DE69324601T2

DE69324601T2 - Multifunktionelle neurotrophe faktoren

Info

Publication number: DE69324601T2
Application number: DE69324601T
Authority: DE
Inventors: Carlos Ibanez; Hakan Persson
Original assignee: MCINTYRE KATHERINE R
Current assignee: MCINTYRE KATHERINE R
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2013-11-20
Also published as: US5488099A; EP0674660B1; DE69324601D1; WO1994012539A1; AU677979B2; IL107674A0; ZA938709B; US5889173A; AU5614894A; ATE179181T1; CA2149862A1; EP0674660A1; JPH08504405A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neurotrophe Faktoren, die zahlreiche neurotrophe Spezifitäten aufweisen. Sie basiert teilweise auf der Entwicklung eines Modells, welches eine Bestimmung der Wirkung spezifischer Reste in Neurotrophin- Molekülen auf die Rezeptor-Bindung, Rezeptor-Aktivierung und die Umwandlung in eine biologische Antwort ermöglicht.

Hintergrund der Erfindung

Zahlreiche Polypeptid-Wachstumsfaktoren vermitteln ihre biologischen Antworten durch Bindung an und Aktivierung von Zelloberflächen-Rezeptoren mit intrinsischer Tyrosinkinase-Aktivität. Nach Liganden-Bindung werden diese Rezeptoren an zahlreichen Tyrosin-Resten autophosphoryliert und assoziieren anschließend mit intracellulären Molekülen, die für die Signal- Transduktion wichtig sind (Ullrich, 1990). Es ist jedoch wenig über die Struktur-Determinanten der Spezifität der Liganden- Rezeptorbindung bekannt und wie diese Interaktion zur Rezeptor- Aktivierung und der Vermittlung pleiotroper biologischer Effekte führt.
Jüngere Arbeiten über die Trk-Familie von Tyrosinkinase- Rezeptoren haben nachgewiesen, daß diese Moleküle signal-transduzierende Rezeptoren einer Familie strukturell und funktionell verwandter neurotropher Faktoren beinhalten, die im allgemeinen als Neurotrophine bekannt sind. Das meiste unserer Kenntnis über neurotrophe Faktoren stammt von Arbeiten über den Nerven-Wachstumsfaktor (nerve growth factor; NGF), ein 118- Aminosäuren-Polypeptid, welches die Reifung und das Überleben sympathischer Neuronen, sowie von Subpopulationen sensorischer und zentraler Neuronen kontrolliert (Levi-Montalcini, 1968; Thoenen, 1980; Thoenen, 1987). Andere Neurotrophine beinhalten den vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor; BDNF) (Barde, 1982; Leibrock, 1989), Neurotrophin-3 (NT-3) (Hohn, 1990; Maisonpierre, 1990; Ernfors, 1990; Rosenthal, 1990) und Neurotrophin-4 (NT-4) (Hallbook, 1991; Ip, 1992) auch Neurotrophin-5 genannt (NT-5) (Berkemeier, 1991). Die Fähigkeit von Neurotrophinen, die Überlebensfähigkeit peripherer und zentraler Neuronen während der Entwicklung und nach neuronaler Schädigung zu erhöhen, hat das Interesse an diesen Molekülen als wirkungsvolle therapeutische Mittel für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Verletzungen des Nervensystems stimuliert.
Die Neurotrophine zeigen ungefähr 50% Sequenz-Identität untereinander und zeigen eine Anzahl sowohl überlappender als auch spezifischer neurotropher Aktivitäten auf periphere und zentrale Neuronen. Alle Neurotrophine unterstützen z. B. in unterschiedlichen Anteilen das Überleben sensorischer Neuronen, die aus der Neuralleiste stammen (Thoenen, 1980; Lindsay, 1985; Hohn, 1990; Ip, 1992). Im Gegensatz dazu wird das Überleben embryonaler sympathischer Neuronen nur durch NGF unterstützt, während vom Embryo abstammende sensorische Neuronen durch BDNF und NT-3 unterstützt werden, jedoch nicht durch NGF (Thoenen, 1980; Lindsay, 1985; Hohn 1990). Man glaubt, daß diese Spezifität zum Teil durch die selektive Interaktion zwischen den unterschiedlichen Neurotrophinen und den Mitgliedern der Trk- Familie von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren, die auf der Oberfläche der unterschiedlichen neuronalen Populationen exprimiert sind, erhalten wird. Das heißt, während NGF nur an p140trk bindet (hierin TrkA genannt) (Kaplan, 1991; Kaplan, 1991a; Klein, 1991), interagieren BDNF und NT-4 ausschließlich mit p145trkB (hierin TrkB genannt) [Soppet, 1991; Squinto, 1991; Klein, 1991b; Ip, 1992], wohingegen NT-3 mit p145trkC interagiert (hierin TrkC genannt) und mit geringerer Effizienz auch mit TrkA und TrkB [Cordon- Cardo, 1991; Lambelle, 1991; Klein, 1991b; Squinto, 1991].
Anders als die Trk-Rezeptoren erkennt der niedrig-affine Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor p75NGFR (hierin LNGFR genannt) [Radeke, 1987; Johnson, 1986] jedes der Neurotrophine mit einer ähnlichen Affinität [Rodriquez-Tebar, 1990; Ernfors, 1990; Hallbook, 1991 Rodriquez-Tebar, 1992]. Obwohl LNGFR ursprünglich als eine Komponente des funktionellen hoch-affinen NGF-Rezeptors angesehen wurde (Hempsted, 1989; Hempstead, 1989a), der an der Übermittlung der biologischen Aktivität beteiligt ist (Hempstead, 1989; Yan, 1991), stellen immer mehr Befunde eine direkte Beteiligung dieses Moleküls an der Signaltransduktion in Frage (Westcamp, 1991; Glass, 1991; Ibanez, 1992; Jing, 1992).
Informationen über Interaktionen des Neurotrophin-Rezeptors wurden aus Untersuchungen über Struktur-Funktions-Beziehungen und die Herstellung von Neurotrophin-Mutanten mit veränderten Eigenschaften erhalten. Dieser Ansatz wurde z. B. verwendet, um zu zeigen, daß eine positiv geladene Grenzfläche im NGF-Protein, die durch Lys-32, Lys-34 und Lys-95 gebildet wird, die Bindung von NGF an LNGFR vermittelt. NGF-Moleküle, die an diesen Positionen mutiert sind, binden nicht an LNGFR, behalten jedoch die Bindungsfähigkeit an TrkA-Rezeptoren und die biologische Aktivität in Kulturen primärer Neuronen, und damit wird demonstriert, daß TrkA alleine ausreichend ist, um die biologische Aktivität von NGF in neuronalen Zellen zu vermitteln.
Die meisten der Sequenz-Variationen unter den Neurotrophinen treten in unterschiedlichen Bereichen auf, und einleitende Studien, in denen chimäre Moleküle aus NGF und BDNF verwendet wurden, haben gezeigt, daß spezifische Kombinationen einiger dieser variablen Sequenzen ein breiteres Spektrum neurotropher Aktivitäten zeigen, als diejenigen der beiden Wildtyp-Proteine (Ibanez, 1991; Suter, 1992). Diese Studien identifizierten jedoch keine spezifischen Rezeptor-Bindungsstellen in den Neurotrophinen, die für die beobachteten Unterschiede in den biologischen Spezifitäten verantwortlich waren.
Die kürzlich erreichte Aufklärung der Kristall-Struktur von NGF hat dreiviertel der variablen Reste in drei β-Haar schleifen und einer gegenläufigen Windung lokalisiert (McDonald, 1991). Andere variable Regionen beinhalten einen Teil des β- Stranges und das Amino(NH&sub2;)- und Carboxy(COOH)-terminale Ende. Die Tatsache, daß die meisten der konservierten Aminosäure-Reste in den Neurotrophinen eine strukturelle Rolle spielen, impliziert, daß alle 4 Neurotrophine sehr ähnliche Konformationen haben und die individuellen Unterschiede auf die variablen Regionen beschränkt sind (Mc Donald, 1991). Es wird im allgemeinen angenommen, daß die Oberflächen-Loop-Regionen für die Rezeptor- Bindung von Wachstumsfaktoren wichtig sind (Sclunegger, 1992; Daopin, 1992; Oefner, 1992). In dem U.S.-Patent Nr. 5.134.121 beispielsweise, welches am 28. Juli 1992 erteilt wurde, sind Agonisten und Antagonisten des Nerven-Wachstumsfaktors beschrieben, welche aus Peptiden bestehen, die aus der Region zwischen Aminosäure 26 und Aminosäure 40 des NGF erhalten wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Neurotrophin-3 (NT-3)- Molekül, wobei die Aminosäuren 3 bis 9 durch die Aminosäuren 3-9 vom Nerven-Wachstumsfaktor ersetzt sind und/oder wobei die Aminosäuren 94 bis 98 durch die Aminosäuren 94 bis 98 des vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor; BDNF) ersetzt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, welche die erfindungsgemäßen chimären Neurotrophine codieren, Vektoren, die die Nucleinsäuren enthalten, wobei der Vektor in der Lage ist, Neurotrophin in wiedergewinnbarer Form zu exprimieren, wenn er sich innerhalb einer Wirtszelle befindet, Wirtszellen, die die Vektoren enthalten und Verfahren zur Produktion der chimären Neurotrophine, wobei die Wirtszellen gezüchtet und das Protein gewonnen wird.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, welche ein erfindungsgemäßes chimäres Neurotrophin zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel enthalten, diagnostische Reagenzien, die Nucleinsäuren enthalten, welche in der Lage sind mit Nucleinsäuren, die die erfindungsgemäßen chimären Neurotrophine codieren, zu hybridisieren und die Verwendung der erfindungsgemäßen chimären Neurotrophine und Nucleinsäuren, von denen sie codiert werden, in Verfahren zur Diagnose bzw. Behandlung neurologischer Störungen im Körper eines Menschen oder Tieres.
Die erfindungsgemäßen chimären neurotrophen Faktoren stellen die Aktivität verschiedener neurotropher Faktoren im gleichen Molekül bereit. Zusätzlich können sie derart verändert werden, daß sie für einen bestimmten Zelltyp spezifischer sind, wobei Nebeneffekte, welche durch unspezifische Interaktionen des Ausgangsmoleküles verursacht werden, vermindert werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 Variable Bereiche in den Neurotrophinen. (A)Abgleich der Aminosäure-Sequenzen (Einbuchstabencode) vom NGF der Ratte (SEQ. ID. NR.1) (Whittemore, 1988), BDNF der Ratte (SEQ. ID. NR.2) (Maisonpierre 1990) und NT-3 der Ratte (SEQ. ID. NR.3) (Ernforse 1990). Variable Regionen sind umrandet und markiert. (B) Schematische Darstellung der dreidimensionalen Struktur des NGF- Monomers (Mc Donald, 1991). Die Reste der verschiedenen variablen Bereiche sind durch ihren Einbuchstabencode angezeigt. Die Reste, welche im NGF-Protein als Resultat des Austausches der variablen Regionen von BDNF verändert wurden, sind schattiert. Die fetten Linien am unteren Rand zeigen Disulfidbrücken an.
Fig. 2. TrkA-Rezeptor-Bindung, Rezeptor-Phosphorylierung und biologische Aktivität von Wildtyp- (wt) und chimären Molekülen (siehe SEQ. ID. NRs. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, die gleiche Mengen an wt-NGF ( ), wt-BDNF (*) und chimären Molekülen NH&sub2; (O), COOH (Δ), I + III + IV + V ( ), NH&sub2; + I + III + IV + V ( ) und COOH + I + III + IV + V ( ) enthielten wurden auf ihre Fähigkeit in diesen Zellen ¹²&sup5;I-markierten NGF zu binden, getestet. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer Dreifachbestimmung dar. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unter ± 10%. (B) und (C) Tyrosin-Phosphorylierung von TrkA-Rezeptoren, welche mit wt-NGF, wt-BDNF und chimären Molekülen stimuliert wurden. rtrkA-3T3-Zellen wurden mit 100 ng/ml der angegebenen rekombinanten Proteine behandelt und auf Tyrosin- Phosphorylierung untersucht. Die Medien von scheintransfizierten COS-Zellen wurden als Negativ-Kontrollen (Kontrolle) verwendet. Die Pfeilspitze gibt das Laufverhalten von phosphoryliertem TrkA(p140trk) an. Die Bande mit dem schnelleren Laufverhalten entspricht dem konstitutiv phosphorylierten p140trk-Vorläufer (Kaplan, 1991). (D) Serielle Verdünnungen aus konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen an wt- und chimären Faktoren enthielten, wurden auf ihr Fähigkeit getestet, das Auswachsen der Neuriten aus E8-Hühner-sympathischen Ganglien zu stimulieren. Die Ergebnisse von drei Bestimmungen variierten um ± 20% von den Durchschnittswerten, die hier dargestellt sind. Die Symbole wurden entsprechend dem Teil (A) verwendet.
Fig. 3. Die variablen Regionen I, IV und V von NGF stellen in dem NH&sub2; + I + III + IV + V-chimären Molekül (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte) die Bindungsaktivität und biologische Aktivität von TrkA teilweise wieder her. (A) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS- Zellen, welche gleiche Mengen an wt-NGF( ), chimären Molekülen NH&sub2; + I + III + IV + V (O), NH&sub2; + III + IV + V (Δ), NH&sub2; + I + III + V ( ), NH&sub2; + I + III + IV ( ) und NGF-Mutante I31A ( ) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, ¹²&sup5;I-markierten NGF von den Rezeptoren auf rtrkA-3T3- Zellen zu verdrängen. Das Medium scheintransfizierter Zellen war nicht in der Lage ¹²&sup5;I-markierten NGF von diesen Zellen zu verdrängen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer Dreifachbestimmung dar. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unterhalb von ± 10%. (B) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen an wt-, mutanten und chimären Faktoren enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das Auswachsen von Neuriten auf E8-Hühner-sympathischen Ganglien zu stimulieren. Die Ergebnisse von drei verschiedenen Bestimmungen variierten um ± 20% von den Durchschnittswerten, welche hierin dargestellt sind. Die Symbole werden wie in Teil (A) verwendet.
Fig. 4. Die Reste der variablen Region II von NGF sind bei der TrkA-Aktivierung und -Bioaktivität beteiligt, jedoch nicht an der TrkA-Bindung (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen an wt-NGF ( ) und chimären Molekülen E41A + I + III + IV + V (O), I + IIa + III + IV + V ( ), I + IIb + III + IV + V ( ) und I + II + III + IV + V ( ) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, ¹²&sup5;I-markierten NGF von diesen Zellen zu verdrängen. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von Dreifach-Bestimmungen. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unterhalb von ± 10%. (B) und (C) Tyrosin- Phosphorylierung von TrkA-Rezeptoren, die durch wt-NGF und chimäre Moleküle stimuliert wurden. rtrkA-3T3-Zellen wurden mit 100 ng/ml der angegebenen rekombinanten Proteine behandelt und auf Tyrosin-Phosphorylierung getestet- Die Pfeilspitze gibt das Laufverhalten von phosphoryliertem TrkA (p¹&sup4;&sup0;trk) an. Die Bande mit dem schnelleren Laufverhalten entspricht den konstitutiv phosphorylierten p¹&sup4;&sup0;trk-Vorläufern (Kaplan, 1991). (D) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen an wt- und chimären Faktoren enthielten, wurden auf ihr Fähigkeit das Auswachsen von Neuriten aus E8-Hühner-sympathischen Ganglien zu stimulieren, getestet. Die Ergebnisse aus Dreifach-Bestimmungen variierten um ± 20% von dem Durchschnittswert, welcher hierin dargestellt ist. Die Symbole werden wie in (A) verwendet, mit Ausnahme für das chimäre Molekül I + III + IV + V (Δ).
