JPH08511675A

JPH08511675A - 受容体への結合特異性を変更した神経栄養因子

Info

Publication number: JPH08511675A
Application number: JP5515594A
Authority: JP
Inventors: ベントペルッソン，ハーカン; フェルナンドイバネッツモリナー，カルロス
Original assignee: マックインタイアー，キャサリンロウ; フェルナンドイバネッツモリナー，カルロス
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 1996-12-10
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: DE69332047T2; US5705617A; ES2178641T3; AU674305B2; DK0632817T3; CN1079992A; ZA931597B; CN1041831C; US5349055A; IL104958A0; ATE219500T1; DE69332047D1; WO1993018066A1; EP0632817A1; JP3694523B2; EP0632817B1; CA2131552A1; AU3655093A

Abstract

(57)【要約】神経栄養因子の受容体結合性および安定性を変更する方法を開示する。変更された受容体結合特異性を有する変異型の神経栄養因子を記載する。特定の態様には、ｔｒｋ受容体には結合するが、低親和性ＮＧＦ受容体には結合しない神経栄養因子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】受容体への結合特異性を変更した神経栄養因子序文本発明は、受容体への結合親和性および生物学的特異性を変更した神経成長因子ファミリーの変異型神経栄養因子を提供する。本発明は、部分的には、神経栄養因子の類似体およびキメラの合理的な設計に有用であるモデル系を開発したことに基づくものである。発明の背景細胞の成長および分化を制御するには、応答細胞の表面にある受容体との相互作用を介してその効果を発揮する特異的な因子が必要である。多くの成長因子および分化因子が発見され、その特性付けがなされてきているにもかかわらず、結合活性や生物活性に関与する正確な構造、並びに多数の受容体の活性化の根底にある結果的または原因的な分子挙動は不明である。神経成長因子（ＮＧＦ）は交感神経系並びに一部の感覚および中枢神経系の生存、発達、分化をコントロールする１１８個のアミノ酸からなるポリペプチドである（Levi-Montalcini and Angeletti，1968；Thoenen and Barde，1980；Whit temore and Seiger，1987；Thoenenら，1987）。ＮＧＦの生理活性形態は同一のサブユニットの二量体からなり、各サブユニットは前駆体分子から産生される（ Angeletti and Bradshaw，1971；Angeletti ら，1973）。ＮＧＦのｃＤＮＡクローンは最初にマウスから単離された（scott ら，1983）。その後、数種の哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類などを含む多くの他の動物種においてＮＧＦ遺伝子の特性決定が行われた（Schwarzら，1989；Hallboo kら，1991）。ＮＧＦは、集合的には神経成長因子ファミリーのニューロトロフィンとして知られている、構造的にも機能的にも関連した分子のファミリーに属しており、このファミリーには他に少なくとも３種のメンバー、すなわち脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Bardeら，1982；Leibrockら，1989）、ニューロトロフィン− ３（ＮＴ−３）（Hohnら，1990；Maisonpierreら，1990；Rosenthalら，1990；E rnforsら，1990）、そしてニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）（Hallbookら， 1991；Ipら，1992）が含まれる。ＮＧＦは、ニューロンと非ニューロンの両方に由来する各種の細胞型に発現される低親和性受容体と相互作用する（Ernforsら，1988；Yan and Johnson，1988 ；Heuerら，1990；Hallbookら，1990）。神経成長因子ファミリーの他の３種のニューロトロフィン類もＮＧＦの低親和性受容体に結合することができる（Rodr iguez-Tebarら，1990；Ernforsら，1990；Squintoら，1991；Hallbookら，1991 ）。この受容体は約75,000ダルトンの膜貫通糖タンパク質（ｐ７５^NGFR）に相当し、１０^-9ＭのＫｄでもってＮＧＦと結合する（Johnsonら，1986；Radekeら，1 987）。ところが、ＮＧＦの生物学的作用を仲介するにあたっては、ｐ７５^NGFR 陽性細胞のサブ集団に限られる高親和結合（Ｋｄ＝１０^-11Ｍ）が必要となる（B anerjeeら，1973；Herrup and Shooter, 1973；Sutterら，1979；Richardsonら，1986）。２つの受容体の分子状態の関係は完全には解明されていないが、他の受容体においてシグナル変換を仲介することが知られている構造的特徴を欠いているｐ７５^NGFRの細胞質ドメインが高親和結合並びにシグナル変換には必要である、という一部の報告がある（Hempstead ら，1989；Yanら，1991；Bergら，1991）。最近、がん原遺伝子のｔｒｋがＮＧＦの機能的受容体をコードしていることが明らかになった（Kaplanら，1991a；Kleinら，1991）。ｔｒｋがん原遺伝子の産物は、膜貫通受容体のチロシンキナーゼファミリーに属する140,000ダルトンのタンパク質（ｐ１４０^trk）である（Martin-Zancaら，1991）。このタンパク質は当然のことながらＮＧＦの一次シグナル変換機構に関与するとされてきたが、ＮＧＦに対するｐ１４０^trkの平衡結合定数に関しては相当の不一致が存在する。クライン（Klein）ら（1991）は、ｐ１４０^trkが低親和性と高親和性の両方でもってＮＧＦと結合すると報じており、一方、カプラン（Kaplan）ら（1991）およびヘンプステッド（Hempstead）ら（1991）は、ｐ１４０^trkがｐ７５^NGFRの親和性と同程度の親和性でもってＮＧＦと結合し、高親和結合が起こるためには両方の受容体の同時発現が必要であると報じている。近年になって、ｔｒｋがん原遺伝子の産物はＮＧＦの機能的受容体を構成していることが明らかになった（Ka planら，1991a；Kleinら，1991）。ＮＧＦがｐ１４０^trkに結合すると、この分子の急速なリン酸化が生じ、そのチロシンキナーゼ活性が促進される（Kaplan ら，1991a；Kaplanら，1991b；Kleinら，1991）。これに対して、ｐ７５^NGFRがシグナル変換に果たす役割は依然として解明されないままである。最近、この受容体の細胞質ドメインがニューロンの分化（Yan ら，1991）並びにＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘導性のチロシンのリン酸化（Be rgら，1991）を仲介すると報じられた。ところが、最近の他の研究によれば、ｐ７５^NGFRに対するポリクローナル抗体はこの分子へのＮＧＦの結合および一部の高親和結合を阻止するが、ＮＧＦに対する生物学的応答を阻止しないことが明らかにされた（Weskamp and Reichardt,1991）。ｐ１４０^trkを発現する細胞系を使った最近の報告からは、ＮＧＦの存在下で、この受容体分子がｐ７５^NGFRの不在下に繊維芽細胞の生存と有糸分裂増殖を仲介し得ることが実証されている（Co rdon-Cardoら，1991）。