PT95911B

PT95911B - Processo para preparacao de vectores geneticos da expressao do factor de crescimento dos nervos em celulas eucarioticas

Info

Publication number: PT95911B
Application number: PT95911A
Authority: PT
Inventors: Francesco Della Valle; Lanfranco Callegaro; Alessandro Negro
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1998-01-30
Also published as: IT1238348B; HUT61047A; EP0432510B1; KR910009929A; PL287811A1; JP2001000194A; AU6655890A; IL96347A; CA2030108A1; ES2173856T3; TW205069B; DE69033937D1; CN1051934A; PT95911A; ATE214735T1; US5457034A; NZ236058A; FI905691A; ZA909122B; EP0432510A1

Description

Esta invenção refere-se a us processa para & preparação, a partir de células transformadas, do polipsptido designado por Factor ds Cresci mento dos Nervos ííT-MGF) , s mais precisarnenta ao processo para a preparação, por meio de tecnologia de ADN recombinante utilizando construções genéticas que se podem inserir nas linhas da cálulas eucarióticas adequadas, da forma madura humana biologicamente activa (subunidade.....β).

Antecedentes , da.......Invengão

A_a_Factor_do_^r5sçimgnte.....,dgs^leo/gs._(NSF).

Factor ds Crescimento dos Nervos CNSF) foi pela primeira voo descoberto sm tumores do sarcoma do rato (Lsvi-Montalcini, R.. e col», J.. E:-:p., Zoai. 116s321,

1?5Í) o fci em seguida purificado s homogeneizado a partir dac glândulas salivares de ratos macho CVaron S,. e col., Dieohemistry =s2232, 1937) e a partir ds veneno ds cobras • (Angsletti ,P. :L , Proc» Natl» Acad» Sei», USA áSsáéS, 1970)..

Fora® indicadas muitas outras fontes relativament© ricas && N8F, incluindo a próstata ds cabalas, CHarpsr, B.P. β col». Matura 279s?ié0, 197^) S placenta humana 03οί dstei η, L.fi» s col», Weuroche». Res. 3sl75, 197S, tóalker, P, & col.. Life âciencs 26U93, Í980, Fidia Patent 47745AS8). Fora» encontradas pequenas . quantidadesde ΗΘΡ o® outros tecidos cose por exemplo, na sistema nervoso centrai dos «amíferos, (Vrm, 8« , Slscqssians Sn Keyrogeiencs_s Vol-- XI» Ng 3» IWSÍs' ' Hefti. f« a col., Neuroscience 14l55| 1ΨΘ5). A relação fisiológica entre estas -fontes potenciais de WGF e as sítios aparentes de acção não ê «uíta clara mas geral®srsfce é susposto qua α WSF ê segregado por vários tecidos periféricos que requerem a inervagãa a partir das células, que responde® a© NBP» ... '

N6F obtido a partir daa glândulas sub«axilares do rato é a mais utilizada para os estudos in,vitro ® in vivo da actividade do MBF. A gama ds actividade biológica Inryívo do MSP foi deterainad» sm células de nervos primários © em linhas de células clanadas. De entre as células dos nervos primários que respondem ao NEF ' -ÍB/yite».; encontram-se âs neurões sensariais de fetos itíia fetal B-121 das raízes dos gangliSes espinais-, neurões fetais noradrsnérgicos autonômicos do gangliao dõ simpático, neurões fetais colinérgicos da septa & células de ermafína durante o desenvolvimento. Embora os «surges ssnsoriais * a do simpático dependam do NBF par® sabrevivare s© desmvaiver» os oeurBss colinérgloos «So oareces necessitar da RBF para sobreviverem' mas apenas psra a sua diferenciação, isto é, para a expressão das csractsrístieas..fenatspiesfi iígadss ao n©uratran@fflissor« -ft‘ãtíifie- do H5F ãs células suprarenais de crosafina (derivadas do cresto neurall durante a primeira fase do seu desenvolvimento provoca a expressão dos fenotípes doe nervosDas‘linhas das células que resptKide® ao‘ WBF in , vitro. tal como descrito na literatura, estão incluídas células suprarenais da cromâfína derivadas de tumores do cresto natural, designadas por células tío feocromocxtoma CPC12; '© células do nstiroblastona humano. Apôs tratamento co» fl-MBF, estas célu- 2 “Η

