粒的测量结果制作标准曲线，将GMD mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。另外，假设从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量在克隆之间都是相同的，计算并比较GMDmRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量，结果示于图4。
经显示，在通过导入GMD-靶向siRNA表达质粒获得的所有克隆中，GMD mRNA的量减少至亲代细胞的8％至50％。
                  实施例2
使用其中导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性CHO/DG44细胞生产抗体组合物：
1.获得其中导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆所产生的抗体组合物
根据以下方法获得由实施例1中得到的导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和克隆12-GMDB-5产生的抗-CCR4嵌合抗体。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将它们以15mL接种在T75粘附细胞用培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养6天后，去掉培养上清液，用10mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen制造)冲洗两次后，加入20mL EXCELL301培养基(JRH Bioscience制造)。在5％CO2和37℃的条件下培养7天后，回收培养上清液，使用MabSelectcolumn(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-CCR4嵌合抗体。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/LKH2PO4缓冲液更换后，使用孔径0.22mm的Millex GV(MILLIPORE制造)对从各个克隆培养上清液中纯化的抗-CCR4嵌合抗体进行无菌过滤。
2.由导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆产生的抗体组合物的单糖组成分析
根据已知的方法对在本实施例第1项中获得的抗-CCR4嵌合抗体进行单糖组成分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
                   表1
    克隆     未结合岩藻糖的糖链比例
    32-05-12     3％
    12-GMDB-2     78％
    12-GMDB-5     79％
从每个抗体的单糖组成比例计算出的未结合岩藻糖的复杂型糖链在全部复杂型糖链中的组成比例显示于表1。在亲代克隆32-05-12(用来导入GMD-靶向siRNA表达载体)产生的抗体组合物中，未结合岩藻糖的糖链比例为3％，而其中导入了siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5则分别为78％和79％，证明相比于亲代细胞，未结合岩藻糖的糖链比例大为增加。
以上结果证明，宿主细胞产生的抗体中α1，6-岩藻糖的含量可以通过导入GMD-靶向siRNA来控制。
                           实施例3
导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性CHO/DG44细胞的无血清流加培养：
1.导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性CHO/DG44细胞对无血清培养基的适应
根据以下方法，使导入载体前的亲代克隆32-05-12、实施例1中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5对无血清培养基进行适应。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，每个克隆以5mL接种在T75粘附细胞用培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，通过胰蛋白质酶处理获得细胞悬液，在1,000rpm下离心5分钟回收细胞。以5×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在含有500nmol/L MTX(SIGMA制造)、6mmol/L L-谷氨酰胺(Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(Nacalai Tesque制造)和100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲状腺原氨酸(SIGMA制造)的EX-CELL302培养基(JRH制造)(下文中称为“无血清培养基”)，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的无血清培养基中，将15mL细胞悬液接种到125mL锥形瓶(Corning制造)中。在用5％CO2向培养瓶中通气(至少培养容器体积的4倍)并将培养瓶密封后，在90-100rpm和在35℃下进行悬浮旋转培养。以3至4天的间隔传代，最后，获得了在无血清培养基中生长的克隆。之后，适应了无血清培养基的克隆32-05-12称为“32-05-12AF”，适应了无血清培养基的12-GMDB-2和12-GMDB-5分别称为“12-GMDB-2AF”和“12-GMDB-5AF”。
2.导入了GMD-靶向siRNA表达质粒、并适应无血清培养基的凝集素抗性CHO/DG44细胞的无血清流加培养
(1)锥形瓶中的无血清流加培养
根据以下方法使用本实施例第1项中对无血清培养基适应的克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF进行无血清流加培养。
使用含有500nmol/L MTX(SIGMA制造)、6mmol/L L-谷氨酰胺(Invitrogen制造)、100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲状腺原氨酸(SIGMA制造)、0.1％Pluronic F-68(Invitrogen制造)和5,000mg/L D(+)-葡萄糖(Nacalai Tesque制造)的EX-CELL302培养基(JRH制造)(下文中称为“无血清流加培养基”)进行流加培养，含有以较通常添加量更高的浓度制备的氨基酸(0.177g/L L-丙氨酸、0.593g/L L-精氨酸盐酸盐、0.177g/L L-天冬酰胺一水合物、0.212g/L L-天冬氨酸、0.646g/L L-胱氨酸二盐酸盐、0.530g/L L-谷氨酸、5.84g/L L-谷氨酰胺、0.212g/L甘氨酸、0.297g/L L-组氨酸盐酸盐二水合物、0.742g/L L-异亮氨酸、0.742g/L L-亮氨酸、1.031g/L L-赖氨酸盐酸盐、0.212g/L L-蛋氨酸、0.466g/L L-苯丙氨酸、0.283g/L L-脯氨酸、0.297g/L L-丝氨酸、0.671g/L L-苏氨酸、0.113g/L L-色氨酸、0.735g/L L-酪氨酸二钠二水合物和0.664g/L L-缬氨酸)、维生素(0.0918mg/L d-生物素、0.0283g/L D-泛酸钙、0.0283g/L氯化胆碱、0.0283g/L叶酸、0.0509g/L肌醇、0.0283g/L烟酰胺、0.0283g/L盐酸吡哆醛、0.00283g/L核黄素、0.0283g/L盐酸硫胺、和0.0918mg/L氰钴胺)和0.314g/L胰岛素的培养基(下文中称为“饲养培养基(feed medium)”)作为饲养用培养基。
以3×105细胞/mL的密度将克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF悬浮在无血清流加培养基中，将每种细胞悬液40mL接种至250mL锥形瓶(Corning制造)中。在用5％CO2向培养瓶中通气(至少为培养容器体积的4倍)并将培养瓶密封后，在90-100rpm和35℃下进行悬浮旋转培养。在开始培养后的第3、6、9和12天，加入3.3mL饲养培养基以补充氨基酸和类似物的消耗，以5,000mg/L的终浓度加入20％(w/v)的葡萄糖溶液以调整葡萄糖浓度。在开始培养后的第0、3、6、9、12和14天，每种培养物收集2-4mL，用于第(2)至(4)项中所述的分析。另外，在开始培养后第14天完成流加培养，收集全部培养物，用于第(4)项中所述的分析。
(2)测定活细胞数目
通过台盼蓝(trypan blue)染色测定在开始培养后第0、3、6、9、12和14天收集的第(1)项中培养物的活细胞数目和活力。克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF开始培养后每个时间点的活细胞数目显示于图5。与克隆32-05-12AF相比，克隆12-GMDB-2生长得较慢，即使在第14天仍然保持很高的活力。另外，开始培养后每个时间点克隆12-GMDB-5AF的活细胞数目与克隆32-05-12相似。因此，证明GMD-靶向siRNA的靶序列对细胞生长没有显著影响。
(3)测定抗体浓度
根据以下方法测定第(1)项中获得的开始培养后第0、3、6、9、12和14天培养上清液中所含抗体的浓度。
在750mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen制造)中，溶解1mL抗-人IgG(H+L)抗体(American Qualex制造)，将混合物以50μl分配至ELISA板的每个孔中。在4℃下过夜后，去掉溶液，向每孔中加入100μL含有1％BSA(牛血清白蛋白质)的PBS(下文中称为“BSA-PBS”)，测定板在室温下静置大约1小时，在-20℃下储存。在测定抗体量的过程中，使测定板在室温下复温，除去孔中的BSA-PBS后，向每孔中加入50μL用BSA-PBS稀释的培养上清液。使测定板在室温下静置1至2小时后，用含有0.05％Tween 20TM的PBS(下文中称为“Tween-PBS”)冲洗各孔。除去冲洗液体后，向每孔中加入50μL用BSA-PBS稀释2000倍的羊抗人IgG(H&L)-HRP(American Qualex制造)作为第二抗体。测定板在室温下静置1至2小时后，用Tween-PBS冲洗各孔，然后树脂水冲洗。冲洗后，向每孔中加入50μL添加有0.1％H2O2的ABTS底物溶液[0.55g 2，2′-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵溶解在1 L0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH4.2)中，使用添加1μL/mL的充氧水]进行显色。测定板在室温下静置大约15分钟后，当适当显色时，向每孔加入50μL5％SDS溶液终止反应。使用酶标仪以415nm处的吸收作为参比，测定490nm处的吸光度。使用纯化抗体制剂标准品制作的标准曲线中S形曲线的线性区域计算每个稀释样品的抗体浓度。将得到的稀释样品抗体浓度乘以稀释度，便可计算出每个培养上清液的抗体浓度。克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF开始培养后每个时间点培养上清液抗体浓度的测定结果显示于图6。在克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF当中，开始培养后培养上清液中的抗体组合物浓度是相似的。因此，证明GMD-靶向siRNA序列不影响细胞的抗体产率。
(4)抗体组合物的糖链结构分析
使用MabSelect column(Amersham Biosciences制造)根据生产厂商的说明书，从第(1)项获得的克隆32-05-12AF的第14天无血清流加培养上清液和克隆12-GMDB-2AF、12-GMDB-5AF无血清流加培养第6、12和14天的培养上清液纯化抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/L KH2PO4缓冲液换液后，将从各个克隆的培养上清液中纯化的抗-CCR4嵌合抗体组合物用孔径0.22mm的Millex GV(MTLLIPORE制造)进行无菌过滤。根据已知方法对从每个克隆适应无血清培养基的培养上清液获得的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行单糖组成分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。从每个抗体组合物单糖组成比例计算出来的全部复杂型糖链当中未结合岩藻糖的糖链比例(下文中称为“岩藻糖(-)％”)示于表2。
                      表2
    克隆     培养天数     岩藻糖(-)％
    32-05-12AF     14     7％
12-GMDB-2AF     6     88％
    12     87％
    14     85％
12-GMDB-5AF     6     84％
    12     82％
    14     81％
在第14天当培养结束时，克隆32-05-12AF所产生抗体组合物的岩藻糖(-)％为7％，而导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2AF、12-GMDB-5AF则为81至85％。因此，证明了在无血清流加培养基中，导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆也可产生岩藻糖(-)％高于亲代克隆的抗体组合物。另外，由克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％在第6、12和14天显示的数值大致恒定。因此，证明了通过导入GMD-靶向siRNA表达质粒来抑制α1，6-岩藻糖加入到抗体组合物复杂型糖链上的作用在无血清流加培养中是稳定的。
                      实施例4
使用α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)-靶向siRNA表达载体文库筛选有效获得凝集素抗性克隆的siRNA靶向序列并构建有效的FUT8-靶向siRNA表达载体：
1.构建α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)-靶向siRNA表达载体文库(FUT8shRNAlib/pPUR)
(1)获得源于CHO细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)cDNA序列
根据WO00/61739所述的方法，从由来源于中国仓鼠卵巢的CHO/DG44细胞制备的单链cDNA克隆编码α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的cDNA。
首先，根据小鼠FUT8 cDNA的核苷酸序列(GenBank Acc.No.AB025198)设计5′-未翻译区特异性正向引物(SEQ ID NO：68)和3′-未翻译区特异性反向引物(SEQ ID NO：69)。
然后，制备25μL含有1μLCHO/DG44细胞来源的单链cDNA的反应溶液[ExTaq缓冲液(TaKaRa制造)、0.2mmol/L dNTP、4％DMSO和0.5μmol/L上述特异性引物(SEQ ID NO：68和69)]之后，使用DNA聚合酶ExTaq(TaKaRa制造)进行PCR。在94℃下加热1分钟后，进行30次PCR循环，一个循环组成为：在94℃下反应30秒，在55℃下反应30秒，在72℃下反应2分钟，然后在72℃下反应10分钟。
PCR后，对反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收特异扩增的片段(大约2kb)。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen制造)根据生产厂商的说明书，将DNA片段与质粒pCR2.1连接，并将E.coli DH5α用连接反应溶液转化。在得到的卡那霉素抗性集落当中，根据已知方法从8个克隆中分离插入cDNA的质粒DNA。
使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready反应试剂盒(Applied Biosystems制造)根据生产厂商的说明书进行反应后，使用Applied Biosystems制造的ABI PRISM 377型DNA测序仪对每个质粒中插入的cDNA的序列进行分析。通过这种方法，证实所有质粒中插入的cDNA均为编码全长中国仓鼠FUT8 ORF的cDNA。在质粒DNA中插入的序列经测定的cDNA当中，选择PCR产生的核苷酸没有读码错误(readout error)的质粒DNA。下文中，该质粒称为“CHfFUT8-pCR2.1”。以这种方式测定的中国仓鼠FUT8 cDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO：1表示。
(2)制备FUT8-靶向siRNA表达载体文库
根据WO03/46186实施例13中的方法，使用第(1)项中获得的CHfFUT8-pCR2.1构建人tRNA-val启动子型FUT8-靶向siRNA表达载体文库。另外，使用限制性酶BamHI的识别序列作为反义和正义DNA之间的loop序列，使用pPUR(CLONTECH制造)作为载体。下文中，制得的文库称为“FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B”。
对siRNA表达载体文库FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B进行扩增，制备质粒载体。使用无菌培养皿[243mm×243mm×18mm(Nalgenunc制造)]制备含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基，每皿接种50μL FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B甘油母液。在37℃下静止培养过夜后，用无菌水将平皿中的大肠杆菌收集在悬液中，根据已知方法回收质粒DNA。下文中，将回收的质粒称为“FUT8shRNAlib/pPUR”。
2.获得导入了α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)-靶向siRNA表达文库的凝集素抗性克隆
将本实施例第1项中获得的FUT8-靶向siRNA表达文库质粒FUT8shRNAlib/pPUR导入克隆32-05-12，如下分离对特异性识别α1，6-岩藻糖的凝集素LCA有抗性的克隆。
将本实施例第1项中获得的质粒FUT8shRNAlib/pPUR用限制性酶FspI(New England Biolabs制造)消化进行线性化，通过电穿孔法[Cytotechnology， 3，133(1990)]将10μg线性化的质粒FUT8shRNAlib/pPUR导入1.6×106细胞的克隆32-05-12后，将细胞悬浮在基础培养基[含有10％胎牛血清(Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(NacalaiTesque制造)和500nmol/L MTX(SIGMA制造)的IMDM(Invitrogen制造)]中，以8mL接种在3个粘附细胞培养用10cm培养皿中(Falcon制造)。另外，在相同条件下转染10次，细胞培养在共计30个10cm培养皿中。在5％CO2孵箱中在37℃下培养24小时后，用8mL含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基更换培养基。在5％CO2孵箱中在37℃下培养7天后，用8mL含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR制造)的基础培养基更换培养基，继续培养6至8天，分离凝集素抗性克隆。
3.分析α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)-靶向siRNA表达质粒的靶序列
(1)在凝集素抗性克隆的基因组DNA中分离siRNA表达盒
如下从本实施例第2项中获得的凝集素抗性克隆的基因组DNA中分离siRNA表达盒(图7)。
根据已知方法[Gene Targeting，Oxford University Press(1993)]，将凝集素抗性克隆收集在粘附细胞用平底培养皿(Greiner制造)中，在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中在5％CO2孵箱中在37℃下培养1周。
培养后，将皿中的每个克隆用胰蛋白质酶处理，并分配至2个粘附细胞用平底96孔板(Greiner制造)上。一块板用作复制板，另一块作为母板冻存。复制板在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中在5％CO2孵箱中在37℃下培养1周后，根据已知方法从每个克隆中制备基因组DNA[Analytical Biochemistry， 201，331(1992)]，并各自在30μLTE-RNase缓冲液(pH8.0)[10mmol/LTris-HCl、1mmol/L EDTA和200μg/mL RNase A]中溶解过夜，然后用无菌水稀释为0.05μg/μL。
另外，为FUT8-靶向siRNA表达质粒FUT8shRNAlib/pPUR分别设计与siRNA表达盒tRNA-val启动子区上游结合的正向引物(SEQ IDNO：70)和与siRNA表达盒终止子序列下游结合的反向引物(SEQ IDNO：71)。
使用从每个克隆制备的基因组DNA作为模板，采用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO制造)进行聚合酶链式反应(PCR)。为每个克隆制备含有5μL上述基因组DNA溶液的反应溶液(50μL)[KODBuffer1(TOYOBO制造)、0.2mmol/L dNTP、1mmol/L MgCl2和0.4umol/L上述引物(SEQ ID NO：70和71)]，在94℃下加热1分钟后，进行25次PCR循环，一个循环组成为：在97℃下反应10秒，在68℃下反应30秒。PCR后，反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，回收含有siRNA表达盒区的扩增片段(大约300 bp)。
另外，将2μg质粒pPUR(CLONTECH制造)用限制性酶PvuII(New England Biolabs制造)在37℃下消化过夜。消化反应后，反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，回收被消化的DNA片段(大约4.3 kb)。
使用Ligation High(TOYOBO制造)对以上获得的PCR-扩增片段(大约300 bp)和来自质粒pPUR的PvuII片段进行连接。将Ecoli DH5α用反应溶液转化。根据已知的方法从若干获得的氨苄青霉素抗性集落中分离质粒DNA。
(2)分析在siRNA表达单位中所含的靶序列
对第(1)项中获得的质粒的siRNA表达盒中包含的FUT8-靶向序列进行分析。
首先，在用BigDye Terminator v3.0 Cycle测序试剂盒(AppliedBiosystems制造)根据生产厂商的说明书进行反应后，使用ABI PRISM377型DNA测序仪(Applied Biosystems制造)对插入到第(1)项中获得的每个质粒DNA中的siRNA表达盒的核苷酸序列进行分析。在159个克隆的测定核苷酸序列中，靶序列对FUT8的同源性与CHO细胞FUT8 cDNA的序列(SEQ ID NO：1)进行比较，与SEQ ID NO：1对应的每条靶序列的起点和终点显示于表3中。
                         表3
    克隆编号     靶序列起始点     靶序列终点     靶序列长度(bp)
    1     1     19     19
    2     1     20     20
    3     1     22     22
    4     2     31     30
    5     5     30     26
    6     29     53     25
    7     35     60     26
    8     35     62     28
    9     76     103     28
    10     78     105     28
 11  83   112   30
 12  87   112   26
 13  95   120   26
 14  96   120   25
 15  97   121   25
 16  109   133   25
 17  121   146   26
 18  144   170   27
 19  148   174   27
 20  150   174   25
 21  175   200   26
 22  216   242   27
 23  221   260   40
 24  230   256   27
 25  245   267   23
 26  268   296   29
 27  275   300   26
 28  276   306   31
 29  278   308   31
 30  279   306   28
 克隆编号  靶序列起始点   靶序列终点   靶序列长度(bp)
 31  283   309   27
 32  301   326   26
 33  302   328   27
 34  330   361   32
 35  334   359   26
 36  372   398   27
 37  401   428   28
 38  534   563   30
 39  534   566   33
 40  536   563   28
 41  539   565   27
 42  543   567   25
 43  543   570   28
 44  545   569   25
 45  561   589   29
 46  567   589   23
 47  603   629   27
 48  608   640   33
 49  642   660   19
 50  642   663   22
 51  642   670   29
 52  650   679   30