これらの研究は、ニューロンおよびニューロン様細胞系において、ｐ７５^NGFRへの結合がＮＧＦ応答を仲介する上で重要であるとする説を除外するものではない。また、ｔｒｋがん原遺伝子は変異型のＮＧＦ非応答性ＰＣ１２細胞系においてＮＧＦ応答性を救済し得ることが最近明らかにされた（ Loebら，1991）。しかし、これらの細胞はなお実質的レベルのｐ７５^NGFRを発現しており、それ故、観察された機能的成果にとってこの分子の存在が必要であったのか否かを判断することは難しいだろう。ＮＧＦがその生物学的作用を発揮する分子機構をより良く理解するには、構造と機能の関係を研究し、さらに改変された性質を有するＮＧＦ変異体を作製することが必要となる。この線に沿った初期のころの研究から、ニワトリＮＧＦの高度に保存されたアミノ酸残基が機能的に重要であることが判明した（Ibanezら， 1990）。より最近になって、ＮＧＦとＢＤＮＦとのキメラ分子の解析により、これら２つの因子の生物学的特異性の決定に関与している領域がはっきりしてきた（Ibanezら，1991a）。さまざまな種から得られたＮＧＦ遺伝子を比較したところ、各種の脊椎動物を通して高度に保存されているアミノ酸残基のかたまり（クラスター）が存在することがわかった（図１を参照のこと；異なる種に由来するＮＧＦ並びに異なるニューロトロフィンの相同領域におけるアミノ酸残基２５− ３６（一文字表記）の保存状態を示す）。図１Ａは、ラット（Whittemoreら，1988）、マウス（Scottら，1983）、ヒト（Ullrichら，1983）、ウシ（Meierら，1986）、モルモット（Schwarzら，1989 ）、ニワトリ（Ebendalら，1986；Meierら，1986）、ツメガエル（文献）およびヘビ（Selbyら，1987）のＮＧＦに由来する残基２５−３６の整合（上下合わせ）を示す。図１Ｂは、ラットＮＧＦ由来の残基２５−３６と、ラットＢＤＮＦ（Maisonpi erreら，1990）、ラットＮＴ−３（Maisonpierreら，1990；Ernforsら，1990）およびツメガエルＮＴ−４（Hallbookら，1991）の相同領域との整合を示す。これらの保存された部分の中でも、残基２５から残基３６にわたる領域は最も親水性であり、そのためＮＧＦ分子の表面に存在するようだ（Meierら，1986；E bendalら，1989）。この配列から設計された合成ペプチドはin vitroでＮＧＦの生物活性を阻害することが示された（Longoら，1990）。発明の概要本発明は、その親分子と比べて、受容体への新規な結合親和性並びに特異性を有する神経成長因子の変異型の神経栄養分子を提供する。本発明は、部分的には、ｐ７５^NGFRとｐ１４０^trkの両受容体にＮＧＦ分子が結合するにあたって特定のアミノ酸が果たす役割を調べるためのモデル系としてＮＧＦを使用したことに基づくものである。本発明は、さらに、かかるモデル系を用いて、ＮＧＦ分子のｐ１４０^trkへの結合能を保持させて野生型分子に匹敵する生物活性を維持しつつ、該分子のｐ７５^NGFRへの結合能を失わせるようにＮＧＦを修飾することができるという知見に基づくものである。さまざまな実施態様において、ＮＧＦ並びに神経成長因子ファミリーの他のメンバーの対応領域に修飾を施すと、ｔｒｋシグナル変換受容体に対して高度な特異性を有する神経栄養因子が得られる。図面の説明図１．さまざまな動物種に由来するＮＧＦのアミノ酸残基２５−３６（一文字表記）の比較。図２．ＣＯＳ細胞における親および変異型のＮＧＦの安定性。図３．Ｅ３５Ａ変異がＮＧＦプロペプチドのプロセシングに及ぼす影響。図４．親（野生型）および変異型のＮＧＦの競合的受容体結合並びに生物活性。図５．親ＮＧＦおよび低親和性受容体への結合を欠損している変異型ＮＧＦのＰＣ１２細胞における生物活性。図６．親ＮＧＦおよび変異型ＮＧＦの競合的受容体結合。図７．Ｋ９５Ａ変異が異なる細胞型の受容体へのＮＧＦの結合に及ぼす影響。図８．親ＮＧＦおよびｐ７５^NGFRへの結合能を欠損している変異型ＮＧＦの交感神経ニューロンにおける生物活性。図９．ｐ７５^NGFR受容体へのＮＧＦの結合部位の機能的解体図。発明の詳細な説明神経成長因子（ＮＧＦ）は、その他の多くの成長因子並びにホルモンと同様に、応答細胞の膜に存在する２つの異なる受容体分子に結合する。がん原遺伝子ｔｒｋの産物であるｐ１４０^trkは、最近ＮＧＦのシグナル変換受容体として同定されたチロシンキナーゼ受容体である。ＮＧＦの低親和性受容体であるｐ７５^NG ^FR がシグナル変換において果たす役割はあまり解明されていない。最近になって、ＮＧＦの結晶構造が決定されたところであり、受容体への結合および生物活性に関与する構造は依然として不明のままである。結合アッセイおよびバイオアッセイと組み合わせた部位特異的突然変異誘発法は、神経栄養分子の結合に関連したアミノ酸残基の機能的な重要性を検討する上で非常に役立つ方法である。かかる研究は、ＮＧＦの三次元結晶構造の解析（Mc Donaldら，1991）と合わせて、受容体への結合特性を変更した神経栄養分子の合理的な設計を可能にする。従って、本発明は、神経成長因子ファミリーの親つまり野生型の神経栄養因子の１個またはそれ以上のアミノ酸を修飾することによって作製される新規な変異型の神経栄養因子に関するものである。かかる修飾は、該因子のｔｒｋ受容体への結合能を保持しつつ、該因子の低親和性ＮＧＦ受容体への結合を抑制するように選ばれる。本明細書において、特定のアミノ酸残基の修飾とはＮＧＦの特異性を変更することである。ＮＧＦの三次元構造に基づいて、これらの変更はＮＧＦ二量体の外側のアームに露出されたβ−ヘアピンループのアミノ酸残基にあることが実証された（McDonaldら，1991）。ここに記載するように、この領域内の正に荷電した側鎖を有する残基はＮＧＦとｐ７５^NGFRとの主な接触に関係しているようだ。本発明者らの知見によると、これらの位置で突然変異を起こしたＮＧＦ分子はｐ７５^NGFRに結合しないが、ｔｒｋがん原遺伝子の産物への結合性と生物活性を保持している。これらの結果から、神経細胞においてＮＧＦの生物活性を仲介するには、少なくとも培養下ではｐ１４０^trkだけで十分であることが示唆される。変異型のＮＧＦを用いて行った実験からは、ｐ７５^NGFRへの結合はｃ−ｆｏｓのような初期の遺伝子発現の誘導には必要でなく、また、ＰＣ１２細胞のニューロンの分化にも必要でないことがわかる。さらに、ｐ７５^NGFRのｍＲＮＡおよびタンパク質（Ernforsら，1988；Yan and Johnson，1988）とｔｒｋｍＲＮＡ（ G.Barbany，未発表）の両方を発現する培養下の交感神経ニューロンの神経突起の成長およびニューロンの生存率も、ｐ７５^NGFRへの結合性が失われたことによって影響を受けなかった。これらの結果は、培養下の神経細胞においてＮＧＦに対する応答を仲介するにはｔｒｋがん原遺伝子の産物だけで十分であることを初めて実証するものであり、かくして、ＮＧＦの生物活性を仲介する際のｐ７５^NGFRとｐ１４０^trkの両方の役割を解明し、かつ結合特異性の向上した神経栄養分子を作製する可能性が開かれたことになる。ここに記載する変異体では、ＮＧＦがｐ７５^NGFRとｐ１４０^trkのヘテロ二量体によって作られた新たなポケットに異なる結合部位を介して結合したり（Hemp steadら，1991）、あるいは遊離のｐ７５^NGFRがまだＮＧＦ−ｐ１４０^trk複合体と接触でき、このような方法でシグナル変換に協力することがあるかもしれないが、ｐ７５^NGFRまたはｐ１４０^trkのホモ二量体の検出が可能な条件下でＰＣ１２細胞あるいは感覚ニューロンを用いて行った架橋実験では、ｐ７５^NGFR−ｐ１４０^trk複合体は検出されなかった（Meakin and Shooter，1991）。本発明の変異体分子がｐ１４０^trkへの結合性を強く保持するという事実は、観察された生物活性がこの受容体分子単独によって仲介されるという事実を裏付けるものである。