Fig. 5. TrkB-Rezeptorbindung, Rezeptor-Phosphorylierung und biologische Aktivität von wt- und chimären Molekülen (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A)(B) und (C) Tyrosin-Phosphorylierung von TrkB-Rezeptoren, welche durch wt-NGF-, wt-BDNF- und NGF-Mutanten -chimären Molekülen stimuliert worden sind. rtrkB-3T3-Zellen wurden mit 100 ng/ml der angegebenen rekombinanten Proteine behandelt und auf Tyrosin-Phosphorylierung getestet. Die Pfeilspitze zeigt das Laufverhalten von phosphoryliertem TrkB (p145trkB) an. (D) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen wt-BDNF ( ), wt-NGF ( ) und chimäre Moleküle I + III + IV (O), III + IV + V (Δ) und I + III + IV + V ( ) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit ¹²&sup5;I-markiertes BDNF von den Rezeptoren auf rtrkB-3T3- Zellen zu verdrängen, getestet. Das Medium scheintransfizierter Zellen war nicht in der Lage, I-BDNF von diesen Zellen zu verdrängen. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnittswert von Dreifach-Bestimmungen. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unterhalb von ± 10%. (E) Neuronale Überlebensrate dissoziierter E8-Hühner-Neuronen des unteren Vagusganglions in Anwesenheit von Sättigungsmengen (20-50 ng/ml) wt-BDNF, wt-NGF und chimärer Moleküle. Die Medien scheintransfizierter COS- Zellen wurden als eine negative Kontrolle (Kontrolle) verwendet. Die Ergebnisse sind als der Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung (standard deviation; SD) dargestellt.
Fig. 6. Reste in der variablen Region II von BDNF übertragen die TrkB-Bindung und BDNF-ähnliche biologische Aktivität auf chimäre Moleküle (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A) serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen wt-BDNF (Q) und chimäre Moleküle I + III + IV + V (O), I + IIa + IV + V ((Δ)), I + IIb + III + IV + V ( ), I + II + III + IV + V ( ) und wahres NH&sub2; + I + III + IV + V ( ) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, ¹²&sup5;I-markiertes BDNF von Rezeptoren auf rtrkB-3T3-Zellen zu verdrängen. Das Medium von scheintransfizierten Zellen war nicht in der Lage, ¹²&sup5;I-markiertes BDNF von diesen Zellen zu verdrängen. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnittswert einer Dreifachbestimmung. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unterhalb von ± 10%. (B) neuronale Überlebensrate dissoziierter E8-Hühner-unteres Vagusganglion-Neuronen in Anwesenheit sättigender Mengen (20- 50 ng/ml) wt-BDNF und chimärer Moleküle. Die Medien von scheintransfizierten COS-Zellen wurden als Negativkontrolle (Kontrolle) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung dargestellt.
Fig. 7. Ähnliche Mengen an TrkB-Rezeptor-Phosphorylierung können in unterschiedlichen biologischen Aktivitäten resultieren (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen an wt-BDNF ( ), wt-NGF ( ) und chimären Molekülen I + III + IV + V (O) und III + IV + V (Δ) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Tyrosin-Phosphorylierung von TrkB, welches in rtrkB-3T3-Zellen exprimiert wird, zu stimulieren. Entsprechend exponierte Autoradiogramme von Phosphotyrosin-Blots wurden für eine densitometrische Auswertung verwendet und die Ergebnisse sind als willkürliche Einheiten optischer Dichte ausgedrückt. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem Wiederholungsexperiment erhalten. (B) Stimulation des Auswachens von Neuriten aus explantierten E8-Hühner-unterer Vagus- Ganglien in Anwesenheit von 50 ng/ml wt-BDNF, wt-NGF und chimären Molekülen I + III + IV + V und III + IV + V. Die Medien von scheintransfizierten COS-Zellen wurden als eine negative Kontrolle (Kontrolle) verwendet. Die Ergebnisse sind als der Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung dargestellt. (C) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen der ange gebenen wt- und chimären Moleküle enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit die Überlebensdauer von dissoziierten E8-Hühner- unterer Vagus-Neuronen zu stimulieren, getestet. Die Ergebnisse sind als der Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung dargestellt.
Fig. 8. PNT-1 interagiert wirkungsvoll mit TrkA-, TrkB- und TrkC-Rezeptoren (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). (A), (B) und (C) Tyrosin-Phosphorylierung von TrkA (A)-, TrkB (B)- und TrkC (C)-Rezeptoren, stimuliert durch wt- NGF, wt-BNDF, wt-NT-3 und den von NT3-abstammenden chimären Molekülen PNT-1, BDNF V/NT-3 und NGF NH&sub2;/NT-3. Trk-exprimierende Zellen wurden mit 100 ng/ml der angegebenen rekombinanten Proteine behandelt und auf Tyrosin-Phosphorylierung getestet. Pfeilspitzen in A, B und C geben das Laufverhalten von phosphoryliertem TrkA (p¹&sup4;&sup0;trk), TrkB (p145trkB) bzw. TrkC (p145trkC) an. (D) Serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium transfizierter COS-Zellen, welche gleiche Mengen von wt-NGF ( ), wt-NT-3 (O) und von NT-3- abstammenden chimären Molekülen BDNF V/NT-3 (Δ) und PNT-1 ( )) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit, ¹²&sup5;I-markierten NGF von Rezeptoren auf rtrkA-3T3-Zellen zu verdrängen, getestet. Das Medium von scheintransfizierten Zellen war nicht in der Lage, ¹²&sup5;I-markierten NGF von diesen Zellen zu verdrängen. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen. Die Standardabweichung lag bei oder im allgemeinen unterhalb von ± 10%.
Fig. 9. PNT-1 zeigt zahlreiche neurotrophe Spezifitäten (A), (B), (C) und (D) Dunkelfeld-Mikrophotographien von E8-Hühnersympathischen Ganglien, welche für 48 h in Anwesenheit von COS- Zell-konditioniertem Medium gezüchtet wurden, die 2,5 ng/ml wt- NGF (A), 20 ng/ml wt-NT-3 (B), 20 ng/ml PNT-1 (C) und 20 ng/ml NGF NH2/NT-3 (Δ) enthielten. (E) Dosis-Wirkungs-Kurven des Auswachsens von Neuriten nach Stimulation von E8-Hühner-sympathischen Ganglien durch wt-NGF ( ), wt-NT-3 (O) und von NT-3- abstammenden chimären Molekülen NGF NH2/NT-3 (Δ) PNT-1( ). Die Ergebnisse von drei Bestimmungen variierten um ± 20% vom Durchschnittswert, der hierin dargestellt ist. (F) Neuronale Überlebensdauer dissoziierter E8-Hühner-sympathischer Neuronen in Anwesenheit von 2 ng/ml wt-NGF, wt-NT-3 und von NT- 3-abstammenden chimären Molekülen NGF NH2/NT-3 und PNT-1. Die Medien von scheintransfizierten COS-Zellen wurden als eine negative Kontrolle (Kontrolle) verwendet. Die Ergebnisse sind als der Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung dargestellt. (G) Neuronale Überlebensrate dissoziierter E8-Hühner-unterer Vagus-Neuronen in Anwesenheit von absättigenden Mengen (20-50 ng/ml) wt-BDNF, wt-NGF, wt-NT-3 und von NT-3-abstammendenchimären Molekülen PNT-1 und BDNF V/NT-3. Die Medien von scheintransfizierten COS-Zellen wurden als eine negative Kontrolle (Kontrolle) verwendet. Die Ergebnisse sind als der Durchschnittswert von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung dargestellt.
Fig. 11. Modell für die Dynamik von NGF-Rezeptorkomplexen auf der Membran responsiver Zellen. Crosslinking-Experimente haben bisher nur die Assoziation von monomeren und homodimeren Rezeptoren mit dem Liganden gezeigt. Die bivalente Natur des NGF-Dimers kann die Ausbildung von heterodimeren Rezeptorkomplexen erlauben, welche transiente Zwischenprodukte während dem Transfer des Liganden von LNGFR zu TrkA sein können. Aktiv bindende Oberflächen in dem NGF-Dimer sind markiert. Die Signalisierungs-Fähigkeit von homodimerem LNGFR und von heterodimeren Rezeptorkomplexen muß noch nachgewiesen werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Neurotrophin- 3 (NT-3)-Molekül, in dem die Aminosäuren 3 bis 9 durch die Aminosäuren 3 bis 9 vom Nervenwachstumsfaktor ersetzt sind, und/oder in dem die Aminosäuren 94 bis 98 durch die Aminosäuren 94 bis 98 des vom Gehirn stammenden Neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor; BDNF) ersetzt sind. Sie basiert teilweise auf der Entwicklung eines Modells, das die Gestaltung von Molekülen erlaubt, welche spezifische Regionen enthalten, die die Rezeptorbindung und/oder rezeptoraktivierende Domänen der Neurotrophine nachahmen.
Gemäß der Erfindung und wie im Detail in den Beispielen beschrieben, werden die Aminosäuren 3 bis 9 und/oder die Aminosäuren 94 bis 98 von NT-3 mit den entsprechenden Regionen von NGF und/oder BDNF ersetzt, das heißt die Aminosäuren 3 bis 9 vom NGF und/oder die Aminosäuren 94 bis 98 von BDNF, welche vergleichbare dreidimensionale Struktur und Rezeptor-Bindungsdomänen haben.
Die Nerven-Wachstumsfaktor-(nerve growtrifactor; NGF)Familie der Neurotrophine beinhaltet NGF(SEQ. ID. NR. 1), den vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor; BDNF) (SEQ. ID. NR. 2), Neurotrophin-3 (NT-3) (SEQ. ID. NR. 3) und Neurotrophin-4 (NT-4). Fig. 1A stellt einen Aminosäure-Sequenzabgleich (Einbuchstabencode) von Ratten-NGF(Whittemore, 1988), Ratten-BDNF (Maisonpierre, 1990) und Ratten-NT-3 (Ernforse, 1990) dar. Variable Regionen sind markiert und in einem Kasten dargestellt.
Gemäß der Erfindung sind die Aminosäuren 3 bis 9 und/oder 94 bis 98 von NT-3 durch die entsprechenden Regionen vom NGF und/oder BDNF, das heißt die Aminosäuren 3 bis 9 vom NGF und/oder die Aminosäuren 94 bis 98 vom BDNF, ersetzt und die resultierenden Chimären wurden auf den Gewinn oder Verlust spezifischer Funktionen getestet, die mit den jeweiligen parentalen Faktoren assoziiert sind. Solche Funktionen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf 1) die Fähigkeit, den relevanten Rezeptor zu binden, z. B. trkA, trkB oder trkC; 2) die Phosphorylierung des relevanten Rezeptors; 3) die Induktion von "immediate early"-Genen und 4) die biologische Aktivität.
Damit wird z. B. in einer Ausführungsform die variable Region V von NT-3 (Aminosäuren 94 bis 98) mit der entsprechenden Region von BDNF ersetzt. (Das resultierende Konstrukt wurde als BDNF V/NT-3 bezeichnet, um die Quelle der variablen Region anzugeben, die in das NT-3-Molekül substituiert wurde.) Es zeigte sich, daß das resultierende Konstrukt die Fähigkeit hat, trkB stärker zu binden und die Überlebensdauer von unterer Vagusganglion-Neuronen im Vergleich zum elterlichen NT-3-Molekül stärker zu fördern. Basierend auf der funktionellen Information, die mit chimären und mutanten Molekülen erhalten wurde, wurde ein chimäres Neurotrophin konstruiert, welches biochemische und biologische Eigenschaften von drei verschiedenen Neurotrophinen zeigt. In diesem Konstrukt wurde die variable Region V von NT-3 (siehe SEQ. ID. NR. 3) mit den entsprechenden Aminosäuren von BDNF (siehe SEQ. ID. NR. 2) ersetzt, und die aminoterminale Region von NT-3 (Reste 3 bis 9: SEQ. ID. NR. 3) wurde mit der entsprechenden Region von NGF ersetzt (siehe SEQ. ID. NR. 1). Der resultierende Faktor, als Pan- Neurotrophin-1 (PNT-1) bezeichnet, war in der Lage TrkA-, B- und C- Rezeptoren wirkungsvoll zu aktivieren und zeigte biologische Spezifitäten auf Neuronen, die für NGF, BDNF und NT-3 charakteristisch sind. Dieses Ergebnis zeigt, daß die strukturellfunktionelle Information, die erhalten wurde, dafür verwendet werden kann, Moleküle mit breiteren oder neuen biologischen Spezifitäten zu gestalten.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung erfindungsgemäßer chimärer neurotropher Faktoren bereit, was den Vorteil bietet, die Aktivitäten bereitzustellen, die typischerweise mit mehreren neurotrophen Faktoren assoziiert sind. Solche Faktoren können dafür verwendet werden, das Wachstum und/oder die Überlebensdauer von Zellen des Nervensystems zu verstärken, insbesondere, jedoch nicht beschränkt auf, dopaminerge Neuronen, cholinerge Neuronen, sensorische Neuronen, Striatum-Zellen, Zellen des Cortex, des Striatum, des Hippocampus, des Kleinhirns, des Bulbus olfactorius, des Stratum griseum centrale cerebri, der Nuclei raphae, des Locus ceruleus, des Spinalganglions, Derivate neuraler Placoden, sympathische Neuronen und obere und untere Motoneuronen.
Die hierin beschriebenen Faktoren können zum Teil für die Behandlung von Erkrankungen oder Störungen eingesetzt werden, die die Zerstörung von sowohl sensorischen als auch motorischen Neuronen beinhalten, einschließlich z. B. Schädigungen, welche durch Chemotherapie oder Neuropathien, wie diejenigen, die mit Diabetes assoziiert sind, verursacht werden. Die hierin beschriebenen neuen Neurotrophine können im zentralen Nervensystem erhöhte Spezifität und verbesserte Diffusionseigenschaften über die Eltern-Moleküle bereitstellen, womit ein geeignetes Mittel zur Behandlung von Erkrankungen wie Alzheimer, welche den Verlust zahlreicher neuronaler Zelltypen beinhaltet, zur Verfügung stehen.
Die erfindungsgemäß hergestellten chimären neurotrophen Faktoren können für die Behandlung jeder Erkrankung oder Mangelerscheinung eingesetzt werden, für welche die individuellen Faktoren zweckmäßig sind. Z. B. verstärkt PNT-1 die Überlebensdauer von sowohl sympathischen Ganglien als auch von Populationen unterer Vagusganglien, für die gezeigt wurde, daß die Überlebensrate auch von parentalen BDNF und NT-3-Faktoren unterstützt wird. Es kann sich erweisen, daß ein solcher Faktor insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen oder Fehlfunktionen geeignet ist, welche sympathische, parasympathische und sensorische Neuronen beinhalten.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen Faktoren in Verbindung mit einer operativen Gewebeimplantation zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung und/oder Parkinson'schen Erkrankung erfolgen. Faktoren wie PNT-1 können verwendet werden, um die Überlebensdauer dopaminerger Neuronen der Substantia nigra dosisabhängig zu verstärken, was die Verwendung der Faktoren für die Behandlung von Fehlfunktionen dopaminerger Neuronen des zentralen Nervensystems (central nerve System; CNS), einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Parkinson'sche Erkrankung, unterstützt. Zusätzlich wird erwartet, daß PNT-1 die Überlebensfähigkeit von cholinergen Neuronen des CNS und, insbesondere, cholinerger Neuronen des basalen Vorderhirns erhält, was bedeutet, daß sie für die Behandlung von Fehlfunktionen, die cholinerge Neuronen beinhalten, einschließlich, jedoch nicht limitiert auf die Alzheimer Erkrankung, zweckmäßig sind. Es ist gezeigt worden, daß etwa 35% der Patienten mit Parkinson'scher Erkrankung an Demenz des Alzheimer-Typs leiden; erfindungsgemäß hergestellte Faktoren könnten sich als Einzel- Wirkstoff zur Behandlung dieses Krankheitskomplexes erweisen. Auf ähnliche Weise können erfindungsgemäß hergestellte Faktoren zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung in Verbindung mit dem Down-Syndrom therapeutisch eingesetzt werden.
Wirkungsvolle Dosen der hierin beschriebenen Faktoren können in geeignete pharmakologische Träger formuliert und nach einem angemessenen Verfahren verabreicht werden, welches die Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan etc.), durch Absorption über Epithel- oder Haut(Schleimhaut)-Schichten (z. B. orale Mucosa, rectale und intestinale Mucosa etc.) etc. einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Zusätzlich können die Faktoren zusammen mit jedem geeigneten pharmakologischen Träger verwendet werden, der an ein Träger- oder Zielmolekül (z. B. Antikörper, Hormon, Wachstumsfaktor etc.) gekoppelt ist und/oder in Liposomen, Mikrokapseln eingeschlossen werden und vor der in vivo Verabreichung zur kontrollierten Freisetzung vorbereitet werden.