£ae altera® o seu comportamento , passando de uma -Fase fortemente prolíferativa a uma condição post-micótica» j 0 factor de cresci mnto dos nsrws obtido [ a partir da glândula submaxilar do rato é o «aís oaraEp teriaada, também co» om perfil químico- e imunoquímico. 0 NSF ís íi daa glândulas de murina oue actua® como complexo ds proteína j.

dO ~ tipo 7S (peso molecular cerca de 14Q ββΒ dal tons) constituída por 3 subgnidades <s, íh Y ) qua coordenam um j átomo d®- 20*® - - ^; <

_; A parte mais interessante da molécula 7S, p e® rel-afSe. ã aua açtlvitíad® bíoi-égxcs, ê cppsfcitaida’por doas ^! j| cadeias de polipéptido, possuindo cada usa u® peso molécuíar jj de 13 23® e formada por 11S asdnoácidos„ Cada cadeia de moná' mero te® três pontes de sulfureto, que foraa® ligaçSes covajj lentes entre dois resíduos de eistaína, qoe conferem · «ma j forte estabilidade á estrutura tridimensional da proteína» Qs l·p dois monómeros de NSF ligados um as outro por ligações fracas í; formam «® dímero com peso molecular de 26 3SS» Foi dsmons- [ jj trado que a actividade biológica está associada co® o dímero designada . por 2,5S ou convencionai©ente sufounidad©-S» é sabido que este também está presente no sonárag-o, j\ j?

ί ' ; 7 t - - - ' L· ? As técnicas ds engenharia genética tor- !

narso possível identificar o gene que codifica a subunidada-fi ' j de » Í0-WJ (Scsot₉ d» . e cal», Nature 303iS38, Í983f '3 UXlriefr,.A. e cai., Hatura 3»®2i, 1963^ EP Pafcenfc PubXn/'· f

WS» 0 121 338) „ 0 gene humano que codifica a molécula está j| localizada no braço pequeno do cromossoma Ϊ e codifica para a síntese ds ty«a molécula muito raaiòr do que a do peso molécular 26 5iM que constitui a molécula biologicamente activa» Assim, o gene instrui inicial menta a. síntese de um precursor hjõ de HBr ou pro-NSF de maiores dimensões,, Foi ainda demonstrado que o gene que codifica para a subunidade-β ds MSF ê altamente cBFieerysde es.-. espécies- -dsrt» <avéS->.-ãté^: aq j homem ífeíer, R. e cal., EH0Q J. Ss1489, 1986)s esclarecimento das sequências de nucls™ ôtlda de g~HÈ3F da amrina, do heras®, gado bovino @ galinhas tornou possível a comparação os sítios conservados e os não conservados destas iiiolèculas @ a soa rel-sção cos a actividade biológica e antigenicidade, Ά conservação global do β-NSF durante a avoluç-So ê ®uito surpreendente» Dos tíS aminoâcidos da foras madura ds WSF purificado das glândulas eubmaxilares salivares de rata» apenas 16- asincácido-s são'diferentes ne ff-·· WSF de gado bovino, 19 em â-NSF de galinha e 11 em f5~WSF do homem, enquanto existem apenas 6 amínaácidos de diferença entre o fB-WEF bovino e do homem» Todos os resíduos da cisteina são rigorosamente conservados'am todas ss espécies» A redução das três pontes S-S de * β-NSF prõvocs a perda completa da sua actividade biológica, A discrepância aparente entre o' sito nível de caise-vaçss global das sequências d©. aminoácidos e a baixa reactividade cruzada do tipo imunoquímica á devida ao facto de as alterações dos aminoácidos entre as espécies estarem · localizados em agregadcss¹ específicos» Com traçagem de hidropaticidade é possível demonstrar qu® - ©State alterações ocorre® 'quase eoapletaeente em sítios hidrofíXicos cmisiderados co«o determinantes antigénieos potências» Apenas uma região hidrofílies parece ser estritaraante conservada nas moléculas de WBF para todas as espécies estudadas até agora» a^^glggla.Je,W.XS£artHQâfe