限定するつもりはないが、ここでは当然のこととして、神経成長因子ファミリーのある種のニューロトロフィン、すなわちＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４では、β−ヘアピンループの正に荷電したアミノ酸３０−３４が該分子のｐ７５^NG ^FR への結合において重要な役割を果たすとみなされる。従って、本発明の一つの実施態様によると、１個または数個のこれらアミノ酸に、この領域の全体的な電荷が変わるような変更を導入して、該分子の対応するｔｒｋ受容体への結合能を保持しつつ該分子のｐ７５^NGFRへの結合能を低下させるようにする。ここで用いるとき、アミノ酸残基１は成熟タンパク質の最初のアミノ酸を指す。かかる実施態様では、Ｌｙｓ３２の正に荷電した側鎖が、例えばＡｌａのメチル基で置換される。このような置換は、該分子のｐ７５^NGFRへの結合を、親ＮＧＦのときに見られる結合の５％に減少させる（表２および図６）。別の実施態様において、Ｌｙｓ３４をＡｌａに変えると、Ａ８７５細胞への結合が親のレベルの５５％に減少する。さらに別の実施態様において、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５をアラニンで同時に置換すると、該変異体分子のｐ７５^NGFRへの結合が完全に消失する。これらの変異体はそれぞれ、ｐ７５^NGFRへの結合が低下したり消失したりするにもかかわらず、該分子は交感神経節の移植片に対して野生型の生物活性を保持している。更なる実施態様では、第二のβ−ヘアピンループのアミノ酸９５の近傍にある正に荷電したアミノ酸がＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４と相互に作用してｐ７５^NG ^FR への結合に関与する正に荷電したインターフェイス（界面）を形成するという知見に基づいて、変異型の神経栄養因子が設計される。Ｌｙｓ３２と他の２つのリシン（Ｌｙｓ３４またはＬｙｓ９５）のいずれか一方を同時に修飾するとｐ７５^NGFRへの結合が消失する。ｐ７５^NGFRへの結合の消失にもかかわらず、これらの変異体はｐ１４０^trkに結合し、しかも、ＰＣ１２細胞のニューロンの分化並びに培養下の交感神経ニューロンの生存により測定したとき、その生物活性を保持している。他の３種の既知ニューロトロフィンもＮＧＦの低親和性受容体に結合し得る（Rodriguez-Tebarら，1990；Ernforsら，1990；Squintoら，1991 ；Hallbookら，1991）ので、対応するアミノ酸の同様の変化は、これらの分子のそれぞれのシグナル変換ｔｒｋ受容体への結合能に影響を及ぼすことなく、結合特異性の匹敵する変更をもたらすことが予測されよう。Ｌｙｓ９５はこれまでに開示された４種すべてのタンパク質に保存されている（ツメガエルのＮＴ−４では、位置９５のアミノ酸がＬｙｓであり、一方、ヒトＮＴ−４では、位置９４および９６が正に荷電したアミノ酸のグルタミンとアルギニンである）。さらに、ＮＴ−３とＮＴ−４では、Ｌｙｓ３２がＡｒｇで置き換えられる。ＮＴ−４ではＬｙｓ３４も保存されている。従って、これら正に荷電したアミノ酸のどれかを変えて（例えば、正に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸で置換して）、ｐ７５^NGFRへの結合性を低下させることも本発明の意図するところである。また、本発明は、Ｌｙｓ９５の近傍のβ−ループ領域に別の修飾を施した改変分子も意図している。例えば、ＢＤＮＦでは、Ｌｙｓ３２とＬｙｓ３４がそれぞれＳｅｒおよびＧｌｙで置換される。興味深いことに、ＢＤＮＦの残基９３−９６の空間的に近接したループがＬｙｓ３２とＬｙｓ３４の消失を補い得る３個の保存的な正に荷電した残基（２個のリシンと１個のアルギニン）をもっている。残基２３−３５（可変領域Ｉ）をＢＤＮＦの対応する残基で置換したキメラなＮＧＦ分子（Ibanezら，1991a）は、ＰＣ１２細胞への低親和結合が１０倍減少した。可変領域ＩとＢＤＮＦ由来の残基９４−９８（可変領域Ｖ）の両方を含む別のキメラ分子では低親和結合が回復し、このことはＢＤＮＦの位置９５、９６および９７の３個の正に荷電した残基がＬｙｓ３２とＬｙｓ３４の不在を補い得ることを示すものである。ＮＧＦとＢＤＮＦはともにｐ７５^NGFRへの結合について同等に競合するようだが、この受容体は２つのリガンド間の差異をも認識しており、これがＢＤＮＦの場合には、ポジティブな協同性と遅い解離速度となって現れる（Rodriguez-Tebarら，1990）。こうして、ＢＤＮＦとＮＧＦは同一ではないが類似した構造としてｐ７５^NGFRによって認識されるらしい。ここに記載した結果から、ＮＧＦとＢＤＮＦとの観察された差異についての構造的説明が可能であり、また、他のニューロトロフィンも同じ領域を介してｐ７５^NGFRと相互作用し得ることが示唆される。さらに、親の神経栄養因子をその安定性を高めるように修飾することも本明細書中に具体化される。ここに記載するように、神経成長因子ファミリーの神経栄養因子のアミノ酸２５−３６間に存在する１個またはそれ以上のアミノ酸残基を選択的に修飾すると、該因子の安定性が変化するようだ。従って、本発明は、このようなアミノ酸を改変し、次に改変分子の安定性並びに生物活性を測定して、その生物活性を保持するが親分子と比較して安定性が向上している該因子を選択することを意図している。本発明はＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４のような神経栄養因子から誘導される第二世代の因子に関するものであり、親因子と本質的に同じようにして病気の治療に利用される。例えば、それらは、神経栄養因子の発現パターンの変化と関係していたり、あるいは神経栄養因子との接触により利益を受ける神経系の病気および障害の治療に利用し得る。本発明により調製されるｐ７５^NGFRに結合しない因子に関して、かかる分子は標的細胞に対する特異性が増強されていて、より少ない投与量で有効であるかもしれない。さらに、この種の分子は、より広い範囲に分布している神経細胞に結合する親分子よりも副作用が少ないかもしれない。ｐ７５^NGFRによって仲介されると考えられる逆行性輸送が変異型のニューロトロフィンの使用によって防止でき、かくして高親和性受容体を発現する脳の特定領域（例えば、脳傷害後の海馬）における変異型ニューロトロフィンの局所作用が可能になるだろう。材料および方法ここに記載するすべての実験に以下の実験手順を使用した。ＤＮＡクローニングおよび部位特異的突然変異誘発：ラットのＮＧＦ遺伝子（Whittemoreら，1988）から得られたプレプロＮＧＦコード配列を含む７７０塩基対のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＳＫＳ＋（Stratagene社）にクローニングした。このプラスミドから得られた一本鎖ＤＮＡを、Kunkelら（1985）に記載されかつIbanezら（1990）に詳述されるようなオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発法の鋳型として用いた。置換はチェーンターミネーション法によるヌクレオチド配列の解析により確認した（Sangerら，1977 ）。タンパク質を発現させるために、その後所望の置換を含むＤＮＡ挿入物をｐＸＭ（Yangら，1986）にサブクローニングした。組換えタンパク質の生産並びに定量：約７０％の集密度にまで増殖させたＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥデキストランークロロキン法（Luthman and Magnusson，1983）を用いて１００ｍｍの培養皿あたり２５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。異なる構築物によって生産された組換えタンパク質の量の差を補正するために、並行してトランスフェクトした３５ｍｍの培養皿を１００μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−システイン（Amersham社）の存在下で増殖させた。