 53  663   689   27
 54  682   708   27
 55  710   736   27
 56  711   741   31
 57  713   740   28
 58  774   801   28
 59  789   816   28
  60   802   836   35
  61   824   850   27
  62   824   852   29
  63   824   854   31
  64   824   857   34
  65   827   858   32
  66   828   853   26
  67   834   858   25
  68   834   858   25
  69   834   860   27
  70   880   906   27
  71   886   913   28
  72   898   926   29
  73   900   922   23
  74   905   930   26
  75   907   934   28
  76   912   937   26
  77   917   946   30
  78   932   952   21
  79   950   968   19
  克隆编号   靶序列起始点   靶序列终点   靶序列长度(bp)
  80   986   1013   28
  81   990   1019   30
  82   1015   1042   28
  83   1022   1049   28
  84   1046   1071   26
  85   1062   1089   28
  86   1073   1102   30
  87   1095   1124   30
  88   1112   1137   26
  89   1122   1145   24
  90   1138   1169   32
  91   1149   1174   26
  92   1149   1182   34
  93   1150   1181   32
  94   1157   1181   25
  95   1166   1191   26
  96   1180   1207   28
  97   1211   1237   27
  98   1254   1278   25
  99   1340   1365   26
  100   1340   1370   31
  101   1416   1445   30
  102   1422   1448   27
  103   1425   1453   29
  104   1428   1460   33
  105   1441   1468   28
  106   1451   1480   30
  107   1463   1491   29
  108   1464   1489   26
  109   1465   1490   26
  110   1498   1517   20
  121   1555   1578   24
  122   1584   1612   29
  123   1588   1615   28
  124   1591   1615   25
  125   1591   1619   29
  126   1602   1626   25
  127   1602   1629   28
  128   1610   1637   28
  129   1613   1637   25
  130   1619   1645   27
  131   1622   1647   26
  132   1680   1707   28
  133   1687   1713   27
  134   1729   1746   18
  135   1730   1746   17
  136   1730   1746   17
  137   1744   1758   15
  138   1744   1768   25
  克隆编号   靶序列起始点   靶序列终点   靶序列长度(bp)
  139   1744   1773   30
  140   1765   1796   32
  141   1786   1811   26
  142   1821   1839   19
  143   1821   1842   22
  144   1821   1844   24
  145   1863   1890   28
  146   1927   1951   25
  147   1940   1965   26
  148   1948   1984   37
  149   1949   1976   28
  150   1951   1979   29
  151   1957   1982   26
  152   1957   1982   26
  153   1963   1987   25
  154   1963   1989   27
  155   1963   1990   28
  156   1964   1987   24
  157   1965   1990   26
  158   1974   2000   27
  159   1978   2008   31
在159个克隆的靶序列当中，与代表性靶区域对应的RNA序列由SEQ ID NO：14至23所示。
(3)搜索与siRNA表达单位所含靶序列同源的小鼠、大鼠和人序列
在小鼠、大鼠和人FUT8序列中如下搜索第(2)项中获得的SEQID NO：14至23所示的与靶序列对应的序列。
SEQ ID NO：2、3和4分别显示小鼠、大鼠和人FUT8序列。在这些序列当中，搜索第(2)项中获得的SEQ ID NO：14至23所示的与靶序列对应的序列。在该项搜索中，排除完全匹配的序列。
以下显示了所选序列的各个序列号。与SEQ ID NO：14对应的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO：85表示；与SEQ ID NO：14对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：86表示；与SEQ ID NO：15对应的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO：24表示；与SEQ ID NO：15对应的人FUT8序列由SEQID NO：25表示；与SEQ ID NO：15对应的大鼠FUT8序列由SEQ IDNO：87表示；与SEQ ID NO：16对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：26表示；与SEQ ID NO：17对应的人、小鼠和大鼠FUT8序列由SEQ IDNO：27表示；与SEQ ID NO：18对应的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO：28表示；与SEQ ID NO：18对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：29表示；与SEQ ID NO：18对应的大鼠FUT8序列由SEQ ID NO：30表示；与SEQID NO：19对应的小鼠和大鼠FUT8序列由SEQ ID NO：31表示；与SEQID NO：19对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：32表示；与SEQ ID NO：20对应的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO：33表示；与SEQ ID NO：20对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：34表示；与SEQ ID NO：21对应的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO：88表示；与SEQ ID NO：21对应的人FUT8序列由SEQ ID NO：89表示；与SEQ ID NO：22对应的大鼠FUT8序列由SEQ IDNO：35表示。
4.构建高效的α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)-靶向siRNA表达载体
在本实施例第3项中获得的FUT8-靶向siRNA的靶区中，根据以下方法构建靶向SEQ ID NO：15或16中所含序列的siRNA表达载体(图7、8和9)：
在本实施例第3(1)项中获得的含有siRNA表达盒的质粒当中，选择如下质粒：含有SEQ ID NO：72所示的DNA序列(该序列是与表1所示的克隆No.31相同的包含在SEQ ID NO：15中的靶序列)作为正义DNA、和与SEQ ID NO：72所示DNA序列互补的核苷酸序列作为反义DNA的质粒(下文中称为“FUT8shRNA/lib2B/pPUR”)；和含有与表3所示的克隆No.72相同的与SEQ ID NO：16对应的DNA序列作为正义DNA、与SEQ ID NO：16对应的DNA序列互补的核苷酸序列作为反义DNA的质粒(下文中称为“FUT8shRNA/lib3/pPUR”)(图7)。
首先，将1μg FUT8shRNA/lib2B/pPUR或FUT8shRNA/lib3/pPUR质粒溶解在30μL用于EcoRI的NEBuffer(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶EcoRI和XhoI(New England Biolabs制造)在37℃下消化3小时之后，对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收含有人tRNA-val启动子-短发夹型RNA-终止子序列表达盒的DNA片段(大约250 bp)。
另外，将1μg质粒pBluescript II KS(+)溶解在30μL用于EcoRI的NEBuffer(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶EcoRI和XhoI(New England Biolabs制造)在37℃下消化2小时。反应后，向反应溶液中加入13μL无菌水、5μL 10×碱性磷酸酶缓冲液和1单位碱性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应，对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收来自质粒pBluescript II KS(+)的EcoRI-XhoI片段(大约2.9 Kb)。
然后，将8μL上述EcoRI-XhoI DNA片段(大约250 bp)、2μL来自质粒pBluescript II KS(+)的EcoRI-XhoI片段(大约2.9 Kb)和10μLLigation High(TOYOBO制造)混合，在16℃下反应2小时。将E.coliDH5α(Invitrogen制造)用反应溶液转化，使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒。之后，在上述质粒中，分别将插入来自FT8libB/pPUR和FT8lib3/pPUR的DNA片段(大约250bp)的质粒称为“FT8libB/pBS”和“FT8lib3/pBS”。
将1μg质粒FT8libB/pBS或FT8lib3/pBS溶解在20μL NEBuffer 4(New England Biolabs制造)中，并用10单位限制性酶SmaI(NewEngland Biolabs制造)在25℃下消化5小时后，在65℃下加热20分钟，使限制性酶SmaI灭活。向反应溶液中加入14.6μL无菌水、4μL10×NEBuffer 2(New England Biolabs制造)、0.4μL 100×BSA(NewEngland Biolabs制造)和10单位限制性酶XhoI(New England Biolabs制造)，在37℃下消化过夜，然后对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收含有人tRNA-val启动子-短发夹型RNA-终止子序列表达盒的DNA片段(大约250bp)。
另外，将1μg质粒pAGE249溶解在30μLNEBuffer 1(New EnglandBiolabs制造)中，并用10单位限制性酶NaeI和XhoI(New EnglandBiolabs制造)在37℃下消化6小时。消化反应后，向反应溶液中加入22μL无菌水、6μL 10×碱性磷酸酶缓冲液和1单位碱性磷酸酶E.coliC75(TAKARABIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO制造)回收来自质粒pAGE249的NaeI-XhoI片段(大约4.4 Kb)。另外，pAGE249是pAGE248的衍生物[J.Biol.Chem.， 269，14730(1994)]，即从中用SphI限制性酶消化去掉含有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因表达单元的2.7Kb片段的pAGE248载体。
然后，将10μL上述DNA片段(大约250bp)、5μL来自质粒的NaeI-XhoI片段(大约4.4Kb)和15μL Ligation High(TOYOBO制造)混合，在16℃下反应过夜。将E.coli DH5α(Invitrogen制造)用反应溶液转化，使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。使用377型DNA测序仪(Perkin Elmer制造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，根据生产厂商的说明书测定各个质粒中插入的DNA的核苷酸序列。使用pAGE249-seq FW(SEQ ID NO：73)和pAGE249-seq RV(SEQ ID NO：74)作为测序引物，确认插入的DNA序列与对应于EcoRI-XhoI片段的序列(其为质粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR或FUT8shRNA/lib3/pPUR中所含的人tRNA-val启动子-短发夹型RNA表达单位)一致。之后，在上述质粒中，分别将其中插入了来自质粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR和FUT8shRNA/lib3/pPUR的DNA片段(大约250bp)的质粒称为“FT8libB/pAGE”和“FT8lib3/pAGE”。
                     实施例5
在L-岩藻糖的存在下通过将FUT8-靶向siRNA表达质粒共同导入已导入GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆制备凝集素抗性CHO/DG44细胞：
1.在L-岩藻糖的存在下通过将FUT8-靶向siRNA表达质粒导入已导入GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆获得和培养凝集素抗性克隆
(1)在L-岩藻糖的存在下通过导入FUT8-靶向siRNA表达载体获得凝集素抗性克隆
在加有L-岩藻糖的培养条件下，将FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE、实施例2构建的FUT8-靶向siRNA表达载体导入实施例1中获得的已导入GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆12-GMDB-2或12-GMDB-5中，获得凝集素抗性克隆。
通过与实施例1中2(1)相同的方法将质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE转染到克隆12-GMDB-2或12-GMDB-5中。
转染之后，将细胞悬液悬浮在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，并接种在4个粘附细胞用10cm培养皿中。在37℃和5％CO2的条件下培养24小时后，去掉培养上清液，向其中加入含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基，然后继续培养8天。随后，从其中一皿中去掉培养上清液，向其中加入含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基，然后继续培养6至8天，对出现的潮霉素抗性集落进行计数。另外，从其余的皿中也去掉培养上清液，向其中加入含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)、3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)、100μmol L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR制造)的基础培养基，接着继续培养9天，在100μmol/L L-岩藻糖的存在下获得凝集素抗性克隆，即共同导入FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆。
(2)凝集素抗性克隆的扩大培养
根据以下方法对第(1)项中通过共同导入FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体获得的凝集素抗性克隆进行扩大培养。
首先，对每个皿中出现的集落数进行计数。然后，将凝激素抗性集落刮下，在立体显微镜的观察下用pipetteman(GILSON制造)吸取，收集在粘附细胞用U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS制造)中。胰蛋白质酶处理后，将每个克隆接种在粘附细胞用平底96孔板(Greiner制造)中，在5％CO2和37℃的条件下在含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中培养过夜。培养后去掉培养上清液，将细胞在含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)、3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)、100μmol L-岩藻糖(NacalaiTesque制造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR制造)的基础培养基中继续培养6天。培养后，上述皿中的每个克隆在含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中进行扩大培养。下文中，用于扩大培养的克隆当中，通过将FT8libB/pAGE导入克隆12-GMDB-2获得的凝集素抗性克隆分别称为“12-GB2/FB-1”、“12-GB2/FB-2”、“12-GB2/FB-3”、“12-GB2/FB-4”和“12-GB2/FB-5”；将FT8lib3/pAGE导入克隆12-GMDB-2获得的克隆分别称为“12-GB2/F3-1”、“12-GB2/F3-2”、“12-GB2/F3-3”、“12-GB2/F3-4”和“12-GB2/F3-5”；将FT8libB/pAGE导入克隆12-GMDB-5获得的克隆分别称为“12-GB5/FB-1”、“12-GB5/FB-2”、“12-GB5/FB-3”、“12-GB5/FB-4”和“12-GB5/FB-5”；将FT8lib3/pAGE导入克隆12-GMDB-5获得的克隆分别称为“12-GB5/F3-1”、“12-GB5/F3-2”、“12-GB5/F3-3”、“12-GB5/F3-4”和“12-GB5/F3-5”。另外，克隆12-GB5/FB-1和12-GB5/F3-2已经于2004年7月1日保藏于专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(Tsukuba Central 6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，编号分别为FERM BP-10049和FERMBP-10050。
2.测定在L-岩藻糖的存在下导入了GMD-靶向表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆中GMD mRNA和FUT8 mRNA的量
(1)制备全RNA
根据以下方法从导入载体之前的亲代克隆32-05-12、实施例1中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及本实施例第1项中获得的共同导入了GMD-靶向表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆制备全RNA。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将导入了FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆悬浮在含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，每种4mL接种在粘附细胞用6cm-培养皿(Falcon制造)中。将细胞在5％CO2和37℃的条件下培养3天，通过胰蛋白质酶处理以及在1,000rpm 4℃下离心5分钟回收每种细胞悬液。将回收的细胞悬浮在Dulbecco′s PBS缓冲液(Invitrogen制造)后，再次通过在1,000rpm 4℃下离心5分钟对细胞进行回收，使用RNeasy(QIAGEN制造)提取全RNA。根据生产厂商的说明书实施该方法，将制备的全RNA溶解在40μL无菌水中。
(2)合成单链cDNA
采用SUPERSCRIPTTM Preamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen制造)根据生产厂商的说明书，通过在20uL反应系统中与寡聚(dT)引物进行逆转录反应，从3μg第(1)项中获得的每种全RNA合成单链cDNA。随后，将反应溶液用RNase处理，并将最终反应体积调整至40μL。此外，将每种反应溶液用无菌水稀释50倍，用于测定下述的基因转录量。
(3)通过SYBR-PCR测定GMD基因的转录量
如下所述对从GMD基因和β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量进行定量。另外，使用WO02/31140实施例15中描述的含有来源于CHO细胞的质粒pAGE249GMD(各稀释成浓度为0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL)作为GMD测定的内参照，使用WO02/31140实施例9中描述的β-肌动蛋白质标准质粒(各稀释成浓度为1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作为β-肌动蛋白质测定的内参照。而且，分别使用SEQ ID NO：64和65所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增GMD，分别使用SEQ ID NO：66和67所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增β-肌动蛋白质。
然后，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO制造)制备20μL含有5μL第(2)项中制备的单链cDNA溶液或每种浓度内参照质粒溶液的反应溶液[R-PCR缓冲液(TAKARA BIO制造)、2.5mmol/L用于R-PCR的Mg2+溶液(TAKARABIO制造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARABIO制造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀释SYBR GreenI、1单位TaKaRaEx Taq R-PCR]。将制得的反应溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon制造)的每个孔中，并将板用Plate Sealer(Edge Biosystems制造)密封。使用ABI PRISM 7700型测序检测系统进行PCR和分析，根据生产厂商的说明书测定GMD mRNA和β-肌动蛋白质mRNA的量。
根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将GMD mRNA和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。另外，假设从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量在这些克隆之间都是相同的，对GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量进行计算和比较，结果示于图10。在共同导入FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体的所有克隆中，与亲代克隆32-05-12相比，GMD mRNA的量减少至约10％。
(4)通过SYBR-PCR测定FUT8的基因转录量
如下所述测定从FUT8基因和β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。另外，使用WO02/31140实施例9中所述的FUT8标准质粒(各稀释成浓度为0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL)作为FUT8测定的内参照；使用WO02/31140实施例9中所述的β-肌动蛋白质标准质粒(各稀释成浓度为1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作为β-肌动蛋白质测定的内参照。而且，分别使用SEQ ID NO：75和76所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增FUT8，分别使用SEQ ID NO：66和67所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增β-肌动蛋白质。