A tecnologia ds ADN recombinante torna possível construir sôris de. veetares que são capazes de ©apressar proteínas de entrasse em gartdes quantidades» Esta técnologia permite que os ' biólogos moleculares construam sequências - -d» ' ΑΒΜΓ xdáilEt SUL&S**' csptíveis de produzir uma proteína de interesse» Os processos utilizam várias reacções como por exemplo, corte co© enzimas de restrição, ligação dos fragmentos asssiai obtidos . co® ligase, síntese química'de oligonucleótidos a serem montados © ' outras metodologias de vários laboratórios do sector

t-

CWariatis, T. e cal., Molecular Cloning» A teboratery Manual„ CgW Spring Hãrhor Laboratory, cold Qpríng Laboratory · NV, 19β2>«- Para se obterem altos níveis de expressão os elementos de ABN a serem montados devem apresentar a in-forraapão essencial., Por exemplo, uma origem de replicação, uma selecção para antibióticos» um promotor de expressão, activadores da transcrição do gene ds interesse e outras caracteristicas conhecidas dos cultivadores tio referido material» A combiii nação destes elementos de uma forma adequada dâ: origem a um | |S plasmídio, se o gene de interesse for inserido naturaimente l -ã. II ®«- relação às sequências .reguladoras da transcrição e | translacgão a o plassídio rsuitante é definido em expressão» ! 0 plasmídio ou o vector de expressão é assim susceptível de |l exprimir a proteína nas células hospedeiras» -A proteína pode ser em seguida obtida por um sistema de purificagão»' Qs elementos (promotores) que controlam naturalmente a expressão _ ,; de muitas genes» tal como, por exemplo, vectores de crest cimento, não sSo muito fortes ns sua expressão, e são i| activados apenas em condições adequadas naturais que frequen- | ;; temente não são conhecidas» Para este objectivo, _Q5 promo- teres são utilizados quando a actividade ê conhecida, por j exemplo o vírus da série de papovavírus ou outras sequências j, / íj promotoras de genes conhecidas» Os elementos que são utili- I I zadas para altos níveis de expressão são assim uma eaabinaçãe ! í de AON de vária origem (eucariótica, baéteriana, virai, stcJ J .I constituídas no final de partes de genes diferentes ligadas para formarem um híbrido» A actividade de transcrição e [ transíacçso de um gene depende das distâncias adequadas entre sequências reguladoras e de codificação»

Tenda sido fei-ta esta introdução, um dos ífjl ·

melhores processos para o processamento adequado das sequências ds regulação é que o gene introduzido -seja colocado na posição Idêntica do gene natural» Ubs sistema que é utilizado ê.aquele em que as sequências de regulação compreendem também alguns aminoácidos das sequências de codificação» A união com α gene introduzido resulta assim numa proteína fundida» 3®, por outro lado, a parte fundida for removida, ê possível obter altos valoras biológicos,, Ss a técnica de proteínas de fusão nãe» for util izada, as tecnologias convencionais para ss obteres genes localizados numa próxima vizinhança das sequências tíe regulação depende® da existência de sítios de restrição’adequados que psrsiiãa a sua cíonação» 5e os sítios compatíveis nao existirem nas vizinhanças ©as e© sítios diferentes, é possível obter a união dos segmentos co© a síntese da uni oligonucleótido ou ligante que conte® o sítio tíe restrição pretendido., Ss os sítios ds restrição que peraltas a utilização do ligante não existirem na vizinhança, então a técnica' ds eliminação ds ADW co® Bal 3í ou SI á a utilizada» Esta possibilidade não permite uma eliminação precisa e é sempre necessário confirmar por sequenciação os vAríçe danes- para war qual é o mais adequado» Esses sistemas são muito limitativos para obiôlogo molecular e eonssqusntsmente ê necessário desenvolver estratégias alternativas como função do desenvolvimento de novas tecnologias, ccso por ©xeaplo a da reacção em cadeia de pol inter ase fPCRÍ CSaifei © cal», Science 2395487, X988| Scharf, S-.J,₅ Science 2S3sWã, 19Óâí« . ’

Com esta técnica é possível amplificar um segmento de gene até í©K D princípio è baseado na utilização de dois oligonucleótidos que podem s-er emparelhados, rsspeetivamente em caria uma das duas hélices ds ‘ADM que se pretendem amplificar. A distância que intervém entre os dois oligonucleótidos em relação à sequência do gene examinada dá as dimensões da molécula a produzir» Estes dois ollgonucleótidos são construídos de forma 'a que dentro da sua sequência exista um sítio de restrição que permita a sua clonoleÇão posterior» Este sitio-de restrição está natural·» «ente presente ou é construído ad hoc por degeneração do ndmero mínimo de bases» Esta técnica, que pode ser definida como «itagénese orientada para sítios, torna possível construir sítios de restrição em posições teoricamente deter©inedas pelo biólogo molecular» AcontruÇão dos s&lioe compatíveis com outros segmentos de gene permite, por u» à

lado, ά clonação fácil mas especialments a possibilidade de união de vários segmentos de gene nume forme pretendida»