その後、馴化培地のアリコートをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、Ibanezら（1991b）に記載されるように、対応するオートラジオグラムのデンシトメーター走査の後に個々の試料中の組換えタンパク質の量を平衡化した。親ＮＧＦタンパク質の絶対量は馴化培地の定量的イムノブロッティングと、精製したマウスＮＧＦの標準品を用いた培養下の交感神経節における生物活性の測定により評価した（Ibanezら，1990；Ibanezら，1991b）。次に、これらの分析から得られたデータを使って、変異型タンパク質を含有する試料中のタンパク質濃度を求めた。パルスチェイスおよび免疫沈降：トランスフェクションの４８時間後、細胞をシステイン不含培地で４時間インキュベートした。次に、細胞を１ｍＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−システインで１５分間パルス標識した。標識用培地を２ｍｇ／ｍｌの未標識システインを補充した完全培地で置き換えてチェイスを実施した。並行して行ったウェルを異なる時点で回収し、マウスＮＧＦに対するポリクローナルウサギ抗血清（ウサギｎｏ．３０）を用いて細胞抽出液と馴化培地を免疫沈降させ（Ebendalら，1989）、以前に記載された（Ibanezら，1990；Ibanezら，1991b）ようにして還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した。結合アッセイマウスＮＧＦをクロラミン−Ｔ法により¹²⁵Ｉで標識して平均の比活性を３× １０⁷ｃｐｍ／μｇとした。ラットのＰＣ１２細胞（Greene and Tischler，1976 ）、ヒトのＡ８７５細胞（Buxserら，1983）、そしてマウスのｒｔｒｋ−３Ｔ３細胞（Kaplanら，1991a）は２〜１０×１０⁶細胞／ｍｌで使用した。定常状態の結合は１．５×１０^-9Ｍの¹²⁵Ｉ−ＮＧＦおよび等量の親または変異型のＮＧＦタンパク質を含有する馴化培地の連続希釈物を用いて３７℃で実施した競合アッセイにより測定した。全成分を同時点で加え、平衡に達した（１〜２時間のインキュベーション）後細胞を遠心分離により回収した。偽トランスフェクトしたＣＯＳ細胞から得られた培地を用いて対照実験を行ったところ、馴化培地に含まれる他のタンパク質は¹²⁵Ｉ−ＮＧＦの細胞への結合に何の影響も与えないことがわかった。非特異的結合は、少なくとも１０００倍過剰モル量の未標識ＮＧＦを加えて並行インキュベーションを行うことにより測定した。すべての結果についてこの非特異的結合を補正したが、これは常に総結合の１０％未満であった。５０％の結合をもたらした変異型および野生型ＮＧＦの濃度（ＩＣ₅₀）をそれぞれ測定し、次の式：（変異型ＩＣ₅₀／野生型ＩＣ₅₀）×１００を用いて相対的結合を算出した。バイオアッセイ以前に記載された（Ebendal，1984；Ebendal，1989）とおりに移植した９日齢のニワトリ胚の交感神経節を用いて、等量（０．２〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲）の組換えタンパク質を含有する馴化培地の連続希釈物についてその生物活性を調べた。繊維の成長を、精製したマウスＮＧＦにより得られた基準（この場合の１ＢＵ（生物学的単位）は約５ｎｇ／ｍｌに等しい）と比べて、半定量的スケールのＢＵで評価した。このスケールで０．５ＢＵを示したそれぞれのＮＧＦタンパク質の濃度を測定し、この濃度を用いて親ＮＧＦにより得られた濃度と比べて相対的活性を算出した。ポリ−Ｄ−リシンを被覆した３５ｍｍのウェルにまいたＰＣ１２細胞を、等量の組換えタンパク質を含有する馴化培地の連続希釈物とともにインキュベートした。さまざまな時間経過後に、２個分の細胞の直径より長い繊維を有する細胞のパーセントを顕微鏡で調べて測定した。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡの誘導は、等量の組換え体の親および変異型ＮＧＦを含有する馴化培地の希釈物で処理したＰＣ１２細胞からの全ｍＲＮＡの定量的ノーザンブロット分析により測定した。全ＲＮＡを以前に記載された（Ibanezら，19 90）とおりに抽出した。１０μｇの全ＲＮＡを０．７％のホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移した。次に、フィルターをα−³²Ｐ−ｄＣＴＰで放射性標識したラットｃ−ｆｏｓ遺伝子断片（Curranら，1987）とハイブリダイズさせ、高ストリンジェンシーで洗浄した。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡの量をオートラジオグラムのデンシトメーター走査により測定した。生後１日目のラットから得た上頚神経節の解離したニューロンを、ポリ−Ｄ− リシンを被覆した３５ｍｍのウェルにて３０，０００細胞／ウェルの密度で培養した。プレートした時点で等量の組換えタンパク質を含有する馴化培地の連続希釈物を加え、７２時間後にニューロンの生存を位相差顕微鏡で調べた。実施例１ＰＣ１２細胞への受容体結合に関与するβ−ヘアピンループ３０−３４のアミノ酸残基実験および結果等量の変異型ＮＧＦタンパク質を含有する馴化培地を用いて、ＮＧＦ応答性の褐色細胞腫ＰＣ１２細胞系に存在するその受容体から¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを移動させた。細胞に結合している放射性標識リガンドの８０％が低親和性ＮＧＦ受容体に結合するような濃度（約１．５ｎＭ）の¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを用いて競合的結合アッセイを行った（Sutterら，1979）。ＰＣ１２細胞から¹²⁵Ｉ−ＮＧＦの５０％を移動させるのに要する親および変異型のタンパク質の濃度（ＩＣ₅₀）を計算した（表１）。Ｌｙｓ２５のＡｒｇによる保存的置換、あるいは３個の残基（２６、２７および２９）のいずれか１個のＡｌａによる置換は、ＰＣ１２細胞上の受容体へのタンパク質の親和性に何の影響も与えなかった（表１）。しかし、Ａｓｐ３０またはＩｌｅ３１を修飾したときには、結合親和性の３〜４倍の低下が観察された（実施例２、表１、および図４Ａを参照のこと）。Ｉｌｅ３１をＭｅｔ（ＢＤＮＦではこの位置にＭｅｔが存在する）（Leibrockら，1989）で、またはＶａｌで置換してＩｌｅ３１の重要性をさらに試験した。興味深いことに、最も保存的な変化（Ｉ３１Ｖ）だけが親のＮＧＦと同様の結合親和性を示した（表１）。顕著な受容体への結合の低下がＬｙｓ３２をＡｌａで置換したときに見られ、この場合には親和性が親ＮＧＦと比べて約６倍低下した（表１および図４Ａ）。Ｌｙｓ３４のＡｌａによる置換およびＶａｌ３６のＬｅｕによる置換は、それぞれ野生型の５０％および４５％に結合を低下させた（表１および図４Ａ）。驚いたことに、不完全にプロセシングされたＥ３５Ａ変異体は親に近い結合親和性を示した（表１および図４Ａ）。このことは、ＮＧＦ生合成の中間体が成熟タンパク質と同程度にＮＧＦ受容体に結合し得ることを示している。考察ＮＧＦ二量体の結晶構造の解析（McDonaldら，1991）から、−鎖の３つのアンチパラレルな対と、異なるＮＧＦ関連分子間に観察されたほとんど全ての可変残基を含む４つのループ領域からなる新規な構造が明らかになった。これらのループの１つが本研究で解析された残基に相当し、β−ヘアピンターン（残基３０− ３４）を含む。我々の結果からは、領域２５−３６の残基がＮＧＦ分子の安定性、受容体への結合性、それに生物活性にとって重要であることがわかる（図９Ａ）。Ｌｙｓ２５は構造上重要な役割を果たしていることが明らかになった。というのは、近縁のＡｒｇだけがこの位置のＬｙｓと置き換わって安定したタンパク質を形成できるが、ＡｌａやＧｌｎは安定したタンパク質を形成できなかったからである。これに合致して、Ｌｙｓ２５はＮＧＦタンパク質の正確な折りたたみに重要な残基であるＧｌｕ５５と側鎖で水素結合していることがその結晶構造から明らかになった（McDonaldら，1991）。