JPWO2006013964A1 - 糖蛋白質組成物の製造法 - Google Patents

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本発明は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法などを提供する。

Description

本発明は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いるＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡ、並びに該ＤＮＡとその相補ＤＮＡとを含有するベクターに関する。また、本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞、並びに該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法に関する。更に、本発明はＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含有するベクターおよび該ベクターが導入された細胞、並びにＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターが導入された細胞、該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法に関する。
遺伝子工学あるいは細胞工学的な技術の急速な進歩の結果、生体内に微量にしか存在しない生理活性蛋白質を安定、かつ多量に医療の現場に供給できるようになり、多くの患者の治療が可能となった。これら蛋白質医薬品は遺伝子組換え医薬品あるいは細胞培養医薬品として製造、販売されている。これら蛋白質医薬品は、その薬理活性に糖鎖が関与しない単純蛋白質医薬品と、その薬理活性に糖鎖が重要な役割を担う糖蛋白質医薬品とに分類される。
薬理活性に、糖鎖が重要な役割を担う糖蛋白質医薬品の代表的な例としてエリスロポイエチンがあげられる。エリスロポイエチンの糖鎖構造は実に多様であるが、３本のコア構造部分にフコースが結合したＮ−グリコシド結合複合型４本鎖糖鎖および１本のＯ−グリコシド結合糖鎖を有することが知られている。エリスロポイエチンの生体内での生理活性に糖鎖構造は深く関与しており、Ｏ−グリコシド結合糖鎖を除いてもその生理活性に影響を与えないが（非特許文献１、２）、Ｎ−グリコシド結合糖鎖を除去すると薬理活性が消失する（非特許文献３）。また、Ｎ−グリコシド結合糖鎖へのシアル酸付加や分岐構造などの糖鎖構造の違いが薬理活性に影響を与える（非特許文献４、５、６）。さらに、フコース修飾された糖鎖構造を有する蛋白質は、一般に、血中半減期が短くなることが示されている（非特許文献７）。
抗体に関しても、その糖鎖構造が薬理活性に大きな影響を与えることが知られている。
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域には、２個所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合部位が存在しており、血清中のＩｇＧでは、該部位にシアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンが付加される割合が少ない、複数の分岐鎖を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端へのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性がある（非特許文献８）。抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）などの抗体のエフェクター機能には、この糖鎖構造、すなわち、抗体Ｆｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへ付加されたフコースが重要な役割を担っている（特許文献１、２、非特許文献９、１０）。
医薬への応用が考えられている糖蛋白質の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用い製造されている。しかしながら、遺伝子組換え技術を用いて作製された糖蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞によって異なるため（非特許文献１０、１１）、遺伝子組換え技術を用いて作製された糖蛋白質には、必ずしも最適な薬理活性が発揮できるような糖鎖が付加されていない。
細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用することが試みられている。しかしながら、これら阻害剤の特異性は低く、また標的とする酵素を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられている（非特許文献１２、非特許文献１３）。β１、４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示した（非特許文献１１、特許文献３）。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１、４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されているため、このような宿主細胞は抗体医薬の生産には適切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されている。糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が変化した突然変異体は、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＷｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ． ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ． ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）などのレクチンに耐性を示す株として取得されている（非特許文献１４）。このような糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質が生産されることも報告されており、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体が生産されることが報告されている（非特許文献１５）。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されているが、医薬への応用に適するようにエフェクター作用を向上させた抗体の発現には成功していない（非特許文献１５）。
このような中、最近になって、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ ｎｏｖｏ合成経路において、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤなどとも表記する）の活性が低下した株を宿主細胞として用いることで、ＡＤＣＣ活性の高い、医薬応用に適した抗体が生産できることが報告された（特許文献１、非特許文献９、非特許文献１０）。これら報告では、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を示す株、例えば、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＬＣＡ株あるいはＬｅｃ１３株が宿主細胞として用いられた。また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの活性が低下した株としては、この他にも、マウス白血病由来の細胞株ＢＷ５１４７のＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）耐性変異株として樹立されたＰＬＲ１．３が知られている（非特許文献１６）。
しかしながら、上記の株は完全な遺伝子欠損体ではないため、抗体が高いＡＤＣＣ活性を示す原因となっている糖鎖構造、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加を完全に抑制することはできない。また、ＰＬＲ１．３やＬｅｃ１３株などの変異株は、変異剤処理によりランダムに変異を導入することで取得されており、医薬品製造に用いる株としては適していない。
以上のように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素や蛋白質の活性を制御する試みがなされているが、糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。特に、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の活性が低下した細胞株が取得され、エフェクター活性の高い抗体組成物が作られるようになったとはいえ、その活性の制御は未だ不十分である。
簡便な、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素や蛋白質の活性を制御する試みの一例として、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いる、特定遺伝子の機能制御の方法が知られている（特許文献４）。また、遺伝子の機能抑制に用いるＲＮＡ分子の設計方法が報告されているが（非特許文献１７）、このような方法で設計したＲＮＡ分子が必ずしも目的遺伝子の機能を効果的に抑制できる分子とはならず（非特許文献１８）、特定遺伝子に対する効果的な機能抑制効果を示すＲＮＡ分子の設計は、試行錯誤を伴う。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いることで、産生糖蛋白質に付加する糖鎖へのフコース修飾を制御できることが示された（特許文献２、４）。この報告では、抗体分子を生産する細胞株にα１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを導入することで、産生抗体分子に付加する糖鎖のうちフコース修飾のない糖鎖の割合を高められることが示されている。
ＷＯ００／６１７３９ ＷＯ０２／３１１４０ ＷＯ９９／５４３４２ ＷＯ０３／８５１１８
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３１，９８７２，（１９９２） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６７，７７０３，（１９９２） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６５，１２１２７，（１９９０） ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），７３，８４，（１９８９）
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，７８１９（１９８９） ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），８４，３，（２００１） サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９５，１８９８，（２００２） バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，１９９７ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７７，２６７３３，（２００２）
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７８，３４６６，（２００３） グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３，（１９９５） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８（１９８９） サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８（１９９１）
ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６） ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３（１９９８） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５５，９９００（１９８０） ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），２２，３２６（２００４） カレント・オピニオン・イン・モルキュラー・セラピテクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），６，１２９（２００４）
本発明の目的は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いるＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡ、並びに該ＤＮＡとその相補ＤＮＡとを含有するベクターを提供することである。また、本発明の目的は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞、並びに該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法を提供することである。更に、本発明の目的は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含有するベクターおよび該ベクターが導入された細胞、並びにＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターが導入された細胞、該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法を提供することである。
本発明は、以下の（１）〜（７１）に関する。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入した細胞；
（ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（２）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、（１）に記載の細胞。
（３）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２）に記載の細胞；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２）に記載の細胞；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（５）以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡ。
（ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（６）（５）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡ。
（７）（５）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡを含有するベクター。
（８）（７）に記載のベクターを細胞に導入した細胞。
（９）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
（１０）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
（１１）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素である（９）または（１０）に記載の細胞。
（１２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の細胞。
（１３）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（１２）に記載の細胞；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１４）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（１２）に記載の細胞；
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（１５）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（９）〜（１４）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（１６）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（９）〜（１４）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（１７）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、（１１）〜（１６）のいずれか１項に記載の細胞。
（１８）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（１７）に記載の細胞；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１９）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（１７）に記載の細胞；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（２０）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（１１）〜（１９）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（２１）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（１１）〜（１９）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（２２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ。
（２３）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ。
（２４）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素である（２２）または（２３）に記載のＤＮＡ。
（２５）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（２２）〜（２４）のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
（２６）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２５）に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２７）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２５）に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（２８）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、（２２）〜（２７）のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（２９）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、（２２）〜（２７）のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（３０）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、（２４）〜（２９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
（３１）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（３０）に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３２）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（３０）に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（３３）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、（２４）〜（３２）のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（３４）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、（２４）〜（３２）のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（３５）（２２）〜（３４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するベクター。
（３６）配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡを含んでなる、（３５）に記載のベクター。
（３７）配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡを含んでなる、（３５）に記載のベクター。
（３８）配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡを含んでなる、（３５）に記載のベクター。
（３９）配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡを含んでなる、（３５）に記載のベクター。
（４０）（３５）〜（３９）のいずれか１項に記載のベクターを導入した細胞。
（４１）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターを導入した細胞。
（４２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターを導入した細胞。
（４３）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡがＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡである（４１）または（４２）に記載の細胞。
（４４）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（４１）〜（４３）のいずれか１項に記載の細胞。
（４５）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（４４）に記載の細胞；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４６）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（４４）に記載の細胞；
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（４７）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（４１）〜（４６）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（４８）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（４１）〜（４６）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（４９）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、（４３）〜（４８）のいずれか１項に記載の細胞。
（５０）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（４９）に記載の細胞；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５１）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（４９）に記載の細胞；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（５２）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（４３）〜（５１）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（５３）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、（４３）〜（５１）のいずれか１項に記載の細胞；
（ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（５４）細胞が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、（１）〜（４）、（８）〜（２１）および（４０）〜（５３）のいずれか１項に記載の細胞。
（５５）レクチンが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンである、（５４）に記載の細胞；
（ａ）レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）；
（ｂ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）；
（ｃ）ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）。
（５６）細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（４）、（８）〜（２１）および（４０）〜（５５）のいずれか１項に記載の細胞。
（５７）動物細胞が、以下の（ａ）〜（ｋ）からなる群から選ばれる細胞である、（５６）に記載の細胞；
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）ヒト白血病細胞株ＮＭ−Ｆ９細胞；
（ｉ）ヒト胚性網膜細胞株ＰＥＲ．Ｃ６細胞；
（ｊ）胚性幹細胞；
（ｋ）受精卵細胞。
（５８）糖蛋白質をコードする遺伝子を含む、（１）〜（４）、（８）〜（２１）および（４０）〜（５７）のいずれか１項に記載の細胞。
（５９）糖蛋白質が抗体分子である、（５８）に記載の細胞。
（６０）抗体分子が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、（５９）に記載の細胞；
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む融合蛋白質。
（６１）抗体分子のクラスがＩｇＧである、（５９）または（６０）に記載の細胞。
（６２）（５８）に記載の細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法。
（６３）（５８）に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物の製造方法。
（６４）（５９）〜（６１）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物の製造方法。
（６５）（５９）〜（６１）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取精製する工程を含む、抗体組成物の製造方法。
（６６）抗体組成物が、親株細胞が生産する抗体組成物より抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物である、（６４）または（６５）に記載の方法。
（６７）抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物より高いことを特徴とする、（６６）に記載の方法。
（６８）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（６７）に記載の方法。
（６９）（６２）または（６３）に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
（７０）（６４）〜（６８）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（７１）（６９）または（７０）に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
本発明によると、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いるＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡ、並びに該ＤＮＡとその相補ＤＮＡとを含有するベクターが提要される。また、本発明によると、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞、並びに該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法が提供される。更に、本発明によると、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含有するベクターおよび該ベクターが導入された細胞、並びにＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターが導入された細胞、該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年８月５日に出願された日本国特許出願２００４−２２８９２８号、２００４年８月３１日に出願された日本国特許出願２００４−２５２６８２号および２００５年５月９日に出願された日本国特許出願２００５−１３６４１０号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載される内容を包含する。
図１は、プラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍの構築を示した図である。 図２は、プラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍの構築を示した図である。 図３は、プラスミドｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢの構築を示した図である。 図４は、各細胞株におけるＧＭＤのｍＲＮＡ量を示した図である。横軸には、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは、ｓｉＲＮＡを導入していない親株細胞を、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ示す。
図５は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２ＡＦ株、並びにＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株である１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株の、無血清フェドバッチ培養中の生細胞密度の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度をそれぞれ示した。図中▲は３２−０５−１２ＡＦ株を、○は１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株を、●は１２−ＧＭＤＢ−５株をそれぞれ示す。 図６は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２ＡＦ株、並びにＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株である１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株の、無血清フェドバッチ培養中の、培養上清中に蓄積された抗体量の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には抗体蓄積量をそれぞれ示した。図中▲は３２−０５−１２ＡＦ株を、○は１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株を、●は１２−ＧＭＤＢ−５株をそれぞれ示す。
図７は、プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲおよびＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲの構築を示した図である。 図８は、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＢＳおよびＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＢＳの構築を示した図である。 図９は、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥおよびＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥの構築を示した図である。 図１０は、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入して得られた各細胞株、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを単独で導入して得られた各細胞株または親株細胞における、ＧＭＤのｍＲＮＡ量を示した図である。横軸には、ＧＭＤｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは、ｓｉＲＮＡを導入していない親株細胞を、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ示す。
図１１は、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入して得られた各細胞株、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを単独で導入して得られた各細胞株または親株細胞における、ＦＵＴ８のｍＲＮＡ量を示した図である。横軸には、ＦＵＴ８ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは、ｓｉＲＮＡを導入していない親株細胞を、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ示す。 図１２は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２ＡＦ株、並びにＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株であるＷｉ２３−５ＡＦ株の、無血清フェドバッチ培養中の生細胞密度の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度をそれぞれ示した。図中点線は３２−０５−１２ＡＦ株を、実線はＷｉ２３−５ＡＦ株をそれぞれ示す。
図１３は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２ＡＦ株、並びにＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株であるＷｉ２３−５ＡＦ株の、無血清フェドバッチ培養中の、培養上清中に蓄積された抗体量の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には抗体蓄積量をそれぞれ示した。図中点線は３２−０５−１２ＡＦ株を、実線はＷｉ２３−５ＡＦ株をそれぞれ示す。 図１４は、抗ＣＣＲ４キメラ抗体のフコース（−）％が分かっている標準品サンプルのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にはフコース（−）％を、縦軸にはｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示す波長４９０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ示した。 図１５は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２ＡＦ株、並びにＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株であるＷｉ２３−５ＡＦ株の、無血清フェドバッチ培養中の、培養上清に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性から算出されるフコース（−）％をそれぞれ示した図である。横軸には培養日数を、縦軸にはフコース（−）％をそれぞれ示した。図中点線は３２−０５−１２ＡＦ株を、実線はＷｉ２３−５ＡＦ株をそれぞれ示す。
図１６は、プラスミドｐＣＲ／ＧＭＤｓｈＢおよびｐＣＲ／ＧＭＤｍＢの構築を示した図である。 図１７は、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥ、ＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥ、ＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥおよびＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥの構築を示した図である。 図１８は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２株へ、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＧＭＤ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合のＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。