Beispiele

Material und Methoden

Die folgenden Materialen und Methoden werden für jedes der nachfolgenden Beispiele verwendet.

DNA-Clonierung und ortsspezifische Mutagenese

Fragmente, welche die pre-pro-codierenden Sequenzen der Gene von Ratten-NGF (Whittemore, 1988), Maus-BDNF (Hofer, 1990) und Ratten-NT-3 (Ernfors, 1990) enthalten, wurden in den pBS KS + (Stratagene) cloniert. Es ist zu beachten, daß die Aminosäure sequenzen von Maus- und Ratten-BDNF identisch sind (Maisonpierre, 1990). Als Matrize für die auf Oligonucleotiden-basierende ortspezifische Mutagenese, wie von Kunkel beschrieben (Kunkel, 1985), wurde einzelsträngige DNA dieser Plasmide verwendet. Die Austausche wurden durch Nucleotid-Sequenzanalyse nach dem Ketten- Terminationsverfahren (Sanger, 1977) bestätigt. Zur Protein- Expression wurden die DNA-Insertionen, die die gewünschten Austausche enthielten, in den pXM subcloniert (Yang, 1986).

Herstellung und Quantifizierung rekombinanter Proteine.

Zu etwa 70% konfluent gewachsene COS-Zellen wurden mit 25 ug Plasmid-DNA pro 100 ml Petrischale unter Verwendung des DEAE- Dextran-Chloroquin-Protokolls (Luthmann, 1982) transfiziert. Um Unterschiede in den Mengen an durch die unterschiedlichen Konstrukte hergestellten rekombinanten Proteine zu korrigieren, wurden 35 mm-Schalen in Anwesenheit von 100 uCi/ml ³&sup5;S-Cystein (Amersham) gehalten. Aliquots konditioniertes Medium wurden dann in der SDS/PAGE analysiert und die Mengen an rekombinantem Protein in den unterschiedlichen Proben wurde nach densitometrischer Auswertung der entsprechenden Autoradiogramme, wie bereits beschrieben, equilibriert (Ibanez, 1991). Die absolute Menge an wt-NGF-Protein wurde durch quantitatives Immunblotten von konditioniertem Medium und durch Messung der biologischen Aktivität in kultivierten sympathischen Ganglien unter Verwendung von gereinigtem Maus-NGF bestimmt (Ibanez, 1991). Die aus diesen Analysen erhaltenen Daten wurden dann verwendet, um die Protein-Konzentration in den Proben, die wt-BDNF, wt-NT-3, chimäre und mutante Proteine enthielten, zu bestimmen.

Bindungs-Tests

Gereinigter Maus-NGF und BDNF wurden mit dem Lactoperoxidase-Verfahren auf eine durchschnittliche spezifische Aktivität von 1 · 10&sup8; cpm/ug mit ¹²&sup5;I markiert. Für die Markierung von BDNF wurden die Modifikationen, die von Rodriguez-Tebar et al. beschrieben wurden (Rodrigues-Tebar, 1992), verwendet. NIH3T3- Fibroblasten, die TrkA, TrkB oder TrkC exprimieren, wurden in einer Menge von 1-2 · 10&sup6; Zellen/ml verwendet. Die Gleichgewichts- Bindung wurde in Kompetitionstests gemessen, die bei 4ºC durchgeführt wurden, wobei 1,5 · 10&supmin;&sup9; M ¹²&sup5;I-markierter BDNF und serielle Verdünnungen von konditioniertem Medium, welches equivalente Mengen an wt- oder mutiertem NGF-Protein enthielt, verwendet wurden. Alle Komponenten wurden zur gleichen Zeit zugegeben und die Zellen wurden, nachdem das Gleichgewicht erreicht war (90- 120 Minuten Inkubation), durch Zentrifugation gesammelt. Die Zell- Pellets wurden dann in einem Gamma-Zähler gezählt. Kontrollexperimente, in denen Medium von scheintransfizierten COS-Zellen verwendet wurde, zeigten, daß andere Proteine, die in dem konditionierten Medium anwesend waren, keinen Effekt auf die Bindung von ¹²&sup5;I-NGF oder ¹²&sup5;I-BDNF an die Zellen hatten. Unspezifische Bindung wurde in einer parallelen Inkubation gemessen, in welcher ein 300-1000-facher molarer Überschuß unmarkierter, gereinigter Faktor zugegeben wurde. Alle Ergebnisse wurden um diese unspezifische Bindung, die weniger war als 10% (für NGF) oder 30% (für BDNF) der Gesamtbindung, korrigiert. Die Konzentration jedes chimären, mutanten und Wildtyp-Moleküls, die 50% Bindung ergab (IC&sub5;&sub0;), wurde bestimmt und die relative Bindung wurde unter Verwendung folgender Beziehung berechnet: (Mutante IC&sub5;&sub0;/Wildtyp IC&sub5;&sub0;) · 100.