Ａｌａ２８を欠失させると馴化培地中へのＮＧＦタンパク質の蓄積が妨げられ、このことはこの位置の構造的役割を示すものである。Ｇｌｕ３５のＡｌａによる置換は２３〜３４Ｋの範囲の不完全にプロセシングされたポリペプチドの生産をもたらしたが、これらの変異体は完全なプロセシングを受けた親分子と類似した受容体への結合親和性並びに生物活性を有することがわかった。in vitroで合成された３５Ｋの全長ＮＧＦはきわめて低レベルの生物活性しかもたないという知見が以前に示されたことからして、ＮＧＦ前駆体の活性化には若干のアミノ末端配列の除去が重要でありうることが示唆される（Ed wardsら，1988）。我々の結果からは、さらに、ＮＧＦプロペプチドの保存されたドメイン（Suterら，1991）のほかに、成熟分子の残基も完全にプロセシングされた成熟ＮＧＦの生合成においてある役割を担っていることがわかる。Ｖａｌ３６の非極性側鎖をＬｅｕで置換することも、ＰＣ１２細胞への受容体結合に影響を及ぼすことが判明した。Ｉｌｅ３１と対照的に、Ｖａｌ３６はＮＧＦ単量体の中に深く埋め込まれており、ＮＧＦサブユニットの疎水性コアの形成に係わっているようだ（McDonaldら，1991）。ＡｌａではなくＬｅｕがこの位置のＶａｌを置換し得るという知見は、該分子のコアにＶａｌ３６の疎水性が大いに貢献していることを示し、おそらくこの位置に比較的大きいＬｅｕの側鎖を埋め込むのに必要とされる構造上の再構成によりＶ３６Ｌ変異体の結合性の低下が生じたと考えられる。実施例２Ａｓｐ３０およびＩｌｅ３１の修飾実験および結果変異型ＮＧＦタンパク質の生物活性は、最初、Ｅ９ニワトリ交感神経節からの神経突起の成長を刺激するその能力を検定することにより調べられた（Levi-Mon talcini and Angeletti，1968；Ebendal，1984；Ebendal，1989）。ＰＣ１２細胞から¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを移動させるその能力と合致して、変異型のＫ２５Ｒ、Ｔ２６Ａ、Ｔ２７ＡおよびＴ２９Ａの生物活性はどれも親ＮＧＦの活性と類似していた（表１）。Ｔｈｒ残基が、個々に変化させたときに、その修飾を補い得るとする説を検討するために、３個のＴｈｒ残基が同時にＡｌａで置換された三重変異体を作製した。ところが、この変異体はトランスフェクトした細胞の培地中に検出可能なレベルで蓄積しなかった（表１）。Ｄ３０ＮおよびＩ３１Ａの変異体の場合には生物活性が４倍低下し（表１および図４Ｂ）、それぞれの受容体への結合親和性と相関していた（表１）。活性の低下がこれら変異体分子の安定性の低下によるものであるとする説を排除するために（図２Ｃ）、ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡの誘導をＰＣ１２細胞において試験した。かかる細胞でのｃ−ｆｏｓｍＲＮＡの最大誘導はＮＧＦへの暴露後３０〜４５分以内に起こることが知られており（Milbrandt，1986；Gizang-Ginsberg and Z iff，1990）、この期間はこれらの分子の概算半減期より２０〜３０倍短い。ＰＣ１２細胞を親ＮＧＦに暴露してから３０分後にｃ−ｆｏｓｍＲＮＡのピークが検出された（図４Ｃ）。Ｄ３０ＮおよびＩ３１Ａの両変異体は３０分後にｃ−ｆｏｓｍＲＮＡの最大レベルを誘導したが、親ＮＧＦの場合に得られた最大レベルより３〜４倍低かった（図４Ｃ）。興味深いことに、ＰＣ１２細胞への結合親和性が低下した４つの変異体（Ｉ３１Ｍ、Ｋ３２Ａ、Ｋ３４ＡおよびＶ３６Ｌ）は親ＮＧＦと同レベルの生物活性を示した（表１および図４Ｂ）。こうして、Ｋ３２Ａ変異体の場合には、結合の６倍低下が交感神経節におけるその生物活性に影響を及ぼさなかった（図４のＡとＢを比較のこと）。受容体への結合データと合致して、Ｅ３５Ａ変異体は、正確にプロセシングされた成熟タンパク質を５％ほどしか含んでいなかったが、親レベルの生物活性を示した（表１および図４Ｂ）。考察ＮＧＦサブユニットには、Ａｓｐ３０を含めて数個の重要な水素結合性の側鎖が埋め込まれている（McDonaldら，1991）。これらの結果からは、Ａｓｐ３０をＡｌａ（Ａｓｐ３０の側鎖からＬｙｓ３４の主鎖への想定上の水素結合を妨げる残基）で置換すると、ＮＧＦ分子の半減期が約２０倍短縮されることが判明した。Ｄ３０Ｎ変異体の低減した回収率並びに半減期は、Ａｓｎが効率は低くともこの位置で機能し得ることを示すものである。一方、Ｇｌｙ３３の除去またはＧｌｙ３３のアラニンによる置換はＮＧＦタンパク質の回収不能をもたらしたが、おそらくこの分子の安定性が低下したことによるものだろう。この位置のグリシンは、側鎖をもつアミノ酸の許容範囲の外側に主鎖の回転角をもってくることによりターンの形成を可能にする（Sibandaら，1989）。Ａｓｐ３０およびＧｌｙ３３の変異体に関する結果を合わせて考えると、これらの残基はβ−ヘアピンループ３０−３４の安定化において構造的役割を果たしていること、そしてそれらの修飾はループのコンホメーションの変化を介して機能的効果を及ぼし得ることが示唆される（図９Ａ）。ＮＧＦファミリーの他のメンバーでもこれらの位置が高度に保存されていることから、これらの残基は他の３種のニューロトロフィンでも同様の役割を担っていると考えられる。３０−３４のターンの結果として、疎水性のＩｌｅ３１はＮＧＦ分子の表面に露出するようになる。この残基をＡｌａで置換すると、ＰＣ１２細胞での受容体結合と生物活性の両方が低下した。興味深いことに、Ｍｅｔに置換した後では生物活性だけが救済されて、受容体への結合は低下したままだった。一方、Ｖａｌに変えた後では野生型の結合と生物活性が見られた。さらに、予備的な結果として、Ｉ３１Ａ変異体ではｐ１４０^trkへの結合が５倍低下するが、Ｉ３１Ｍでは親レベルであることがわかった。これらの結果を合わせて考えると、ｐ１４０^tr ^k への結合に相関する生物活性と低親和結合の両方においてＩｌｅ３１の非極性側鎖がある役割を担っていることが示唆される（図９Ａ）。実施例３ＡｌａによるＬｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５の同時置換個々の突然変異が生物活性に何も影響を及ぼさなかった３つの荷電残基Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５をＡｌａで同時に置換し、これによって３つの位置で荷電側鎖を排除した。興味深いことに、この変異型タンパク質は、これがＥ３５Ａ変異を含んでいたという事実にもかかわらず、十分にプロセシングされたタンパク質として完全に回収された（図３Ａ）。この三重突然変異によりこのタンパク質のＰＣ１２細胞への結合は親分子に見られた結合の１％以下に低減した（表１および図４Ａ）。¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを加える前に細胞を変異型タンパク質とともに２時間プレインキュベーションした場合にも同じ結果が得られた（結果示さず）。しかしながら、交感神経節における三重変異体の生物活性は親ＮＧＦ活性に近かった（表１および図４Ｂ）。結合の消失がこれらの細胞における生物活性と関連するのか試験するために、ＰＣ１２細胞中での神経突起の成長を検定した（図５Ａ）。Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５をＡｌａに個々に変更すると、これらの細胞上のＮＧＦ受容体への親和性は異なっていたにもかかわらず、タンパク質の神経突起成長を刺激する能力には有意な変化がなかった。さらに、三重変異体（Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａ）も、ＰＣ１２細胞への低親和結合がおおいに低減したにもかかわらず、親の活性を引き出した（図５Ａ）。結合と生物活性との間に見られる見かけ上の矛盾が、遅い受容体媒介性の分解によるものであるという可能性も検討した。