図１９は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株である３２−０５−１２株へ、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である３２−０５−１２株の値を１００とした場合のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。 図２０は、プラスミドｐＰＵＲ／ＧＭＤｍＢの構築を示した図である。
図２１は、ＳＰ２／０細胞由来抗ＧＭ２抗体生産株であるＫＭ９６８株へ、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＧＭＤ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株であるＫＭ９６８株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株であるＫＭ９６８株の値を１００とした場合のＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。 図２２は、ＳＰ２／０細胞由来抗ＧＭ２抗体生産株であるＫＭ９６８株へマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株であるＫＭ９６８株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株であるＫＭ９６８株の値を１００とした場合のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。
図２３は、ＮＳ０細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株であるＮＳ０／２１６０株へ、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＧＭＤ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株であるＮＳ０／２１６０株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株であるＮＳ０／２１６０株の値を１００とした場合のＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。 図２４は、ＮＳ０細胞由来抗ＣＣＲ４抗体生産株であるＮＳ０／２１６０株へ、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株における、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡの相対的発現量を示した図である。横軸には、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量のβ−アクチンｍＲＮＡに対する比率について親株であるＮＳ０／２１６０株の値を１００とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバーは親株の、白抜きのバーはＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株であるＮＳ０／２１６０株の値を１００とした場合のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値をそれぞれ示す。
本発明において、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素（以下、ＧＤＰ−フコース合成酵素とも標記する）としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含する。また、本発明のＧＤＰ−フコース合成酵素には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素なども包含される。
細胞内ＧＤＰ−フコースは、ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路あるいはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素または蛋白質はすべて、ＧＤＰ−フコース合成酵素に包含される。
ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素、ＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換する反応を触媒する酵素などがあげられる。
本発明のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素としては、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が好適に用いられる。ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ）があげられる。
本発明のＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換する反応を触媒する酵素としては、ＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−フコースに変換する反応を触媒する酵素、ＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−フコースの４位を還元する反応を触媒する酵素などがあげられ、具体的には、ＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−フコースに変換する反応を触媒する酵素活性を有し、かつ、ＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−フコースの４位を還元する反応を触媒する酵素である、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケト−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ，４−リダクターゼ）などがあげられる。
Ｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述のＧＤＰ−フコース合成酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質であればいかなる蛋白質も包含され、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
本発明のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞とは、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素（以下、「ＧＤＰ−マンノース変換酵素」とも表記する）の活性または発現を抑制するＲＮＡが導入された細胞であれば、いかなる細胞も包含される。
本発明において、ＧＤＰ−マンノース変換酵素としては、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが好適に用いられる。
本発明において、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、下記（ａ）〜（ｆ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｇ）〜（ｏ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｊ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｋ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｌ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｍ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｎ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｏ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号８〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
また、本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞に関する。
本発明のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、「α１，６−フコース修飾酵素」とも表記する）の活性または発現を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性または発現を抑制するＲＮＡが導入された細胞であれば、いかなる細胞も包含され、好ましくはα１，６−フコース修飾酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡが導入された細胞があげられ、さらに好ましくは、α１，６−フコース修飾酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡ、およびＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素（ＧＤＰ−マンノース変換酵素）の活性または発現を抑制するＲＮＡが導入された細胞があげられる。
本発明において、α１，６−フコース修飾酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。
α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｉ）〜（ｔ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｏ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｐ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｑ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｒ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｓ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｔ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
また、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１〜４のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１〜４のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１〜４のいずれかまたは８〜１０のいずれかで表れる塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ディーエヌエー・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １）：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１〜４のいずれかまたは８〜１０のいずれかで表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号５〜７および８４のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質または配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１０，６４８７（１９８２）、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、ジーン（Ｇｅｎｅ），３４，３１５（１９８５）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１３，４４３１（１９８５）、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ），８２，４８８（１９８５）などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号５〜７および８４のいずれか、または配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
本発明において、配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質とは、配列番号１１〜１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質である。
また、本発明において、配列番号５〜７および８４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、配列番号５〜７および８４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。
本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），２１５，４０３（１９９０）〕においてデフォルトパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２５，３３８９（１９９７）；ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．），７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ〕においてデフォルトパラメータを用いて算出される数値などがあげられる。
デフォルトパラメーターとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。また、アミノ酸配列の解析ソフトとしてはＦＡＳＴＡ〔メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１８３，６３（１９９０）〕などもあげられる。
本発明で用いられる細胞としては、抗体分子などの糖蛋白質を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、好ましくは、動物細胞があげられる。動物細胞の好ましい具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。
本発明の、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞、あるいはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞（以下、両者をまとめて本発明の細胞とも称す）は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する。該ＲＮＡを導入していない親株細胞は該レクチンに耐性を有さない。
したがって、本発明の細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの糖蛋白質組成物を製造することができる細胞であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞があげられ、具体的には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、ハイブリドーマ細胞、ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック非ヒト動物を製造する胚性幹細胞および受精卵細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック植物を製造する植物カルス細胞、ミエローマ細胞、トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞などがあげられる。ミエローマ細胞はハイブリドーマ細胞を製造する際に融合細胞として用いることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物に抗原を免疫し該動物の脾臓細胞などの抗体産生細胞を用いてハイブリドーマ細胞を製造することもできる。
レクチンに耐性を有する細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、親株細胞に用いる細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。親株細胞にＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した場合、あるいはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した場合のレクチンの有効濃度とは、該親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上の濃度をいう。
親株細胞とは、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入する前の細胞、あるいはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入する前の細胞をいう。
親株細胞としては、特に限定はないが、具体例として、以下に示す細胞があげられる。
ＮＳ０細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１（２００１）などの文献に記載されているＮＳ０細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳ０細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９（１９９２）などの文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１０８，９４５（１９５８）、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０，１２７５（１９６８）、ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、メソッド・イン・セル・サイエンス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ），１８，１１５（１９９６）、ラジエーション・リサーチ（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１４８，２６０（１９９７）、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７，４２１６（１９８０）、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）．６０，１２７５（１９６８）、セル（Ｃｅｌｌ），６，１２１（１９７５）、モルキュラー・セル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）などの文献に記載されているＣＨＯ細胞などがあげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），９３，５７６（１９８２）、メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），７３Ｂ，１（１９８１）などの文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
上記以外にも、本発明に用いられる親株細胞としては、ヒト白血病細胞株ＮＭ−Ｆ９細胞（ＤＳＭ ＡＣＣ２６０５、ＷＯ０５／１７１３０）またはヒト胚性網膜細胞株ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９６０２２９４０、ＵＳ６８５５５４４）、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡおよび細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡとしては、ＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコース修飾酵素のｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡおよび細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のｍＲＮＡ量または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡであればいかなるものでもよいが、ＲＮＡの長さとしては、１０〜４０、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜３０の連続したＲＮＡがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡとしては、好ましくはＧＤＰ−マンノース変換酵素のｍＲＮＡ量を減少させることが可能なＲＮＡがあげられ、具体的には、
（ａ）配列番号８で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
があげられ、より好ましくは、
（１）配列番号３７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２）配列番号３７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３）配列番号５７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４）配列番号５７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５）配列番号５８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（６）配列番号５８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡがあげられる。
上記（ａ）〜（ｃ）および（１）〜（６）のＲＮＡにおいて、（ａ）、（１）および（２）はハムスター由来の親株細胞において、（ｂ）、（３）および（４）はヒト由来の親株細胞において、（ｃ）、（５）および（６）はマウス由来の親株細胞において、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡとして使用することが好ましい。
本発明において、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡとしては、好ましくはα１，６−フコース修飾酵素のｍＲＮＡ量を減少させることができるＲＮＡがあげられ、ＲＮＡの長さとしては、１０〜４０、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜３０である。具体的には、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｇ）配列番号４で表される塩基配列中の連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
があげられ、より好ましくは、
（７）配列番号１４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（８）配列番号１４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（９）配列番号１５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（１０）配列番号１５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（１１）配列番号１６で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（１２）配列番号１６で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（１３）配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（１４）配列番号１７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（１５）配列番号１８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（１６）配列番号１８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（１７）配列番号１９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（１８）配列番号１９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（１９）配列番号２０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２０）配列番号２０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（２１）配列番号２１で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２２）配列番号２１で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（２３）配列番号２２で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２４）配列番号２２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（２５）配列番号２３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２６）配列番号２３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（２７）配列番号２４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（２８）配列番号２４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（２９）配列番号２５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（３０）配列番号２５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３１）配列番号２６で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（３２）配列番号２６で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３３）配列番号２７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（３４）配列番号２７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３５）配列番号２８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（３６）配列番号２８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３７）配列番号２９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（３８）配列番号２９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（３９）配列番号３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４０）配列番号３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（４１）配列番号３１で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４２）配列番号３１で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（４３）配列番号３２で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４４）配列番号３２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（４５）配列番号３３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４６）配列番号３３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（４７）配列番号３４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（４８）配列番号３４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（４９）配列番号３５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（５０）配列番号３５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５１）配列番号８５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（５２）配列番号８５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５３）配列番号８６で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（５４）配列番号８６で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５５）配列番号８７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（５６）配列番号８７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５７）配列番号８８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（５８）配列番号８８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（５９）配列番号８９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（６０）配列番号８９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡがあげられる。
上記の（ｄ）〜（ｇ）および（７）〜（６０）のＲＮＡにおいて、（ｄ）および（７）〜（２６）はハムスター由来の親株細胞において、（ｅ）、（１１）、（１２）、（２３）〜（２８）、（３３）〜（３９）、（４１）、（４２）、（４５）、（４６）、（５１）、（５２）、（５７）および（５８）はマウス由来の親株細胞において、（ｆ）、（７）、（８）、（１１）、（１２）、（１９）、（２０）、（２３）〜（２６）、（３３）、（３４）、（３９）〜（４２）、（４９）、（５０）、（５５）および（５６）はラット由来の親株細胞において、（ｇ）、（２３）〜（２６）、（２９）〜（３４）、（３７）、（３８）、（４３）、（４４）、（４７）、（４８）、（５３）、（５４）、（５９）および（６０）はヒト由来の親株細胞において、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡとして使用することが好ましい。
１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列とは、例えば配列番号１４〜３７、５７、５８、８５〜８９のいずれかで示される塩基配列中で１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列をいう。塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された結果生じる２本鎖ＲＮＡは、一方の鎖にのみ塩基が欠失、置換、挿入および／または付加されていてもよく、即ち、該２本鎖ＲＮＡは、本発明の効果が得られる範囲において、必ずしも完全な相補鎖でなくてもよい。
また、本発明はＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ、および該ＤＮＡを含有するベクターに関する。
本発明のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡとしては、α１，６−フコース修飾酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡであれば、いかなるＤＮＡも包含され、好ましくはα１，６−フコース修飾酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含む、ＤＮＡがあげられ、さらに好ましくは、α１，６−フコース修飾酵素の活性または発現を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、およびＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡがあげられる。
本発明のベクターは、上記の本発明のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡを含んでいればいかなるベクターでもよい。
本発明のベクターとしては、例えば、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターに、上記のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡを組み込み構築してもよい。
本発明のベクターとしては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡをそれぞれ独立したプロモーターで転写されるようにベクターに組み込み、さらに細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡをそれぞれ独立したプロモーターで転写されるように該ベクターに組み込み、一つのベクターとしても作製してもよいが、２本鎖ＲＮＡを形成させやすくするために、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカー配列で連結したＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを独立したプロモーターで転写されるようにベクターに組み込み、さらに細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカーで連結したＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカーで連結したＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを独立したプロモーターで転写されるようにベクターに組み込み、一つのベクターとして作製するのが好ましい。
また、上記の、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカー配列で連結したＤＮＡおよび細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカーで連結したＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡとをリンカーで連結したＤＮＡを一つのプロモーター下に挿入して１本の連続したＲＮＡに転写されるようにベクターに組み込んでもよい。
二つの独立したプロモーターは、同種のプロモーターでも異なる種類のプロモーターでもよく、二つの独立したプロモーターの向きは同方向でも、逆方向でもよい。本発明のベクターにおける二つの独立したプロモーターは、異なる種類のプロモーターが同方向に配置されるのが好ましい。
プロモーターとしては、親株細胞で機能することができるプロモーターであれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、動物細胞を親株細胞として用いる場合には、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩ系のプロモーターなどが用いられる。
リンカーに用いられる塩基配列としては、２本鎖ＲＮＡの形成に用いられる配列であればいかなるものでもよく、ＲＮＡとその相補鎖ＲＮＡとが２〜１０塩基程度のループを介して連結され、２本鎖ＲＮＡが形成される、ヘアピン型ｓｉＲＮＡを発現させることが可能な配列が好ましい。
α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡとしては、具体的には、配列番号９０、９１、９４および９５でそれぞれ表される塩基配列から選ばれるＤＮＡがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡとしては、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡが好ましい。ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡとしては、具体的には、配列番号９２、９３および９６でそれぞれ表される塩基配列から選ばれるＤＮＡがあげられる。
本発明のベクターとしては、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡおよび細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡにそれぞれ対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをリンカー配列で連結したＤＮＡは、導入する親株細胞の由来の動物種ごとに有効な組み合わせを選択して用いることが好ましい。具体的には、親株細胞がハムスター由来である場合には、配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡの組み合わせ、または配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡの組み合わせが好適に用いられる。
親株細胞がマウス由来である場合には、配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡの組み合わせ、または配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡの組み合わせが好適に用いられる。