然后，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO制造)制备20μL含有5μL第(2)项中制备的单链cDNA溶液或每种浓度的内参照质粒溶液的反应溶液[R-PCR缓冲液(TAKARA BIO制造)、2.5mmol/L用于R-PCR的Mg2+溶液(TAKARABIO制造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARA BIO制造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀释SYBR GreenI、1单位TaKaRaEx Taq R-PCR]。将制得的反应溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon制造)的每个孔中，并将板用Plate Sealer(Edge Biosystems制造)密封。使用ABI PRISM 7700型测序检测系统进行PCR和分析，根据生产厂商的说明书测定GMD mRNA和β-肌动蛋白质mRNA的量。
根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将FUT8 mRNA和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。另外，假设从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量在这些克隆之间都是相同的，对FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量进行计算和比较，结果示于图11。在共同导入FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体得到的所有克隆中，与亲代克隆32-05-12相比，FUT8 mRNA的量减少至约10％。
                      实施例6
使用导入了GMD-靶向siRNA表达质粒和FUT8-靶向siRNA表达质粒的CHO/DG44细胞制造抗体组合物：
1.在不存在L-岩藻糖的条件下培养获得抗体组合物
根据以下方法，获得由导入载体之前的亲代克隆32-05-12、实施例1中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及实施例3中获得的共同导入了FUT8-靶向siRNA表达载体和GMD-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4所产生的抗-CCR4嵌合抗体组合物。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在含有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4悬浮在含有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，并将其以15mL接种在粘附细胞用T75培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养6天后，去掉培养上清液，用10mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen制造)冲洗后，加入20mL EXCELL301培养基(JRH Bioscience制造)。在5％CO2和37℃的条件下培养7天后，回收培养上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)更换为10mmol/L KH2PO4缓冲液后，将从各种克隆的培养上清液纯化的抗-CCR4嵌合抗体组合物通过孔径0.22μm的Millex GV(MTLLIPORE制造)进行无菌过滤。
2.在L-岩藻糖的存在下培养获得抗体组合物
根据下面的方法获得由导入载体之前的亲代克隆32-05-12、实施例1中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及实施例3中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达质粒和FUT8-靶向siRNA表达质粒的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4在存在L-岩藻糖的培养条件下所产生的抗-CCR4嵌合抗体组合物：
将克隆32-05-12在基础培养基中培养，以3×105细胞/mL的密度，将克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5悬浮在添加有12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4悬浮在添加有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，将其以15mL接种在粘附细胞用T75培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，去掉培养上清液，用添加有500μmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)的基础培养基为克隆32-05-12换液，用添加有500μmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)和12μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基为克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5换液，用添加有500μmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)、400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基为克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4换液。在5％CO2和37℃的条件下继续培养3天后，去掉培养上清液，用10mLDulbecco′s PBS(Invitrogen制造)冲洗后，加入20mL添加有500μmol/LL-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)的EXCELL301培养基(JRH Bioscience制造)。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，向每个培养瓶中加入1mL 10mmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)，然后继续培养4天。培养后，回收培养上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)更换为10mmol/L KH2PO4缓冲液后，通过孔径0.22μm的Millex GV(MTLLIPORE制造)对从各个克隆的培养上清液纯化的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行无菌过滤。
3.抗体组合物的单糖组成分析
根据已知方法对本实施例第1和2项中获得的每种抗-CCR4嵌合抗体组合物进行单糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
                            表4
每个克隆产生的抗-CCR4-嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％
    克隆                       岩藻糖(-)％
    在L-岩藻糖存在下培养   在不存在L-岩藻糖的条件下培养
    32-05-12     6％   3％
    12-GMDB-2     6％   78％
    12-GB2/FB-1     66％   94％
    12-GB2/FB-3     67％   92％
    12-GB2/F3-3     81％   98％
    12-GB2/F3-5     79％   97％
    12-GMDB-5     8％   79％
    12-GB5/FB-1     71％     97％
    12-GB5/FB-2     76％     96％
    12-GB5/F3-2     81％     95％
    12-GB5/F3-4     67％     91％
从每种抗体组合物的单糖成分比例计算的糖链中复杂型N-糖苷-连接糖链中还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的抗体比例显示在表4中。
在不存在L-岩藻糖的条件下培养时，用于导入GMD-靶向siRNA表达载体的亲代克隆32-05-12所产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为3％，而导入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5则分别为78％和79％，这证明与亲代细胞相比，其抗体组合物中的岩藻糖(-)％显著增加。另外，共同导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4产生的抗体组合物中的岩藻糖(-)％为91至98％，进一步证明与单独导入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆相比，其抗体组合物中岩藻糖(-)％进一步增加。
另外，在不存在L-岩藻糖的条件下培养时，用于导入GMD-靶向siRNA表达载体的亲代克隆32-05-12所产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为6％，而导入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5则分别为6％和8％。另一方面，共同导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4产生的抗体组合物中岩藻糖(-)％为66至81％，证明与单独导入GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆相比，其抗体组合物中岩藻糖(-)％显著增加。
如上所述，在存在或不存在L-岩藻糖的条件下培养时，共同导入了GMD-靶向和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％均高于单独导入GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆高，因此，无论L-岩藻糖存在与否，共同导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA来抑制α1，6-岩藻糖加入至细胞产生的抗体组合物的复杂型糖链上的作用高于单独导入GMD-靶向siRNA。
此外，共同导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％在不存在L-岩藻糖的条件下培养时要高于在存在L-岩藻糖的条件下培养(此时升高GMD-靶向siRNA的岩藻糖(-)％的作用丧失)，显示共同导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA对α1，6-岩藻糖加入至细胞产生的抗体组合物复杂型糖链上的抑制作用要高于单独导入GMD-靶向siRNA。
                    实施例7
导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的CHO/DG44细胞的无血清流加培养：
1.导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的CHO/DG44细胞对无血清培养基的适应
根据下面的方法使导入载体之前的亲代克隆32-05-12、实施例3中获得的导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4对无血清培养基进行适应。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4悬浮在添加有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的基础培养基中，每种克隆以15mL接种在粘附细胞用T75培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，通过胰蛋白质酶处理使细胞悬浮，在1,000rpm下离心5分钟回收细胞。以5×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在含有500nmol/L MTX(SIGMA制造)、6mmol/L L-谷氨酰胺(Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(Nacalai Tesque制造)和100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲状腺原氨酸(SIGMA制造)的EX-CELL302培养基(JRH制造)(下文中称为“无血清培养基”)中，将克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4悬浮在添加有400μg/mL潮霉素(WAKO制造)和3μg/mL嘌呤霉素(SIGMA制造)的无血清培养基中，将15mL细胞悬液接种在125mL锥形瓶(Corning制造)中。在用5％CO2向培养瓶中通气(至少4倍于培养容器体积)并将培养瓶密封后，在90-100rpm和35℃下进行悬浮旋转培养。以3至4天的间隔传代，最后，获得了可以在无血清培养基中生长的克隆。下文中，分别将适应无血清培养基的克隆32-05-12称为“32-05-12AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB2/FB-1称为“克隆Wi2B-1AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB2/FB-3称为“Wi2B-3AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB2/F3-3称为“Wi23-3AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB2/F3-5称为“Wi23-5AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB5/FB-1称为“Wi5B-1AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB5/FB-2称为“Wi5B-2AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB5/F3-2称为“Wi53-2AF”；适应无血清培养基的克隆12-GB5/F3-4称为“Wi53-4AF”。
2.使用导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体、并适应无血清培养基的CHO/DG44细胞进行无血清流加培养
根据下面的方法使用本实施例第1项中的适应无血清培养基的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF进行无血清流加培养：
使用无血清流加培养基和饲养培养基(feed medium)进行流加培养。
将克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1 AF以3×105细胞/mL的密度悬浮在无血清流加培养基中，将40mL每种细胞悬液接种在250mL锥形瓶(Corning制造)中。在用5％CO2向培养瓶中通气(至少4倍于培养容器体积)并将培养瓶密封后，在90-100rpm和在35℃下进行悬浮旋转培养。在开始培养后的第3、6、9和12天，加入3.3mL饲养培养基以补充氨基酸和类似物的消耗，以5,000mg/L的终浓度加入20％(w/v)葡萄糖溶液以调节葡萄糖浓度。在开始培养后的第0、3、6、9、12和14天，每种培养物收集2-4mL，通过台盼蓝染色测定活细胞数目和活力，并通过本实施例第3(1)项中所述的ELISA法测定每种培养上清液中所含抗体的浓度。在开始培养克隆32-05-12AF和Wi23-5AF后，各个时间点的活细胞数目和培养上清液中抗体组合物的浓度分别显示于图12和13。开始培养后每个时间点的活细胞数目和培养上清液中抗体组合物的浓度在克隆32-05-12AF和Wi23-5AF之间是相似的。因此，证明GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的靶序列对细胞的生长和抗体的产生没有显著影响。
3.使用与可溶性人FcγRIIIa的结合活性作为标志物测定糖链中岩藻糖的1-位未与还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接的抗体
使用WO03/85119实施例10中所述的结合可溶性人FcyRIIIa(下文中称为“shFcyRIIIa”)的活性作为标志物，根据下面的方法对本实施例第2项中获得的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF的无血清流加培养上清液中所含的抗-CCR4嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％进行测定。
(1)通过ELISA测定抗体浓度
以与实施例3第2(3)项相同的方式测定培养上清液中的抗体浓度。
使用以纯化抗体制剂标准品制作的标准曲线S形曲线的线性区域，对每种稀释样品的抗体浓度进行计算，将获得的稀释样品抗体浓度乘以稀释度，计算每种培养上清液的抗体浓度。
(2)制备不同岩藻糖(-)％的标准品
使用WO03/85119实施例4中所述的抗-CCR4嵌合抗体、来源于YB2/0细胞的KM2760-1和来源于CHO/DG44细胞的KM3060制备不同岩藻糖(-)％的标准品。通过实施例4第3项中所述的单糖成分分析对共计11个标准样品(包括KM2760-1、KM3060、和将KM2760-1和KM3060混合而制备的9个标准样品)进行岩藻糖(-)％测定；KM2760-1为90％；KM3060为10％；制备的9个标准制剂样品分别为82％、74％、66％、58％、50％、42％、34％、26％和18％。
(3)评价抗体与shFcyRIIIa的结合活性
以与WO03/85119实施例4第2项中所述的方法相同的方式，制备具有SEQ ID NO：77所示氨基酸序列、并与抗-CCR4嵌合抗体发生反应的人CCR4细胞外区肽与BSA的共轭物。
将制得的浓度1μg/mL的人CCR4细胞外区肽与BSA的共轭物以50μL/孔分配至96孔ELISA板(Greiner制造)，将混合物放置4℃过夜进行吸附。用PBS冲洗后，加入100μL/孔BSA-PBS，在室温下反应1小时，以封闭剩余的活性基团。每孔用Tween-PBS冲洗后，以50μL/孔加入用BSA-PBS稀释的抗-CCR4嵌合抗体样品，根据第(1)项中描述的ELISA测定的抗体浓度为2.5μg/mL，在室温下反应1小时。每孔用Tween-PBS冲洗后，向其中以50μL/孔加入用BSA-PBS稀释为5μg/mL的shFcyRIIIa溶液，在室温下反应1小时。每孔用Tween-PBS冲洗后，以50μL/孔加入用BSA-PBS制备的浓度0.1μg/mL的HRP-标记小鼠抗体Penta-His HRP共轭物(QIAGEN)，混合物在室温下反应1小时。用Tween-PBS冲洗后，以50μL/孔加入ABTS底物溶液，通过与第(2)项中的方法相似的方式显影后，使用酶标仪以415nm处的吸光度作为参比，测定490nm的吸光度。
第(2)项中制备的岩藻糖(-)％已知的每种抗-CCR4嵌合抗体标准制剂与shFcγRIIIa的结合活性显示于图14。结合shFcγRIIIa的活性与岩藻糖(-)％成比例增加，基于此获得标准曲线。另外，在测定中，制作各个96孔ELISA板的标准曲线。
使用标准曲线，从490nm处的吸光度可以获得培养上清液中包含的抗-CCR4嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％，上述吸光度显示的是本实施例第2项中获得的无血清流加培养上清液中所含的各种抗-CCR4嵌合抗体组合物与shFcyRIIIa的结合活性。克隆32-05-12AF和Wi23-5AF的结果显示于图15。
32-05-12AF的培养上清液中所含的抗体组合物显示出的与培养物中shFcγRIIIa的结合活性很低，其岩藻糖(-)％大约为10％。另外，克隆Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF培养上清液中所含抗体组合物显示出的与培养物中shFcγRIIIa的结合活性很高，其岩藻糖(-)％为75至90％或更高。因此，证明GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的靶序列可以在不影响细胞生长和抗体产生的情况下稳定地产生岩藻糖(-)％很高的抗体组合物。
4.无血清流加培养结束时所产生抗体组合物的糖链结构分析
(1)在无血清流加培养完成时获得纯化抗体
使用MabSelect柱(Amersham Biosciences制造)根据生产厂商的说明书，从本实施例第2项中获得的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF、和Wi5B-1AF无血清流加培养第14天的培养上清液中纯化每种抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/L KH2PO4缓冲液换液后，使用孔径0.22μm的Millex GV(MILLIPORE制造)对每种纯化的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行无菌过滤。
(2)抗体组合物单糖成分分析
根据已知方法对从第(1)项中的适应无血清培养基的克隆的培养上清液获得的每种抗-CCR4嵌合抗体组合物进行单糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
从每种抗体组合物单糖成分比例计算出岩藻糖(-)％显示于表5。
                         表5
每种克隆产生的抗-CCR4-嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％
    克隆     岩藻糖(-)％
    32-05-12AF     7％
    Wi23-3AF     87％
    Wi23-5AF     81％
    Wi5B-1AF     81％
克隆32-05-12AF产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为7％，而共同导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF为大约80至90％，与亲代克隆的比较证明，即使在培养结束时，共同导入了GMD-靶向siRNA表达载体和FUT8-靶向siRNA表达载体的凝集素抗性克隆中仍然保持着抑制α1，6-岩藻糖加入至抗体组合物复杂型糖链上的作用。
                    实施例8
使用导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的CHO/DG44细胞产生抗体组合物
1.构建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体
(1)构建人U6启动子下游中的GMD-靶向siRNA表达单位
根据下面的方法，使用实施例1第1项中构建的pPUR/GMDshB构建人U6启动子下游的GMD-靶向siRNA表达单位(图16)：
首先，设计具有XhoI限制性酶的识别序列的PUR-FW-XhoI正向引物(SEQ IDNO：78)(其与pPUR/GMDshB的人U6启动子序列上游连接)、和PUR-RV-XhoI反向引物(SEQ ID NO：79)(其与siRNA表达盒的终止序列下游连接)。
以pPUR/GMDshB为模板，使用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO制造)进行PCR。然后，制备20μL含有10ng质粒pPUR/GMDshB的反应溶液[KOD buffer 1(TOYOBO制造)、0.2mmol/LdNTP、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L上述引物(SEQ ID NO：78和79)和1U KOD聚合酶]，在98℃下加热1分钟后，进行25个PCR循环，一个循环组成为：98℃下反应15秒、65℃下反应5秒，74℃下反应30秒。PCR后，反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，回收人U6启动子下游中含有GMD-靶向siRNA表达盒的扩增片段(大约600bp)。
使用Ligation High(TOYOBO制造)将上述PCR-扩增片段(大约使用600bp)与pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen制造)连接。将E.coliDH5α用反应溶液转化。使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的卡那霉素抗性克隆中获得质粒DNA。下文中，该质粒称为“pCR/GMDshB”。
(2)构建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体
根据下面的方法，使用第(1)项中构建的质粒pCR/GMDshB和实施例4第4项中构建的质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE构建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体(图17)。
首先，将质粒pCR/GMDshB溶解在40μL含有100μg/mL BSA(NewEngland Biolabs制造)的NEBuffer 2(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶XhoI(New England Biolabs制造)在37℃下消化过夜。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHEP(TAKARA BIO制造)回收在人U6启动子下游含有GMD-靶向siRNA表达盒的DNA片段(大约600bp)。