受容体媒介性のエンドサイトーシスを受ける他のペプチドホルモン（すなわちインスリン）に見られるように、長期間試験すると、結合親和性の低減が必ずしも生物活性の低減に結びつかないことがある。結合性が低減する結果、変異体分子は受容体媒介性の分解速度が低くなり、その結果遅いけれども持続する生物活性となり、長期間にわたって総和すると親の濃度に達することができる。この可能性を検討するために、ＰＣ１２細胞中の初期（ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ誘導）および遅い（神経突起成長の刺激）応答の速度論を研究した。結合親和性が低減したにもかかわらず、Ｋ３２Ａおよび三重変異体はいずれも、親分子と同じ時間経過と強度でｃ−ｆｏｓｍＲＮＡと神経突起成長を誘導した（図５ＢおよびＣ）。実施例４ＮＧＦ結合に対するＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４突然変異の効果観察される結合のほとんどが低親和性型となる高濃度の¹²⁵Ｉ−ＮＧＦ（Sutte rら，1979）を用いて、ＰＣ１２細胞に対する受容体結合検定を実施した。しかしながら、ＰＣ１２細胞はｐ７５^NGFRおよびｐ１４０^trk受容体の両方を発現するので（Herrup and Thoenen，1979；Hosang and Shooter，1985；Kaplanら，19 91b）、これらの結果からは、変異型ＮＧＦがこれら２つの分子のいずれと結合するのかをはっきりと区別することはできない。したがって、変異体Ｋ３２Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｅ３５Ａおよび三重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａの、ｐ７５^NGFR のみを高濃度で発現するヒトメラノーマ細胞系であるＡ８７５細胞（Buxser ら， 1983）、およびラットｐ１４０^trkのみを発現する繊維芽細胞系であるｒｔｒｋ −３Ｔ３細胞（Kaplanら，1991a）への結合親和性を比較した。Ｌｙｓ３２の正に荷電した側鎖をＡｌａのメチル基で置換すると、この分子のｐ７５^NGFRへの結合が親ＮＧＦに見られる結合の５％に低減した（表２および図６）。Ｌｙｓ３４をＡｌａに変えると、Ａ８７５細胞への結合が親のレベルの５５％に低減した。しかしながら、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５を同時置換すると、ｐ７５^NGFRへの変異型分子の結合が完全に無くなった（表２および図６）。Ｇｌｕ３５をＡｌａに個別変更してもＡ８７５細胞への結合親和性に影響はなく（表２および図６）、三重変異体に見られる結合性の消失は、正に荷電したＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４残基の修飾によるものであることが示唆される。ｐ７５^NGFRへの結合の２０倍低減にもかかわらず、Ｋ３２Ａ変異体はｒｔｒｋ −３Ｔ３細胞上に発現したｐ１４０^trkへの結合において親ＮＧＦと区別できなかった（表２および図６）。同様に、Ｋ３４ＡおよびＥ３５Ａ変異体はｐ１４０^trk への親の親和性を示した（表２および図６）。興味深いことに、ｐ７５^NGFR から¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを置き換えることができない三重変異体はｐ１４０^trkへの結合性を有意に保持しており、親ＮＧＦに見られるレベルの約５５％であった（表２および図６）。さらに、ＮＧＦ分子を含む別の態様において、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＬｙｓ９５はｐ７５^NGFRとの結合に関与する正に荷電した界面を形成する。Ｌｙｓ３２を他の２つのリシンのいずれかとともに同時修飾するとｐ７５^NGFRへの結合性を消失する。ｐ７５^NGFRへの結合性はないが、これらの変異体は、ＰＣ１２細胞のニューロン分化と培養下の交感神経ニューロンの生存によって測定したところ、生物活性とともにｐ１４０^tr ^k への結合性を保持している。実施例５２５−３６領域中の残基の修飾はＮＧＦ分子の安定性を変更するラットＮＧＦのアミノ酸残基２５−３６の領域中の構造的かつ機能的に重要な残基を特定するために、アラニン−スキャニング突然変異誘発（Cunninghamand Wells，1989）を用いた。この領域は各種脊椎動物間で高度に保存されており（図１Ａ）、ＮＧＦファミリーの他のメンバーとの間に５０−６０％の保存を示す（図１Ｂ）。変異型タンパク質をＣＯＳ細胞中で一過性に発現させた。受容体結合およびバイオアッセイに用いられた変異型タンパク質の量を標準化するために、変異型タンパク質の生産収率を、トランスフェクションした細胞の馴化培地中における代謝標識ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。表１に示すように、変異型ＮＧＦタンパク質のレベルは１０倍の範囲で変化した。変異型ＮＧＦタンパク質のうちの５つ（Ｋ２５Ａ、Ａ２８△，Ｄ３０Ａ、Ｇ３３△およびＶ３６Ａ）は検出しうるレベルで培地中に蓄積しなかった。興味深いことに、これらの残基は、ＮＧＦファミリーの各種異なるメンバーの間で厳密に保存されている領域からの５つの残基に対応する（図１Ｂ）。Ｌｙｓ２５またはＧｌｙ３３のいずれかをより類似のアミノ酸であるＧｌｎおよびＡｌａにそれぞれ変えるとタンパク質は全く検出されなかった（表１）。これとは対照的に、Ｄ３０ＡおよびＶ３６Ａ変異体は、野生型（ｗｔ）タンパク質に見られるよりも低レベルではあったが、それぞれＡｓｎおよびＬｅｕで置換することによって救われた（表１）。Ｌｙｓ２５をこの位置における最も保存された置換であると考えられるＡｒｇにも変えてみた。この変異体では親タンパク質のレベルの約５０％のレベルでＮＧＦタンパク質を検出できた（表１）。変異体タンパク質の量のバラツキはＣＯＳ細胞中におけるタンパク合成、個々のポリペプチドの安定性または分泌の差異によるものかも知れない。これらの可能性を区別するために、パルスチェイス実験を行い、続いて免疫沈降とＳＤＳ− ＰＡＧＥを行った。１５分パルスをした後、主要な２３Ｋの親ＮＧＦ前駆体タンパク質が細胞抽出物から免疫沈降された（図２Ａ）。十分にプロセシングされた成熟１３ＫのＮＧＦは３０分のチェイス後に検出され、またほとんどすべての細胞内ＮＧＦが３時間後に消失した。細胞内ＮＧＦの消失は培地中のＮＧＦの出現と関連し、これはチェイスの６時間後に最高となり、さらに少なくとも１４時間このレベルを保持した（図２Ｂ）。親ＮＧＦよりも３〜４倍低く生産されたＩ３１Ａ変異体（表１）は、親タンパク質とほぼ同量でトランスフェクションした細胞中に蓄積した（図２Ａ）。しかしながら、低レベルのＩ３１Ａ変異体が培地中に検出され、チェイス後の最後の１７時間に５０％低下が観察され（図２Ｂ）、これはＩ３１Ａタンパク質の安定性が低下したことを示唆する。同様に、親ＮＧＦよりも１０倍低レベルで生産された（表１）Ｄ３０Ｎ変異体タンパク質の量は、３時間のチェイス後に有意に減少した（図２Ｃ）。さらに、非常に低レベルのＤ３０Ａ変異体タンパク質が３時間のチェイス後に観察されたが、続く１２時間で検出できないレベルに減少した（図２Ｃ）。Ｉ３１Ａ、Ｄ３０ＮおよびＤ３０Ａ変異体タンパク質の減少した半減期はそれぞれ１８、１２および３時間であると推定され、これはこれらの変異体の低い収率が馴化培地中におけるこれらのタンパク質の安定性が低いためであることを示唆する。Ｄ３０ＮおよびＤ３０Ａ変異体において３時間のチェイス後に見られる非常に低下したピークレベルは、この場合にはタンパク質合成も影響を受けたことを示唆する（図２Ｃ）。実施例６Ｇｌｕ３５のＡｌａによる置換十分にプロセシングされた成熟Ｅ３５Ａ変異体タンパク質が、親ＮＧＦの５％に対応するレベルで馴化培地中に検出された（表１）。しかしながら、免疫沈降後、親ＮＧＦ試料中には非常に弱くしか検出されなかったより高分子量のポリペプチド（２３−３４Ｋの範囲）がいくつか観察された（図３Ａ）。