親株細胞がヒト由来である場合には、配列番号９４で表されるＤＮＡおよび配列番号９６で表されるＤＮＡの組み合わせ、または配列番号９５で表されるＤＮＡおよび配列番号９６で表されるＤＮＡの組み合わせなどがあげられる。
本発明のベクターが導入された細胞も、本発明の細胞に包含される。
また、上記のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを、それぞれ独立した２種類のベクターに導入した後、これら２種類のベクターが共導入された細胞も、本発明の細胞に包含される。
本発明の細胞は、フコース修飾のない糖鎖構造を有する、生理活性の高い糖蛋白質を製造することができる。すなわち、本発明は、親株細胞が生産する糖蛋白質より生理活性の高い糖蛋白質の製造法を提供できる。
フコース修飾のない糖鎖構造を有することで高い生理活性を示す代表的な糖蛋白質としては、フコース修飾のない糖鎖構造を有することで受容体との親和性が向上する糖蛋白質、血中の半減期が向上する糖蛋白質、血中投与後の組織分布が変化する糖蛋白質、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用が向上する糖蛋白質などがあげられる。
したがって、本発明において糖蛋白質としては、親株細胞で生産した場合、その産生蛋白質の糖鎖構造にフコースの修飾がある糖蛋白質であればいかなる糖蛋白質も含有される。その具体的な例としては、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅＩ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼなどがあげられる。
フコース修飾のない糖鎖構造を有することで、その生理活性が大幅に上昇する糖蛋白質のより具体的な例としては、例えば、抗体組成物があげられる。
すなわち、本発明の細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物より、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物を生産することができる。
また、本発明の細胞は、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞よりも高い抗体組成物を生産することができる。
本発明において、抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、「Ｖ領域」と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、「Ｃ領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
Ｈ鎖はＮ末端側より抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨと表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域１（以下、ＣＨ１と表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域２（以下、ＣＨ２と表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域３（以下、ＣＨ３と表記する）の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の化学式１に示される構造式（Ｉ）のような基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
Figure 2006013964
上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１ヶ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明において、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いて製造した抗体組成物、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いて製造した抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合（以下、「本発明の糖鎖の割合」と表記する）とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
本発明の糖鎖の割合が高いほど、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が高くなる。ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、本発明の糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％の抗体組成物があげられる。
また、本発明は、親株細胞が生産する抗体組成物よりＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物の製造方法に関する。
本発明の糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い場合、親株細胞が生産する抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞などの細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞などを傷害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージなどがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほかにも、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラットなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよび抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬと表記する）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨと表記する）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、「ｈＩｇ」と表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体トランスジェニック動物あるいはヒト抗体トランスジェニック植物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体などの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギなどがあげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
抗体の断片は、上記抗体のＦｃ領域を含んだ断片いう。抗体の断片としては、上記抗体のＦｃ領域を含んだ断片であればいかなるものでもよいが、具体的には、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域を有する融合蛋白質としては、抗体のＦｃ領域を含んだ抗体あるいは抗体断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質であればいかなるものでもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞の作製
（１）ＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞の作製
本発明のＧＤＰ−マンノース変換酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞は、例えば、以下のようにして作製することができる。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したＧＤＰ−マンノース変換酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするＧＤＰ−マンノース変換酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の２．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の２．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトの該酵素のアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、ＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販の製品（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）などがあげられる。
さらに、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）などに記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクターなどいずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］などをあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］などが用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、ＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などの塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡを取得することができる。
また、ＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
取得したＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などの塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
また、上記の方法で得られるＧＤＰ−マンノース変換酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号８〜１０のいずれかに記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などのＤＮＡ合成機で化学合成することにより、ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーなどに記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、ＧＤＰ−マンノース変換酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
ＧＤＰ−マンノース変換酵素の活性が低下した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーなどに記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を測定する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法などがあげられる。
また、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法があげられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法をあげることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）などに記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、好ましくはレンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
具体的には、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地に１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の細胞を選択することができる。
ＧＤＰ−マンノース変換酵素の遺伝子のｍＲＮＡ量を抑制するためのＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０（２０００）］などの記載に従って設計することができる。
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−マンノース変換酵素の塩基配列に基づいて設計した２本鎖ＲＮＡを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
２本鎖ＲＮＡは、常法またはＲＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、ＧＤＰ−マンノース変換酵素のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの相補ＲＮＡ塩基配列のうち、１０〜４０塩基、好ましくは１０〜３０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を合成することで調製することができる。該オリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ独立に合成してもよいし、２本鎖ＲＮＡ形成に支障のないようなスペーサーヌクレオチドでつながれていてもよい。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）などがあげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などがあげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（２）α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡ、およびＧＤＰ−フコース合成酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞の作製
本発明のα１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡ、およびＧＤＰ−フコース合成酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞の作製方法を、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡ、およびＧＤＰ−フコース合成酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を例として以下に説明するが、α１，６−フコース修飾酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞も同様にして作製することができる。
α１，６−フコース修飾酵素およびＧＤＰ−フコース合成酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、α１，６−フコース修飾酵素およびＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したα１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするα１，６−フコース修飾酵素の遺伝子とＧＤＰ−フコース合成酵素の遺伝子とを有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の２．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の２．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、例えば、本項（１）に記載の方法と同様にして取得することができる。
α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素の活性が低下した細胞を選択する方法としては、上記（１）に記載の生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などが用いられる。
また、α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、上記（１）に記載の方法などが用いられる。
α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース合成酵素の遺伝子のｍＲＮＡ量を抑制するためのＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、上記（１）の記載の方法と同様にして設計することができる。
また、発現ベクターを用いず、α１，６−フコース修飾酵素の塩基配列に基づいて設計した２本鎖ＲＮＡおよびＧＤＰ−フコース合成酵素の塩基配列に基づいて設計した２本鎖ＲＮＡを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
２本鎖ＲＮＡは、上記（１）に記載の方法と同様にして調製することができる。
２．抗体組成物を例とした糖蛋白質の製造方法
抗体組成物の製造を例に、本発明の細胞を用いた糖蛋白質の製造方法を示す。
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）などに記載された方法を用い、例えば、以下のように本発明の細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
本発明において、抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した本発明の細胞であって、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができるが、好ましくは動物細胞があげられる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、上記１．に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）などをあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼなどの解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーターなどをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属などに属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓなどをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法などをあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０などをあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）の遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、ＮＭ−Ｆ９細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］などをあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）などに記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）などをあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］などをあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどをあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーターなどをあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギなどの植物細胞などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］などをあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母などの真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類などを用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３〜９に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清などを添加した培地などを用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］などを用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃などの条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニンなど、植物ホルモンを添加した培地などを用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１などに記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵などをあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーターなどが好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）などレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、など電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などをあげることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体およびＦｃ融合蛋白質の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物などの糖蛋白質についても上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、「ｈＣγ１」と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、「ｈＣκ」と表記する）などがあげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）］などがあげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］などが用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項２の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項２の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項２の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、上記１．で作製した、本発明の細胞であって、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９９８）、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］などにより測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系などを利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８（１９８８）、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などを組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２（１９８８）、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］などで測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、Ｆｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］などがあげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）などがあげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］などが用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などの塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
本項２のＢの（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］などがあげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、上記１．で作製した、本発明の細胞であって、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞などがあげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８などの薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系などを利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などを組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２、モノクローナル・アンティボディズ）などで測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、宿主細胞が抗体分子などの糖蛋白質を発現する能力を有している場合には、前記１．に記載の方法を用いて宿主細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする糖蛋白質を精製することにより、糖蛋白質を製造することができる。
３．糖蛋白質の活性評価
精製した糖蛋白質の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液投与後の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を測定する方法としては、カレント・プロトコールズ・イン・プロテイン・サイエンス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，（１９９５）、日本生化学会編 新生化学実験講座１９ 動物実験法，東京化学同人（１９９１）、日本生化学会編 新生化学実験講座８ 細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（１９９０）、日本生化学会編 新生化学実験講座９ ホルモンＩペプチドホルモン，東京化学同人（１９９１）、実験生物学講座３ アイソトープ実験法，丸善株式会社（１９８２）、モノクローナル・アンチボディーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）、酵素免疫測定法 第３版，医学書院（１９８７）、改訂版酵素抗体法，学際企画（１９８５）などに記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、精製した糖蛋白質をラジオアイソトープなどの化合物で標識し、標識した糖蛋白質の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合反応の強さを定量的に測定する方法があげられる。また、Ｂｉａｃｏｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅシリーズなどの各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１４５，２２９（１９９１）、実験医学別冊 バイオマニュアルＵＰシリーズ 蛋白質の分子間相互作用実験法，羊土社（１９９６）］。
標識した糖蛋白質を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血液投与後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検出する方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応を組み合わせた系が好ましい。
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズあるいはアンチボディエンジニアリングなどに記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］などにより測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性などを測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザルなどのヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
５．糖蛋白質の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた糖蛋白質の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、抗体組成物の場合、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析などの手法を用いて行うことができる。
以下に、抗体組成物の糖鎖の分析方法を具体的に示すが、他の糖蛋白質も同様に分析することができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸などで、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．導入したＲＮＡの副作用の解析
導入したＲＮＡは、目的とした酵素の機能を抑制する以外に相同性の高い配列を有する遺伝子の発現量や翻訳などの影響［ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），２１，６３５（２００３）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），１０１，１８９２（２００４）］が考えられるので、抗体組成物などの糖蛋白質を製造する場合には、ＲＮＡの導入による副作用で形質転換株の生育または製造する糖蛋白質の発現に影響しないことを解析する必要がある。
具体的には、抗体組成物などの糖蛋白質の発現細胞において、本発明のＲＮＡの導入していない親株細胞と導入細胞を同時に培養し、細胞の増殖曲線および糖蛋白質の発現量に変化が無く、製造された糖蛋白質の種々の性質を解析することによって、製造された糖蛋白質の糖鎖構造および糖鎖構造の違いに起因する生物活性以外に違いが無いことを確認する。
製造された糖蛋白質の糖鎖構造は上記５．の方法で解析することができる。糖蛋白質の種々の性質は、任意の公知の蛋白質の解析方法で解析することができる。蛋白質の解析方法としては、電気泳動、ゲル濾過、等電点またはアミノ酸配列解析などの物理化学的解析、製造された糖蛋白質が抗体の場合には抗原に対する結合性、製造された糖蛋白質が酵素の場合には酵素活性、並びに糖蛋白質がリガンドまたは受容体である場合にはそれぞれのリガンドまたは受容体に対する結合性などがあげられる。
７．糖蛋白質の利用
抗体組成物などの糖蛋白質は、フコース修飾のない糖鎖構造を有しており、例えば、受容体との親和性の向上、血中半減期の向上、血中投与後の組織分布の改善、または薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用の向上などの効果が期待でき高い生理活性を示す。特に、抗体組成物は、高いエフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞障害活性を有している。これら生理活性の高い糖蛋白質、あるいは高いＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウイルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，（１９９８）］、抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウイルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウイルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体［イムノロジー・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ），２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ１０抗体［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），１１３，３７４（２０００）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７９，４３８６（１９８２）］、抗ＧＤ２抗体［アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８９，４２８５（１９９２）］、抗ＣＤ５２抗体［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）］、抗ＭＡＧＥ抗体［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［モルキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ），８８，２９０９（２０００）］、抗ＦＧＦ８抗体［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８６，９９１１（１９８９）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６５，１６４５５（１９９０）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体、抗インスリン様増殖因子受容体抗体［ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．），４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＭＳＡ抗体［ジャーナル・オブ・ウロロジー（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ），１６０，２３９６（１９９８）］、抗血管内皮細胞増殖因子抗体［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），５７，４５９３（１９９７）］または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体［オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），１９，２１３８（２０００）］などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＩｇＥ抗体）、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体［イムノロジー・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ），２１，４０３（２０００）］、抗ＣＲＴＨ２抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６２，１２７８（１９９９）］、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）、抗インターロイキン６抗体［イムノロジカル・レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．），１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［モルキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［イムノロジカル・レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．），１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ），３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．），２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［モルキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），４００，７７６（１９９９）］、抗ケモカイン抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．），１７４，２４９（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１８６，１３７３（１９９７）］などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７２，１７４００（１９９７）］または抗血液凝固因子抗体［サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），１０１，１１５８（２０００）］などがあげられる。