另外，将1μg质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE溶解在40μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs制造)的NEBuffer 2(NewEngland Biolabs制造)中，用10单位限制性酶XhoI(New England Biolabs制造)在37℃下消化过夜。反应后，向20μL反应溶液中加入15μL无菌水、4μL 10×碱性磷酸酶缓冲液和1单位碱性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO制造)，在37℃下进行1小时脱磷酸化反应。反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用RECOCHTP(TAKARABIO制造)回收来自质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE的XhoI片段(大约4.7kb)。
将上面获得的5μL在人U6启动子下游含有GMD-靶向siRNA表达盒的DNA片段(大约600bp)和5μL来自质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE的XhoI片段(大约4.7kb)与10μL Ligation High(TOYOBO制造)混合后，使混合物在16℃下反应过夜。将E.coli DH5α(TOYOBO制造)用反应溶液转化，使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(Qiagen制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。使用377型DNA测序仪(Perkin Elmer制造)和BigDye Terminator v3.0Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，根据生产厂商的说明书确认每种质粒的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO：61)、pPUR PvuII-seq-R(SEQ ID NO：62)、hu6pTsp45I/seq-F(SEQ ID NO：63)、pAGE249-seqFW(SEQ ID NO：73)和pAGE249-seqRV(SEQ ID NO：74)作为序列分析引物。出于序列分析的结果，选择siRNA表达盒正确、且人U6启动子下游的GMD-靶向siRNA表达盒和人tRNA-val启动子下游的FUT8-靶向siRNA表达盒方向相同的克隆。下文中，将在人hU6启动子下游插入GMD-靶向siRNA表达盒的质粒FT8libB/pAGE和FT8lib3/pAGE分别称为“FT8libB_GMDB/pAGE”和“FT8lib3_GMDB/pAGE”。
2.通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得并培养凝集素抗性克隆CHO/DG44
(1)通过导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体获得凝集素抗性克隆CHO/DG44
根据以下方法将本实施例第1项中构建的GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE导入克隆32-05-12，获得凝集素抗性克隆。
以与实施例1第2(1)项相同的方式将质粒FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE转染到克隆32-05-12中。
转染后，将细胞悬液悬浮在基础培养基中，并接种在10个粘附细胞培养用10cm培养皿(Falcon制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时后，去掉培养上清液，加入含有500μg/mL潮霉素(WAKO制造)的基础培养基(下文中称为“Hyg500-IMDM培养基”)，然后继续培养8天，对出现的潮霉素抗性集落进行计数。而且，从一些培养皿中去掉培养上清液，加入LCA-IMDM培养基[含有5％胎牛血清(Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(Nacalai Tesque制造)、500nmol/L MTX(SIGMA制造)、1mmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)和500μg/mL LCA(VECTOR制造)的IMDM培养基(Invitrogen制造)]，然后继续培养7天。结果，通过导入质粒FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE，凝集素抗性克隆的获得率很高。
(2)凝集素抗性克隆的扩大培养
根据下面的方法对在第(1)项中获得的导入了GMD-靶向和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆进行扩大培养。
首先，对每个皿中出现的集落数目进行计数。然后将凝激素抗性集落刮下，在立体显微镜的观察下用pipetteman(GILSON制造)吸取，并收集在粘附细胞用U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS制造)中。进行胰蛋白质酶处理后，将每个克隆接种在粘附细胞用平底96孔板(Greiner制造)中，在5％CO2和37℃的条件下在LCA-IMDM培养基中培养过夜。培养后，去掉培养液，向其中添加新的Hyg500-IMDM培养基，然后继续培养9天。培养后，对培养皿中的每个克隆在Hyg500-IMDM培养基中进行扩大培养。下文，分别将质粒FT8libB_GMDB/pAGE导入克隆32-05-12获得的凝集素抗性克隆称为“克隆iBcho-H1”、“克隆iBcho-H2”、“克隆iBcho-H3”、“克隆iBcho-H4”或“克隆iBcho-H5”；将质粒FT8lib3_GMDB/pAGE导入克隆32-05-12获得的克隆称为“克隆i3cho-H1”、“克隆i3cho-H2”、“克隆i3cho-H3”、“克隆i3cho-H4”、“克隆i3cho-H5”、“克隆i3cho-H6”、“克隆i3cho-H7”或“克隆i3cho-H8”。
3.测定导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆CHO/DG44中GMD mRNA和FUT8 mRNA的量
(1)制备全RNA
根据下面的方法，从克隆32-05-12和本实施例第2项中获得的导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆iBcho-H1、iBcho-H2、iBcho-H3、iBcho-H4、iBcho-H5、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8中制备全RNA。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将克隆iBcho-H1、iBcho-H2、iBcho-H3、iBcho-H4、iBcho-H5、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8悬浮在Hyg500-IMDM培养基中，并以2mL接种在粘附细胞用6孔板(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，用胰蛋白质酶处理使各细胞悬浮，在1,000rpm和4℃下离心5分钟进行收集。将细胞悬浮在Dulbecco′s PBS缓冲液(Invitrogen制造)并在1,000rpm和4℃下再次离心5分钟收集细胞后，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN制造)根据生产厂商的说明书提取每种克隆的全RNA。将制得的全RNA溶解在40μL无菌水中。
(2)合成单链cDNA
采用SuperScriptIII First-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen制造)根据生产厂商的说明书，使用寡聚(dT)引物在20μL反应系统中通过逆转录反应从3μg第(1)项中获得的各种全RNA合成单链cDNA。将合成的单链cDNA用RNase处理，最终的反应体积调节至40μL。另外，每种反应溶液用无菌水稀释50倍，用于下述的基因转录量的分析。
(3)通过SYBR-PCR测定GMD基因的转录量
根据实施例5第2(3)项中所述的方法从测定GMD转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。分别使用SEQ IDNO：80和81所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增GMD，使用SEQ ID NO：66和67所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增β-肌动蛋白质。
根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将GMD mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。假设克隆32-05-12中GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，GMDmRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图18。与亲代克隆32-05-12相比，导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的所有克隆中，GMD mRNA的量减少至约10％。
(4)通过SYBR-PCR测定FUT8基因的转录量
根据实施例5第2(4)项中所述的方法从测定FUT8基因转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。分别使用SEQID NO：75和76所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增FUT8，使用SEQ ID NO：66和67所示的正向和反向引物作为PCR引物，用于扩增β-肌动蛋白质。
假设克隆32-05-12中GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图19。与亲代克隆32-05-12相比，导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的所有克隆中，FUT8 mRNA的量减少至约5％。
4.使用导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆CHO/DG44产生并分析抗体组合物
(1)使用导入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆CHO/DG44产生抗体组合物
根据下面的方法，对克隆32-05-12和本实施例第2项中获得的导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆iBcho-H2、iBcho-H3、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8所产生的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行纯化。
以3×105细胞/mL的密度，将克隆32-05-12悬浮在基础培养基中，将克隆iBcho-H2、iBcho-H3、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8悬浮在Hyg500-IMDM培养基中，并以10mL接种在粘附细胞用T75培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养5天后，去掉培养上清液，用10mLDulbecco′s PBS(Invitrogen制造)冲洗2次后，加入24mL EXCELL301培养基(JRH Bioscience制造)。在5％CO2和37℃的条件下培养7天后，回收各培养上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/L KH2PO4缓冲液换液后，使用孔径0.22μm的Millex GV(MILLIPORE制造)对从各个克隆的培养上清液中纯化的抗-CCR4嵌合抗体进行无菌过滤。
(2)抗体组合物单糖成分分析
根据已知方法对本实施例第4(1)项中获得的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行单糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
从每种抗体的单糖成分比例计算出的岩藻糖(-)％示于表6。另外，当检测不到岩藻糖产生的峰时，岩藻糖(-)％被视为100％。
                       表6
每种克隆产生的抗-CCR4-嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％
    克隆     岩藻糖(-)％
    32-05-12     4％
    iBcho-H2     100％
    iBcho-H3     99％
    i3cho-H1     100％
    i3cho-H2     100％
    i3cho-H3     100％
    i3cho-H4     98％
    i3cho-H5     100％
    i3cho-H6     98％
    i3cho-H7     100％
    i3cho-H8     100％
克隆32-05-12产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为4％，而通过将GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体导入亲代克隆32-05-12获得的的凝集素抗性克隆产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为98至100％，与亲代克隆相比显示出显著的增加。这些结果证明，导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体可以将CHO/DG44细胞转变成产生岩藻糖含量低的抗体组合物的细胞。
                    实施例9
使用导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的SP2/0细胞产生抗体组合物
1.构建小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体
(1)构建人U6启动子下游的小鼠GMD-靶向siRNA表达载体
根据以下方法构建小鼠GMD基因-靶向siRNA表达载体(图20)：
首先，选择与证实在中国仓鼠卵巢来源CHO/DG44细胞中有效的GMD-靶向siRNA表达载体(pPUR/GMDshB)的靶序列(SEQ IDNO：37)对应的小鼠序列(SEQ ID NO：58)作为靶序列。然后，以与实施例1第1(3)项相同的方式针对所选择的靶序列设计双链DNA盒。设计的合成寡DNA的正义链(下文中称为“mGMD-B-F”)和反义链(下文中称为“mGMD-B-R”)分别由SEQ ID NO：82和83表示。
此外，以与实施例1第1(4)项相同的方式，使用377型DNA测序仪(Perkin Elmer制造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems制造)根据生产厂商的说明书，对通过将合成寡DNA退火得到的双链DNA插入实施例1第1(2)项中获得的pPUR-U6term中构建的质粒DNA的核苷酸序列进行测定。使用pPURPvuII-seq-F(SEQ ID NO：6 1)和pPUR PvuII-seq-R(SEQ ID NO：62)作为序列分析引物，确认插入的合成寡DNA的序列和连接位点。下文中，将插入了合成寡DNA(mGMD-B-F和mGMD-B-R)退火得到的双链DNA的质粒称为“pPUR/GMDmB”。
(2)获得人U6启动子下游的小鼠GMD-靶向siRNA表达单位
通过与实施例6第1(1)项相同的方法，使用第(1)项中构建的pPUR/GMDmB获得人U6启动子下游的小鼠GMD-靶向siRNA表达盒(图16)。
使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(QIAGEN制造)从若干卡那霉素抗性集落中分离质粒DNA。下文中，该质粒称为“pCR/GMDmB”。
(3)构建小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体
通过与实施例6第1(2)项相同的方式，使用第(2)项中构建的质粒pCR/GMDmB和实施例2第4项中构建的质粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE构建小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体(图17)。
使用QIAprep spin Mini制备试剂盒(QIAGEN制造)从得到的氨苄青霉素抗性克隆中分离质粒DNA。使用377型DNA测序仪(PerkinElmer制造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle测序试剂盒(AppliedBiosystems制造)根据生产厂商的说明书确认每种质粒的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO：61)、pPUR PvuII-seq-R(SEQ IDNO：62)、hu6pTsp45I/seq-F(SEQ ID NO：63)、pAGE249-seqFW(SEQ IDNO：73)、和pAGE249-seqRV(SEQ ID NO：74)作为序列分析引物。
出于序列分析的结果，选择siRNA表达盒正确、且人U6启动子下游的GMD-靶向siRNA表达盒和人tRNA-val启动子下游的FUT8-靶向siRNA表达盒插入方向相同的克隆。下文中，分别将在人hU6启动子下游插入GMD-靶向siRNA表达盒的质粒FT8libB/pAGE称为“FT8libB_GMDmB/pAGE”，在人U6启动子下游插入小鼠GMD-靶向siRNA表达盒的FT8lib3/pAGE称为“FT8lib3_GMDmB/pAGE”。
2.通过导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体获得和培养凝集素抗性细胞系SP2/0
根据下面的方法，将本实施例1第1项中获得的小鼠GMD-靶向和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体FT8libB_GMDmB/pAGE或FT8lib3_GMDmB/pAGE导入克隆KM968[下文中称为“克隆KM968”，它是已公开未审查的日本专利申请第205694/94号的实施例1中所述的产生抗-GM2嵌合抗体的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(ATCC CRL-1581)的转化体]，获得凝集素抗性克隆。
根据以下方法通过电穿孔法将多种siRNA表达载体质粒转染到克隆KM968中[Cytotechnology，3，133(1990)]：
首先，将10μg每种siRNA表达载体质粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶FspI(New EnglandBiolabs制造)在37℃下消化过夜进行线性化。使用一部分反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳确认被线性化的质粒后，通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀对剩余反应溶液进行纯化，将回收的线性化质粒溶解在10μL无菌水中。
另外，将克隆KM968以1.6×107细胞/mL的密度溶解在K-PBS缓冲液中。将200μL细胞悬液(3.2×106)与10μL上述的线性化质粒溶液混合后，将所有细胞/DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette(电极间隔：2mm)(BIO-RAD制造)，使用细胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD制造)在脉冲电压200V、电容250μF的条件下进行转染。
转染后，将细胞悬液悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培养基[含有10％胎牛血清(Invitrogen制造)和500nmol/L MTX(SIGMA制造)的RPMI1640(Invitrogen制造)]中，并接种在悬浮培养用T75培养瓶(ASAFII TECHNOGLASS制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时后，以500μg/mL的最终浓度加入潮霉素(WAKO制造)，细胞继续培养3天。培养后，在800rpm下离心5分钟收集细胞，并将其以0.5-1×104活细胞/mL的密度悬浮在含有500μg/mL潮霉素的RPMI-FBS(10)-MTX(500)培养基[下文中称为“RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基”]中，以100μL接种在96-孔培养板(Greiner制造)中。随后，细胞继续培养2周，期间每2-3天用新的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基以一半的体积例行更换1次培养上清液。
培养后，将96孔培养板中每孔中的细胞分至两块96孔培养板中；一块为母板，另一块为复制板。将母板和复制板分别在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基和含有1mmol/L L-岩藻糖(Nacalai Tesque制造)、500μg/mL LCA(VECTOR制造)的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基中各培养3天。结果，确认了对应于显示出良好生长的母板孔的复制板孔中大约30％在LCA的存在下显示出良好的生长。
对与显示良好生长的复制板孔对应的母板孔中的细胞在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基中进行扩大培养。下文中，在扩大培养中使用的克隆当中，分别将导入FT8libB_GMDmB/pAGE获得的克隆称为“克隆968iB-1”、“克隆968iB-2”、“克隆968iB-3”、“克隆968iB-4”、“克隆968iB-5”、“克隆968iB-6”和“克隆968iB-7”；将导入FT8lib3_GMDmB/pAGE获得的克隆称为“克隆968i3-1”、“克隆968i3-2”、“克隆968i3-3”、“克隆968i3-4”、“克隆968i3-5”、“克隆968i3-6”、“克隆968i3-7”、“克隆968i3-8”、“克隆968i3-9”和“克隆968i3-10”。
3.测定导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性SP2/0细胞中GMD mRNA的量和FUT8 mRNA的量
(1)制备全RNA
根据下面的方法，从克隆KM968和本实施例第2项中获得的导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性细胞系SP2/0的克隆968iB-1、968iB-2、968iB-3、968iB-4、968iB-5、968iB-6、968iB-7、968i3-1、968i3-2、968i3-3、968i3-4、968i3-5、968i3-6、968i3-7、968i3-8、968i3-9和968i3-10制备全RNA。
以1×105细胞/mL的密度，将克隆KM968悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培养基中，将导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性细胞系SP2/0悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基中，并接种在悬浮细胞用T75培养瓶(ASAHI TECHNOGLASS制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，对细胞进行计数，以5×105细胞/mL收集每种细胞。在800rpm下离心5分钟回收细胞。将回收的细胞悬浮在Dulbecco′sPBS缓冲液(Invitrogen制造)中后，在800rpm下再次离心5分钟，回收细胞，使用RNeasy Micro Kit(QIAGEN制造)根据生产厂商的说明书提取每种克隆的全RNA。将制得的每种全RNA溶解在14μL无菌水中。
(2)合成单链cDNA
采用SuperScriptIII First-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen制造)根据生产厂商的说明书，使用寡聚(dT)引物在20μL反应系统中通过逆转录反应从3μg第(1)项中获得的各种全RNA合成单链cDNA。将合成的每种单链cDNA用RNase处理，最终的反应体积调节至40μL。另外，每种反应溶液用无菌水稀释50倍，用于下述的基因转录量的分析。
(3)通过SYBR-PCR测定小鼠GMD基因的转录量
根据实施例8第3(3)项中所述的方法测定从GMD基因转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将GMD mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。
假设克隆KM968中GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图21。与亲代克隆KM968相比，导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的所有克隆中，GMDmRNA的量减少至约10％。
(4)通过SYBR-PCR测定FUT8基因的转录量
根据实施例8第3(4)项中所述的方法测定从FUT8转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将FUT8 mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。