Esta técnica pode ser definida coíbo ciona&ãa por mutagénese directa,; Ma prática, por tecnologia de AON rseomfainante, ê possível expressar polipéptidos hetsrôlogos completos por expressão -directa, oo alternativamente pode ser expresso o poli péptido heterélogo fundido co® uma .parfce «te seouSocia ds aaínoâcidos da um poiípéptído -sase~ Ihante. Em geral, os produtos obtidos por sste processo não · slo biologicamente activos CBritish Patent Aplícatlon Publ.

MS 28107676¾ Meneei, American Scie-ntíst 68, 6é4, Í9BB)»

A capacidade de isolar o ge-ne humano da submidade-β do factor de crescimento dos nervos oferece uma possibilidade importante» é possível per tecnologia tíe ADN recombinante produzir ~ uma . quantidade suficiente desta ; proteína, rara. Actualmente, a proteína de crescimento dos nervos pode ser aceite para utilização clínica no tratamento l· de;várias doenças neurodegenerativas. Neste sentida existe decumentaÇ-Moreiativa á obtenção da subun idade-jS de MQF por tecnologia de ADW recombinante ÍEuropean Patent Publ» MS ι 0i2i3S8s Sruce, S- ε col._? Weurobiology of Aging 10289« 19S9j 4

Hu, 8» e col.;, Mucísíc Acid Research 70j57, 19SS;( Edwards,

R.H.» Mol» Cell» Biol. 8s24-56, l?88j Emfors, F», Proc» MatU a Acad,, Sei. Sis475é_ç ÍW?>„ Para a-produção, são escolhidas ¹células de mamíferos em voz ds,bactérias apenas nos casos e® ] que a expressão e« células microbianas manos caras, não é possível. Actualmente, é muito mais económico produzir certas J proteínas em linhas de bactérias por exemplo E._. poli, mas geralmente este sistema da. hospedeiro/vector reproduz core fiabilidade apenas a sequência/ linear 'ds aadnoáeídos que constituem a proteína, obtendo-se um tipo da massa inaclúvsl ' na bactéria» Partindo da hipótese que um dado produto pode J^!ser preparado a partir deste material- de forma económica, E. j. ggli_ podia sei'- o sistema escolhi do, tal como no caso da certas moléculas mais pequenas, como por exemplo os interfsrãea e algumas proteínas de crescimento animal em que uma :--,7/ctirrect® dobragem da molécula ân , vitro é possível» Estes sistemas sSo mi ta produtivos nas casas etn que ’ se refere® geralmente ãs proteínas com uma única ponte de dissulfureto e com péptidos ou proteínas cuja utilização (como antigénios do diagnóstico ou componentes de vacina) nao necessitam de uma conformação bem definida»

As proteínas 'terapêuticas, a que pertence θ factor de crescimanto dos nervos ίίΐ-ΜθΕί, necessitam ds uma corracta conformação para serem activas s utilizáveis e também necessitam ds estarem isentas de resposta antígénica» 0 processa de preparação pode compreender, para a proteína obtida a partir ds ADN recombinante, a gl icosilação, a formação de pontes de dissulfureto correctas e outras modX*— flcaçSes pós-trsnsdução. A linha bactsriana E». Coli não é capas de cumprir ssta requisito, enquanto que as células eucaríáticas ds mamíferos e leveduras o sao» A aplicação potencial de fí-NSF humano como agente farmacêutico, obtido per biotecnologia, deve tei- estes pr oh*» amas au cwitsidér ^sÇao»