自己免疫疾患、例えば、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体［イムノロジー・レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ），７２，６１（２０００）］、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体［イムノロジー・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ），２１，４０３（２０００）］などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体［ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ），２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），３７，３９６（１９９９）］などがあげられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所などの公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社などの民間試薬販売会社から入手することができる。
以下に、本発明のＦｃ領域融合蛋白質の具体例を述べる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患に関連する結合性蛋白質と抗体Ｆｃ領域の融合蛋白質の具体例としては、ｓＴＮＦＲＩＩとＦｃ領域との融合蛋白質であるｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（ＵＳＰ５６０５６９０）、抗原提示細胞上に発現しているＬＦＡ−３とＦｃ領域との融合蛋白質であるａｌｅｆａｃｅｐｔ（ＵＳＰ５９１４１１１）、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＣＴＬＡ−４）とＦｃ領域との融合蛋白質［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メヂスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１８１，１８６９（１９９５）］、インターロイキン−１５とＦｃ領域との融合蛋白質［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，５７４２（１９９８）］、ファクターＶＩＩとＦｃ領域との融合蛋白質［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９８，１２１８０（２００１）］、インターロイキン１０とＦｃ領域との融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，５５９０（１９９５）］、インターロイキン２とＦｃ領域との融合蛋白質［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１４６，９１５（１９９１）］、ＣＤ４０とＦｃ領域との融合蛋白質［サーグレイ（Ｓｕｒｇｅｒｙ），１３２，１４９（２００２）］、Ｆｌｔ−３（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）と抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質［アクタ・ヘマトロジー（Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏ．），９５，２１８（１９９６）］およびＯＸ４０と抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質［ジャーナル・オブ・ルーケミア・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕ．Ｂｉｏｌ．），７２，５２２（２００２）］などがあげられる。これらの他にも、各種ヒトＣＤ分子［ＣＤ２、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１３７］や接着分子［ＡＬＣＡＭ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ、ＩＣＡＭ（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３］、サイトカイン受容体（以下、受容体をＲと表記する）（インターロイキン−４Ｒ、インターロイキン−５Ｒ、インターロイキン−６Ｒ、インターロイキン−９Ｒ、インターロイキン−１０Ｒ、インターロイキン−１２Ｒ、インターロイキン−１３Ｒα１、インターロイキン−１３Ｒα２、インターロイキン−１５Ｒ、インターロイキン−２１Ｒ）、ケモカイン、細胞死誘導シグナル分子［Ｂ７−Ｈ１、ＤＲ６（Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ６）、ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ１］、共刺激分子［Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ２、ＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）］、増殖因子（ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＧＦＲ）あるいは分化誘導因子（Ｂ７−Ｈ３）、活性化因子（ＮＫＧ２Ｄ）、シグナル伝達分子（ｇｐ１３０）および該結合蛋白質の受容体やリガンドなどと抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質は多数報告されている。
抗体組成物などの糖蛋白質を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、糖蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。または、糖蛋白質を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該糖蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該糖蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該糖蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の場合、各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法などがあげられ、インビボ実験としては、マウスなどの実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験などがあげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］などに記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
ＧＭＤを標的としたｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現プラスミド導入によるレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
（１）ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットのクローニング
以下の手順で、ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを取得した（図１）。
まず、ヒトＵ６プロモーター配列［ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１４４８６］に結合する塩基配列の５’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶの認識配列を付加したフォワードプライマー（以下ｈＵ６ｐ−Ｆ−Ｈｉｎｄ３／ＥｃｏＲＶと称し、配列番号５９に示す）および、ヒトＵ６プロモーター配列に結合する塩基配列の５’末端に、制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶの認識配列、ターミネーター配列に相当する連続した６塩基のアデニン、さらに別の合成オリゴＤＮＡ挿入のための制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩの認識配列を付加したリバースプライマー（以下ｈＵ６ｐ−Ｒ−ｔｅｒｍ−Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＶと称し、配列番号６０に示す）をそれぞれ設計した。
次に、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、鋳型としてＷＯ０３／０８５１１８実施例１２記載のプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏを４０ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／ＬプライマーｈＵ６ｐ−Ｆ−Ｈｉｎｄ３／ＥｃｏＲＶ、０．４μｍｏｌ／ＬプライマーｈＵ６ｐ−Ｒ−ｔｅｒｍ−Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＶ］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと記す）を行った。ＰＣＲは、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で１５秒間、６５℃で５秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとした３０サイクルの条件で行った。
ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約３００ｂｐの特異的増幅断片を回収した。該ＤＮＡ断片をＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および１０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液に対し、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈澱により制限酵素消化したＤＮＡ断片を回収し、滅菌水２０μＬに溶解した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｇを１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で８時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水２２μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ６μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約２．９ＫｂのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片を回収した。
上記で得たＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）８μＬ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片（約２．９Ｋｂ）２μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１０μＬを混合し、１６℃で２時間反応させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドを以下ｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍと称す。
（２）ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットのｐＰＵＲへの連結
以下の手順で、本項（１）にて得たプラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍに含まれるヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを切り出し、発現ベクターｐＰＵＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）へ連結した（図２）。
まず、上記（１）で作製したプラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍ １μｇを１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約３５０ｂｐのヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを含むＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）６μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。反応後、該反応液に滅菌水５μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ３μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約４．３ＫｂのプラスミドｐＰＵＲ由来のＰｖｕＩＩ断片を回収した。
上記で得たヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを含む約３５０ｂｐのＤＮＡ断片８μＬ、プラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ｋｂのＰｖｕＩＩ断片２μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１０μＬを混合し、１６℃で３時間反応させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮＡ約０．５μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とする挿入断片の有無および挿入方向を確認した。さらに、各プラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークエンス解析のプライマーには、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６１に示す）およびｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｒ（配列番号６２に示す）を用い、挿入ＤＮＡのヒトＵ６プロモーター領域の配列がＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１４４８６の配列と一致し、ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットの増幅に用いたプライマー領域の配列および各連結部の配列に間違いが無いことを確認し、得られたプラスミドのうち、挿入したｈＵ６プロモーターの方向が、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットと同方向であるプラスミドを選択した。以下、該プラスミドをｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍと称す。
（３）標的配列の選定および合成オリゴＤＮＡの設計
以下のような、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＧＭＤ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの標的配列を含む二本鎖ＤＮＡカセットを形成する合成オリゴＤＮＡを作製した。
まず、チャイニーズハムスター由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ５２５３６４；配列番号８に示す）から、以下の条件を満たす標的配列を７箇所選定した。選定した標的配列を配列番号３６〜４２に示した。
条件１ 「ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮ」からなるコンセンサス配列を含む。ＮはＡ、Ｇ、ＵまたはＣを、ＲはＡまたはＧ、ＹはＵまたはＣをそれぞれ表す。
条件２ 条件１を満たし、３塩基以上の同一塩基の連続した配列を含まない。
条件３ 条件１〜２を満たし、ＧＣ含量がより好ましくは３５〜４５％、好ましくは４５〜５５％である。
条件４ 条件１〜３を満たした２３塩基の配列の前後に６塩基追加した２９塩基の配列が条件２を満たす。
条件５ 条件４を満たし、ＧＣ含量がより好ましくは３５〜４５％、好ましくは４５〜５５％である。
さらに、選定した標的配列について以下の手順で二本鎖ＤＮＡカセットを設計した。二本鎖ＤＮＡカセットは５’末端から順に、制限酵素ＳａｃＩ切断により生じる３’突出末端、配列番号３６〜４２に対応するセンスコードＤＮＡ、ヒトｍｉＲ−２３−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１９ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ４８０５５８）の１０塩基のループ配列、配列番号３６〜４２に対応するＤＮＡ配列に相補的なアンチセンスコードＤＮＡおよび制限酵素ＫｐｎＩ切断により生じる３’突出末端を有する。該二本鎖ＤＮＡの５’末端はリン酸化した。
配列番号３６に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ａ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４３、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ａ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号４４に、配列番号３７に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４５、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号４６に、配列番号３８に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｃ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４７、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｃ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号４８に、配列番号３９に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｄ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４９、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｄ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号５０に、配列番号４０に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｅ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号５１、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｅ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号５２に、配列番号４１に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号５３、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号５４に、配列番号４２に示す標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号５５、アンチセンス鎖（以下ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号５６にそれぞれ示した。設計した合成オリゴＤＮＡの合成は定法（モレキュラー・クローニング第２版）に従って行った。
（４）合成オリゴＤＮＡのプラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍへの挿入
本項（２）にて取得したｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍのクローニングサイトへ、本項（３）にて合成した合成オリゴＤＮＡの挿入を行った（図３）。
まず、合成オリゴＤＮＡのアニーリングを以下の手順で行った。合成オリゴＤＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖各２００ｐｍｏｌを、アニーリングバッファー［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）−５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］１０μＬに溶解し、２分間煮沸した。その後、徐冷し約３時間かけて室温まで冷却した。その後、アニーリングした合成オリゴＤＮＡを滅菌水で１５倍希釈した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍ ３μｇを１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μＬに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で４時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水１２μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ６μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約４．５ＫｂのプラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍ由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得た二本鎖合成オリゴ溶液１μＬ、プラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍ由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片１μＬ、および滅菌水８μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１０μＬを混合し、１６℃で一晩反応させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンについて、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークエンス解析の鋳型には、約１分間煮沸した後、急冷したプラスミドＤＮＡを、プライマーには、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６１）、ｈＵ６ｐ Ｔｓｐ４５Ｉ／ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６３）およびｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｒ（配列番号６２）を用い、挿入された合成オリゴＤＮＡの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ａ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ａ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＡ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｃ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｃ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＣ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｄ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｄ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＤ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｅ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｅ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＥ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｆ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＦ、合成オリゴＤＮＡ ＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｇ−ＦおよびＧＭＤ−ｄｓＲＮＡ−Ｇ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＧと称す。
２．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるレクチン耐性株の取得および培養
（１）ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるレクチン耐性株の取得
ＷＯ０３／８５１１８の参考例１に記載の方法と同様にして取得したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産株３２−０５−１２株（以下、３２−０５−１２株と記す）へ、本実施例の１．において構築したプラスミドｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＡ、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢ、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＣ、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＤ、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＥ、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＦあるいはｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＧをそれぞれ導入し、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであるレンズマメレクチン（以下、ＬＣＡと記す）耐性株を以下のようにして取得した。
各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミドの３２−０５−１２株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミド１０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により、該プラスミドが線状化されていることを確認した後、残りの反応液に対し、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを滅菌水１０μＬに溶解した。
一方、３２−０５−１２株をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０６個／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド溶液１０μＬと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入した後、細胞懸濁液を基本培地［１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＩＭＤＭと称す；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）４枚へ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１２μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を注入し、さらに７日間培養した。その後、ディッシュ１枚について、培養上清を除去し、１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を注入し、さらに６〜８日間の培養した後、出現したピューロマイシン耐性コロニー数を計数した。一方、残りのディッシュについて、培養上清を除去し、１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）および０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を含む基本培地を添加し、さらに７日間培養した。その結果、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢを導入した場合においてレクチン耐性株が取得された。
（２）レクチン耐性株の拡大培養
本項（１）でｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢ導入により得られたレクチン耐性株を以下の手順で拡大培養した。
まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コロニーを、実体顕微鏡観察下にてピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて掻き取って吸い込み、接着細胞用Ｕ底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ各クローンを播種し、１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一週間培養した。培養後、１０クローンについて、１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて拡大培養を行った。拡大培養に供した細胞株を、それぞれ１２−ＧＭＤＢ−１、１２−ＧＭＤＢ−２、１２−ＧＭＤＢ−３、１２−ＧＭＤＢ−４、１２−ＧＭＤＢ−５、１２−ＧＭＤＢ−６、１２−ＧＭＤＢ−７、１２−ＧＭＤＢ−８、１２−ＧＭＤＢ−９、１２−ＧＭＤＢ−１０と命名し、以下の３．に記載する解析に供した。尚、１２−ＧＭＤＢ−５株は、平成１６年７月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−１００５１として寄託されている。
３．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株におけるＧＭＤ ｍＲＮＡ量の定量
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
３２−０５−１２株および本実施例の２．で取得したレクチン耐性株からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製は以下の手順で行った。３２−０５−１２株は基本培地、レクチン耐性株は１２μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用６ｃｍディッシュ（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間静置培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し１０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去した。細胞をダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度１０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去した後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用しｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製を抽出した。方法は添付の説明書に従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製を４０μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成
本項（１）において得られた各々のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＮａｓｅ処理を行い、最終反応液量を４０μＬとした。さらに、該反応液を各々、滅菌水を用いて５０倍希釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
（３）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによる遺伝子転写量の定量
ＧＭＤ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、Ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて以下の手順で行った。
なお、ＧＭＤ定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例１５記載のＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを０．０５１２ｆｇ／μＬ、０．２５６ｆｇ／μＬ、１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものを、β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のβ−アクチンスタンダードプラスミドを１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬ、８００ｆｇ／μＬ、４０００ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものを使用した。また、ＰＣＲプライマーとしては、ＧＭＤの増幅には配列番号６４に示すフォワードプライマーおよび配列番号６５に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号６６に示すフォワードプライマーおよび配列番号６７に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。
Ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて、本項（２）において調製したｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ溶液あるいは各濃度の内部コントロールプラスミド溶液を各々５μＬ含む２０μＬの反応液［Ｒ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）、０．３μｍｏｌ／Ｌフォワードプライマー、０．３μｍｏｌ／Ｌリバースプライマー、２×１０−５希釈ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、１単位ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ］を調製した。調製した反応液を９６−ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ファルコン社製）の各ウェルへ分注し、Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプレートをシールした。ＰＣＲ反応および解析には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付マニュアルに従ってＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量の測定を行った。
内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。さらに、細胞株間でのβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量は均一であると考え、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を図４に示した。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入により得られた細胞株ではいずれも、親株の８％から５０％までＧＭＤ ｍＲＮＡ量が低下していることが示された。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗体組成物の生産
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物の取得
実施例１において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐株１２−ＧＭＤＢ−２株、１２−ＧＭＤＢ−５株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体を以下の手順で取得した。
３２−０５−１２株は基本培地、１２−ＧＭＤＢ−２株、および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で６日間培養後、培養上清を除去し、１０ｍＬのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）にて２回洗浄を行なった後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を２０ｍＬ注入した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。各種細胞株の培養上清から精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