假设克隆KM968中FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图22。与亲代克隆KM968相比，导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的所有克隆中，FUT8mRNA的量减少至约10％。
4.使用导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性细胞系SP2/0产生和分析抗体组合物
(1)使用导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性细胞系SP2/0产生抗体组合物
根据下面的方法，对克隆KM968和本实施例第2项中获得的导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性克隆968i3-2和968i3-3所产生的抗-GM2嵌合抗体组合物进行纯化。
以1×105细胞/mL的密度，将克隆KM968悬浮在SP-HSFM培养基[含有5％UltraLow-IgG FBS(Invitrogen制造)、500nmol/L MTX(SIGMA制造)的杂交瘤-SFM培养基]中，将克隆968i3-2和968i3-3悬浮在含有500μg/mL潮霉素(WAKO制造)的SP-HSFM培养基中，并以50mL接种在悬浮培养用T225培养瓶(Greiner制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养7天后，去掉培养上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-GM2嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/LKH2PO4缓冲液换液后，使用孔径0.22μm的Millex GV(MILLIPORE制造)对从各个克隆的培养上清液中纯化的抗-GM2嵌合抗体进行无菌过滤。
(2)抗体组合物单糖成分分析
根据已知方法对本实施例第4(1)项中获得的抗-GM2嵌合抗体组合物进行单糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
从每种抗体的单糖成分比例计算出的岩藻糖(-)％示于表7。
                        表7
每种克隆产生的抗-GM2嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％
  克隆     未结合岩藻糖的糖链比例(-)％
  KM968     3％
  968i3-2     64％
  968i3-3     62％
克隆KM968产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为3％，而导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的凝集素抗性克隆968i3-2和968i3-3所产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为大约60％，与亲代克隆KM968相比显示出显著增加。这些结果证明导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体将SP2/0细胞转变成产生岩藻糖含量低的抗体组合物的细胞。
                    实施例10
使用导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的NS0细胞产生抗体组合物
1.获得和培养导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的细胞系NS0
根据下面的方法，将实施例7第1项中获得的小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体FT8libB_GMDmB/pAGE或FT8lib3_GMDmB/pAGE导入来源于小鼠骨髓瘤NS0细胞(RCB0213)的产生抗-CCR4嵌合抗体的克隆NS0/2160(下文中称为“克隆NS0/2160”，其通过与WO03/85118实施例1第(2)项相同的方式获得)，获得转化体。
根据下面的方法通过电穿孔法将多种siRNA表达载体质粒转染到克隆NS0/2160中[Cytotechnology， 3，133(1990)]。
首先，将10ug每种siRNA表达载体质粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs制造)中，用10单位限制性酶FspI(New EnglandBiolabs制造)在37℃下消化过夜进行线性化。使用一部分反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳确认被线性化的质粒后，将剩余反应溶液通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化，回收的线性化质粒溶解在10μL无菌水中。
另外，将克隆NS0/2160以1×107细胞/mL溶解在K-PBS缓冲液中。将200μL细胞悬液(1.6×106)与10μL线性化质粒溶液混合后，将所有的细胞/DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette(电极间隔：2mm)(BIO-RAD制造)，在脉冲电压200V、电容250μL的条件下使用细胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD制造)进行转染。
转染后，将细胞悬液悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培养基中，并接种到悬浮培养用T75培养瓶(ASAFII TECHNOGLASS制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时后，以500μg/mL的最终浓度加入潮霉素(WAKO制造)，细胞继续培养2天。培养后，在800rpm下离心5分钟收集细胞，并将其以0.5-1×104活细胞/mL的密度悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)中，以100μL接种在96-孔培养板(Greiner制造)中。随后，每2-3天用新的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基以一半的体积例行更换1次培养上清液，将细胞培养2-3周。
培养后，收集96孔培养板每孔中的培养上清液，通过实施例7第3项中所述的方法评价每种培养上清液中所含的抗-CCR4嵌合抗体组合物与shFcγRIIIa结合的活性。对每种载体在80孔中分析的结果是，与亲代克隆NS0/2160相比，90％或更多孔中培养上清液的抗体组合物与shFcγRIIIa的结合活性得以增加，这证明各个孔中的细胞被转变成产生岩藻糖含量低的抗体组合物的细胞。
在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基中对显示出与shFcγRIIIa的结合活性增加的5个孔中的细胞进行扩大培养。下文中，在用于扩大培养的克隆当中，分别将导入FTRlibB GMDmB/pAGE获得的克隆称为“克隆NS0/2160iB-1”、“克隆NS0/2160iB-2”、“克隆NS0/2160iB-3”、“克隆NS0/2160iB-4”和“克隆NS0/2160iB-5”；将导入FT8lib3_GMDmB/pAGE获得的克隆称为“克隆NS0/2160i3-1”、“克隆NS0/2160i3-2”、“克隆NS0/2160i3-3”、“克隆NS0/2160i3-4”和“克隆NS0/2160i3-5”。
2.测定导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性NS0细胞中GMD mRNA的量和FUT8 mRNA的量
(1)制备全RNA
根据以下方法从克隆NS0/2160和本实施例第1项中获得的导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的细胞系NS0(克隆NS0/2160iB-1、NS0/2160iB-2、NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-4、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-2、NS0/2160i3-3、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5)中制备全RNA。
以1×105细胞/mL的密度，将克隆NS0/2160悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培养基中，将导入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的细胞系NS0悬浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培养基中，将它们接种在悬浮培养用T75培养瓶(ASAHI TECHNOGLASS制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养3天后，对细胞进行计数，每种收集5×105个细胞。将细胞悬浮在Dulbecco′s PBS缓冲液(Invitrogen制造)、并再次在800rpm下离心5分钟之后，回收细胞。使用RNeasy Micro试剂盒(QIAGEN制造)根据生产厂商的说明书提取各全RNA。将制得的全RNA溶解在14μL无菌水中。
(2)合成单链cDNA
采用SUPERSCRIPTTM Preamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen制造)，根据生产厂商的说明书，使用寡(dT)引物在20μL反应系统中通过逆转录反应从第(1)项中获得的各种全RNA合成单链cDNA。将合成得单链cDNA用RNase处理，最终的反应体积调整至40μL。然后，将各种反应溶液用无菌水稀释50倍，并用于下述基因转录量的测定。
(3)通过SYBR-PCR测定GMD基因的转录量
根据实施例8第3(3)项中所述的方法测定从GMD基因转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将GMD mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。
假设克隆NS0/2160中GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，GMD mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图23。与亲代克隆NS0/2160相比，导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体获得的所有克隆中，GMD mRNA的量减少至约20％。
(4)通过SYBR-PCR测定FUT8基因的转录量
根据实施例8第3(4)项中所述的方法测定从FUT8基因转录的mRNA的量和从β-肌动蛋白质基因转录的mRNA的量。根据内参照质粒的测量结果获得标准曲线，将FUT8 mRNA的量和β-肌动蛋白质mRNA的量转变成数字形式。
假设克隆NS0/2160中FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量为100时，FUT8 mRNA相对于β-肌动蛋白质mRNA的相对量的比较结果示于图24。与亲代克隆KM968相比，通过导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体得到的所有克隆中，FUT8 mRNA的量减少至约10％。
3.使用导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的凝集素抗性细胞NS0产生和分析抗体组合物
(1)通过导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体、产生岩藻糖含量低的抗体的细胞系NS0产生抗体组合物
根据下面的方法，对克隆NS0/2160和本实施例第1项中的导入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体的细胞系NS0(克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5)所产生的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行纯化。
以2×105细胞/mL的密度，将克隆NS0/2160悬浮在NS-HSFM培养基[含有0.2％胎牛血清(Invitrogen制造)、500nmol/L MTX(SIGMA制造)的杂交瘤-SFM培养基]中，将克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5悬浮在含有500μg/mL潮霉素(WAKO制造)的NS-HSFM培养基中，并以40mL接种在悬浮培养用T225培养瓶(ASAHI TECHNOGLASS制造)中。在5％CO2和37℃的条件下培养7天后，去掉各个培养上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience制造)根据生产厂商的说明书纯化抗-CCR4嵌合抗体组合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad制造)用10mmol/LKH2PO4缓冲液换液后，使用孔径0.22μm的Millex GV(MILLIPORE制造)对从各个克隆的培养上清液中纯化的抗CCR4-嵌合抗体组合物进行无菌过滤。
(2)抗体组合物单糖成分分析
根据已知方法对本实施例第3(1)项中获得的抗-CCR4嵌合抗体组合物进行单糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography， 6，1577(1983)]。
从每种抗体的单糖成分比例计算出的岩藻糖(-)％示于表8。
                        表8
每种克隆产生的抗-CCR4嵌合抗体组合物的岩藻糖(-)％
  克隆     岩藻糖(-)％
  NS0/2160     28％
  NS0/2160iB-3     93％
  NS0/2160iB-5     92％
    NS0/2160i3-1     93％
    NS0/2160i3-4     93％
    NS0/2160i3-5     92％
克隆NS0/2160产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为28％，，而通过将小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表达载体导入亲代克隆NS0/2160获得的克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5所产生的抗体组合物的岩藻糖(-)％为大约90％，与亲代细胞相比显示出显著增加。这些结果证明导入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表达载体可以将NS0细胞转变成产生岩藻糖含量低的抗体组合物的细胞。
工业应用性
本发明提供了一种其中导入了能够抑制酶功能的RNA的细胞(上述酶催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应)；使用该细胞产生糖蛋白质的方法；一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA(所述糖链中在复杂型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接)、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶蛋白质功能的RNA、或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA；使用该细胞产生糖蛋白质的方法；和类似物。通过本发明的方法产生的抗体组合物具有很高的效应器活性，可用作药物。
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序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>糖蛋白组合物的制造方法
<130>11708W01
<150>P2004-228928
<151>2004-08-05
<150>P2004-252682
<151>2004-08-31
<150>P2005-136410
<151>2005-05-09
<160>96
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>2008
<212>DNA
<213>中国仓鼠(Cricetulus griseus)
<400>1
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<210>2
<211>3052
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<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
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aatattcact ctccattagg aagttttgta aaacaatgcc atgaacaaat tctttagtac 3000
tcaatgtttc tggacattct ctttgataac aaaaaaataa atttcaaaaa gg         3052
<210>3
<211>1728
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<400> 3
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gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataactta tctccagaat 600
cccaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaggg ctgtggctat 660
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cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag atcgactcgt aagagtccat 960
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<210>4
<211>2902
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400> 4
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<210>5
<211>575
<212>PRT
<213>中国仓鼠
<220>
<400> 5
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
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Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
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Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
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Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
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Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
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Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
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Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
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Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
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Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
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<210>6
<211>575
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<400>6
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  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
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     50                  55                  60
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Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu ValLys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
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Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
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Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu ValGln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
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Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
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Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570
<210>7
<211>575
<212>PRT
<213>人
<220>
<400>7
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala
            500                 505                 510
His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570
<210>8
<211>1606
<212>DNA
<213>中国仓鼠
<220>
<221>CDS
<222>(130)..(1248)
<400>8
agactgtggc ggccgctgca gctccgtgag gcgactggcg cgcgcaccca cgtctctgtc 60
ggcccgctgc cggttccacg gttccactcc tccttccact cggctgcacg ctcacccgcc 120
cgcggcgac atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct 171
          Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser
            1                    5                      10
ggg gac ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc   219
Gly Asp Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly
 15                  20                  25                  30
atc acc ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa   267
Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys
                 35                  40                  45
gga tac gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca   315
Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr
             50                  55                  60
ggt cga att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga   363