A actividade do MSP mostrou depender da ferea dimêrica, isto ê, do conjunto de dois polipéptidos diferentes com XIS aadnoâcidas. A redução co® «ercaptoetenal faz com que a actividade biológica cais praticafliente para «are* te · tentativas- ds rs-naturação das três pontes 'd©' dissulfureto fazem com que s restontage® da cisteína dê origs®, do ^«to cfe^vieta-agfeatísiiceirra _ue«/a»ficala- cem uma estrutura correcta e igual ã correspondente natural com uma probabilidade de 1 em 1S„ Sonsequentemente obtendo a molécula «a £»_Coli não ss garante a homologia da estrutura e a sua aplicação como agente farmacêutico' no homem» Realmente, após ser purificada até a hompgensidade ser obtida, o MSP humano produzida de E» Coli mostra em ensaios de imuno-ravelaçao, : por anticorpos poli cionais específicos para fl-MBF ds aturína, usa' série de bandas que não se podem atribuir ã f tsr ma di métrica biologicamente activa» Além disso, a actividade biológica desta mistura de estruturas e formas mostrou ser ifíi vezes inferior quando comparada co® a forma humana semelhante

purificada- «Ξ& t-Χ tlcd la 5 í_£^iís_í p£3£ EdX t^Ufp Λ if tecido de placenta.

Esta técnica de clonação e tíe se obter ô.„ factor do cresci mento doe nervos em E» Gol i, se por um lado prodws elevados níveis de expressão da proteína de interesse,. prodisi. u»a série de moléculas inexactas que administradas in yivo. podia® provocar, efeitos secundários, por esestplo, anticorpos que reconhecia® e bloqueava© a acti vi dade biológica da molécula naturalmente presente» Ao stea» tempo, a elonaÇã© da molécula eadúra em E. Col.i. apresenta uma ©etionina inicial irremovível que é csrtaments imunogénica, dado que está colocada numa parte exposta da molécula»

Outra técnica refere—se é, donação do prepro W8F e© células eucariõticas e consiste a© usar a vanté-gê® do ataque das peptidases específicas natural mente presentes nas células eucàrióticas para se obter a molécula «adura» Em particular,, a ©lunação â .efectuada em células de ovários de hamsteres Chineses íCHD). Da literatura corrente, a.elonaçãu genómica completa do MSF humano não foi ainda seqamciada, mas mostrou-se que o gene é estendido por mais de W kda CLíllrich, A» a col., Matura 3®3s82i» '198350 gene assim estendido não permite a clmação convencional, a partir desta sequência genámica completa» & técnica é ds clonar uma parte do cADW que contem apenas as partes ds eodificação da proteína» Mesta altura, o cAQN completo para o MBF humano nao foi ainda isolado (algumas sequências faltara na posição 5’5 mas ê conhecida muita informação de NSF mensageiros de outra origem inato, bovinos, galinhas, etc.5 (Meier, R» e col», B« J» SX489, 1986? Selfoy, H.J», J of Weuron Research J.8s293j 19875 que podem levar a deduções interessantes» 0 gene do MSF de rato está presente numa cópia simples e produz pela menos quatro mensageiros diferentes de dimensões diferentes CSelby, K«J» e col», Mol» Cell Biol. 7s30S7, 19875» Estas dimensões diferentes são reflsctidas especialmente no Códãa de partida AU8 diferente, mais importante são as posições -187 e -121 e® relação á proteína ©adura» Estes mansagsiros estão presentes ni®a' abundância relativa diferente em relação sos vários tecidos» Os . que começam em -187 são ίβ vezes mais abundantes na glândula submaxilar ea comparação cqííí os que começam em -121» Contudo, diferentes» evidências aostraram «que a percentagem mais consi atente dos W6F ssnsageires.expressos no cérebro usam precisamente o AUG a -121»

A presente mvsnÇao r lutí processo para ss obter a subuni dads-jB do JMSF humano por verteres de expressão, da -forma a que exista Uma distância natural entre os sítios de regulação e os que codificam a referida proteína, vectorss a utilizar nas linhas de células raucarióticas, por exemplo CWO» que tornam possível obter no «eio de cultura a forma madura dar suhuni dade-f?» do factor do crescimento dos nervos humano (hg-MSFl, ia atssíãjíicsía de um ou aalsk amínoãciods fundidos ao polipéptido, diferente dos presentes na sua sequência natural» D polipéptido 'assim obtido apresenta actividade’ biológica que é utilizada em células ®lvs• 0 h£-H6F descrito nesta invenção pode ser utilisãdo para a manutenção ou prevenção da perda da função dos nervos, para a sua recuperação em condiÇões-patológicas dos tipo crónico ou aguda, em situações nsíirodegenerati-vas mesmo em fases tardias de patologias agudas, como por exemplo cershrovasculares„ ínfecoiasas, ί nf1amat órlas, comprsssivas, deficiências metabólicas 'e em situações de modulação do sistema imune» D polipéptido obtido ê ainda isento de outras proteínas cont emanantes de origs® humana ' que podiam apresentar actividade biológica indesejável» ’