２．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物の単糖組成分析
本実施例第１項で取得した、抗ＣＣＲ４キメラ抗体に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従って単糖組成分析を行なった。
Figure 2006013964
 表１に各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占めるフコースを持たない複合型糖鎖の割合を示した。ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入に供した親株３２−０５−１２株の生産する抗体組成物のフコースを持たない糖鎖の割合が３％であったのに対し、ｓｉＲＮＡ導入レクチン耐性株１２−ＧＭＤＢ−２株、１２−ＧＭＤＢ−５株が生産する抗体組成物のフコースを持たない糖鎖の割合はそれぞれ７８％、７９％であり、親株と比較してフコースを持たない糖鎖の割合が大幅に上昇していることが示された。
以上の結果より、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡの導入により、宿主細胞の生産する抗体のα１，６−フコースの含量を制御できることが示された。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清フェドバッチ培養
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清培地への馴化
ベクター導入前の親株である３２−０５−１２株、実施例１において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐株１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株の無血清培地への馴化を、以下の手順で行った。
３２−０５−１２株は基本培地を、１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って細胞を回収した。３２−０５−１２株は、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を５０μｇ／ｍＬの濃度で、３，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏ−Ｌ−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と称す）を、１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した無血清培地を用いて、それぞれ回収した細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で懸濁し、該細胞懸濁液１５ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。３〜４日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増殖可能な細胞株を取得した。以下、無血清培地へ馴化した３２−０５−１２株を３２−０５−１２ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＭＤＢ−２株を１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＭＤＢ−５株を１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦとそれぞれ称す。
２．無血清培地に馴化したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた無血清フェドバッチ培養
（１）三角フラスコ無血清フェドバッチ培養
本実施例の１．で無血清培地に馴化した３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株を用いて、以下の手順で無血清フェドバッチ培養を行った。
フェドバッチ培養には、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、３，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏ−Ｌ−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（インビトロジェン社製）を０．１％の濃度で、Ｄ（＋）−グルコース（ナカライテスク社製）を５０００ｍｇ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清フェドバッチ培養培地と称す）を、フィード用の培地としては、通常の添加濃度よりも高濃度に調製したアミノ酸（Ｌ−アラニン０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．５９３ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．６４６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．５３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５．８４ｇ／Ｌ、グリシン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．０３１ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．４６６ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２８３ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．６７１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１１３ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．７３５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．６６４ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０９１８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２８３ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２８３ｇ／Ｌ、葉酸０．０２８３ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０５０９ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２８３ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２８３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０９１８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．３１４ｇ／Ｌから構成された培地（以下、フィード培地と称す）を用いた。
３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株を、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で無血清フェドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に４０ｍＬずつ播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。培養開始後３日目、６日目、９日目、１２日目に、アミノ酸等の消費量を補う目的でフィード培地を３．３ｍＬ添加し、グルコース濃度を制御する目的で２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１４日目に培養液を２〜４ｍＬずつ採取し、本項（２）〜（４）に記載の解析に用いた。また、培養開始後１４日目にフェドバッチ培養を終了し、培養液を全量回収し、本項（４）に記載の解析に用いた。
（２）生細胞密度の測定
本項（１）で採取した培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１４日目の培養液について、生細胞密度と細胞生存率をトリパンブルー染色により測定した。３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株の培養開始後の各時点における生細胞密度の結果を図５に示した。１２−ＧＭＤＢ−２株は、３２−０５−１２ＡＦ株と比較して増殖速度が遅く、培養１４日目においても細胞生存率が高い状態が維持されていた。一方、１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株は、培養開始後の各時点における生細胞密度は３２−０５−１２株と同等であった。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡの標的配列は、細胞の増殖性には大きな影響を及ぼさない配列であることが示された。
（３）抗体濃度の定量
本項（１）で採取した培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１４日目の培養液の上清中に含まれる抗体濃度の定量を以下の手順で行った。
１ｍＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）をダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）７５０ｍＬに溶解し、５０μＬずつＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分注した。４℃にて一晩放置した後、溶液を除去し、１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００μＬずつ各ウェルへ加え、室温に約一時間放置した後、−２０℃にて保存した。抗体量測定時にプレートを室温で溶解しウェル中のＢＳＡ−ＰＢＳを除去した後に、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて希釈した培養上清溶液を５０μＬずつ各ウェルに添加した。室温にて１〜２時間放置し、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄した。洗浄液の水分を除去した後、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて２０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体として５０μＬずつ各ウェルに添加した。室温にて１〜２時間放置し、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、さらにレジン水により洗浄した。洗浄後０．１％Ｈ２Ｏ２を加えたＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬずつ各ウェルに添加し発色させた。室温で約１５分間放置し、適当な発色が得られた時点で５％ＳＤＳ溶液を５０μＬずつ各ウェルに添加し反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて波長４１５ｎｍにおける吸光度を対照として、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。各希釈試料の抗体濃度の算出は、標準抗体精製標品を用いて作製した検量線シグモイドカーブの直線領域を使用して行った。得られた希釈試料の抗体濃度に希釈率を乗じて、培養上清の抗体濃度をそれぞれ算出した。３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株の培養開始後の各時点における培養上清中の抗体濃度の定量結果を図６に示した。３２−０５−１２ＡＦ株と１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株は、培養開始後の各時点における培養上清中の抗体組成物濃度は同等であった。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡの標的配列は、細胞の抗体生産性には影響を及ぼさない配列であることが示された。
（４）抗体組成物の糖鎖構造解析
本項（１）で採取した３２−０５−１２ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養１４日目の培養上清、および、１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養６日目、１２日目、１４日目の培養上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物をそれぞれ精製した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。それぞれの無血清馴化株の培養上清から得られた各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７（１９８３）］に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。各抗体組成物の単糖組成比より計算される、全複合糖鎖に占めるフコースを持たない複合型糖鎖の割合（以下、フコース（−）％などと称す）を表２に示した。
Figure 2006013964
 培養終了時である培養１４日目において、３２−０５−１２ＡＦ株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が７％であったのに対し、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株である１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は８１〜８５％であった。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株は、無血清フェドバッチ培養においても、親株と比較してフコース（−）％の高い抗体組成物の生産が可能であることが示された。また、培養６日目、１２日目、１４日目における１２−ＧＭＤＢ−２ＡＦ株および１２−ＧＭＤＢ−５ＡＦ株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は、ほぼ一定の値を示した。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドの導入による抗体組成物の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果は、無血清フェドバッチ培養の過程において安定であることが示された。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーを用いたレクチン耐性株取得に有効なｓｉＲＮＡ標的配列の探索およびＦＵＴ８を標的とした有効ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
１．α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲの作製
（１）ＣＨＯ細胞由来α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ｃＤＮＡ配列の取得
ＷＯ００／６１７３９の記載に従って、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調製した一本鎖ｃＤＮＡより、以下の手順でチャイニーズハムスター由来α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）をコードするｃＤＮＡをクローニングした。
まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ塩基配列［ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２５１９８］より、５’側非翻訳領域に特異的なフォワードプライマー（配列番号６８に示す）および３’側非翻訳領域に特異的なリバースプライマー（配列番号６９に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡ１μＬを含む２５μＬの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記特異的プライマー（配列番号６８および配列番号６９）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルを行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。
ＰＣＲ後、該反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約２Ｋｂを回収した。該ＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）用いて、添付の説明書に従ってプラスミドｐＣＲ２．１と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた８クローンから、公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７を用いて解析した。本法により、全てのプラスミドに挿入されていたｃＤＮＡが、チャイニーズハムスターのＦＵＴ８のＯＲＦ全長をコードするｃＤＮＡであることを確認した。配列を決定したプラスミドＤＮＡの挿入ｃＤＮＡうち、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。このようにして決定したチャイニーズハムスターのＦＵＴ８ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した。
（２）ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーの調製
本項（１）で取得したＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１を用いて、ＷＯ０３／４６１８６実施例１３に記載の方法に基づき、ＦＵＴ８を標的としたヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター型ｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーを作製した。尚、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの間のＬｏｏｐ配列としては制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を用い、ｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をベクターとして用いた。以下、作製したライブラリーをＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂと称す。
ｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂを増幅し、プラスミドベクターを調製した。滅菌シャーレ［２４３ｍｍ×２４３ｍｍ×１８ｍｍ（Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ社製）］を用いて１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を作製し、そこに、シャーレ１枚当たり５０μＬのＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂのグリセロールストックを播種した。３７℃にて一晩静置培養した後、プレート上の菌体を滅菌水に懸濁して回収し、公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを回収した。以下、回収したプラスミドをＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲと称す。
２．α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を標的としたｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを導入したレクチン耐性株の取得
本実施例の１．で得たＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ライブラリープラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを、３２−０５−１２株へ導入し、α１，６−フコースを特異的に認識するレクチンであるＬＣＡに耐性を有する株を、以下のようにして取得した。
本実施例の１．で得たプラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した１０μｇのプラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを１．６×１０６個の３２−０５−１２株へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］で導入した後、基本培地［１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）３枚へ８ｍＬずつ播種した。この時、同一の条件で１０回の遺伝子導入を行い、合計３０枚の培養用１０ｃｍディッシュにおいて培養を行った。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で、およびＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換し、さらに６〜８日間の培養を行い、レクチン耐性クローンを取得した。
３．α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドの標的配列の解析
（１）レクチン耐性株ゲノムＤＮＡ上のｓｉＲＮＡ発現カセットの単離
本実施例の２．で得られたレクチン耐性株に対し、以下のようにしてゲノムＤＮＡよりｓｉＲＮＡ発現カセットの単離を行った（図７）。
レクチン耐性クローンを、公知の方法［Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ採取し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２枚の接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。このうち１枚のプレートをレプリカプレートとする一方、残りの１枚のプレートをマスタープレートとして凍結保存に供した。レプリカプレートは、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々３０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ］に一晩溶解した後、０．０５μｇ／μＬの濃度となるように滅菌水で希釈した。
また、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲの、ｓｉＲＮＡ発現カセットのｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター領域の上流に結合するフォワードプライマー（配列番号７０）およびｓｉＲＮＡ発現カセットのターミネーター配列の下流に結合するリバースプライマー（配列番号７１）を各々設計した。
ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、上記で調製した各クローンのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、各クローンについて、上記のゲノムＤＮＡ溶液を５μＬ含む５０μＬの反応液［ＫＯＤ Ｂｕｆｆｅｒ１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（配列番号７０および配列番号７１）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９７℃で１０秒間、６８℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ｓｉＲＮＡ発現カセットを含む領域の増幅断片約３００ｂｐを回収した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）２μｇを制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約４．３ＫｂのＤＮＡ消化断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ増幅断片（約３００ｂｐ）をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ由来のＰｖｕＩＩ断片と、連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
（２）ｓｉＲＮＡ発現ユニットに含まれる標的配列の解析
本項（１）で得られたプラスミド中のｓｉＲＮＡ発現カセットに含まれるＦＵＴ８に対する標的配列の解析を行った。
まず、本項（１）で得た各プラスミドＤＮＡに挿入されたｓｉＲＮＡ発現カセットの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７を用いて解析した。決定した１５９クローンの塩基配列のうち、ＦＵＴ８に対する標的配列について、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）との相同性を比較し、各標的配列の配列番号１に対応する開始点および終止点を表３に示した。
Figure 2006013964
Figure 2006013964
１５９クローンの標的配列のうち、代表的であった標的部位に対応するＲＮＡ配列を配列番号１４〜２３に示した。
（３）ｓｉＲＮＡ発現ユニットに含まれる標的配列のマウス、ラットおよびヒトのホモログ配列の検索
本項（２）で得られた配列番号１４〜２３で示される標的配列に相当する配列をマウス、ラットおよびヒトのＦＵＴ８の配列中から、以下のようにして検索した。
配列番号２はマウスのＦＵＴ８を、配列番号３はラットのＦＵＴ８を、配列番号４はヒトのＦＵＴ８の配列をそれぞれ示す。該配列中より、本項（２）で得られた配列番号１４〜２３で示される標的配列に相当する配列を検索した。このとき、完全に一致する配列を除外した。
以下に、選択した配列の配列番号をそれぞれ示す。配列番号１４に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号８５、配列番号１４に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号８６、配列番号１５に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号２４、配列番号１５に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２５、配列番号１５に対応するラットＦＵＴ８の配列は配列番号８７、配列番号１６に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２６、配列番号１７に対応するヒト、マウスおよびラットＦＵＴ８の配列は配列番号２７、配列番号１８に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号２８、配列番号１８に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２９、配列番号１８に対応するラットＦＵＴ８の配列は配列番号３０、配列番号１９に対応するマウスおよびラットＦＵＴ８の配列は配列番号３１、配列番号１９に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号３２、配列番号２０に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号３３、配列番号２０に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号３４、配列番号２１に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号８８、配列番号２１に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号８９、配列番号２２に対応するラットＦＵＴ８の配列は配列番号３５にそれぞれ示した。
４．α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を標的とした有効ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
本実施例の３．で得られたＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの標的部位のうち、配列番号１５あるいは配列番号１６に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現ベクターを以下の手順で構築した（図７、図８および図９）。
本実施例の３．（１）で得たｓｉＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドのうち、表１に示すクローン番号３１に相当する配列番号１５に含まれる標的配列である配列番号７２で示されるＤＮＡ配列をセンスコードＤＮＡとして、配列番号７２で示されるＤＮＡ配列に相補的な塩基配列をアンチセンスコードＤＮＡとして含むプラスミド（以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲと称す）、および、表３に示すクローン番号７２に相当する配列番号１６に対応するＤＮＡ配列をセンスコードＤＮＡとして、配列番号１６に対応するＤＮＡ配列に相補的な塩基配列をアンチセンスコードＤＮＡとして含むプラスミド（以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲと称す）を選択した（図７）。
まず、プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲあるいはＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ １μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約２５０ｂｐのヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター−ショートヘアピン型ＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットを含むＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。反応後、該反応液に滅菌水１３μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約２．９ＫｂのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を回収した。
上記で得たＤＮＡ ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（約２５０ｂｐ）８μＬ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（約２．９Ｋｂ）２μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１０μＬを混合し、１６℃で２時間反応した。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（インビトロジェン社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドのうち、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＰＵＲ由来の約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを以下ＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＢＳ、プラスミドＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ由来の約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを以下ＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＢＳとそれぞれ称す。
プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＢＳあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＢＳ １μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて２５℃で５時間消化反応を行った後、６５℃、２０分間の加熱による制限酵素ＳｍａＩの不活化処理を行った。該反応液に滅菌水１４．６μＬ、１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４μＬ、１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）０．４μＬ、１０単位の制限酵素Ｘｈ ｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）をそれぞれ加えて３７℃で一晩消化反応を行った後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約２５０ｂｐのヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター−ショートヘアピン型ＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットを含むＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＡＧＥ２４９ １μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＮａｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で６時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水２２μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ６μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約４．４ＫｂのプラスミドｐＡＧＥ２４９由来のＮａｅＩ−ＸｈｏＩ断片を回収した。尚、ｐＡＧＥ２４９は、ｐＡＧＥ２４８［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）］の誘導体であり、ｐＡＧＥ２４８よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）発現ユニットを含む、制限酵素ＳｐｈＩで切り出される、２．７Ｋｂの断片を除去したベクターである。
上記で得た約２５０ｂｐのＤＮＡ断片１０μＬ、プラスミドｐＡＧＥ２４９由来の約４．４ＫｂのＮａｅＩ−ＸｈｏＩ断片５μＬおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１５μＬを混合し、１６℃で一晩反応した。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（インビトロジェン社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークエンス解析のプライマーには、ｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑ ＦＷ（配列番号７３）およびｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑ ＲＶ（配列番号７４）を用い、挿入ＤＮＡの配列が、プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲあるいはプラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲに含まれるヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター−ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットであるＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片に相当する配列と矛盾しないことを確認した。本プラスミドのうち、プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲ由来の約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを以下ＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥ、プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ＰＵＲ由来の約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを以下ＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥとそれぞれ称す。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入レクチン耐性株へのＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド共導入によるＬ−フコース存在条件下レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株へのＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるＬ−フコース存在下におけるレクチン耐性株の取得および培養