Gly Arg Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly
         65                  70                  75
aac atg aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta   411
Asn Met Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val
     80                  85                  90
aaa atc atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc   459
Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala
 95                 100                 105                 110
cag agc cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat   507
Gln Ser His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp
                115                 120                 125
gtt gat gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt   555
Val Asp Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys
            130                 135                 140
ggc ctt ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg   603
Gly Leu Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu
        145                 150                 155
tat gga aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat   651
Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr
    160                 165                 170
cca agg tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta   699
Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val
175                 180                 185                 190
gtg aac ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc   747
Val Asn Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu
                195                 200                 205
ttc aat cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa   795
Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys
            210                 215                 220
att agc cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc   843
Ile Ser Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe
        225                 230                 235
agt ttg gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac   891
Ser Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp
    240                 245                 250
tat gtc gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac   939
Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp
255                 260                 265                 270
ttt gtc ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag   987
Phe Val Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu
                275                 280                 285
aaa tca ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat   1035
Lys Ser Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn
            290                 295                 300
gaa aat gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act   1083
Glu Asn Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr
        305                 310                 315
gtg gat ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga   1131
Val Asp Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly
    320                 325                 330
gac tgc tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc   1179
Asp Cys Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala
335                 340                 345                 350
ttt gac gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg   1227
Phe Asp Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met
                355                 360                 365
aga acc aac ccc aac gcc tgagcacctc tacaaaaaat tcgcgagaca          1275
Arg Thr Asn Pro Asn Ala
            370
tggactatgg tgcagagcca gccaaccaga gtccagccac tcctgagacc atcgaccata 1335
aaccctcgac tgcctgtgtc gtccccacag ctaagagctg ggccacaggt ttgtgggcac 1395
caggacgggg acactccaga gctaaggcca cttcgctttt gtcaaaggct cctctgaatg 1455
attttgggaa atcaagaagt ttaaaatcac atactcattt tacttgaaat tatgtcacta 1515
gacaacttaa atttttgagt cttgagattg tttttctctt ttcttattaa atgatctttc 1575
tatgaaccag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                1606
<210>9
<211>1698
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(191)..(1309)
<400>9
cccggccctc cctgcacggc ctcccgtgcg cccctgtcag actgtggcgg ccggtcgcgc 60
ggtgcgctct ccctccctgc ccgcagcctg gagaggcgct tcgtgctgca cacccccgcg 120
ttcctgccgg caccgcgcct gccctctgcc gcgctccgcc ctgccgccga ccgcacgccc 180
gccgcgggac atg gca cac gca ccg gca cgc tgc ccc agc gcc cgg ggc    229
           Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly
             1                         5                  10
tcc ggg gac ggc gag atg ggc aag ccc agg aac gtg gcg ctc atc acc   277
Ser Gly Asp Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr
     15                  20                  25
ggt atc aca ggc cag gat ggt tcc tac ctg gct gag ttc ctg ctg gag   325
Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu
 30                  35                  40                  45
aaa ggc tat gag gtc cat gga att gta cgg cgg tcc agt tca ttt aat   373
Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn
                 50                  55                  60
acg ggt cga att gag cat ctg tat aag aat ccc cag gct cac att gaa   421
Thr Gly Arg Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu
             65                  70                  75
gga aac atg aag ttg cac tat ggc gat ctc act gac agt acc tgc ctt   469
Gly Asn Met Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu
         80                  85                  90
gtg aag atc att aat gaa gta aag ccc aca gag atc tac aac ctt gga   517
Val Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly
     95                 100                 105
gcc cag agc cac gtc aaa att tcc ttt gac ctc gct gag tac act gcg   565
Ala Gln Ser His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala
110                 115                 120                 125
gac gtt gac gga gtt ggc act cta cga ctt cta gat gca gtt aag act   613
Asp Val Asp Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr
                130                 135                 140
tgt ggc ctt atc aac tct gtg aag ttc tac caa gcc tca aca agt gaa   661
Cys Gly Leu Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu
            145                 150                 155
ctt tat ggg aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc acc cct ttc   709
Leu Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe
        160                 165                 170
tat ccc cgg tca ccc tat ggg gca gca aaa ctc tat gcc tat tgg att   757
Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile
    175                 180                 185
gtg gtg aac ttc cgt gag gcg tat aat ctc ttt gca gtg aac ggc att   805
Val Val Asn Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile
190                 195                 200                 205
ctc ttc aat cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttc gtt act cga   853
Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg
                210                 215                 220
aaa att agc cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt   901
Lys Ile Ser Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys
            225                 230                 235
ttc agt ttg gga aat ctg gat gcc aaa cga gat tgg ggc cat gcc aag   949
Phe Ser Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys
        240                 245                 250
gac tat gtg gag gct atg tgg ttg atg ttg cag aat gat gag ccg gag   997
Asp Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu
    255                 260                 265
gac ttc gtt ata gct act ggg gag gtc cat agt gtc cgg gaa ttt gtc   1045
Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val
270                 275                 280                 285
gag aaa tca ttc ttg cac att gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag   1093
Glu Lys Ser Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys
                290                 295                 300
aat gaa aat gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg   1141
Asn Glu Asn Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val
            305                 310                 315
act gtg gat ctc aag tac tac cgg cca act gaa gtg gac ttt ctg cag   1189
Thr Val Asp Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln
        320                 325                 330
ggc gac tgc acc aaa gcg aaa cag aag ctg aac tgg aag ccc cgg gtc   1237
Gly Asp Cys Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val
    335                 340                 345
gct ttc gat gag ctg gtg agg gag atg gtg cac gcc gac gtg gag ctc   1285
Ala Phe Asp Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu
350                 355                 360                 365
atg agg aca aac ccc aat gcc tgagcagcgc ctcggagccc ggcccgccct      1336
Met Arg Thr Asn Pro Asn Ala
                370
ccggctacaa tccccgcaga gtctccggtg cagacgcgct gcggggatgg ggagcggcgt 1396
gccaatctgc gggtcccctg cggcccctgc tgccgctgcg ctgtcccggc cgcaagagcg 1456
gggccgcccc gccgaggttt gtagcagccg ggatgtgacc ctccagggtt tgggtcgctt 1516
tgcgtttgtc gaagcctcct ctgaatggct ttgtgaaatc aagatgtttt aatcacattc 1576
actttacttg aaattatgtt gttacacaac aaattgtggg gccttcaaat tgtttttctc 1636
ttttcatatt aaaaatggtc tttctgtgaa ctagcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1696
aa                                                                1698
<210>10
<211>1529
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(62)..(1180)
<400>10
ggcccgcggc tcgttccact ccgccttcct cttggccgca cgctcacccg cctgaggcga 60
c atg gct caa gct ccc gct aag tgc ccg agc tac ccg ggc tcc ggg gat 109
  Met Ala Gln Ala Pro Ala Lys Cys Pro Ser Tyr Pro Gly Ser Gly Asp
    1                5                  10                  15
ggc gag atg ggc aag ctc agg aag gtg gct ctc atc act ggc atc acc   157
Gly Glu Met Gly Lys Leu Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
gga cag gat ggt tcg tac ttg gca gaa ttc ctg ttg gag aaa ggg tac   205
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
gag gtc cat gga ata gta cgg cga tct agt tca ttt aat aca ggt cga   253
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
att gaa cat tta tat aag aat cct cag gct cat att gaa gga aac atg   301
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
aag ttg cac tat ggt gac ctc act gac agc acc tgc cta gtg aaa atc   349
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
atc aat gaa gtc aag cct aca gag atc tat aat ctt gga gcc cag agc   397
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
cat gtc aag atc tcc ttt gac tta gct gag tac acc gca gat gtt gat   445
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
ggc gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aaa act tgt ggc ctt   493
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca aca agt gaa ctt tat gga   541
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc aca cct ttc tat ccg agg   589
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
tca ccc tat gga gca gcc aaa ctc tat gcc tat tgg att gtg gtg aat   637
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
ttc cgt gaa gct tat aat ctc ttt gca gtg aat gga att ctc ttc aat   685
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc   733
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agc ttg   781
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
gga aat ctg gat gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gta   829
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
gag gct atg tgg ctc atg ttg cag aat gat gag cca gag gac ttt gtc   877
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
ata gct act ggg gaa gtt cac agt gtc cgt gaa ttt gtt gaa aag tca   925
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
ttc atg cac atc gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat   973
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg act gtg gat   1021