Phosphorylierungs-Tests

Eine konfluente 10 cm-Platte, welche etwa 10&sup7; rtrk-3T3 oder rtrkB-3T3-Zellen enthielt, wurde für 5 Minuten bei 37ºC mit wt-, chimären oder mutanten Faktoren behandelt und nachfolgend mit 1 ml eines eiskalten Puffers, enthaltend 1% NP40, 20 mM Tris pH 8,0, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 mM PMSF, 0,15 U/ml Aprotinin, 20 uM Leupeptin und 1 mM Na-Orthovanadat lysiert. Die Platten wurden 15 Minuten bei 4ºC inkubiert, wonach unlösliches Material durch Zentrifugation entfernt wurde. Die Zell-Lysate wurden vor der Immunpräzipitation auf den Proteingehalt normalisiert. Die Trk-Immunpräzipitation wurde durch Inkubation der Lysate mit 1 ul anti-trkB-polyclonalem Antiserum 443 (Soppet, 1991), welches TrkA, TrkB und TrkC erkennt, durchgeführt. Nach 2 h bei 4ºC wurden die Immunkomplexe mit Protein A-Sepharose (Pharmacia, Schweden) gesammelt, in Lysis-Puffer gewaschen und vor der SDS/PAGE 5 Minuten gekocht. Nach der Elektrophorese wurden die Gele auf Nitrocellulose-Membranen geblottet, mit anti-Phosphotyrosin-monoclonalem Antikörper 4G10 (UBI, New York) umgesetzt und mit dem ECL-Western-Nachweissystem (Amersham, UK) entwickelt. Angemessen exponierte Autoradiogramme der Phosphotyrosin-Blots wurden für die densitometrische Auswertung verwendet.

Biologische Tests

Serielle Verdünnungen konditionierter Medien, die gleiche Mengen an rekombinantem Protein enthalten, wurden wie bereits beschrieben (Ebendal, 1989; Ibanez, 1991) auf Stimulation des Auswachsens von Neuriten auf explantierten, 8 Tage alten (E8) embryonalen sympathischen und unteres Vagus-Ganglien getestet. Das Auswachsen der Faser wurde in einem semi-quantitativen Ansatz in biologischen Einheiten (biological units; BU) gemessen, wobei mit Standards verglichen wurde, welche mit gereinigtem Maus-NGF erhalten wurden, für welchen 1 BU etwa 5 ng/ml aequivalent sind. Die Konzentration jedes Proteins, welche 0,6 BU in diesem Ansatz ergab, wurde bestimmt und verwendet, um die relative Aktivität im Vergleich zu der, die mit wt-NGF erhalten wurde, zu betrachten. Dissoziierte Neuronen aus E8-Hühner-sympathischen und unteres Vagus-Ganglien wurden für 2 h auf Plastik vorplattiert und dann in Platten mit 96 Vertiefungen, welche mit Poly-L-Ornithin und Laminin beschichtet waren, in einer Dichte von 800-1000 Zellen pro Vertiefung gezüchtet. Serielle Verdünnungen von konditionierten Medien, welche gleiche Mengen an rekombinanten Proteinen enthielten, wurden zum Zeitpunkt des Ausplattierens zugegeben und die neuronale Überlebensdauer wurde nach 36 bis 48 h durch Phasenkontrast- Mikroskopie bestimmt, wobei die Anzahl der überlebenden Neuronen in der ganzen Vertiefung gezählt wurde.

Beispiel 1. Strukturelle Elemente in NGF, die für die Bindung an und Aktivierung von TrkA veranwortlich sind.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß NGF beträchtliche strukturelle Veränderungen ohne substantiellen Verlust biologischer Aktivität tolerieren kann (Ibanez, 1990; Ibanez, 1991; Ibanez, 1992). Konsistent mit dieser Beobachtung wurden durch den individuellen Austausch der variablen Regionen I, II, III, IV oder V mit den vergleichbaren Regionen aus BDNF chimäre Moleküle erzeugt, die bezüglich der TrkA-Rezeptorbindung, Aktivierung und in ihrer biologischen Aktivität vom wt-NGF nichtunterscheidbar waren (nicht gezeigt) (siehe SEQ. ID. NR. 1 und 2 für alle chimären Konstrukte). Darüber hinaus behielt das chimäre Molekül I + III + IV + V Wildtyp- Mengen der Bindung an TrkA, obwohl mehr als 50% seiner variablen Sequenzen durch die entsprechenden Sequenzen des BDNF ersetzt wurden (Fig. 2A und Tabelle 1). Der Austausch dieser Regionen hatte keine Auswirkung auf die Mengen an TrkA-Tyrosinkinase- Phosphorylierung (Fig. 2B), er reduzierte jedoch die biologische Aktivität auf sympathische Neuronen auf 50% des Wildtyp-NGF (Fig. 2D und Tabelle 1). Aus diesen Ergebnissen folgt, daß die verbleibenden NGF-variablen Regionen (d. h. Region II und die NH&sub2;- und COOH-Enden) für die NGF-Aktivitäten des I + III + IV + V-Moleküls verantwortlich sein könnten. Um dies zu testen, wurden die NH&sub2;- und COOH-Enden im Wildtyp-NGF und in den I + III + IV + V-Chimären durch diejenigen von BDNF ersetzt. Der Ersatz des COOH-Endes von NGF mit dem von BDNF hatte keinen Effekt auf die TrkA-Bindung, TrkA- Aktivierung oder biologische Aktivität (Fig. 2A, C, D und Tabelle 1). Der Ersatz des NH&sub2;-Endes jedoch reduzierte die Bindungsaffinität für TrkA 4-5fach (Fig. 2A). Interessanterweise wurde durch die reduzierte TrkA-Bindung weder die TrkA-Phosphorylierung noch die biologische Aktivität beeinflußt (Tabelle 1 und Fig. 2D). Der Ersatz des NH&sub2;-Endes in den I + III + IV + V-Chimären reduzierte jedoch die Bindung, die Rezeptor-Phosphorylierung und biologische Aktivität auf weniger als 1% des Wildtyp-NGF (Fig. 2A, C und D). Man beachte, daß diese Chimäre die beiden NH&sub2;- terminalen Ser-Reste von NGF, gefolgt von dem NH&sub2;-Ende von BDNF behielt (Fig. 1A). Es wurden deshalb zusätzliche Moleküle mit dem NH&sub2;-Ende konstruiert (nicht gezeigt), was ergab, daß Reste, die für TrkA-Bindung in dieser Region wichtig sind, zwischen den Positionen 3 und 9 lokalisiert sind.
Die Unterschiede, die zwischen den NH&sub2;-, I + III + IV + V- und NH&sub2; + I + III + IV + V- Molekülen beobachtet wurden, ergaben, daß abseits vom NH&sub2;-Ende, andere variable Regionen synergistisch mit dem NH&sub2;-Ende kooperieren könnten, um die Bindung, Rezeptor- Aktivierung und biologische Aktivität zu verstärken. Um diese Möglichkeit zu testen, tauschten wir alternativ die variablen Regionen I, IV oder V in der NH&sub2; + I + III + IV + V Chimären zu denjenigen von NGF zurück, wobei die Moleküle NH&sub2; + III + IV + V, NH&sub2; + I + III + V bzw. NH&sub2; + I + III + IV generiert wurden. Jeder dieser drei Austausche stellte die Rezeptorbindung teilweise wieder her (Fig. 3A und Tabelle 1), womit das Argument unterstützt wurde, daß die Regionen I, IV und V ebenfalls in den Kontakt mit TrkA involviert sind. Durch Region V (Chimäre NH&sub2; + I + III + IV) wurde eine stärkere Rezeptor-Bindung erzielt als durch die Regionen 1 oder IV (Chimären NH&sub2; + III + IV + V bzw. NH&sub2; + I + III + V), obwohl keiner dieser Austausche mehr als 20 bis 25% der Wildtyp-NGF-Bindung ergab (Tabelle 1). Die Rezeptor-Phosphorylierung und biologische Aktivität in sympathischen Neuronen wurde auf 40% des Wildtyp-NGF wiederhergestellt (Fig. 3B und Tabelle 1). In dem biologischen Test waren die Chimären NH&sub2; + I + III + V und NH&sub2; + I + III + IV wirkungsvoller als NH&sub2; + III + IV + V, was bedeutet, daß die Regionen IV und V die NGF-Responsivität wirkungsvoller wiederherstellen können als Region I (Tabelle 1). Frühere Ergebnisse auf der Grundlage eines Alanin-Scanning der variablen Region I ergaben, daß Ile-31 für die maximale biologische Aktivität von NGF wichtig ist (Ibanez, 1992). In Übereinstimmung damit resultierte der Austausch von Ile-31 durch Ala in einer vierfachen Verminderung der TrkA-Rezeptor-Bindung (Fig. 3B), was bedeutet, daß dieser exponierte hydrophobe Rest beim Kontakt mit TrkA involviert ist.
Der Ersatz der Regionen IIa, IIb und IIa + IIb (d. h. Region II) im Wildtyp-NGF reduzierte die Menge an rekombinantem Protein nahezu auf nicht nachweisbare Mengen. Der Ersatz dieser Regionen in der I + III + IV + V-Chimären erlaubte eine Protein-Produktion von 5-10% der Wildtyp-Mengen. Chimäre Moleküle, die diese variablen Sequenzen von BDNF enthielten, behielten immer noch hohe Mengen an Bindungsaktivität für TrkA (Fig. 4A und Tabelle 1). Darüber hinaus war das chimäre Molekül I + IIa + III + IV + V bezüglich Rezeptor- Phosphorylierung und biologischer Aktivität auf Neuronen von I + III + IV + V nicht unterscheidbar (Fig. 4B und D). Im Gegensatz dazu wurde eine drastische Abnahme von sowohl Rezeptor-Aktivierung und biologischer Aktivität beobachtet, wenn die Reste 45 bis 49 ausgetauscht wurden (Chimäre Moleküle I + IIb + III + IV + V) (Fig. 4B, D und Tabelle 1), was bedeutet, daß die zweite Hälfte dieses variablen Loops für die Aktivierung des TrkA-Rezeptors durch NGF wichtig ist. Der Austausch der kompletten Region II (Molekül I + II + III + IV + V) resultierte sogar in niedrigeren Mengen an Rezeptor-Phosphorylierung und Bioaktivität (Fig. 4B, D und Tabelle 1). Interessanterweise behielten diese beiden Moleküle trotz ihrer niedrigen biologischen Aktivität hohe Mengen an TrkA-Bindung, wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, daß sie das NH&sub2;-Ende von NGF enthielten.
Die funktionelle Wichtigkeit der Aminosäure-Reste in der variablen Region II wurde durch Alanin-Scanning-Mutagenese weiter untersucht. Glu-41, Asn-43, Ile-44, Asn-45, Asn-46 und Val-48 wurden im Wildtyp-NGF jeweils durch Ala ersetzt. Überraschenderweise beeinflußte keine dieser Mutationen die Rezeptor-Bindung, Rezeptor- Phosphorylierung oder Bioaktivität des NGF-Moleküls. Das gleiche Alanin-Scanning-Mutagenese-Verfahren wurde dann im I + III + IV + V- Molekül durchgeführt. Diese Chimäre stellte einen etwas sensitiveren Hintergrund bereit, worin die Wirkungen der einzelnen Austausche stärker zum Tragen kamen. In diesem Zusammenhang verminderte der Austausch Glu-41 durch Ala die TrkA-Phosphorylierung und biologische Aktivität wesentlich (Fig. 4C, D und Tabelle 1). Die Mutation von Asn-45 zeigte eine weniger ausgeprägte Wirkung, während der Ala-Austausch an jeder der anderen Positionen keine Wirkung hatte (Tabelle 1).

Beispiel 2. Strukturelle Elemente in BDNF, welche für die Bindung und Aktivierung von TrkB verantwortlich sind.