（１）ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるＬ−フコース存在下におけるレクチン耐性株の取得
実施例１において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクター導入レクチン耐性株１２−ＧＭＤＢ−２株または１２−ＧＭＤＢ−５株へ、実施例２において構築したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥを導入し、Ｌ−フコース添加培養条件におけるレクチン耐性株を取得した。
プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥの１２−ＧＭＤＢ−２株あるいは１２−ＧＭＤＢ−５株への遺伝子導入は上記実施例１の２．（１）と同様に行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液を１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）４枚へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ含む基本培地を注入し、さらに８日間培養した。その後、ディッシュ１枚について、培養上清を除去し、４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を注入し、さらに６〜８日間の培養した後、出現したハイグロマイシン耐性コロニー数を計数した。一方、残りのディッシュについて、培養上清を除去し、４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（和光純薬社製）、３μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１００μｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−フコース（ナカライテスク社製）および０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）をそれぞれ含む基本培地を注入し、さらに９日間培養し、１００μｍｏｌ／ＬのＬ−フコース存在下でのレクチン耐性クローン、即ちＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクター共導入レクチン耐性株を取得した。
（２）レクチン耐性株の拡大培養
本項（１）で取得したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクター共導入レクチン耐性株を、以下の手順で拡大培養した。
まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コロニーを、実体顕微鏡観察下にてピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて掻き取って吸い込み、接着細胞用Ｕ底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ各クローンを播種し、４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養した。培養後、培養上清を除去し、４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）、３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１００μｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−フコース（ナカライテスク社）および０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を含む基本培地を用いて、さらに６日間培養した。培養後、上記プレートの各クローンについて、４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて拡大培養を行った。以下、拡大培養を行った細胞株のうち、１２−ＧＭＤＢ−２株へＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株を１２−ＧＢ２／ＦＢ−１、１２−ＧＢ２／ＦＢ−２、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３、１２−ＧＢ２／ＦＢ−４、１２−ＧＢ２／ＦＢ−５と、１２−ＧＭＤＢ−２株へＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株を１２−ＧＢ２／Ｆ３−１、１２−ＧＢ２／Ｆ３−２、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３、１２−ＧＢ２／Ｆ３−４、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５と、１２−ＧＭＤＢ−５株へＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株を１２−ＧＢ５／ＦＢ−１、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２、１２−ＧＢ５／ＦＢ−３、１２−ＧＢ５／ＦＢ−４、１２−ＧＢ５／ＦＢ−５と、１２−ＧＭＤＢ−５株へＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株を１２−ＧＢ５／Ｆ３−１、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２、１２−ＧＢ５／Ｆ３−３、１２−ＧＢ５／Ｆ３−４、１２−ＧＢ５／Ｆ３−５とそれぞれ称す。尚、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株は、平成１６年７月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株はＦＥＲＭ ＢＰ−１００４９として、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株はＦＥＲＭ ＢＰ−１００５０として、それぞれ寄託されている。
２．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したＬ−フコース存在下レクチン耐性株におけるＧＭＤおよびＦＵＴ８ｍＲＮＡ量の定量
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ベクター導入前の親株である３２−０５−１２株、実施例１で取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株である１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株、並びに本実施例の１．で取得したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを共導入したレクチン耐性株からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製は以下の手順で行った。
３２−０５−１２株は基本培地を、１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を、ＧＭＤおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株は４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用６ｃｍディッシュ（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心分離を行って細胞を回収した。回収した細胞をダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度１０００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用しｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。方法は添付の説明書に従い、調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを４０μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成
本項（１）において得られた各々のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＮａｓｅ処理を行い、最終反応液量を４０μＬとした。さらに、該反応液を各々、滅菌水を用いて５０倍に希釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
（３）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子転写量の定量
ＧＭＤ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、以下の手順で行った。なお、ＧＭＤ定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例１５記載のＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを０．０５１２ｆｇ／μＬ、０．２５６ｆｇ／μＬ、１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものを、β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のβ−アクチンスタンダードプラスミドを１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬ、８００ｆｇ／μＬ、４０００ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものをそれぞれ使用した。また、ＰＣＲプライマーとしては、ＧＭＤの増幅には配列番号６４に示すフォワードプライマーおよび配列番号６５に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号６６に示すフォワードプライマーおよび配列番号６７に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。
Ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて、本項（２）において調製したｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ溶液あるいは各濃度の内部コントロールプラスミド溶液を各々５μＬ含む２０μＬの反応液［Ｒ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）、０．３μｍｏｌ／Ｌフォワードプライマー、０．３μｍｏｌ／Ｌリバースプライマー、２×１０−５希釈ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、１単位ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ］を調製した。調製した反応液を９６−ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ファルコン社製）の各ウェルへ分注し、Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプレートをシールした。ＰＣＲ反応および解析には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付マニュアルに従ってＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量の測定を行った。
内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。さらに、細胞株間でのβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量は均一であると考え、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を図１０に示した。親株である３２−０５−１２株のＧＭＤ ｍＲＮＡ量と比較して、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの共導入により得られた細胞株ではいずれも、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量が約１０％に低下していた。
（４）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、以下の手順で行った。なお、ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のＦＵＴ８スタンダードプラスミドを０．０５１２ｆｇ／μＬ、０．２５６ｆｇ／μＬ、１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものを、β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のβ−アクチンスタンダードプラスミドを１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬ、８００ｆｇ／μＬ、４０００ｆｇ／μＬの濃度にそれぞれ希釈したものそれぞれを使用した。また、ＰＣＲプライマーとしては、ＦＵＴ８の増幅には配列番号７５に示すフォワードプライマーおよび配列番号７６に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号６６に示すフォワードプライマーおよび配列番号６７に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。
Ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて、本項（２）において調製したｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ溶液あるいは各濃度の内部コントロールプラスミド溶液を各々５μＬ含む２０μＬの反応液［Ｒ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）、０．３μｍｏｌ／Ｌフォワードプライマー、０．３μｍｏｌ／Ｌリバースプライマー、２×１０−５希釈ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、１単位ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ］を調製した。調製した反応液を９６−ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ファルコン社製）の各ウェルへ分注し、Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプレートをシールした。ＰＣＲ反応および解析には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付マニュアルに従ってＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量の測定を行った。
内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。さらに、細胞株間でのβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量は均一であると考え、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を図１１に示した。親株である３２−０５−１２株のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量と比較して、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの共導入により得られた細胞株ではいずれも、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量が約１０％低下していた。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗体組成物の生産
１．Ｌ−フコース非添加培養下での抗体組成物の取得
ベクター導入前の親株である３２−０５−１２株、実施例１において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐株１２−ＧＭＤＢ−２株、１２−ＧＭＤＢ−５株、並びに実施例３において取得したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを共導入したレクチン耐株１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を以下の手順で取得した。
３２−０５−１２株は基本培地を、１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を、１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株は４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で６日間培養後、培養上清を除去し、１０ｍＬのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で洗浄を行った後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を２０ｍＬ注入した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を精製した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
２．Ｌ−フコース添加培養下での抗体組成物の取得
ベクター導入前の親株である３２−０５−１２株、実施例１において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐株１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株、並びに実施例３において取得したＧＭＤおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐株１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株が、Ｌ−フコース添加培養条件において生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を以下の手順で取得した。
３２−０５−１２株は基本培地を、１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株は１２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を、１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株は４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養後、培養上清を除去し、３２−０５−１２株は５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−フコース（ナカライテスク社製）を添加した基本培地に、１２−ＧＭＤＢ−２株、および１２−ＧＭＤＢ−５株は５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−フコース（ナカライテスク社製）および１２μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地に、１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株は５００μｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−フコース（ナカライテスク社製）、４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地にそれぞれ交換した。さらに５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養後、培養上清を除去し、１０ｍＬのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で洗浄を行った後、５００μｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−フコース（ナカライテスク社製）を添加したＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を２０ｍＬ注入した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養後、各フラスコに１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−フコース（ナカライテスク社製）を１ｍＬ添加し、さらに４日間培養した。培養後、培養上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体をそれぞれ精製した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
３．抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の１．および２．で取得した、各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース（−）％を表４に示した。
Figure 2006013964
 Ｌ−フコース非添加培養下では、ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入に供した親株３２−０５−１２株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が３％であったのに対し、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ導入レクチン耐性株１２−ＧＭＤＢ−２株、１２−ＧＭＤＢ−５株が生産する抗体組成物のフコース（−）％はそれぞれ７８％、７９％であり、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡを導入することにより、親株細胞が生産する抗体組成物のフコース（−）％と比較してフコース（−）％が上昇している。さらに、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの共導入レクチン耐性株１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株では、これらの細胞が生産する抗体組成物のフコース（−）％はそれぞれ９１％から９８％であり、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡを単独で導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％と比較して、フコース（−）％はさらに上昇していた。
また、Ｌ−フコース添加培養下では、ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入に供した親株３２−０５−１２株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が６％であったのに対して、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ導入レクチン耐性株１２−ＧＭＤＢ−２株および１２−ＧＭＤＢ−５株が生産する抗体組成物のフコース（−）％はそれぞれ６％、８％であった。一方、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの共導入レクチン耐性株１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株では、これらの細胞が生産する抗体組成物のフコース（−）％はそれぞれ６６％から８１％の間の値であり、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡを単独で導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％と比較して、フコース（−）％は大幅に上昇していた。
従って、Ｌ−フコース非添加あるいは添加培養下のいずれの場合においても、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡを共導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡを単独で導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％よりも高かったことから、Ｌ−フコースの存在有無に因らず、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ単独の導入による細胞の生産する抗体の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果よりも、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの共導入による細胞の生産する抗体組成物の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果の方が高いことが示された。
また、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡを共導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％が、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡによるフコース（−）％の上昇効果が消失するＬ−フコース添加培養下より、Ｌ−フコース非添加培養下の方が高かったことから、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ単独の導入による細胞の生産する抗体の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果よりも、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの共導入による細胞の生産する抗体組成物の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果の方が高いことが示された。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清フェドバッチ培養
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清培地への馴化
ベクター導入前の親株である３２−０５−１２株、実施例３において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐株１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株の無血清培地への馴化を、以下の手順で行った。
３２−０５−１２株は基本培地を、１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株は４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って細胞を回収した。３２−０５−１２株は、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を５０μｇ／ｍＬの濃度で、３，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏ−Ｌ−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と称す）を、１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株、１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株、１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株、１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株および１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株は４００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および３μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した無血清培地を用いて、それぞれ回収した細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で懸濁し、該細胞懸濁液１５ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。３〜４日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増殖可能な細胞株を取得した。以下、無血清培地へ馴化した３２−０５−１２株を３２−０５−１２ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ２／ＦＢ−１株をＷｉ２Ｂ−１ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ２／ＦＢ−３株をＷｉ２Ｂ−３ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ２／Ｆ３−３株をＷｉ２３−３ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ２／Ｆ３−５株をＷｉ２３−５ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ５／ＦＢ−１株をＷｉ５Ｂ−１ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ５／ＦＢ−２株をＷｉ５Ｂ−２ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ＧＢ５／Ｆ３−２株をＷｉ５３−２ＡＦ、１２−ＧＢ５／Ｆ３−４株をＷｉ５３−４ＡＦとそれぞれ称す。
２．無血清培地に馴化したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた無血清フェドバッチ培養
本実施例の１．で無血清培地に馴化した３２−０５−１２ＡＦ株、Ｗｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株、およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株を用いて、以下の手順で無血清フェドバッチ培養を行った。
フェドバッチ培養には、無血清フェドバッチ培養培地およびフィード培地を用いた。
３２−０５−１２ＡＦ株、Ｗｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株、およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株を、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で無血清フェドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に４０ｍＬずつ播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。培養開始後３日目、６日目、９日目、１２日目に、アミノ酸等の消費量を補う目的でフィード培地を３．３ｍＬ添加し、グルコース濃度を制御する目的で２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１４日目に培養液を２〜４ｍＬ採取し、生細胞密度と細胞生存率をトリパンブルー染色により、各培養上清中に含まれる抗体濃度を本実施例の３．（１）に記載のＥＬＩＳＡによる抗体濃度の定量法によりそれぞれ測定した。３２−０５−１２ＡＦ株およびＷｉ２３−５ＡＦ株についての培養開始後の各時点における生細胞密度および培養上清中の抗体組成物濃度の結果を図１２および図１３にそれぞれ示した。３２−０５−１２ＡＦ株とＷｉ２３−５ＡＦ株は、培養開始後の各時点の生細胞密度、および培養上清中の抗体組成物濃度はそれぞれ同等であった。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの標的配列は、細胞の増殖性や抗体の生産性には大きな影響を及ぼさない配列であることが示された。
３．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を指標とした、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖を持つ抗体の定量
本実施例の２．で取得した３２−０５−１２ＡＦ株、Ｗｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養上清中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物のフコース（−）％を、ＷＯ０３／８５１１９の実施例１０に記載の可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａと表記）に対する結合活性を指標として、以下の手順で測定した。
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の定量
培養上清中の抗体濃度の定量は、上記実施例３の２．（３）と同様にして行った。
各希釈試料の抗体濃度の算出は、標準抗体精製標品を用いて作製した検量線シグモイドカーブの直線領域を使用して行い、得られた希釈試料の抗体濃度に希釈率を乗じて、培養上清の抗体濃度をそれぞれ算出した。
（２）フコース（−）％の異なる標準品の調製
ＷＯ０３／８５１１９の実施例４に記載の、ＹＢ２／０細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＫＭ３０６０を用い、フコース（−）％が異なる標準品を調製した。ＫＭ２７６０−１、ＫＭ３０６０、並びにＫＭ２７６０−１とＫＭ３０６０を混合して調製した９サンプルの標準品の計１１サンプルの標準品について、実施例４の３．に記載の単糖組成分析によりフコース（−）％を測定したところ、ＫＭ２７６０−１は９０％、ＫＭ３０６０は１０％であり、並びに調製した９サンプルの標準品はそれぞれ８２％、７４％、６６％、５８％、５０％、４２％、３４％、２６％、１８％であった。
（３）抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の評価
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応する配列番号７７で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドのＢＳＡコンジュゲートはＷＯ０３／８５１１９の実施例４の２．に記載の方法と同様にして作製した。
作製したヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドのＢＳＡコンジュゲートを、１μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、本項（１）に記載のＥＬＩＳＡで測定した抗体濃度をもとに２．５μｇ／ｍＬとなるようにＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体サンプルを５０μＬ／ウェルでそれぞれ添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて０．１μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識マウス抗体Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、本項（２）と同様にしてＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで分注、発色させ、マイクロプレートリーダーを用いて波長４１５ｎｍにおける吸光度を対照として、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
図１４に、本項（２）で調製した、フコース（−）％が分かっている各抗ＣＣＲ４キメラ抗体の標準品のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性をそれぞれ示した。フコース（−）％に比例してｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性は上昇しており、これに基づいて検量線が得られた。尚、各測定に際し、検量線は９６ウェルＥＬＩＳＡプレートごとに作製した。
本実施例の２．で採取した無血清フェドバッチ培養上清中に含まれる各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示す波長４９０ｎｍにおける吸光度から、各培養上清中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物のフコース（−）％を、検量線を用いて求めた。３２−０５−１２ＡＦ株およびＷｉ２３−５ＡＦ株についての結果を図１５に示した。
３２−０５−１２ＡＦ株の培養上清中に含まれる抗体組成物は、培養期間を通じてｓｈＦｃγＲＩＩＩａへの結合活性は低く、そのフコース（−）％は約１０％であった。一方、Ｗｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株の培養上清中に含まれる抗体組成物は、培養期間を通じてｓｈＦｃγＲＩＩＩａへの強い結合活性を示し、そのフコース（−）％は７５〜９０％以上であった。従って、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの標的配列は、細胞の増殖性や抗体の生産性には影響を及ぼすことなく、安定してフコース（−）％の高い抗体組成物の生産が可能な配列であることが示された。
４．無血清フェドバッチ培養終了時の産生抗体組成物の糖鎖構造解析
（１）無血清フェドバッチ培養終了時の精製抗体の取得