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
ctg aaa tac tac cga ccg act gaa gtg gac ttt ctg cag gga gac tgc   1069
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
tcc aag gct cag cag aag cta aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac   1117
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
gag ctg gtg agg gag atg gtg cag gcc gac gtg gag ctc atg agg acc   1165
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
aac ccc aac gct tgagcccctc tgcagagact cgaggggcat ggtgacagtg       1217
Asn Pro Asn Ala
    370
cagagccagg gaaccagagt ccagtaactc ctgccaacca tggaccctcg acctcctgtg 1277
ctgtccctgt atccagagct gggccacaga ggtttgtaga gcctgggaca ggacacacca 1337
gagctaaggc cgcattgctt ttgtcaaagt ctcctcctct gactggtttc aggaaatcaa 1397
gaagtttgaa tcacatactc attttacttg aaattatgtc actagacaac ttatattttg 1457
gagtcttgag attgtttttc tcttttctta ttaaataatc tttctataac ccaaaaaaaa 1517
aaaaaaaaaa aa                                                     1529
<210>11
<211>372
<212>PRT
<213>中国仓鼠
<400>11
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
Asn Pro Asn Ala
    370
<210>12
<211>372
<212>PRT
<213>人
<400>12
Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
Asn Pro Asn Ala
    370
<210>13
<211>372
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Met Ala Gln Ala Pro Ala Lys Cys Pro Ser Tyr Pro Gly Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
Gly Glu Met Gly Lys Leu Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Ash Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                    245             250             255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355            360            365
Asn Pro Asn Ala
    370
<210>14
<211>40
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>14
gaagggaguu gaaacucuga aaaugcgggc auggacuggu              40
<210>15
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>15
gaggagaaug gcugagucuc uccgaauacc a                       31
<210>16
<211>33
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>16
ccaaagacau gcagaugaaa uucuuuugga uuu                     33
<210>17
<211>35
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>17
ucuuggaauc ucagaauugg cgcuaugcua cugga                   35
<210>18
<211>32
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>18
auacacagaa aauucacuuc ggggcgugau cc                  32
<210>19
<211>34
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>19
ucaucccagg ucuguagggu ugcuuaugaa auca                34
<210>20
<211>36
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>20
caucuacuau uuuggaggcc aaaaugccca caacca              36
<210>21
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>21
ugcacuggug gaacgccucu uugugaaggg c                   31
<210>22
<211>34
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>22
caagaagcuu ggcuucaaac auccaguuau ugga                34
<210>23
<211>35
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>23
uauggcaccc agcgaacacu caucuuggaa ucuca                35
<210>24
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>24
gaggcgaaug gcugagucuc uccgaauacc a                    31
<210>25
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>25
gaggcgaaug gccgaaucuc uccggauacc a                    31
<210>26
<211>33
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>26
ccaaagacau gcagaugaau uucuuuugga uuu                  33
<210>27
<211>35
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>27
ucuuggaauc ucagaauugg cgcuaugcua cuggu                35
<210>28
<211>32
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>28
guacacagaa aauucacuuc ggggugugau cc                   32
<210>29
<211>32
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>29
auacacagaa aauucacuuc guggagugau cc                   32
<210>30
<211>32
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>30
guacacagaa aauucacuuc ggggcgugau cc                   32
<210>31
<211>34
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>31
ucaucccagg ucugucgggu ugcuuaugaa auca                 34
<210>32
<211>34
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>32
ucaucccagg ucugucgagu ugcuuaugaa auua                 34
<210>33
<211>36
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>33
caucuacuau uuuggaggcc aaaaugccca caauca                 36
<210>34
<211>36
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>34
caucuacuau uuugggggcc agaaugccca caauca                 36
<210>35
<211>34
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>35
caagaagcuu ggcuucaaac auccagucau ugga                   34
<210>36
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>36
cauggaauug uacggcgauc caguucauu                         29
<210>37
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>37
uauaagaauc cacaggcuca uauugaagg                         29
<210>38
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>38
acaugaaguu gcacuauggu gaccucacc                    29
<210>39
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>39
gcagaguaca cugcagaugu ugauggagu                    29
<210>40
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>40
ugugaaguuc uaccaggccu caacuagug                    29
<210>41
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>41
ucaugagagu ccuagaagag gagcuaauu                    29
<210>42
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>42
augccaagga cuaugucgag gcuaugugg                    29
<210>43
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>43
ccatggaatt gtacggcgat ccagttcatt cttcctgtca aatgaactgg atcgccgtac 60
aattccatgg gtac                                                   74
<210>44
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>44
ccatggaatt gtacggcgat ccagttcatt tgacaggaag aatgaactgg atcgccgtac 60
aattccatgg agct                                                   74
<210>45
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>45
ctataagaat ccacaggctc atattgaagg cttcctgtca ccttcaatat gagcctgtgg 60
attcttatag gtac                                                   74
<210>46
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>46
ctataagaat ccacaggctc atattgaagg tgacaggaag ccttcaatat gagcctgtgg 60
attcttatag agct                                                   74
<210>47
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>47
cacatgaagt tgcactatgg tgacctcacc cttcctgtca ggtgaggtca ccatagtgca 60
acttcatgtg gtac                                                   74
<210>48
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>48
cacatgaagt tgcactatgg tgacctcacc tgacaggaag ggtgaggtca ccatagtgca 60
acttcatgtg agct                                                   74
<210>49
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>49
cgcagagtac actgcagatg ttgatggagt cttcctgtca actccatcaa catctgcagt 60
gtactctgcg gtac                                                   74
<210>50
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>50
cgcagagtac actgcagatg ttgatggagt tgacaggaag actccatcaa catctgcagt 60
gtactctgcg agct                                                   74
<210>51
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>51
ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg cttcctgtca cactagttga ggcctggtag 60
aacttcacag gtac                                                   74
<210>52
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>52
ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg tgacaggaag cactagttga ggcctggtag 60
aacttcacag agct                                                   74
<210>53
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>53
ctcatgagag tcctagaaga ggagctaatt cttcctgtca aattagctcc tcttctagga 60
ctctcatgag gtac                                                   74
<210>54
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>54
ctcatgagag tcctagaaga ggagctaatt tgacaggaag aattagctcc tcttctagga 60
ctctcatgag agct                                                   74
<210>55
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>55
catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg cttcctgtca ccacatagcc tcgacatagt 60
ccttggcatg gtac                                                   74
<210>56
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>56
catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg tgacaggaag ccacatagcc tcgacatagt 60
ccttggcatg agct                                                   74
<210>57
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>57
uauaagaauc cccaggcuca cauugaagg                                   29
<210>58
<211>29
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>58
uauaagaauc cucaggcuca uauugaagg                                   29
<210>59
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>59
cccaagct tg atatcaaggt cgggcaggaa gagggcctat                 40
<210>60
<211>52
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>60
gctctagaga tatcaaaaaa ggtaccgagc tcggtgtttc gtcctttcca ca    52
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>61
agcgcctgat gcggtatt                                          18
<210>62
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>62
ggactttcca cacctggt                                          18
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>63
gtgacgtaga aagtaataat                                        20
<210>64
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>64
catgagagtc ctagaagagg agc                                 23
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>65
agtttctgct gcgccttg                                       18
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>66
gatatcgctg cgctcgtcgt cgac                                24
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>67
caggaaggaa ggctggaaga gagc                                24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>68
gtctgaagca ttatgtgttg aagc                                24
<210>69
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>69
gtgagtacat tcattgtact gtg                                   23
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>70
ttcccagtca cgacgtt                                          17
<210>71
<211>17
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>71
caggaaacag ctatgac                                          17
<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>72
agaatggctg agtctctccg aatacc                                26
<210>73
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>73
gagttggtag ctcttgat                                         18
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>74
atacccacgc cgaaacaa                                         18
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>75
atcctcgtcc tccttactta cc                                    22
<210>76
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>76
tccagctgac caagaaatag ag                                    22
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人
<220>
<400>77
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys
  1               5                  10                  15
Pro Cys
<210>78
<211>27
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>78
ccgctcgaga gcgcctgatg cggtatt                                27
<210>79
<211>27
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>79
ccgctcgagg gactttccac acctggt                                     27
<210>80
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>80
aagcccagga aggtggcgct catcac                                      26
<210>81
<211>28
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>81
cactagttga ggcctggtag aacttcac                                    28
<210>82
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>82
ctataagaat cctcaggctc atattgaagg cttcctgtca ccttcaatat gagcctgagg 60
attcttatag gtac                                                   74
<210>83
<211>74
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>83