免疫沈降前に、１％ＳＤＳおよび１．５ＭＮａＣｌの存在下に馴化培地を７０℃で前処理してもＥ３５Ａ変異体から免疫沈降されるポリペプチドパターンに影響を与えなかった（データ示さず）ので、これは高分子量ポリペプチドが、Ｅ３５Ａ変異体と共沈する無関係なタンパク質を表すのではないことを示唆する。むしろ、これらのポリペプチドの大きさは、これらがＥ３５Ａタンパク質の生合成における不完全にプロセシングされた中間体を表すことを示唆する。この変異体を用いるパルスチェイス実験によって、このタンパク質の不完全プロセシング形および成熟形はいずれも馴化培地中で非常に安定であることが判明した（図２Ｃおよび３Ｂ）。実施例７ｐ７５^NGFR結合に対するＬｙｓ９５変更の効果実験および結果Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４および三重変異体を用いる実験の結果は、これら２つの正電荷残基がＮＧＦとｐ７５^NGFR分子との間の接触点を形成することを示唆する。ＮＧＦの結晶構造をコンピューターグラフィックスで調べたところ、別の正電荷残基であるＬｙｓ９５が空間的にＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４と近いことが判明した。他の２つの残基と同様に、Ｌｙｓ９５も十分に露出しており、二次相互作用に関与していない。Ｌｙｓ９５もｐ７５^NGFR分子との接触に関与している可能性を試験するために、この残基をＡｌａで置換した。二重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ９５Ａおよび四重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａ＋Ｋ９５Ａも作製した。Ｋ９５Ａ変異体は親ＮＧＦに比べてＰＣ１２細胞への６５％結合を示した（図７）。しかしながら、Ｋ９５ＡとＫ３２Ａとの組み合わせ、またはＫ９５ＡとＫ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａとの組み合わせは、ＰＣ１２細胞への結合性を、親のレベルの０．７％へと劇的に低減した（図７）。ＰＣ１２細胞への低親和性結合の低減は、Ａ８７５細胞上で発現するｐ７５^NGFRへの結合性の消失と関連する（表２および図７）。四重変異体の場合には、ＩＣ₅₀が計算できなかった。しかしながら、ｐ７５^NGFRとは結合できないにもかかわらず、これらの変異体は繊維芽細胞上で発現するｐ１４０^trkからの¹²⁵Ｉ−ＮＧＦを置換する能力は保持しており（表２および図７）、交感神経ニューロンからの神経突起成長を有意なレベルで促進した（図８Ａ）。三重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａおよび二重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ９５Ａはニューロン生存におけるｐ７５^NGFRの役割を検討する可能性を提供する。ラット上方頸部神経節からの解離交感神経ニューロンを用いて培養３日後の生存を試験した。偽トランスフェクションした細胞から得た培地の存在下または普通の培地中では、親ＮＧＦまたは精製マウスＮＧＦと比較して、５％以下の細胞が生存した（図８Ｂ）。しかしながら、変異型のＮＧＦで処理した培養では、ニューロンの生存程度は、親タンパク質で観察されたのと同程度であった（図８Ｂ）。考察ＮＧＦの結晶構造により、β−ヘアピンループ３０−３４の近くまたはその周囲に、露出された正に荷電した側鎖のかたまりがあることが判明した（図９ＢおよびＣ）。（McDonaldら，1991）。ｐ７５^NGFRで観察される全体としての高い負電荷（ｐＩが４．４と推定される）（Radekeら，1987）は、この領域における高塩基性ＮＧＦ二量体（ｐＩ９．３）からの相補的イオン相互作用を必要とするのかも知れない。ここに提示する結果は、これらの正に荷電したアミノ酸残基が、ＮＧＦとｐ７５^NGFRとの間の主要接触点として作用するという考えを強く支持する。幾つかの証拠がこの仮説を支持する：第一に、結晶構造で判明したように、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＬｙｓ９５は高度に露出されており（側鎖溶媒接近性５０−７０％）、その側鎖は分子中で構造的役割をもっていない（McDona ldら，1991）。第二に、ここで示すように、Ｌｙｓ３２をＡｌａで置換すると、低親和性結合条件下におけるＰＣ１２細胞上の受容体に対する変異体の親和性が６倍低減した。第三に、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３４およびＧｌｕ３５の同時置換は、ＰＣ１２細胞への低親和結合を親ＮＧＦで見られる結合の１％以下にさらに低減した。Ｇｌｕ３５をＡｌａで置換しても結合親和性に変化はなかったので、これはＥ３５Ａ変異によるものではなかった。第四に、Ｌｙｓ９５の置換はＫ３２Ａと組み合わせると相乗効果を示し、ＰＣ１２細胞への結合をほとんど検出できないレベルにまで低減した。第五に、すべての場合において、ＰＣ１２細胞への低親和性結合の消失は、Ａ８７５細胞上で発現するｐ７５^NGFRへの結合の消失と関連する。三重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５Ａおよび二重変異体Ｋ３２Ａ＋Ｋ９５Ａの場合には、ｐ７５^NGFRへの結合はそれぞれ完全に無くなったか、１５０倍低減した。第六に、ｐ７５^NGFRへの結合の消失にもかかわらず、すべての変異型ＮＧＦはｐ１４０^trkへの結合性と生物活性を保持しており、これは低親和性結合の消失が変異型タンパク質のコンホメーションの劇的変化によるものではないことをさらに示している。多重リシン変異体で観察される相乗効果は、これら正のｐ７５^NGFR残基が協同してｐ７５^NGFRへの結合の界面を形成することを示唆する（図９ＢおよびＣ）。Ｌｙｓ３２が最も強い接触を形成し、次いでＬｙｓ３４およびＬｙｓ９５が続き、これらがおそらくはＫ３２Ａ変異体に見られる残余結合の原因である。以前に検討されたＡｒｇ１００およびＡｒｇ１０３（Ibanezら，1990）およびおそらくはＬｙｓ８８などの正電荷残基もさらに結合界面に寄与しているのかも知れない（図９ＢおよびＣ）。Ｋ３２Ａ＋Ｋ３４Ａ＋Ｅ３５ＡおよびＫ３２Ａ＋Ｋ９５Ａ変異体におけるｐ７５^NGFRへの結合の消失は、ｐ７５^NGFRとの安定な接触を提供するためにはＮＧＦ分子の表面での最小数の正電荷が必要であることを示唆する。このモデルは、他のタイプの接触、例えば疎水性残基Ｉｌｅ３１がＮＧＦとｐ７５^NGFRとの会合の安定化に寄与する可能性を排除するものではない。公知の別の３つのニューロトロフィンも低親和性ＮＧＦ受容体と結合できる（ Roderiguez-Tebarら，1990；Ernforsら，1990；Squintoら，1991；Hallbookら， 1991）。Ｌｙｓ９５はこれまでに記載した４つのタンパク質すべてに保存されており、ＮＴ−３およびＮＴ−４ではＬｙｓ３２がＡｒｇで置換されており、もう１つの正電荷アミノ酸残基であるＬｙｓ３４もＮＴ−４で保存されている。しかしながら、ＢＤＮＦにおいては、Ｌｙｓ３２およびＬｙｓ３４はそれぞれＳｅｒおよびＧｌｙで置換されている。興味深いことに、ＢＤＮＦでは残基９３−９６の空間的に近接したループが３つの連続した正電荷残基を有しており、これがＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４の不在を補償しているのかも知れない。この仮説を支持するものとして、残基２３−３５（可変領域Ｉ）をＢＤＮＦの対応する残基（ Ibanezら，1991a）で置換したキメラＮＧＦ分子はＰＣ１２細胞への低親和性結合を１０倍低減した。可変領域ＩおよびＢＤＮＦからの残基９４−９８（可変領域Ｖ）の両方を含む別のキメラ分子では低親和性結合が回復したので、これはＢＤＮＦ中の９５、９６および９７の位置での３つの正電荷残基がＬｙｓ３２およびＬｙｓ３４の不在を実際に補償しているということを示唆する。