Es ist bereits gezeigt worden, daß chimäre Moleküle mit einigen Kombinationen der variablen Regionen I, III, IV und V neurotrophe Spezifitäten zeigen, was sowohl für NGF als auch BDNF chrakteristisch ist, da sie das Auswachsen der Neunte von sowohl sympathischen- als auch unteres Vagus-Ganglien stimulierten (Ibanez, 1991). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen stimulierten die chimären Moleküle III + IV + V und I + III + IV + V hohe Mengen an Tyrosin-Phosphorylierung des TrkB-Rezeptors (Fig. 5A). Das chimäre Molekül I + III + IV und die Doppel-Chimäre I + IV und III + IV stimulierten ebenfalls die TrkB-Phosphorylierung (Fig. 5A), trotz der Tatsache, daß keine BDNF-ähnlichen biologischen Aktivitäten mit diesen Molekülen gesehen wurden (Ibanez, 1991). Deshalb wies der Rezeptor-Phosphorylierungstest Ligand-Rezeptorinteraktionen nach, die wahrscheinlich zu schwach waren, um eine biologische Antwort zu erwirken (siehe nachfolgend). In Tests chimärer Moleküle mit einzelnen Austauschen variabler Sequenzen wurde mit den Regionen II, III oder den NH&sub2;- und COOH-Enden keine TrkB-Aktivierung nachgewiesen (Fig. 5B, 5C und Tabelle 2), obwohl dies im Falle für Region II durch die niedrigen produzierten Mengen dieses chimären Moleküls bedingt sein könnte. Im Gegensatz dazu wurde mit den chimären Molekülen IV und V eine signifikante Rezeptor-Phosphorylierung und mit der Chimäre I ein schwaches aber konsistentes Signal nachgewiesen (Fig. 5B), was bedeutet, daß diese Regionen mit dem TrkB-Rezeptor interagieren. Es ist zu bemerken, daß nachweislich die gleichen Regionen auch an dem Kontakt von NGF mit TrkA beteiligt sind (Fig. 3A und 3B).
Drei hauptsächliche Veränderungen wurden nach Austausch mit der BDNF-variablen Region IV im NGF eingeführt: Tyr-79, Tyr- 81 und His-84 durch Gln, Arg bzw. Gln (Fig. 1A). Interessanterweise sind diese Reste in anderen Neurotrophinen, von welchen berichtet wurde, daß sie mit TrkB interagieren, z. B. NT-3 und NT-4, ebenfalls vorhanden. Andererseits besitzt BDNF in der variablen Region V drei positiv geladene Reste an den Positionen 95, 96 und 97, die in anderen Neurotrophinen nicht vorhanden sind. Wir überprüften die Möglichkeit, daß einige dieser Reste für die Fähigkeit der ChimärenIV und V, den TrkB-Rezeptor zu aktivieren, verantwortlich sind. Tyr-79 und Thr-81 in der Region IV wurden simultan durch Gln bzw. Arg ersetzt und Gln-96 in Region V wurde durch das Dipeptid Lys-Arg ausgetauscht. Die Doppelmutante Y79Q + T81R war nicht in der Lage, die TrkB-Phosphorylierung in dem Maße, wie mit Region IV gesehen, zu stimulieren (Fig. 5C), was bedeutet, daß Gln an Position 84 wichtig ist, und/oder daß die synergistische Kooperation dieser drei Reste für die Rezeptor-Aktivierung notwendig ist. Im Gegensatz dazu resultierte die Mutation von Gln-96 in NGF in Lys-Arg in einem Molekül, welches die Tyrosin- Phosphorylierung von TrkB stimulieren kann (Fig. 5C). Diese Mutante verursachte das gleich Ausmaß an Rezeptor-Aktivierung wie die Chimäre V, was bedeutet, daß die positiven Ladungen in Region V für die Aktivierung von TrkB wichtig sind. Ein Vergleich der Resultate, die in den Fig. 5A, 5B und 5C dargestellt sind, zeigt, daß die Wirkungen der Austausche und Mutationen für die Rezeptor-Aktivierung nur zum Teil additiv sind, was bedeutet, daß sowohl unabhängige wie auch synergistische Kontakte mit dem Rezeptor erfolgen.
Trotz ihrer Fähigkeit, die TrkB-Phosphorylierung zu stimulieren, zeigten diese Mengen in kompetitiven Bindungstests ein sehr niedriges Ausmaß an Rezeptor-Bindung. Wie in Fig. 5D dargestellt, zeigten die Moleküle, die in multiplen Regionen chimär waren (einschließlich der Chimäre I + III + IV + V) Bindungsaffinitäten, die 100 bis 300-fach niedriger als beim Wildtyp- BDNF waren (Fig. 5D und Tabelle 2). Um zu untersuchen, in welchem Ausmaß die Rezeptor-Phosphorylierung, die mit diesen Molekülen beobachtet wird, in eine biologische Wirkung übersetzt wird, wurde die Fähigkeit der unterschiedlichen Chimären, die Überlebensdauer dissozzierter Neuronen aus den unteres Vagus-Ganglien zu erhöhen, getestet. Von all den Kombinationen variabler Regionen I, III, IV und V, die getestet wurden, verstärkte nur das chimäre Molekül I + III + IV + V die Überlebensrate der Neuronen aus dem unteren Vagus. Im Vergleich zu Wildtyp-BDNF konnten jedoch nur 30% der Neuronen mit absättigenden Mengen dieses Proteins gerettet werden (Tabelle 2 und Fig. 5E). Andere chimäre Moleküle waren nicht in der Lage, die Überlebensdauer von Neuronen des unteren Vagus-Ganglion zu verstärken, obwohl sogar in vorangegangenen Studien gezeigt wurde, daß einige von ihnen (z. B. die chimären Moleküle III + V und III + IV + V) in der Lage waren, das Auswachsen von Neuriten aus Explantaten dieses Ganglions zu induzieren (Ibanez, 1991) (siehe nachfolgend).
Die niedrige Rezeptorbindung, die von Molekül I + III + IV + V gezeigt wurde, veranlaßte eine Untersuchung der Beteiligung der variablen Region II und der NH&sub2;- und COOH-Enden von BDNF an der TrkB-Bindung. Im Gegensatz zu dem, was für NGF gesehen wurde, ergab der Austausch des NH&sub2;-Endes von BDNF in die I + III + IV + V- Chimäre nur eine geringere Verbesserung der Bindung an TrkB (Tabelle 2 und Fig. 6A). Der Austausch von Sequenzen aus der variablen Region II resultierte in chimären Molekülen mit erhöhter Affinität für TrkB-Rezeptoren (Fig. 6A und Tabelle 2). Beide Hälften der variablen Region II waren gleichermaßen wirkungsvoll für die Verbesserung der Bindung an TrkB, wobei nun 12% des Ausmaßes erreicht wurden, welches mit Wildtyp-BDNF erzielt wurde (Tabelle 2). Die beiden Sequenzen kooperierten synergistisch, da das I + II + III + IV + V-Molekül mit nur 2-fach niedriger Affinität an TrkB gebunden hat als Wildtyp-BDNF (Fig. 6A und Tabelle 2).
Ein Austausch der Sequenzen der NH&sub2;- und COOH-Enden von BDNF in dem I + III + IV + V-Molekül verbesserte die biologische Aktivität auf Neuronen des unteren Vagus nicht (Fig. 6B). Der Austausch der Region IIb, jedoch nicht IIa, resultierte in einem Molekül, welches in der Lage war, 60% der Neuronen des unteren Vagus, im Vergleich zu Wildtyp-BDNF, zu retten (Fig. 6B und Tabelle 2). Dies bedeutet, daß die Reste 45 bis 49 im BDNF für die weitere Aktivierung des TrkB-Rezeptors wichtig sind. Es ist zu bemerken, daß diese Region, jedoch nicht die Region IIa, nachweislich auch für die Aktivierung von TrkA durch NGF wichtig ist (Fig. 4B). Die biologische Aktivität für Neuronen des unteren Vagus erreichte 80% des Wildtyp-BDNF-Ausmaßes, wenn die vollständige Region II ersetzt wurde (Rest 40 bis 49) (Fig. 6B und Tabelle 2), was bedeutet, daß die Region IIa (Rest 40 bis 44) indirekt dazu beitragen kann, indem sie eine Konformation dieses Loop erlaubt, welche den Kontakt der Reste 45 bis 49 mit dem TrkB-Rezeptor erleichtert.

Beispiel 3. Ähnliche Mengen an TrkB-Rezeptor-Phosphorylierung kann in unterschiedlichen biologischen Eigenschaften resultieren.

Wie in Fig. 5 gezeigt, verursachten einige chimäre Moleküle eine beträchtliche Phosphorylierung von TrkB-Rezeptoren, waren aber nicht in der Lage BDNF-ähnliche biologische Aktivitäten auf Neuronen zu vermitteln. Darüberhinaus war eine interessante Diskrepanz zwischen den Fähigkeiten einiger chimärer Moleküle (z. B. III + IV + V), das Auswachsen der Neunte und die neuronale Überlebensdauer zu verstärken, zu sehen. Die mögliche Signifikanz dieser Unterschiede wurde erforscht, indem die Dosis-Antwort der TrkB-Phosphorylierung und der biologischen Aktivitäten zwischen einigen dieser chimären Moleküle und Wildtyp-BDNF verglichen wurden. Wie in Fig. 7A gezeigt, wurden mit Wildtyp-BDNF und den chimären Molekülen I + III + IV + V und III + IV + V ähnliche Dosis- Antwort-Kurven der Rezeptor-Phosphorylierung erhalten, obwohl die letzteren beiden in Richtung höhere Konzentrationen verschoben wurden. In diesem Test war die EC&sub5;&sub0; für Wildtyp-BDNF 5 ng/ml, wohingegen die EC&sub5;&sub0; für die chimären Moleküle I + III + IV + V und III + IV + V 125 bzw. 250 ng/ml waren (Fig. 7A). Trotz dieser Unterschiede stimulierten sowohl die chimären Moleküle als auch Wildtyp-BDNF das Auswachsen der Neuriten von explantierten unteres Vagus-Ganglien in ähnlichem Ausmaß, wenn sie mit Konzentrationen im Bereich von 20 bis 200 ng/ml getestet wurden (Fig. 7B und nicht veröffentliche Ergebnisse). Es wurden jedoch wichtige Unterschiede bezüglich ihrer Fähigkeit, die neuronale Überlebensdauer der unteren Vagus-Neuronen zu ver stärken, sichtbar (Fig. 7C). Das chimäre Molekül III + IV + V war nicht in der Lage, sogar bei Konzentrationen, die erhebliche Mengen an Rezeptor-Phosphorylierung erlaubten, die neuronale Überlebensrate zu erhöhen (vgl. Fig. 7A und 7C).
Andererseits waren die chimären Moleküle I + III + IV + V in der Lage, einige Neuronen zu retten, es wurde aber ein Plateau erreicht, welches dreifach niedriger war als das von Wildtyp- BDNF, sogar obwohl beide Moleküle ähnliche maximale Werte an TrkB-Phosphorylierung verursachten (vergleiche Fig. 7A und 7C). Ein Vergleich der Fig. 7A, 7B und 7C zeigt, daß alle drei Moleküle in ähnlichem Ausmaß das Auswachsen der Neunte verstärken, wenn ihre jeweiligen EC&sub5;&sub0;-Werte der Rezeptor-Phosphorylierung getestet werden, während sie sich in ihrer Fähigkeit, die Überlebensdauer der gleichen Neuronen zu erhöhen, stark unterscheiden, was bedeutet, daß sie unterschiedliche Formen der Rezeptoraktivierung induzieren.

Beispiel 4. Erzeugung eines multifunktionellen Neurotrophin- Agonisten: Pan-Neurotrophin-1