A invenção è ainda dirigida a construções genéticas que poderá ssr utilizadas para transfecções de células, incluindo as que podem ser implantadas ín.....vivo»

Algumas destas construções podem produzir, a nível local» especificamente a forma activa do factor da crsazioito dos narvas em função ds uma dieta administrada, isto é, ê posai vel manter o gene sob controlo» d <

A invenção ê ainda dirigida à linha da células transformada, qus contam os referidos vectores, s à sua cultura que produz o hfl-WSF» 0 objectivo desta invenção s também a preparação de compssi§8es farmacêuticas que compreynidade.-· & do factor nesurotrófxca e um gsngliõsido natural ou um dos seus derivados ou análogos .semisintáticos ou· um dos seus sais» d . ;< d

B^s_desçricãs^os_^egenhos

A Figura 1 ê um perfil.de-hidropaticidade do polipéptido do factor tíb crescimento .dos nervos, subunidads-S ds origem humana»

A Figura 2 -é «ma representação esqueBátiea da construção do vector de expressão pWSGphNÍSF,

A Figura 3 é uma representação esquemática ao vector de expressão pMSSpbWSF»

A Figura 4 é uma representação esquemática da construção do vector de expressão p8V40MTphN8F»

A Figura 5 è uma representação esquemática do vector de expressão pSV40í^vITphMSF.

A Figura h & uma representação esquemática da construção do vector de expressão p8V40phNF»

A Figura Τ' é uma representação esquemática do vector de expressão p3V4GphftIF.

.A Figura S é uma representação esquemática da construção do'vector de expressão pSV4GhMSF«

Partindo destas evidências» o iS-MSF huma- jj no da presente in ven sito -Foi clonado, partindo precisamente da

- s»tienina a_-i2í« As análises do perfil de hídropaticidade -1 mostraram que es aminoâcidos entre “121 e ”104 podém funcionar et®» pêptidos líder» indicando que a proteína pode ser segregada» Este perfil é mostrado na Figura 1» o-perfil t de hidropaticidade do polípéptido do factor de crescimento [ doe fsrvts, a subunidada, de origem humane» de acorde coa um . j processo descrito (Hopp e coL, Mat 1. Acad» Scí» USA 78§3824, ;

1981). A posição indicada como -Γ21/-Ϊ04 identifica o péptído .1. líder enquanto que a oesiçâo indicada como 4-1/+118 indica a ,

- ^-«5?fejtí,S£fÍ - · í-ífeí X tlí-fSSf t44-í J.JÍ..Í ..U, -w |»J?CSÍj_í Cn -*» * 3tr>—. $*|5dí t crescimento dos - nervos» subunidaderg. da origem humana CUllrich e col.» Nature 303#821, 1983)» Para obter a proteína madura SKiste uma peptidase específica que torna possível 1 'ebfcar a sequência de aminoâcidos de +í até +ÍÍ8 que corresponde ao péptído biologicamente activo. Esta peptidase V contida nas cvélulas que 'normalmente sintetiza© o N8F mostrou esta# contida também nas células AT~2ék Actualmente» por 'j ínt redução nestas células de um vector consistindo de prepro NBF ds um vírus vaccxnía de origem .da ©urina» ales são ί susceptíveis de segregarem NSF maduro tornando possível a produção de uma molécula ds 14 kda em . gel em condiçSes de desnaturação e redução (Edwsrds,/ R,H., Mol. Bell»· Biol»

8#2456, 1988), ;

Ba função das experiências anteriores na obtenção da suhunidade-fl do factor do cresci sento dos nervos acima descritas» os presentes inventores preparara© numa forma nova uma construção de um ou asís vsctor.es que pode ssr iítxlízados ssa células eucarióticas. A técnica de PCR foi utilizada para a clonação do prepro M8F» cujos sítios foram criadas compatíveis com vários verteres de ei-q sítios de restrição foram localizados de modo a manterem tão naturais quanto possível as distâncias entre as sequências de regulação a as sequências de codificação, qua é uma situação