ＮＧＦとＢＤＮＦはいずれもｐ７５^NGFRとの結合において等しく競合しているように思われるが、この受容体はまた２つのリガンドの差を認識してもいるのであり、これがＢＤＮＦの場合には、正の協同性と遅い解離速度となって現れる（Rodriguez-Tebarら，199 0）。したがって、ＢＤＮＦとＮＧＦはｐ７５^NGFRによって類似の構造として認識されても、同一の構造として認識されるのではない。これらの結果は、ＮＧＦとＢＤＮＦとの間で観察される差異の構造的説明を提供するし、また他のニューロトロフィンも同じ領域によってｐ７５^NGFRと相互作用することを示唆する。本発明はここに記載する特定の態様によって限定されない。実際、これまでの記載ならびに添付の図面に基づいて、ここに記載するものに加えて、本発明の各種修飾が当業者には自明である。このような修飾は添付の請求の範囲に包含される。３つの独立した実験からのデータはここに報告する平均値の±１０％で変動した。参考文献 Angeletti，R.H．and 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【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年８月９日【補正内容】１９条補正［原請求の範囲を以下の新請求の範囲に全文差替え］請求の範囲１．神経栄養因子の配列中における唯一の修飾がアミノ酸３０〜３４にある１または２以上の正電荷アミノ酸を非電荷または負電荷アミノ酸で置換することからなり、かつ該修飾が野生型の神経栄養因子と比較して、変異型の神経栄養因子のｐ７５^NGFRへの結合能を低減させるような野生型の神経栄養因子からなる変異型の神経栄養因子。２．野生型の神経栄養因子が、神経成長因子、脳由来成長因子、ＮＴ−３およびＮＴ−４からなる群より選択される請求の範囲１項記載の変異型の神経栄養因子。３．修飾がＬｙｓ３２の置換である請求の範囲２項記載の変異型の神経栄養因子。４．修飾がＬｙｓ３４の置換である請求の範囲２項記載の変異型の神経栄養因子。５．野生型の神経栄養因子がＮＴ−３またはＮＴ−４であり、修飾がＡｒｇ３２の置換である請求の範囲２項記載の変異型の神経栄養因子。６．アミノ酸９３〜９８にある１または２以上の正電荷アミノ酸が非電荷または負電荷アミノ酸で置換されており、かつ該置換が野生型の神経栄養因子と比較して、変異型の神経栄養因子のｐ７５^NGFRへの結合能を低減させるような野生型の神経栄養因子からなる変異型の神経栄養因子。７．野生型の神経栄養因子が、神経成長因子、脳由来成長因子、ＮＴ−３およびＮＴ−４からなる群より選択される請求の範囲６項記載の変異型の神経栄養因子。８．修飾がＬｙｓ９５の置換である請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。９．Ｌｙｓ９５をＡｌａで置換する請求の範囲８項記載の変異型の神経栄養因子。１０．野生型の神経栄養因子がＮＴ−３であり、かつ該置換がＡｒｇ３２、Ｈｉｓ３４、Ａｓｎ９３およびＡｓｎ９４からなる群より選択される１または２以上のアミノ酸の置換である請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。１１．野生型の神経栄養因子がＢＤＮＦであり、該置換がＬｙｓ９５、Ｌｙｓ９６およびＡｒｇ９７からなる群より選択される１または２以上のアミノ酸の置換である請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。１２．野生型の神経栄養因子がＮＴ−４であり、該置換がＧｌｕ９４またはＡｒｇ９６の置換である請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。１３．ａ）野生型の神経栄養因子のアミノ酸３０〜３４またはアミノ酸９３〜９８にある少なくとも１つの正電荷アミノ酸を非電荷または負電荷アミノ酸で置換し；そしてｂ）野生型の神経栄養因子と実質的に同じ生物活性を示す因子を選択することからなる、ｐ７５^NGFRへの結合能が低減した神経栄養因子を選択する方法。１４．ａ）野生型の神経栄養因子のアミノ酸２５〜３６にある１または２以上のアミノ酸残基を置換し、ｂ）変更分子の安定性および生物活性を野生型因子と比較して測定し、そしてｃ）野生型因子と実質的に同じ生物活性と、野生型因子と比較して変更された半減期を示す因子を選択することからなる、野生型の神経栄養因子の半減期を変更する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者モリナー，カルロスフェルナンドイバネッツスウェーデン国 11343 ストックホルム, ヴァストマンナガタン 95

Claims

【特許請求の範囲】１．得られる変異型の神経栄養因子がｔｒｋ受容体との結合能を維持しているが、低親和性ＮＧＦ受容体との結合能は低減するように、１または２以上のアミノ酸が修飾されている親の神経栄養因子からなる変異型の神経栄養因子。２．親の神経栄養因子が、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ＮＴ−３およびＮＴ−４からなる群より選択される請求の範囲１項記載の変異型の神経栄養因子。３．修飾が、アミノ酸３０〜３４またはアミノ酸９３〜９８にある少なくとも１つの正電荷アミノ酸を、非電荷または負電荷アミノ酸で置換することからなる請求の範囲２項記載の変異型の神経栄養因子。４．修飾がＬｙｓ９５の置換である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。５．Ｌｙｓ９５をＡｌａで置換する請求の範囲４項記載の変異型の神経栄養因子。６．親の神経栄養因子が神経成長因子である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。７．修飾がＬｙｓ３２の置換である請求の範囲６項記載の変異型の神経栄養因子。８．修飾がＬｙｓ３４の置換である請求の範囲６項記載の変異型の神経栄養因子。９．修飾がＬｙｓ３４の置換をさらに含む請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。１０．修飾がＬｙｓ９５の置換をさらに含む請求の範囲７項記載の変異型の神経栄養因子。１１．親の神経栄養因子がＮＴ−３であり、かつ修飾がＡｒｇ３２、Ｈｉｓ３４、Ａｓｎ９３およびＡｓｎ９４からなる群より選択される１または２以上のアミノ酸の置換である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。１２．親の神経栄養因子がＢＤＮＦであり、修飾がＬｙｓ９５、Ｌｙｓ９６およびＡｒｇ９７からなる群より選択される１または２以上のアミノ酸の置換である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。１３．親の神経栄養因子がＮＴ−３またはＮＴ−４であり、修飾がＡｒｇ３２の置換である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。１４．親の神経栄養因子がＮＴ−４であり、修飾がＧｌｕ９４またはＡｒｇ９６の置換である請求の範囲３項記載の変異型の神経栄養因子。１５．神経栄養因子の低親和性ＮＧＦ受容体への結合能を低減させるように該因子を修飾することからなる、神経栄養因子の受容体結合特異性を変更する方法。１６．修飾が、正電荷アミノ酸を相対的に非電荷のアミノ酸で置換することからなる請求の範囲１５項記載の方法。１７．修飾が、アミノ酸３０〜３４またはアミノ酸９３〜９８にある少なくとも１つの正電荷アミノ酸を、非電荷または負電荷アミノ酸で置換することからなる請求の範囲１５項記載の方法。１８．神経栄養因子のアミノ酸２５〜３６にある１または２以上のアミノ酸を変更し、変更分子の安定性および生物活性を親分子と比較して測定し、そして親分子と実質的に同じ生物活性と、親分子と比較して増強された安定性を示す因子を選択することからなる、神経栄養因子の安定性を増強する方法。