Die Information, die aufgrund der Struktur-Funktion-Beziehung in NGF und BDNF erhalten wurde, wurde für den Entwurf eines multifunktionellen Neurotrophin-Agonisten verwendet, welcher hierin als Pan-Neurotrophin-1 bezeichnet wird. Da NT-3 das einzige Neurotrophin ist, welches TrkC bindet und aktiviert, wurde es als ein Gerüst verwendet (siehe SEQ. ID. NR. 1, 2 und 3 für die chimären Konstrukte). NT-3 stimuliert auch die Tyrosin-Phosphorylierung von TrkB und, in geringerem Maße, TrkA, obwohl seine Wirksamkeit, über diese Rezeptoren biologische Effekte zu erzielen, 100 mal niedriger als für BDNF bzw. NGF zu sein scheint (Cordon-Cardo, 1991; Klein, 1991b; Squinto, 1991; Glass, 1991). Zusätzlich liegt NT-3 strukturell in intermediärer Position zwischen NGF und BDNF (Halbook et al., 1991) und variable Sequenzen in NT-3 enthalten Merkmale von funktioneller Wichtigkeit sowohl in NGF und BDNF (Fig. 1A). Basierend auf unseren Ergebnissen mit chimären Molekülen untersuchten wir die Fähigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenzen von NGF, die NT-3-Bindung an den und die Aktivierung des TrkA-Rezeptors zu verbessern. Variable Sequenzen der Region V von BDNF wurden in einem Versuch, die Interaktion mit dem TrkB-Rezeptor zu verstärken, ebenfalls eingeführt. Neben der Doppelchimäre (PNT-1) wurden auch einzelchimäre Moleküle (z. B. NGF NH&sub2;/NT-3 bzw. BDNF V/NT-3) konstruiert.
PNT-1 stimulierte eine effiziente Tyrosin-Phosphorylierung von TrkA, B und C (Fig. 8A, 8B bzw. 8C). Im Vergleich zu Wildtyp NT-3 war die Phosphorylierung von TrkA signifikant erhöht und ein Anstieg der TrkB-Phosphorylierung im Vergleich zu Wildtyp- NT-3 war ebenfalls zu sehen. Im allgemeinen aktivierte PNT-1 Trk-Rezeptoren in einem Maß, das vergleichbar war mit dem, das mit jedem der verwandten Wildtyp-Liganden erhalten wurde. Zusätzlich war die Bindungsaffinität in PNT-1 von etwa 3% (entsprechend dem Wildtyp NT-3) auf nahezu 50% verbessert, verglichen mit dem Wildtyp-NGF (Fig. 8D). Interessanterweise war die Affinität von BDNF V/NT-3, in Übereinstimmung mit der Feststellung, daß positive Ladungen in der Region V mit der Bindung an TrkA interferieren, sogar niedriger als die von Wildtyp-NT- 3 (Fig. 8D). Die Bindung an TrkB war in PNT-1 oder BDNF V/NT-3, im Vergleich zu Wildtyp-NT-3, nicht verändert (nicht gezeigt).
Die biologische Aktivität von PNT-1 und verwandter Moleküle wurde in sympathischen Neuronen und Neuronen aus dem unteren Vagus-Ganglion getestet. Sowohl PNT-1 als auch NGF NH&sub2;/NT-3 stimulierten das Auswachsen der Neuriten aus explantierten sympathischen Ganglien wirkungsvoll. Im Gegensatz dazu zeigte Wildtyp-NT-3 nur einen geringen Effekt, wenn es bei hohen Konzentrationen getestet wurde (vergleiche die Fig. 9A, 9B, 9C und 9D). Ein Vergleich der Dosis-Response-Kurven zeigte sowohl in PNT-1 als auch in NGF NH&sub2;/NT-3 in Bezug auf Wildtyp- NT-3 einen deutlichen Anstieg NGF-ähnlicher biologischer Aktivität (Fig. 9E). Im Vergleich mit Wildtyp-NGF lag die Wirksamkeit von NGF NH&sub2;/NT-3 und PNT-1 8- bzw. 15-fach niedriger. Wie durch das TrkA-Bindungsexperiment belegt, beruhen die Unterschiede in der Bioaktivität zwischen NGF NH&sub2;/NT-3 und PNT-1 wahrscheinlich auf dem strukturellen Einfluß der Region V von BDNF auf die Interaktion mit TrkA. Die Fähigkeit von PNT-1, das Auswachsen der Neuriten sympathischer Ganglien zu stimulieren, korrelierte mit der Überlebensdauer dissoziierter sympathischer Neuronen (Fig. 9F), wohingegen mit Wildtyp-NT-3 kein Überleben gesehen wurde (Fig. 9F).
Frühere Studien haben gezeigt, daß BDNF und NT-3 additive Wirkung auf die Überlebensdauer von Neuronen des unteren Vagus zeigen, was bedeutet, daß die beiden Faktoren die Überlebensdauer verschiedener neuronaler Populationen in diesem Ganglion verlängern (Hohn, 1990; Gotz, 1992). Dann wurden die Effekte von PNT-1 auf die Überlebensdauer von Neuronen des unteren Vagus getestet, um die Wirksamkeit dieses Moleküls als BDNF- und NT-3-Agonist zu evaluieren. Wie erwartet war Wildtyp-NGF nicht in der Lage, Neuronen aus diesem Ganglion zu retten, wohingegen Sättigungs-Konzentrationen von Wildtyp-BDNF und Wildtyp-NT-3 40 bzw. 25% retten konnten (Fig. 9G). PNT-1 erhöhte die Überlebensdauer von 45% der Neuronen des unteren Vagus, nahezu ein 2-facher Anstieg im Vergleich zu NT-3 (Fig. 9G). Vergleichbare Wirkungen auf die Überlebensdauer wurden mit der BDNF V/NT-3-Chimären erhalten, was bedeutet, daß die ansteigende Aktivität auf dem Austausch der Region V in NT-3 mit Region V aus BDNF beruhte. Man sollte jedoch beachten, daß die Überlebensdauer-Raten mit PNT-1 nicht das erwartete Ausmaß für additive Wirkungen von BDNF und NT-3 (etwa 65%) (Figur - 9G) erreichten, was bedeutet, daß PNT-1 ein partieller BDNF- Agonist ist.

Beispiel 5: Dreidimensionale Struktur von NGF

Die Position der Aminosäurereste, welche für die Interaktion von Neurotrophinen mit Trk-Rezeptoren verantwortlich sind, wurde durch Computergraphiken in der Kristallstruktur des NGF-Dimers untersucht (McDonald, 1991). Wenn man diese Reste in der dreidimensionalen Struktur anschaut, beschreiben sie eine kontinuierliche Oberfläche, welche sich ungefähr parallel zu der zweifachen Achse des NGF-Dimers erstreckt. Die Regionen I, IV und V eines Protomers bilden eine kontinuierliche Oberfläche unterhalb der Seite des NGF-Dimers. Oberhalb des Dimers tritt diese Oberfläche mit der Region II des anderen Protomers in Kontakt. Wenn man von der Oberseite des Moleküls entlang der zweifachen Achse schaut, fügen sich die Reste 31 bis 34 (Region I) und die Reste 95 bis 97 (Region V) des ersten Protomers und die Reste 41 und 45 bis 49 (Region II) des zweiten Protomers zu einer kontinuierlichen Fläche zusammen, welche sich über die Seiten des NGF-Dimers erstreckt. In der mittleren Region des NGF- Dimers erstreckt sich die Bindungs-Oberfläche mit den Resten 79, 81 und 84 (Region IV) des ersten Protomers bis hinab zu etwa 3/4 des Moleküls (McDonald, 1991) und, obwohl sie hinsichtlich der anderen Regionen des Moleküls nicht positioniert werden können, ist man versucht, zu spekulieren, daß sie bei der Ausbreitung der Bindungsoberfläche entlang der Seite des Dimers kooperieren. Insgesamt ist die Bindungsstelle eine ziemlich flache und langgestreckte Oberfläche, die sich bis zur Loop-Region II erstreckt, die aus dem Rest des Moleküls hervorsteht und welche gut vorstellbar in der Rezeptor-Bindungstasche verborgen wird.

Diskussion

Wir haben früher 5 variable Regionen definiert, in welchen die NGF-Sequenz sich von der von BDNF und NT-3 unterscheidet (Fig. 1A); (siehe SEQ. ID. NR. 1, 2 und 3) (Ibanez, 1991). Drei dieser Regionen (die variablen Regionen I, II und V) entsprechen der β- Haarschleife, die auf der Oberfläche des NGF-Moleküls exponiert sind, wohingegen Region III eine geläufige Windung enthält und Region IV ein β-Strang ist (Fig. 1B) (McDonald, 1991). Unter Verwendung Oligonucleotid-vermittelter ortsspezifischer Mutagenese wurden die variablen Regionen in dem NGF-Molekül systematisch ersetzt, entweder alleine oder in verschiedenen Kombinationen durch die entsprechenden Sequenzen aus BDNF. Es wurden chimäre Moleküle konstruiert, welche Sequenzen des NH&sub2;- und COOH-Endes von BDNF enthalten. Zusätzlich wurden entweder in dem Wildtyp (wt)-NGF-Molekül oder im Zusammenhang eines chimären Moleküls Punktmutationen erzeugt. Die chimären und mutierten Moleküle wurden transient in COS-Zellen exprimiert und die Ausbeute an rekombinanten Proteinen wurde durch SDS-PAGE metabolisch markierter Polypeptide und durch Western-Blot-Analysen quantifiziert. Serielle Verdünnungen konditionierter Medien, welche equivalente Mengen der unterschiedlichen rekombinanten Proteine enthielten, wurden dann in kompetitiven Rezeptor-Bindungstests und Rezeptor-Tyrosin-Phosphorilierung-Tests unter Verwendung von Fibroblasten, die die TrkA oder TrkB-Rezeptoren ektopisch exprimieren, getestet (Kaplan, 1991; Soppet, 1991). Die biologische Aktivität der unterschiedlichen Moleküle wurde in Kulturen NGF-responsiver Neuronen sympathischer Ganglien aus embryonalen Hühnern und BDNF-responsiver Neuronen aus embryonalen unteres Vagus-Ganglien getestet. Strukturelle Elemente, die an der Interaktion von NGF und BDNF mit ihren jeweiligen TrkA- und TrkB-Rezeptoren beteiligt sind, wurden simultan durch Evaluierung der Wirkung der Mutationen als Verlust von NGF-Funktion bzw. Gewinn von BDNF-Funktion untersucht.