ctataagaat cctcaggctc atattgaagg tgacaggaag ccttcaatat gagcctgagg 60
attcttatag agct                                                   74
<210>84
<211>575
<212>PRT
<213>大鼠
<220>
<400>84
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Leu Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Lys Pro Arg Thr Asp Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570
<210>85
<211>40
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>85
ggacagaguu gaaacucuga aaaugcgggc auggacuggu                  40
<210>86
<211>40
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>86
gaagugaguu gaaaaucuga aaaugcggcc auggacuggu                  40
<210>87
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>87
gaggcgaaug gcugagucuc uacgaauacc a                               31
<210>88
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>88
ugcacuggug gaacgccucu uuaugaaggg c                               31
<210>89
<211>31
<212>RNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>89
ucaauuggug gaauuccucu uuaacaaggg c                               31
<210>90
<211>58
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>90
agaatggctg agtctctccg aataccggat ccggtattcg gagagactca gccattct  58
<210>91
<211>72
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>91
aaatccaaaa gaatttcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaaat 60
tcttttggat tt                                                     72
<210>92
<211>68
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>92
tataagaatc cacaggctca tattgaaggc ttcctgtcac cttcaatatg agcctgtgga 60
ttcttata                                                          68
<210>93
<211>68
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>93
tataagaatc ctcaggctca tattgaaggc ttcctgtcac cttcaatatg agcctgagga 60
ttcttata                                                          68
<210>94
<211>58
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>94
cgaatggccg aatctctccg gataccggat ccggtatccg gagagattcg gccattcg  58
<210>95
<211>72
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>95
aaatccaaaa gaaattcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaatt 60
tcttttggat tt                                                     72
<210>96
<211>68
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的描述：合成DNA
<400>96
tataagaatc cccaggctca cattgaaggc ttcctgtcac cttcaatgtg agcctgggga 60
ttcttata                                                          68

Claims (71)

1.一种细胞，其中导入了包括选自下列(a)或(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制酶功能的活性的RNA，所述的酶催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖脱水反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下列(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
4.根据权利要求2所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
5.一种双链RNA，其包括选自下列(a)或(b)的RNA及其互补RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制酶功能的活性的RNA，所述的酶催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应。
6.一种与权利要求5所述的RNA对应的DNA及其互补DNA。
7.一种载体，其包括与权利要求5所述的RNA对应的DNA。
8.一种细胞，其中导入了权利要求7所述的载体。
9.一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA、和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA或能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
10.一种细胞，其中导入了能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA和能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
11.根据权利要求9或10所述的细胞，其中所述的细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶是催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的细胞，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
14.根据权利要求12所述的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至(1)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ IDNO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(1)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
15.根据权利要求9-14中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)至(d)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
16.根据权利要求9-14中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
17.根据权利要求11-16中任意一项所述的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
20.根据权利要求11-19中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)至(c)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
21.根据权利要求11-19中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
22.一种DNA，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、或与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
23.一种DNA，其包括与能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA、和与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
24.根据权利要求22或23所述的DNA，其中所述的细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶是催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶。
25.根据权利要求22-24中任意一项所述的DNA，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
26.根据权利要求25所述的DNA，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自以下(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
27.根据权利要求25所述的DNA，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下面(a)至(1)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(1)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
28.根据权利要求22-27中任意一项所述的DNA，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是选自下列(a)至(d)的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
29.根据权利要求22-27中任意一项所述的DNA，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是选自下列(a)和(b)的RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
30.根据权利要求24-29中任意一项所述的DNA，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
31.根据权利要求30所述的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
32.根据权利要求30所述的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自下列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
33.根据权利要求24-32中任意一项所述的DNA，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是选自下列(a)至(c)的RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
34.根据权利要求24-32中任意一项所述的DNA，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是选自下面(a)和(b)的RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
35.一种载体，其包括权利要求22-34中任意一项所述的DNA。
36.根据权利要求35所述的载体，其包括SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ ID NO：92所示的DNA。
37.根据权利要求35所述的载体，其包括SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ ID NO：92所示的DNA。
38.根据权利要求35所述的载体，其包括SEQ ID NO：90所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA。
39.根据权利要求35所述的载体，其包括SEQ ID NO：91所示的DNA和SEQ ID NO：93所示的DNA。
40.一种细胞，其中导入了权利要求35-39中任意一项所述的载体。
41.一种细胞，其中导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体、和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体、或包括与能够抑制将细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖转运至高尔基体的相关蛋白质功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
42.一种细胞，其中导入了包括与能够抑制糖链修饰相关酶功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体、和包括与能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的功能的RNA对应的DNA及其互补DNA的载体，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
43.根据权利要求41或42所述的细胞，其中所述的能够抑制细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶蛋白质功能的RNA是能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA。
44.根据权利要求41-43中任意一项所述的细胞，其中所述的糖链修饰相关酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
45.根据权利要求44所述的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自(a)至(h)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；
(d)包括由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(g)在严格条件下与由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；
(h)在严格条件下与由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
46.根据权利要求44所述的细胞，其中所述的α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至(1)的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)由在SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)由与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(k)由与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(1)由与SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
47.根据权利要求41-46中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)至(d)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)与包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(b)与包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(c)与包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA；
(d)与包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列的DNA对应的RNA。
48.根据权利要求41-46中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制糖链修饰相关酶的功能的RNA是包括选自下列(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA，所述糖链中在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接：
(a)包括SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：14-35或85-89中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制α1，6-岩藻糖基转移酶活性功能的活性的RNA。
49.根据权利要求43-48中任意一项所述的细胞，其中所述的催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶是GDP-甘露糖4，6-脱水酶。
50.根据权利要求49所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下面(a)至(f)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的DNA；
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(e)在严格条件下与由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA；
(f)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA杂交、并编码具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质的DNA。
51.根据权利要求49所述的细胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是选自列(a)至(i)的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d)由在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(e)由在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(f)由在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(g)由与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质；
(i)由与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的同源性为80％或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白质。
52.根据权利要求43-51中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)至(c)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)与由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(b)与由SEQ ID NO：9所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA；
(c)与由SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中10至40个连续碱基的序列所示的核苷酸序列组成的DNA对应的RNA。
53.根据权利要求43-51中任意一项所述的细胞，其中所述的能够抑制催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮，6-脱氧-GDP-甘露糖的反应的酶功能的RNA是包括选自下面(a)和(b)的RNA及其互补RNA的双链RNA：
(a)包括SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO：37、57或58中任意一个所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并具有抑制GDP-甘露糖4，6-脱水酶功能的活性的RNA。
54.根据权利要求1-4、8-21和40-53中任意一项所述的细胞，其对识别如下糖链结构的凝集素有抗性：在N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键连接。
55.根据权利要求54所述的细胞，其中所述的凝集素选自下列(a)至(d)：
(a)兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(来源于兵豆的扁豆凝集素)；
(b)豌豆(P.sativum)凝集素PSA(来源于豌豆的豌豆凝集素)；
(c)蚕豆(Viciafaba)凝集素VFA(来源于蚕豆的凝集素)；
(d)橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(来源于橙黄网胞盘菌的凝集素)。
56.根据权利要求1-4、8-21和40-55中任意一项所述的细胞，其为选自酵母、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞的细胞。
57.根据权利要求56所述的细胞，其中所述的动物细胞选自下列(a)至(k)：
(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)产生抗体的杂交瘤细胞；
(g)人白血病细胞系Namalwa细胞；
(h)人白血病细胞系NM-F9细胞；
(i)人胚胎视网膜细胞系PER.C6细胞；
(i)胚胎干细胞；
(k)受精卵细胞。
58.根据权利要求1-4、8-21和40-57中任意一项所述的细胞，其包括编码糖蛋白质的基因。
59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述的糖蛋白质是抗体分子。
60.根据权利要求59所述的细胞，其中所述的抗体分子选自下列(a)至(d)：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区的融合蛋白质。
61.根据权利要求59或60所述的细胞，其中所述的抗体分子属于IgG型。
62.一种糖蛋白质组合物制造方法，其包括使用权利要求58所述的细胞。
63.一种糖蛋白质组合物制造方法，其包括将权利要求58所述的细胞在培养基中培养，以在培养物中形成并积聚糖蛋白质组合物；和从培养物中回收和纯化糖蛋白质组合物。
64.一种抗体组合物制造方法，其包括使用权利要求59-61中任意一项所述的细胞。
65.一种抗体组合物制造方法，其包括将权利要求59-61中任意一项所述的细胞在培养基中培养，以在培养物中形成和积聚抗体组合物；和从培养物中回收和纯化抗体组合物。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述的抗体组合物是依赖抗体的细胞介导细胞毒活性高于其亲代细胞产生的抗体组合物的抗体组合物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述的依赖抗体的细胞介导细胞毒活性较高的抗体组合物中，在与抗体组合物Fc区结合的全部复合型N-糖苷-连接糖链当中，岩藻糖未与糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链的比例高于其亲代细胞产生的抗体组合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述的未结合岩藻糖的糖链是在复合型N-糖苷-连接糖链中岩藻糖的1-位未与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合的糖链。
69.一种糖蛋白质组合物，其通过权利要求62或63所述的方法制造。
70.一种抗体组合物，其通过权利要求64-68中任意一项所述的方法制造。
71.一种药物，其包括权利要求69或70所述的组合物作为活性成分。
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CN116064597B (zh) * 2023-01-17 2024-04-26 北京大学 通过自主复制rna实现哺乳动物细胞中的定向进化和达尔文适应

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