本実施例の２．で採取した３２−０５−１２ＡＦ株、Ｗｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養１４日目の培養上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物をそれぞれ精製した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
（２）抗体組成物の単糖組成分析
本項（１）で取得した、それぞれの無血清馴化株の培養上清から得られた各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース（−）％を表５に示した。
Figure 2006013964
 ３２−０５−１２ＡＦ株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が７％であったのに対し、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを共導入したレクチン耐性株であるＷｉ２３−３ＡＦ株、Ｗｉ２３−５ＡＦ株およびＷｉ５Ｂ−１ＡＦ株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は８０〜９０％程度であり、親株と比較して、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを共導入したレクチン耐性株では、抗体組成物の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する状態が培養終了時にも維持されていることが示された。
ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗体組成物の生産
１．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの構築
（１）ヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ユニットの取得
実施例１の１．において構築したｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢを用いて、以下の手順で、ヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを取得した（図１６）。
まず、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢのヒトＵ６プロモーター配列の上流に結合する配列に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加させたフォワードプライマーＰＵＲ−ＦＷ−ＸｈｏＩ（配列番号７８）およびｓｉＲＮＡ発現カセットのターミネーター配列の下流に結合するリバースプライマーＰＵＲ−ＲＶ−ＸｈｏＩ（配列番号７９）を各々設計した。
ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢを１０ｎｇ含む２０μＬの反応液［ＫＯＤ Ｂｕｆｆｅｒ１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（配列番号７８および配列番号７９）、１Ｕ ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］を調製し、９８℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で５秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを含む領域の増幅断片約６００ｂｐを回収した。
上記で得られたＰＣＲ増幅断片（約６００ｂｐ）をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）と、連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた複数のカナマイシン耐性コロニーよりＱＩＡ ｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。以下、本プラスミドをｐＣＲ／ＧＭＤｓｈＢと称す。
（２）ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの構築
本項（１）で構築したプラスミドｐＣＲ／ＧＭＤｓｈＢおよび実施例４の４．において構築したプラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥを用いて、以下の手順で、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを構築した（図１７）。
まず、プラスミドｐＣＲ／ＧＭＤｓｈＢを１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約６００ｂｐのヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥ １μｇを１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。反応後、該反応液２０μＬに滅菌水１５μＬ、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬおよびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製）１単位を添加し、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて約４．７ＫｂのプラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥ由来のＸｈｏＩ断片を回収した。
上記で得たヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを含む約６００ｂｐのＤＮＡ断片５μＬ、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥ由来の約４．７ｋｂのＸｈｏＩ断片５μＬおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１０μＬを混合し、１６℃で一晩反応させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドについて、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い塩基配列の確認を行った。シークエンス解析のプライマーには、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６１に示す）、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｒ（配列番号６２に示す）、ｈＵ６ｐＴｓｐ４５Ｉ／ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６３）、ｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑＦＷ（配列番号７３）およびｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑＲＶ（配列番号７４）を用いた。配列解析の結果、ｓｉＲＮＡ発現カセットの配列に間違いが無く、ヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットとヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター下ＦＵＴ８に対するｓｉＲＮＡ発現カセットが同方向のクローンを選択した。以下、ＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥへヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットが挿入されたプラスミドをＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥおよびＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥへヒトＵ６プロモーター下ＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットが挿入されたプラスミドをＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥとそれぞれ称す。
２．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの導入によるレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株の取得および培養
（１）ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの導入によるレクチン耐性株の取得
３２−０５−１２株へ、本実施例の１．において構築したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥを導入し、以下の手順で、レクチン耐性株を取得した。
プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥの３２−０５−１２株への遺伝子導入は実施例１の２．（１）と同様に行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液を基本培地に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）１０枚へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、５００μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）を含む基本培地（以下、Ｈｙｇ５００−ＩＭＤＭ培地と称す）を注入し、さらに８日間培養し、出現したハイグロマイシン耐性コロニー数を計数した。さらに、一部のディッシュについて、培養上製を除去し、ＬＣＡ−ＩＭＤＭ培地［５％ウシ胎仔透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−Ｆｕｃｏｓｅ（ナカライテスク社製）、および５００μｇ／ｍＬ ＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を注入し、さらに７日間培養した。その結果、プラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥのいずれを遺伝子導入した場合にも、高い頻度でレクチン耐性株が取得された。
（２）レクチン耐性株の拡大培養
本項（１）で取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性株を、以下の手順で拡大培養した。
まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コロニーを、実体顕微鏡観察下にてピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて掻き取って吸い込み、接着細胞用Ｕ底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ各クローンを播種し、ＬＣＡ−ＩＭＤＭ培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養した。培養後、培養上清を除去し、新たにＨｙｇ５００−ＩＭＤＭ培地を注入し、さらに９日間培養した。培養後、上記プレートの各クローンについて、Ｈｙｇ５００−ＩＭＤＭ培地を用いて拡大培養を行った。以下、拡大培養を行った細胞株のうち、３２−０５−１２株へＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株をｉＢｃｈｏ−Ｈ１株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ２株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ３株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ４株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ５株と、３２−０５−１２株へＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤＢ／ｐＡＧＥを導入して得られたレクチン耐性株をｉ３ｃｈｏ−Ｈ１株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ２株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ４株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ６株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ７株およびｉ３ｃｈｏ−Ｈ８株とそれぞれ称す。
３．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株におけるＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の定量
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
３２−０５−１２株、並びに本実施例の２．において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性株であるｉＢｃｈｏ−Ｈ１株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ２株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ３株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ４株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ１株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ２株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ４株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ６株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ７株およびｉ３ｃｈｏ−Ｈ８株からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製は以下の手順で行った。
３２−０５−１２株は基本培地を、ｉＢｃｈｏ−Ｈ１株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ２株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ３株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ４株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ１株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ２株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ４株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ６株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ７株およびｉ３ｃｈｏ−Ｈ８株はＨｙｇ５００−ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用６穴プレート（グライナー社製）に２ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し１０００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心分離を行って細胞を回収した。細胞をダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度１０００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、回収した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し添付の説明書に従って、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは４０μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
本項（１）において得られたそれぞれのｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した一本鎖ｃＤＮＡはそれぞれＲＮａｓｅ処理を行い、最終反応液量を４０μＬとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて５０倍に希釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
（３）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子転写量の定量
ＧＭＤ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例５の２．（３）に記載の手順で行った。なお、ＰＣＲプライマーとしては、ＧＭＤの増幅には配列番号８０に示すフォワードプライマーおよび配列番号８１に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号６６に示すフォワードプライマーおよび配列番号６７に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。３２−０５−１２株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を１００として、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図１８に示した。親株である３２−０５−１２株のＧＭＤ ｍＲＮＡ量と比較して、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞株ではいずれも、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量が約１０％に低下していた。
（４）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例５の２．（４）に記載の手順で行った。なお、ＰＣＲプライマーとしては、ＦＵＴ８の増幅には配列番号７５に示すフォワードプライマーおよび配列番号７６に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号６６に示すフォワードプライマーおよび配列番号６７に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。
３２−０５−１２株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を１００として、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図１９に示した。親株である３２−０５−１２株のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量と比較して、ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞株ではいずれも、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量が約５％に低下していた。
４．ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
（１）ＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株の産生抗体組成物の生産
３２−０５−１２株、並びに本実施例の２．において取得したＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性株であるｉＢｃｈｏ−Ｈ２株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ１株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ２株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ４株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ６株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ７株およびｉ３ｃｈｏ−Ｈ８株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を以下の手順で取得した。
３２−０５−１２株は基本培地を、ｉＢｃｈｏ−Ｈ２株、ｉＢｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ１株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ２株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ３株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ４株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ５株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ６株、ｉ３ｃｈｏ−Ｈ７株およびｉ３ｃｈｏ−Ｈ８株はＨｙｇ５００−ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）に１０ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で５日間培養後、培養上清を除去し、１０ｍＬのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で２回洗浄を行った後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を２４ｍＬ注入した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物をそれぞれ精製した。各種細胞株の培養上清から精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
（２）抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の４．（１）で取得した、抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。
各抗体の単糖組成比より計算される、フコース（−）％を表６に示した。なお、フコース由来のピークが検出されなかった場合には、フコース（−）％を１００％として示した。
Figure 2006013964
 ベクターを導入する前の親株細胞である３２−０５−１２株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が４％であったのに対し、３２−０５−１２株を親株としてＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は９８〜１００％であり、親株と比較して顕著に上昇していた。この結果から、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入することで、フコース含量の少ない抗体組成物を生産する細胞へと変換できることが示された。
マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＳＰ２／０細胞を用いた抗体組成物の生産
１．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの構築
（１）ヒトＵ６プロモーター下マウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
以下の手順で、マウスＧＭＤ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した（図２０）。
まず、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞において有効であったＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターｐＰＵＲ／ＧＭＤｓｈＢの標的配列である配列番号３７に対応するマウス配列（配列番号５８に示す）を標的配列として選定した。さらに、選定した標的配列について、実施例１の１．（３）と同様に二本鎖ＤＮＡカセットを設計した。設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下ｍＧＭＤ−Ｂ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号８２、アンチセンス鎖（以下ｍＧＭＤ−Ｂ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号８３にそれぞれ示した。
さらに、実施例１の１．（４）と同様に、実施例１の１．（２）において取得したｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍへ、上記の合成オリゴＤＮＡをアニーリングさせて得られた二本鎖ＤＮＡを挿入して得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークエンス解析のプライマーには、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６１）およびｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｒ（配列番号６２）を用い、挿入された合成オリゴＤＮＡの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、合成オリゴＤＮＡ ｍＧＭＤ−Ｂ−ＦおよびｍＧＭＤ−Ｂ−Ｒをアニーリングさせて得られた二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＰＵＲ／ＧＭＤｍＢと称す。
（２）ヒトＵ６プロモーター下マウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現ユニットの取得
本項（１）において構築したｐＰＵＲ／ＧＭＤｍＢを用いて、実施例６の１．（１）と同様の手順で、ヒトＵ６プロモーター下マウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを取得した（図１６）。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。以下、本プラスミドをｐＣＲ／ＧＭＤｍＢと称す。
（３）マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの構築
本項（２）で構築したプラスミドｐＣＲ／ＧＭＤｍＢおよび実施例２の４．において構築したプラスミドＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥを用いて、実施例６の１．（２）と同様の手順で、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを構築した（図１７）。
得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドについて、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて、添付マニュアルに従い塩基配列の確認を行った。シークエンス解析のプライマーには、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６１に示す）、ｐＰＵＲ ＰｖｕＩＩ−ｓｅｑ−Ｒ（配列番号６２に示す）、ｈＵ６ｐＴｓｐ４５Ｉ／ｓｅｑ−Ｆ（配列番号６３）、ｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑＦＷ（配列番号７３）およびｐＡＧＥ２４９−ｓｅｑＲＶ（配列番号７４）を用いた。
配列解析の結果、ｓｉＲＮＡ発現カセットの配列に間違いが無く、ヒトＵ６プロモーター下のマウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットとヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター下のＦＵＴ８に対するｓｉＲＮＡ発現カセットが同方向に挿入されたクローンを選択した。以下、ＦＴ８ｌｉｂＢ／ｐＡＧＥへヒトＵ６プロモーター下マウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットが挿入されたプラスミドをＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥ、ＦＴ８ｌｉｂ３／ｐＡＧＥへヒトＵ６プロモーター下マウスＧＭＤに対するｓｉＲＮＡ発現カセットが挿入されたプラスミドをＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥとそれぞれ称す。
２．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターの導入によるレクチン耐性ＳＰ２／０細胞株の取得および培養
特開平６−２０５６９４の実施例１に記載の抗ＧＭ２キメラ抗体を生産するマウスミエローマＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）の形質転換細胞株ＫＭ９６８株（以下、ＫＭ９６８株と記す）へ、本実施例の１．において構築したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入し、以下の手順で、レクチン耐性株を取得した。
各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミドのＫＭ９６８株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。
まず、各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミド１０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により、該プラスミドが線状化されていることを確認した後、残りの反応液に対し、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを滅菌水１０μＬに溶解した。
一方、ＫＭ９６８株をＫ−ＰＢＳ緩衝液に懸濁して１．６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（３．２×１０６ｃｅｌｌｓ）を上記線状化プラスミド溶液１０μＬと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧２００Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液をＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）培地［ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌで含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、浮遊培養用Ｔ７５フラスコ（旭テクノグラス社製）１本へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養した後、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を終濃度が５００μｇ／ｍＬとなるように添加し、さらに３日間培養した。培養後、８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を回収し、生細胞数が０．５〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにハイグロマイシン（和光純薬社製）を５００μｇ／ｍＬで含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）培地（以下、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地と称す）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（グライナー社製）に１００μＬずつ播種した。その後、２〜３日に一度、培養上清の半量を新鮮なＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地へ交換する操作を繰り返しながら、２週間培養した。
培養後、９６ウェル培養用プレートの各ウェルの細胞を、２枚の９６ウェル培養用プレートに分割し、１枚をマスタープレート、もう１枚をレプリカプレートとした。マスタープレートはＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地にて、レプリカプレートは、Ｌ−フコース（ナカライテスク社製）を１ｍｍｏｌ／Ｌで、ＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を５００μｇ／ｍＬで含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地にて、それぞれ３日間培養した。その結果、マスタープレートにおいて良好な増殖が認められたウェルに対応するレプリカプレートのウェルの約３割において、ＬＣＡ存在下でも良好な増殖が認められた。
レプリカプレートにおいて良好な増殖が認められたウェルに対応するマスタープレートの細胞について、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地を用いて拡大培養を行った。以下、拡大培養に供した細胞株のうち、ＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入して得られた細胞株を９６８ｉＢ−１株、９６８ｉＢ−２株、９６８ｉＢ−３株、９６８ｉＢ−４株、９６８ｉＢ−５株、９６８ｉＢ−６株、９６８ｉＢ−７株と、ＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入して得られた細胞株を９６８ｉ３−１株、９６８ｉ３−２株、９６８ｉ３−３株、９６８ｉ３−４株、９６８ｉ３−５株、９６８ｉ３−６株、９６８ｉ３−７株、９６８ｉ３−８株、９６８ｉ３−９株、９６８ｉ３−１０株とそれぞれ称す。
３．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＳＰ２／０細胞株におけるＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の定量
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ＫＭ９６８株、並びに本実施例の２．において取得したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性ＳＰ２／０細胞株である９６８ｉＢ−１株、９６８ｉＢ−２株、９６８ｉＢ−３株、９６８ｉＢ−４株、９６８ｉＢ−５株、９６８ｉＢ−６株、９６８ｉＢ−７株、９６８ｉ３−１株、９６８ｉ３−２株、９６８ｉ３−３株、９６８ｉ３−４株、９６８ｉ３−５株、９６８ｉ３−６株、９６８ｉ３−７株、９６８ｉ３−８株、９６８ｉ３−９株および９６８ｉ３−１０株からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ調製は以下の手順で行った。
ＫＭ９６８株はＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）培地を、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性ＳＰ２／０細胞株はＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地を用いて、それぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、浮遊培養用Ｔ７５フラスコ（旭テクノグラス社製）に播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、細胞数を計数後、各５×１０５ｃｅｌｌｓ相当量を分取した。８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って細胞を回収した。回収した細胞をダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し方法は添付の説明書に従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをそれぞれ抽出した。調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは１４μＬの滅菌水にそれぞれ溶解した。
（２）ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
本項（１）において得られたそれぞれのｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した一本鎖ｃＤＮＡはそれぞれＲＮａｓｅ処理を行い、最終反応液量を４０μＬとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて５０倍に希釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
（３）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子転写量の定量