Rezeptorbindungsstellen für Trk-Rezeptoren in Neurotrophinen

Unsere Studien über strukturelle Determinanten für die Bindung und Aktivierung von Trk-Rezeptoren durch NGF und BDNF zeigen zahlreiche Kontakte, die für die Rezeptor-Bindung, die Rezeptor- Aktivierung und biologische Aktivität synergistisch kooperieren. Die Aminosäurereste, die die Interaktion von NGF mit TrkA vermitteln, wurden dem NH&sub2;-terminalen Ende (Reste 3 bis 9), der variablen Region I (hauptsächlich Ile-31), der variablen Region II, insbesondere Glu-41 und die Reste 45 bis 49 (hauptsächlich Asn-45) und den variablen Regionen IV und V (Reste 94 bis 98) zugeordnet. Innerhalb der variablen Region IV sind Tyr-79, Thr-81 und His-84 in den NGF aller Arten, die bis jetzt analysiert wurden vorhanden, werden aber in anderen Neurotrophinen durch nichtkonservierte Reste ersetzt (Halbook, 1991), was bedeutet, daß sie die Interaktion von der Region IV von NGF mit TrkA vermitteln könnten. Interessanterweise sind die strukturellen Elemente, die die Interaktion von BDNF mit dem TrkB-Rezeptor vermitteln, im allgemeinen in den Variablen Regionenlokalisiert, die denjenigen analog sind, die an der Interaktion von NGF mit TrkA beteiligt sind. So wurde gezeigt, daß die Reste in den variablen Regionen I, IV und V mit TrkB interagieren und die Rezeptor-Phosphorylierung verstärken. In Region V sind Lys-96 und Arg-97 für diesen Effekt verantwortlich, wohingegen in Region IV Gln-84 wichtig zu sein scheint. In ähnlicher Weise sind die Reste 45 bis 49 in der variablen Region II an der TrkB-Bindung und der Bioaktivität in Neuronen des unteren Vagus beteiligt. Ein bemerkenswerter Unterschied wurde jedoch für das NH&sub2;-terminale Ende gefunden, welches für die Rezeptor-Bindung in BDNF eine weniger wichtige Rolle zu spielen scheint als in NGF. Für diese Sequenzen in BDNF sind weitere Mutagenesen erforderlich, um ihre Rolle für die TrkB-Bindung klarzustellen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß während der Evolution die Neurotrophine einen allgemeinen Mechanismus zur Bindung an ihre Rezeptoren konserviert haben, und daß eine parallele Evolution verwandter Liganden und Trks spezifische Kontakte über unterschiedliche Reste in den gleichen variablen Regionen der Neurotrophine entwickelt haben.
Die Ergebnisse, die mit chimären Molekülen des NH&sub2;-terminalen Endes (Reste 3 bis 9) von NGF erhalten wurden, zeigen, daß diese Region für die Bindung an TrkA wichtiger ist als für die Aktivierung oder biologische Aktivität. Die Rolle der anderen variablen Regionen bei der Rezeptor-Bindungscheint sekundär und wahrscheinlich synergistisch mit dem NH&sub2;-terminalen Ende zu sein, indem der Ligand-Rezeptor-Komplex stabilisiert wird. Aufgrund der geringen Dichte des NH&sub2;-terminalen Endes in der strukturellen Karte geht man davon aus, daß diese Region sowohl flexibel als auch für Lösungsmittel zugänglich ist (McDonald, 1991). Es ist möglich, daß die NH&sub2;-terminale Kette von NGF als Anker für den initialen Rezeptorkontakt wirkt, auf eine Weise ähnlich der, die für das COOH-terminale Ende der Insulin-β-Kette vorgeschlagen wurde (Nakagawa, 1986). Diese initiale Bindung würde dann zu weiteren Konformationsänderungen im Ligand und/oder Rezeptor führen, um damit die Bindungs-Interaktionen zu optimieren und die Rezeptor-Aktivierung zu erlauben.
Es ist im allgemeinen anerkannt, daß die Liganden-induzierte Aktivierung von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren durch Rezeptor-Dimerisierung oder -Oligomerisierung vermittelt wird (Schlessinger, 1988). Crosslinking-Studien zeigten die Bildung von TrkA-Homodimeren nach NGF-Bindung an PC12-Zellen und Fibroblasten, die ektopisch TrkA exprimieren (Meakin, 1991; Jing, 1992). Kürzlich demonstrierten Jing et. al. (1992) unter Verwendung von Kinasedefizienten Mutanten des TrkA-Rezeptors, daß die Bildung von funktionellen TrkA-Homodimeren für die NGF-vermittelte Rezeptor- Autophosphorylierung und Signaltransduktion notwendig ist. Aufgrund der 2-fachen Symmetrie des NGF-Dimers bilden sich auf beiden Seiten des Moleküls identische Bindungsoberflächen aus, wobei jede strukturelle Elemente von beiden Protomeren enthält. Es ist deshalb offensichtlich, daß ein bivalentes NGF- Dimer die Dimerisierung benachbarter TrkA-Rezeptoren vermitteln könnte. Die Bindung des NGF-Dimers an ein TrkA-Molekül könnte die Assozziation des Komplexes mit einem zweiten TrkA- Molekül über die verbleibende Bindungsoberfläche verstärken, wobei Rezeptor-Autophosphorylierung und Signaltransduktion resultiert (Fig. 10). Obwohl die Validierung dieses Modells die Bestimmung der Stöchiometrie des NGF-TrkA-Komplexes erfordert, wurden ähnliche Modelle von Liganden-induzierter-Tyrosin-Kinase- Rezeptor-Dimerisierung für ander bivalente Liganden wie aus Blutplättchen erhaltener Wachstumsfaktoren (platelet-derived growth factor; PDGF) vorgeschlagen (Heldin, 1989; Seifert, 1989). Im Falle von PDGF wurde vorgeschlagen, daß jedes PDGF-Monomer mit einem isolierten Monomer des Rezeptors interagiert, wohingegen bei den Neurotrophinen beide Neurotrophin-Monomere den Kontakt mit jedem Trk-Rezeptor herzustellen scheinen. Die Tatsache, daß natives BDNF und NT-3 auch dimere Moleküle zu sein scheinen (Radziejewski, 1992) bedeutet, daß dieses Modell für alle Neurotrophine angewendet werden könnte.
Die Aminosäurereste, die die Bindung von NGF an LNGFR vermitteln sind kürzlich identifiziert worden (Ibanez, 1992). Interessanterweise scheinen diese Reste teilweise mit der TrkA- Bindungsstelle, welche in dieser Studie identifiziert wurde, zu überlappen. Die Assoziation zwischen LNGFR und TrkA wurde als ein notwendiger Schritt für die Bindung an NGF-Bindungsstellen mit großer Affinität vorgeschlagen (Hempstead, 1991), obwohl Ergebnisse aus anderen Laboratorien kürzlich dieses Modell angefochten haben (Klein, 1991; Jing, 1992). Komplexe zwischen LNGFR und TrkA wurden bis jetzt in Crosslinking-Experimenten, mit entweder PC12-Zellen, Fibroblasten oder sensorische Neuronen unter Bedingungen, die den Nachweis von LNGFR- oder TrkA-Homodimeren erlauben, bis jetzt nicht nachgewiesen (Hosang, 1985; Meakin, 1991; Jing, 1992). In unserem Modell, unter der Voraussetzung, daß keine sterischen Hinderungen auftreten, läßt die Bindung von NGF an ein Molekül TrkA oder LNGFR noch eine identische Bindungsstelle frei, die dazu verwendet werden könnte, entweder ein TrkA-LNGFR-Heterodimer oder Homodimere von einem der beiden Rezeptoren zu bilden. Daß bisher keine Rezeptor-Heterodimere nachgewiesen wurden, könnte auf ihrer geringen Anzahl beruhen, oder darauf, daß sie ein transientes Stadium während der Dynamik des NGF-Rezeptorkomplexes auf der Membran responsiver Zellen darstellen (Fig. 10). Es wurde vorgeschlagen, das LNGFR zu der Aktivierung der Trk-Rezeptoren beiträgt, indem es die Liganden-Präsentation oder das Rekrutieren zirkulierender Neurotrophine verstärkt (Glass, 1991; Ying, 1992). Da die Zahl von LNGFR in der Membran responsiver Zellen etwa 10-fach höher als die Zahl an TrkA-Molekülen ist und NGF schneller von LNGFR dissoziiert, ist es möglich, daß LNGFR-TrkA-Komplexe als Intermediate für den Transfer des Liganden von LNGFR-Homodimeren auf TrkA-Homodimere wirken (Fig. 10). Das Verhältnis der gebildeten LNGFR- und TrkA-Homo- und Heterodimere in einer Zelle könnte von der relativen Menge jedes Rezeptortyps und der Umgebung der Membran eines bestimmten Zelltyps abhängen. Nach Liganden-Bindung werden aktivierte TrkA-Homodimere an spezifischen Tyrosin-Resten autophosphoryliert, die dann gut vorstellbar abwechselnd durch intrazelluläre Proteine erkannt werden, welche in die Signaltransduktion involviert sind (Kaplan, 1991). In diesem Zusammenhang ist die Beobachtung, daß ähnliche Mengen TrkB-Rezeptor-Phosphorylierung zu unterschiedlichen biologischen Wirkungen führen können, sehr interessant und kann die Aktivierung unterschiedlicher Komponenten des Signaltransduktionsweges reflektieren. So könnten qualitative Unterschiede, anstatt quantitativer zwischen Stadien der Rezeptor-Aktivierung existieren, die nach Stimulation durch unterschiedliche, wenn auch strukturell verwandte, Liganden erzielt werden. Diese Unterschiede könnten auf Variationen in der Konformation des Rezeptors nach Liganden- Bindung beruhen oder im Phospho-Tyrosin-Muster der cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors oder in beidem. Die kürzliche Beobachtung, daß unterschiedliche Phospho-Tyrosine im PDGF und dem Wachstumsfaktor aus Fibroblasten (fibroblast growth factor; FGF)-Rezeptor an spezifische Moleküle binden, die unterschiedliche Signaltransduktionswege vermitteln (Fantl, 1992; Peters, 1992; Mohammadi, 1992), bedeutet, daß unterschiedliche Phosphorylierungsmuster in TrkA-Rezeptoren in der Transduktion verschiedener biologischer Signale, wie das Auswachsen von Neuriten oder die neuronale Überlebensdauer, resultieren könnten. Damit könnten chimäre Moleküle mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten ein sehr wertvolles Mittel sein, um die Signaltransduktionswege, die zu den pleiotropen biologischen Effekten von Neurotrophinen führen, zu entschlüsseln (Tabelle 1).
Tabelle 1 Relative TrkA-Rezeptor-Bindung, Rezeptor-Aktivierung und spezifische biologische Aktivität von Wildtyp-, Mutanten- und chimären NGF- Proteinen.
a Mutanten werden abgekürzt durch den wt-Rest (Einzel-Aminosäure- Bezeichnung), gefolgt von seiner Codon-Nummer und dem mutierten Rest. Römische Zahlen bezeichnen variable Regionen in den chimären Molekülen, welche durch homologe Regionen aus BDNF ausgetauscht wurden.
b Ergebnisse von mindestens 3 verschiedenen Dosis-Antwort-Experimenten unter Verwendung von rtrkA-3T3-Zellen variierten um ± 10%.
c Gemessen als Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung nach Stimulation durch 100 ng/ml Ligand. In drei unabhängigen Experimenten wurden konsistente Ergebnisse erzielt.
d Gemessen als Auswachsen der Neuriten, hervorgerufen aus Explantaten embryonaler sympathischer Ganglien. Die Ergebnisse von mindestens drei unterschiedlichen Dosis-Antwort-Experimenten variierten um ± 10%. ND, nicht durchgeführt.
Tabelle 2 Relative TrkB-Rezeptor-Bindung, Rezeptor-Aktivierung und spezifische biologische Aktivität von Wildtyp-, Mutanten- und chimären NGF- Proteinen.
a Mutierte und chimäre Moleküle sind wie in Tabelle 1 abgekürzt.
b Ergebnisse von mindestens 3 verschiedenen Dosis-Antwort-Experimenten unter Verwendung von rtrkB-3T3-Zellen variierten um ± 10%.
c Gemessen als Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung nach Stimulation durch 100 ng/ml Ligand. In drei unabhängigen Experimenten wurden konsistente Ergebnisse erzielt.
d Gemessen als maximale Zell-Überlebensdauer in Kulturen dissoziierter embryonaler unteres Vagus-Neuronen. Die Ergebnisse von mindestens drei unterschiedlichen Dosis-Antwort-Experimenten variierten um ± 10%.
e Gehalt an rekombinantem Protein von weniger als 0,5% des wt-NGF. Getestet bei 10 ng/ml.
ND, nicht durchgeführt.