ＧＭＤ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例８の３．（３）に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。
ＫＭ９６８株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を１００として、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図２１に示した。親株であるＫＭ９６８株のＧＭＤ ｍＲＮＡ量と比較して、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞株ではいずれも、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量が約１０％に低下していた。
（４）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例８の３．（４）に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。
ＫＭ９６８株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値を１００として、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図２２に示した。親株であるＫＭ９６８のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量と比較して、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞株ではいずれも、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量が約１０％に低下していた。
４．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＳＰ２／０細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
（１）マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性ＳＰ２／０細胞株の抗体組成物の生産
ＫＭ９６８株、および本実施例の２．において取得したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入レクチン耐性ＳＰ２／０細胞株である９６８ｉ３−２株および９６８ｉ３−３株が生産する抗ＧＭ２キメラ抗体組成物を、以下の手順でそれぞれ取得した。
ＫＭ９６８株は、ＳＰ−ＨＳＦＭ培地［ＵｌｔｒａＬｏｗ−ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５％、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を、９６８ｉ３−２株および９６８ｉ３−３株は、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＳＰ−ＨＳＦＭ培地を用いて、それぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、浮遊培養用Ｔ２２５フラスコ（旭テクノグラス社製）に５０ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各抗ＧＭ２キメラ抗体組成物を精製した。精製した各抗ＧＭ２キメラ抗体は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
（２）抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の４．（１）で取得した、各抗ＧＭ２キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従って単糖組成分析を行った。
各抗体の単糖組成比より計算される、フコース（−）％を表７に示した。
Figure 2006013964
 ＫＭ９６８株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が３％であったのに対し、ＫＭ９６８株を親株としてマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したレクチン耐性株である９６８ｉ３−２株および９６８ｉ３−３株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は６０％程度であり、親株であるＫＭ９６８の生産する抗体組成物のフコース（−）％と比較して顕著に上昇していた。この結果から、ＳＰ２／０細胞へＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入することで、フコース含量の少ない抗体を生産する細胞へと変換できることが示された。
マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＮＳ０細胞を用いた抗体組成物の生産
１．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＮＳ０細胞株の取得および培養
ＷＯ０３／８５１１８の実施例１の（２）に記載の方法と同様にして取得したマウスミエローマＮＳ０細胞（ＲＣＢ０２１３）由来抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産株ＮＳ０／２１６０株（以下、ＮＳ０／２１６０株と記す）へ、実施例７の１．において構築したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥあるいはＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入し、以下の手順で、形質転換細胞を取得した。
各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミドのＮＳ０／２１６０株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。
まず、各種ｓｉＲＮＡ発現ベクタープラスミド１０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μＬに溶解し、１０単位の制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により、該プラスミドが線状化されていることを確認した後、残りの反応液に対し、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを滅菌水１０μＬに溶解した。
一方、ＮＳ０／２１６０株をＫ−ＰＢＳ緩衝液に懸濁して１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を上記線状化プラスミド溶液１０μＬと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧２００Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液をＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）培地に懸濁し、浮遊培養用Ｔ７５フラスコ（旭テクノグラス社製）１本へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養した後、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を終濃度が５００μｇ／ｍＬとなるように添加し、さらに２日間培養した。培養後、８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を回収した後、生細胞の密度が０．５〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（グライナー社製）に１００μＬずつ播種した。その後、２〜３日毎に、培養上清の半量を新鮮なＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地へ交換する操作を繰り返しながら、２〜３週間培養した。
培養後、９６ウェル培養用プレートの各ウェルの培養上清をそれぞれ回収し、実施例７の３．に記載の方法で、それぞれの培養上清中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を評価した。ベクター毎に８０ウェルについて解析した結果、９割以上のウェルの培養上清に含まれる抗体組成物において、親株であるＮＳ０／２１６０株が産生する抗体組成物と比較してｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の上昇が認められ、各ウェルの細胞が遺伝子導入の結果、フコース含量の少ない抗体組成物の生産細胞へと変換されていた。
ｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の上昇が認められたウェルのうち各５ウェルの細胞について、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地を用いて拡大培養を行った。以下、拡大培養に供した細胞株のうち、ＦＴ８ｌｉｂＢ＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入して得られた細胞株をＮＳ０／２１６０ｉＢ−１株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−２株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−３株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−４株およびＮＳ０／２１６０ｉＢ−５株と、ＦＴ８ｌｉｂ３＿ＧＭＤｍＢ／ｐＡＧＥを導入して得られた細胞株をＮＳ０／２１６０ｉ３−１株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−２株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−３株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−４株およびＮＳ０／２１６０ｉ３−５株とそれぞれ称す。
２．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＮＳ０細胞株におけるＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の定量
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ＮＳ０／２１６０株、並びに本実施例の１．において取得したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入ＮＳ０細胞株であるＮＳ０／２１６０ｉＢ−１株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−２株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−３株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−４株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−５株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−１株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−２株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−３株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−４株、およびＮＳ０／２１６０ｉ３−５株からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製は、以下の手順で行った。
ＮＳ０／２１６０株はＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）培地を、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入ＮＳ０細胞株はＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）−ＭＴＸ（５００）−Ｈｙｇ（５００）培地を用いて、それぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、浮遊培養用Ｔ７５フラスコ（旭テクノグラス社製）に播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、細胞数を計数後、各５×１０５ｃｅｌｌｓ相当量を分取した。８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って上清を除去した。細胞をダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し方法は添付の説明書に従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをそれぞれ抽出した。調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは１４μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
本項（１）において得られたそれぞれのｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μＬの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した一本鎖ｃＤＮＡはそれぞれＲＮａｓｅ処理を行い、最終反応液量を４０μＬとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて５０倍に希釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
（３）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＧＭＤ遺伝子転写量の定量
ＧＭＤ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例８の３．（３）に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。
ＮＳ０／２１６０株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値を１００として、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＧＭＤ ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図２３に示した。親株であるＮＳ０／２１６０株のＧＭＤ ｍＲＮＡ量と比較して、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞ではいずれも、ＧＭＤ ｍＲＮＡ量が約２０％に低下していた。
（４）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、実施例８の３．（４）に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を数値化した。
ＮＳ０／２１６０株についてのβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値を１００としてβ−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量の相対値とを比較した結果を図２４に示した。親株であるＫＭ９６８株のＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量と比較して、マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入により得られた細胞ではいずれも、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ量が約１０％に低下していた。
３．マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＮＳ０細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
（１）マウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入した低フコース抗体産生ＮＳ０細胞株の抗体組成物の生産
ＮＳ０／２１６０株、並びに本実施例の１．において取得したマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクター導入ＮＳ０細胞株であるＮＳ０／２１６０ｉＢ−３株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−５株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−１株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−４株、およびＮＳ０／２１６０ｉ３−５株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を、以下の手順で取得した。
ＮＳ０／２１６０株は、ＮＳ−ＨＳＦＭ培地［Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．２％、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−３株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−５株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−１株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−４株およびＮＳ０／２１６０ｉ３−５株は、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＮＳ−ＨＳＦＭ培地を用いて、それぞれ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、浮遊培養用Ｔ２２５フラスコ（旭テクノグラス社製）に４０ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を精製した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物は、それぞれＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ（バイオラッド社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４バッファーに置換し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いてろ過滅菌した。
（２）抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の３．（１）で取得した、各抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従って単糖組成分析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース（−）％を表８に示した。
Figure 2006013964
 ＮＳ０／２１６０株の生産する抗体組成物のフコース（−）％が２８％であったのに対し、ＮＳ０／２１６０株を親株としてマウスＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびマウスＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入したＮＳ０／２１６０ｉＢ−３株、ＮＳ０／２１６０ｉＢ−５株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−１株、ＮＳ０／２１６０ｉ３−４株、およびＮＳ０／２１６０ｉ３−５株が生産する抗体組成物のフコース（−）％は９０％程度であり、親株が生産する抗体組成物のフコース（−）％と比較して顕著に上昇していた。この結果から、ＮＳ０細胞へＧＭＤを標的としたｓｉＲＮＡおよびＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ共発現ベクターを導入することで、フコース含量の少ない抗体を生産する細胞へと変換できることが示された。
本発明によれば、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法などを提供される。本発明の方法により製造される抗体組成物は高いエフェクター活性を有しており、医薬品として有用である。
［０４３２］配列表フリーテキスト
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配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号７８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号８６−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号８７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号８８−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号８９−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号９０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (71)

  1. 以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入した細胞；
    （ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  2. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、請求項１に記載の細胞。
  3. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２に記載の細胞；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  4. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項２に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
  5. 以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡ。
    （ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  6. 請求項５に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡ。
  7. 請求項５に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡを含有するベクター。
  8. 請求項７に記載のベクターを細胞に導入した細胞。
  9. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
  10. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
  11. 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素である請求項９または１０に記載の細胞。
  12. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  13. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項１２に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  14. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１２に記載の細胞；
    （ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
  15. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  16. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  17. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
  18. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項１７に記載の細胞；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  19. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１７に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
  20. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  21. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  22. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ。
  23. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡ、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含むＤＮＡ。
  24. 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素である請求項２２または２３に記載のＤＮＡ。
  25. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
  26. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２５に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  27. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項２５に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
    （ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
  28. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  29. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  30. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
  31. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項３０に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  32. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項３０に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
  33. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  34. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  35. 請求項２２〜３４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するベクター。
  36. 配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡを含んでなる、請求項３５に記載のベクター。
  37. 配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９２で表されるＤＮＡを含んでなる、請求項３５に記載のベクター。
  38. 配列番号９０で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡを含んでなる、請求項３５に記載のベクター。
  39. 配列番号９１で表されるＤＮＡおよび配列番号９３で表されるＤＮＡを含んでなる、請求項３５に記載のベクター。
  40. 請求項３５〜３９のいずれか１項に記載のベクターを導入した細胞。
  41. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターまたは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターを導入した細胞。
  42. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡに対応するＤＮＡとその相補ＤＮＡを含有するベクターを導入した細胞。
  43. 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するＲＮＡがＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡである請求項４１または４２に記載の細胞。
  44. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の細胞。
  45. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４４に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  46. α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４４に記載の細胞；
    （ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
    （ｌ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
  47. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  48. Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１４〜３５または８５〜８９で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  49. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の細胞。
  50. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４９に記載の細胞；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  51. ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４９に記載の細胞；
    （ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｇ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
    （ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
  52. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号８で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号９で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号１０で表される塩基配列中連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  53. ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するＲＮＡが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡである、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の細胞；
    （ａ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号３７、５７または５８で表される塩基配列のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
  54. 細胞が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求項１〜４、８〜２１および４０〜５３のいずれか１項に記載の細胞。
  55. レクチンが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンである、請求項５４に記載の細胞；
    （ａ）レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）；
    （ｂ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）；
    （ｃ）ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）；
    （ｄ）ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）。
  56. 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜４、８〜２１および４０〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
  57. 動物細胞が、以下の（ａ）〜（ｋ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項５６に記載の細胞；
    （ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
    （ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
    （ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
    （ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
    （ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
    （ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
    （ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
    （ｈ）ヒト白血病細胞株ＮＭ−Ｆ９細胞；
    （ｉ）ヒト胚性網膜細胞株ＰＥＲ．Ｃ６細胞；
    （ｊ）胚性幹細胞；
    （ｋ）受精卵細胞。
  58. 糖蛋白質をコードする遺伝子を含む、請求項１〜４、８〜２１および４０〜５７のいずれか１項に記載の細胞。
  59. 糖蛋白質が抗体分子である、請求項５８に記載の細胞。
  60. 抗体分子が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項５９に記載の細胞；
    （ａ）ヒト抗体；
    （ｂ）ヒト化抗体；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
    （ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む融合蛋白質。
  61. 抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項５９または６０に記載の細胞。
  62. 請求項５８に記載の細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法。
  63. 請求項５８に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物の製造方法。
  64. 請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物の製造方法。
  65. 請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取精製する工程を含む、抗体組成物の製造方法。
  66. 抗体組成物が、親株細胞が生産する抗体組成物より抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物である、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物より高いことを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
  68. フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項６７に記載の方法。
  69. 請求項６２または６３に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
  70. 請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
  71. 請求項６９または７０に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
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