Referenzen

Barde, Y.-A., Edgar, D. and Thoenen, H. (1982). Puriflcation of a new neurotrophic factor from mammalian brain. EMBO J. 1, 549-553.
Berkemeier, L, Winslow, J., Kaplan, D., Nicolia, K, Goeddel, D. and Rosenthal, A. (1991). Neurotropin-5: A novel neurotropic factor tat activates trk and trkB. Neuron 7, 857-866.
Cordon-Cardo, C., Tapley, P., Jing, S., Nanduri, V., O'Rourke, E., Lambelle, F., Kovary, K., Klein, R, Jones, K., Reichardt, L. and Barbacid, M. (1991). The trk tyrosine kinase mediates the mitogenic properties of nerve growth factor and neurotrophin-3. Cell 66, 173-183.
Daopin, S., Piez, K., Ogawa, Y. and Davies, D. (1992). Crystal structure of transforming growth factor-β2: an unusual fold for the superfamily. Science 257, 369-373.
Ebendal, T. (1989). In Nerve Growth Factors, R A. Rush, ed. (Chichester: john Wiley & Sons), pp. 81-93.
Ernfors, P., Ib ñez, C. F., Ebendal, T., Olson, L. and Persson, H. (1990). Molecular cloning and neurotrophic activities of a protein with structural similarities to β- nerve growth factor: developmental and topographical expression in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5454-5458.
Fantl, W., Escobedo, J., Martin, G., Turck, C., del Rosario, M., McCormick, F. and Williams, L. (1992). Distinct phosphotyrosines on a growth factor receptor bind to specific molecules that mediate different siganling pathways. Cell 69, 413-423.
Glass, D., Nye, S., Hantzopoulos, P., Macchi, M., Squinto, S., Goldfarb, M. and Yancopoulos, G. (1991). TrkB mediates BDNF/NT-3-dependent survival and proliferation of fibroblasts lacking the low affinity NGF receptor. Cell 66, 405-413.
Götz, R., Kolbeck, R, Lottspeich, F. and Barde, Y. A. (1992). Production and characterization of recombinant mouse neurotrophin-3. Eur. J. Biochem. 204, 745-9.
Hallböök, F., Ib ñez, C. F. and Persson, H. (1991). Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary. Neuron 6, 845-858.
Heldin, C. H., Ernlund, A., Rorsman, C. and Rönnstrand, L (1989). Dimerization of B-type platelet-derived growth factor receptors occurs after ligand binding and is dosely associated with receptor kinase activation. J Biol Chem 264, 8905-12.
Hempstead, B., Martin-ZAnca, D., Kaplan, D., Parada, L. and Chao, M. (1991). Highaffinity NGF binding requires coexpression of the trk proto-oncogene and the lowaffinity NGF receptor. Nature 350, 678-683.
Hempstead, B. L, Schleifer, L S. and Chao, M. V. (1989). Expression of functional nerve growth factor receptors after gene transfer. Science 243, 373-375.
Hofer, M., Pagliusi, S. R, Hohn, A., Leibrock, J. and Barde, Y.-A. (1990). Regional distribution of brain-derived neurotrophic factor in the adult mouse brain. EMBO J. 9, 2459-2464.
Hohn, A., Leibrock, J., Bailey, K. and BArde, Y.-A. (1990). Identification and characterization of a novel member of the nerve greowth factor/brain-derived neurotrophic factor family. Nature 344, 339-341.
Hosang, M. and Shooter, E. M. (1985). Molecular characteristics of nerve growth factor receptors on PC12 cells. J Biol Chem 260, 655-62.
Ib ñez, C. F., Hallböök, F., Ebendal, T. and Persson, H. (1990). Structure-function studies of nerve growth factor: functional importance of highly conserved amino add residues. EMBO J. 9, 1477-1483.
Ib ñez, C., Ebendal, T. and Persson, H. (1991a). Chimeric molecules with multiple neurotrophic activities reveal structural elements determining the specificities of NGF and BDNF. EMBO J. 10, 2105-2110.
Ib ñez, C. F., Hallböök, F., Söderström, S., Ebendal, T. and Persson, H. (1991b). Biological and immunological properties of recombinant human, rat and chicken nerve growth factors: a comparative study. J. Neurochem. 57, 1033-1041.
Ib ñez, C. F., Ebendal, T., Barbany, G., Murray-Rust, J., Blundell, T. L and Persson, H. (1992). Disruption of the Low Affinity Receptor-Binding Site in NGF Allows Neuronal Survival and Differentiation by Binding to the trk Gene Product. Cell 69, 329-341.
Ip, N. Y., Ib ñez, C. F., Nye, S. H., McClain, J., Jones, P. F., Gies, D. R, Belluscio, L, Le Beau, M. M., Espinosa III, R, Squinto, S. P., Persson, H. and Yancopoulos, G. (1992). Mammalian neurotrophin-4: structure, chromosomal localization, tissue distribution and receptor specificity. Proc Natl Acad Sci USA 89, 3060-3064.
Jing, S., Tapley, P. and BArbacid, M. (1992). Nerve growth factor mediates signal transduction through Trk homodimer receptors. Neuron in press, Johnson, D., Lanahan, A., Buck, C. R, Sehgal, A., Morgan, C., Mercer, E., Bothwell, M. and Chao, M. (1986). Expression and strueture of the human NGF receptor. Cell 47,545-554.
Jones, K. R and Reichardt, L. F. (1990). Molecular cloning of a human gene that is a member of the nerve growth factor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060-8064.
Kaisho, Y., Yoshimura, K. and Nakahama, K. (1990). Cloning and expression of a cDNA encoding a novel human neurotropic factor. FEBS Lett. 266, 187-191,
Kaplan, D., Hempstead, B., Martin-Zanca, D., Chao, M. and Parada, L. (1991). The trk proto-oncogene product: a signal transdudng receptor for nerve growth factor. Science 252, 554-558.
Kaplan, D., Martin-Zanca, D. and Parada, L. (1991). Tyrosine phosphorylation and tyrosine kinase activity of the trk proto-oncogene product induced by NGF. Nature 350, 158-160.
Klein, R, Jing, S., Nanduri, V., O'Rourke, E. and Barbacid, M. (1991). The trk protooncogene encodes a receptor for nerve growth factor. Cell 65, 189-197.
Klein, R, Lamballe, F., Bryant, S. and Barbacid, M. (1992). The trkB tyrosine protein kinase is a receptor for Neurotrophin-4. Neuron 8, 947-956.
Klein, R, Nanduri, V., Jing, S., Lambelle, F., Tapley, P., Bryant, S., Cordon-Cardo, C., Jones, K., Reichardt, L and Barbacid, M. (1991). The LrkB tyrosine kinase is a receptor for brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3. Cell 66, 395-403.
Kunkel, T. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 48892
Lambelle, F., Klein, R. and Barbacid, M. (1991). trK, a new member of the trk family of tyrosine protein kinases, is a receptor for neurotrophin-3. Cell 66, 967-979.
Leibrock, J., Lottspeich, A. H., Hofer, M., Hengerer, B., Masiakowski, P., Thoenen, H. and Barde, Y.-A. (1989). Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor. Nature 341, 149-52.
Levi-Montalcini, R and Angeletti, P. (1968). Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569.
Lindsay, R. M., Thoenen, H. and Barde, Y.-A. (1985). Placode and neural crestderived sensory neurons are responsive at early developmental stages to brainderived neurotrophic factor. Dev. Biol. 112, 319-328.
Luthman, H. ard Magnussoa, G. (1983). High efficiency polyoma DNA transfection of chioroquine treated cells. Nucl. Acids Res. 11, 1295-1305.
Maisonpierre, P. C., Belluscio, L., S. S., Ip, N. Y., Furth, M. E., Lindsay, R M. and Yancopoulos, G. D. (1990). Neurotrophin-3: A neurotrophic factor related to NGF and BDNF. Science 247, 1446-1451.
McDonald, N., Lapatto, R., Murray-Rust, J., Gunning, J., Wlodawer, A. and Blundell, T. (1991). New protein fold revealed by a 2.3-Å resolution crystal structure of nerve growth factor. Nature 354, 411-414.
Meakin, S. and Shooter, E. (1991). Molecular investigations an the high affinity nerve growth factor receptor. Neuron 6, 153-163.
Mohammadi, M:, Dionne, C., Li, W., Li, N., Spivak, T., Honegger, A., Jaye, M. and Schlessinger, J. (1992). Point mutation in FGF receptor eliminates phosphatidylinositol hydrolysis without affecting mitogenesis. Nature 358, 681684.
Nakagawa, S. and Tager, H. (1986). Role of the phenylalanine B25 side chain in directing insulin interadion with its receptor. J Biol Chem 261, 7332-7341.
Oefner, C., D'Acry, A., Winkler, F., Eggimann, B. and Hosang, M. (1992). Crystal structure of human platelet-derived growth factor BB. EMBO J 11, 3921-3926.
Peters, K, Marie, J., Wilson, E., Ives, H., Escobedo, J., Del Rosario, M., Mirda, D. and Williams, L. (1992). Point mutation of an FGF receptor abolishes phosphatidylinositol turnover and Ca²&spplus; flux but not mitogenesis. Nature 358, 678- 681.
Radeke, M. J., Misko, T. P., Hsu, C., Herzenberg, L. A. and Shooter, E. M. (1987). Gene transfer and molecular cloning of the rat nerve growth factor receptor. Nature 325, 593-597.
Radziejewski, C., Robinson, R. C., DiStefano, P. S. and Taylor, J. W. (1992). Dimeric structure and conformational stability of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3. Biochemistry 31, 4431436.
Rodriguez-Tébar, A., Dechant, G. and Barde, Y.-A. (1990). Binding of brain-derived neurotrophic factor to the nerve growth factor receptor. Neuron 4, 487492.
Rodriguez-Tebar, A., Dechant, G., Gotz, R and Barde, Y. A. (1992). Binding of Neurotrophin-3 to its neuronal receptors and interactiorts with nerve growth Factor and brain-derived neurotrophic factor. EMBO J 11, 917-922.
Rosenthal, A., Goeddel, D. V., Nguyen, T., Lewis, M., Shih, A., Laramee, G. R., Nikolics, K and Winslow, J. W. (1990). Primary structure and biological activity of a novel human neurotrophic factor. Neuron 4, 767-773.
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R (1977). DNA sequencing with chainterininating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sd. USA 74, 5463-5467.
Schlessinger, J. (1988). Signal transduction by allosteric receptor oligomerization. Trends Biochem Sci 13, 443-447.
Sclunegger, M. and Grüter, M. (1992). An unusual feature revealed by the crystal struture at 2.2 Å resulution of human transforming growth factor-β2. Nature 358, 430-434.
Seifert, R. A., Hart, C. E., Phillips, P. L, Forstrom, J. W., Ross, R., Murray, M. J. and Bowen, P. D. (1989). Two different subunits associate to create isoform-specific platelet-derived growth factor receptors. J Biol Chem 264, 8771-8.
Soppet, D., Escandon, E., Maragos, J., Middlemas, D., Reid, S., Blair, J., Burton, L., Stanton, B., Kaplan, D., Hunter, T., Nikolics, K. and Parada, L. (1991). The neurotrophic factors brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 are ligands for the trkB tyrosina kinase receptor. Cell 65, 895-903.
Squinto, S, Stitt, T., Aldrich, T., Davis, S., Bianco, S., Radziejewski, C., Glass, D., Masiakowski, P., Furth, M., Valenzuela, D., DiStefano, P. and Yancopoulos, G. (1991). trkB encodes a functional receptor for brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 but not nerve grwoth factor. Cell 65, 885-893.
Suter; U., Angst, C., Tien, C. L, Drinkwater, C. C., Lindsay, R. M. and Shooter, E. M. (1992). NGF/BDNF Chimeric Proteins - Analysis of Neurotrophin Specificity by Homolog-Scanning Mutagenesis. J Neurosd 12, 306-318.
Thoenen, H., Bandtlow, C. and Heumann, R (1987). The physiological function of nerve growth factor in the central nervous system: comparison with the periphery. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109, 145-178.
Thoenen, H. and Barde, Y. A. (1980). Physiology of nerve growth factor. Physiol. Rev. 60, 1284-1325.
Ullrich, A. and Schlessinger, J. (1990). Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212.
Weskamp, G. and Reichardt, L. (1990). Evidence that biological activity of NGF is mediated through a novel subclass of high affinity receptors. Neuron 6, 649-663.
Whittemore, S. R, Friedman, P. L., Larhammar, D., Persson, H., Gonzalez, C. M. and Holets, V. R (1988). Rat beta-nerve growth factor sequence and site of synthesis in the adult hippocampus. J. Neurosci. Res. 20, 403-410.
Yan, H., Schlessinger, J. and Chao, M. (1991). Chimeric NGF-EGF receptors define domains responsible for neuronal differentiation. Science 252, 561-564.
Yang, Y. C., Ciarlette, A. B., Temple, P. A., Chung, M. P., Kovacic, S., Witek-Gianotti, J. S., Leary, A. C., Kritz, R., Donahue, R E., Wong, G. G. and Clark, S. C. (1986). Human IL-3 (multi-CSF): identification by expression cloning of a novel hematopoietic growth factor related to murine IL-3. Cell 47, 3-10.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER: Persson et al.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: MULTIFUNKTIONELLE NEUROTROPHISCHE FAKTOREN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
(B) STRASSE: 777 Old Saw Mill River Road
(C) STADT: Tarrytown
(D) STAAT: New York
(E) LAND: U.S.A.
(F) POSTLEITZAHL: 10591
(v) COMPUTER-LESBARES FORMAT:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Auflage #1,0, Version 1,25 (EPÜ)
(vi) LAUFENDE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/979.630
(B) ANMELDUNGSDATUM: 20 Nov 1992
(C) KLASSIFIKATION
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/847.369
(B) ANMELDUNGSDATUM: 06 März 1992
(C) KLASSIFIKATION
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: KEMPLER Ph.D., Gail M.
(B) REGISTRIERNR. 32,143
(C) BEZUGS/AKTENNR. Reg. 41
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 914-347-7000
(B) TELEFAX: 914-347-2113

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 120 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 119 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(3) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 119 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Claims

1. Chimäres Neurotrophin-3 (NT-3)-Molekül, wobei die Aminosäuren 3-9 durch die Aminosäuren 3-9 vom Nervenwachstumsfaktor ersetzt sind, und/oder wobei die Aminosäuren 94-98 durch die Aminosäuren 94-98 vom vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor ("Brain-Derived Neurotrophic Factor": BDNF) ersetzt sind.

2. Chimäres NT-3-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 3-9 durch die Aminosäuren 3-9 vom Nervenwachstumsfaktor ersetzt sind.

3. Chimäres NT-3-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 94-98 durch die Aminosäuren 94-98 vom BDNF ersetzt sind.

4. Chimäres NT-3-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 3-9 durch die Aminosäuren 3-9 vom Nervenwachstumsfaktor und die Aminosäuren 94-98 durch die Aminosäuren 94-98 vom BDNF ersetzt sind.

5. Chimäres NT-3-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 3-9, 28-37, 40-49, 81-88 und 95-97 durch die entsprechenden Aminosäuren vom NGF ersetzt sind.

6. Nucleinsäure, die ein Neurotrophin nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.

7. Vektor, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 6, wobei der Vektor in der Lage ist, Neurotrophin in gewinnbarer Form zu exprimieren, wenn er sich innerhalb einer Wirtszelle befindet.

8. Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 7 enthält.

9. Verfahren zur Produktion eines NT-3-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 8 und die Gewinnung des Neurotrophins umfaßt.

10. Arzneimittel, umfassend ein Neurotrophin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.

11. Diagnostisches Reagenz, umfassend eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, an eine Nucleinsäure nach Anspruch 6 zu hybridisieren.

12. Verfahren zur Diagnose einer neurologischen Störung, umfassend das Inkontaktbringen einer Körperprobe eines zu testenden Säugers mit einem diagnostischen Reagenz nach Anspruch 11 und die Untersuchung der Probe auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Nucleinsäuren nach Anspruch 6.

13. Neutotrophin wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von neurologischen Störungen im Körper eines Menschen oder Tiers.

14. Nucleinsäure wie in Anspruch 6 definiert zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer neurologischen Störung, das am Körper eines Menschen oder Tiers durchgeführt wird.