Hί

.«Uito diferente das construções genéticas anteriormente' descritas na 1 iteratura'para a expressão da. subunidade ft parte de prepro NGF foi ligada a uma sequência de MBF íh$KF> hteano madura modificada, adquirida da .- Sritish

Tschnola^y Ltd» ÍQxford» 6ra Bretanha), em que os sitios da restrição aâo criados de forma a permitirem a mutagénese posterior,. Para o objectivo da invenção, a presença destes sítios de restrição não deve ssr considerada limitativa, tal como a origem da gene não deve ser considerada limitativa»

.... .... Partindo desta hipótese, os presentes inventores çlonaram em seguida o prepro h^-W sob o controlo de diferentes promotores SV4S (vírus de Símios 40), IfTTV (Vírus do Tumor Mamário deRafco), hMTIIa (metalotioneina humana lia)»' Estas sequências genéticas introduzidas nos plasmídios foram em seguida 'transfactadas em células CWQ, «ostrando sue mesmo essas células' são susceptíveis tie produzir no maio de cultura o polipéptido de bHMSF na sua. forma biologicamente activa» Este prepro M6F provou ssr essencial na construção da - molécula, tornando possível a expressão de apenas uma subunidade-β e mostrando que toda a construção genética devia ser considerada correcta,.

âe^ESMâ^feâiâJ^XiãâáaãL - ' / : , - ' . .. rrt · // ^: f

Gs ataques nas eadeias da ABW co® enzimas //> da restrição são sfectuados ds acordo com as especificações ij. -das. ccaparAi an produtor«s» Em gesrai -ê cortado i pg de | plaseítíio com 1 U ds snzíma sm 2S jil de solução ,5 a j temperatura e o tempo de incubação depmtíem da enzíaa rl·

Utilixada, am geral 1 hora a 37“C» Após incubação, o . H plasmídio e-oa

purificados num gel ds

agaros© LMF Agaross ÍBRL, Estados Unidos da América) em 40 ®M d© Tris/HCl 20 mH ds acetato ds sódio, í fd-i de EDTA e sm seguida eluítio com agarose com o dispositivo βΕίβί,ΈΑΝ¹¹'¹ ÍBIQ ΙΟΙ ífi€» , La Jolla, CA, USA5. Para as rsacçaes ds cópia na extremidade 5^?, o ADN é tratado durante 15 minutos a 15*C com

ΙΙ'β'βββ Τ< nufftâ cxmcentraçâD ds í U por 0,5 fig de AuN numa raaeiB© de 28 pg a i3^eC durante 12 heras.

Ag análises para eonfí ornar as sequências cerractas ne- plasaldío sss sfectusdas tranefersando ea células HB101 e es transfarsantes .seleccíonados es placas ds agarose ss seis LB CLuria Bertani) com o antibiótico ampicilina 50 pg/al» O plasmidio contido no HBlkii a cultivada ea LB, 100 pg/ml da ampicilina e purificado, quer as composições pequenas, quer est grandes com o ' dispositivo ds Qulagen CBIASBf SmbH, Dusselctorfe» Repâblica Federal da Alemanha*. Qs vectores da expressão são preparados a partir de células bacterianas cc® o processo ds Qiiagen» . <557 Λ

AON para as reacções de PGR é preparada da seguinte forma a partir de placenta, humana no termo» Corta-se um pedaço de 0,4 cm³ de villi cariónico com u® par de tesouras e suspende-se em 700 pl de 5S mH .de Tris/BCi pH 7.S, 100 mH de EDTA, 100 mH de NaCl, 1 %' de SDS» A esta mistura são em seguida adicionados 35 pl de proteinase <K IBS ug/ínl; e ela é incubada durante a noite a 55C« Em seguida ê adiceionada uma solucção ds 2Q pl a 13 pg/ml ds ARNass A s incuba-ss durante mais 2 horas. Sao feitas duas extraeçõee cosa fenol e duas com clorofõrmxo» O ADN é era seguida feito precipitar num capilar de vidro por adição de um volume ds isopropanol» Nesta altura são .efectuadas algomas passagens cem etanol β '702 e a 180% e ê feita a secagem» O ADN ê dissolvido num tampão ÍÍ0 «H de Tris/HCI pH 7.4, 1 ®M de BOTA5, deixa-se sm agitaçao lenta num tubo ds ensaio»· Após algumas horas, o ADN dissolvido está pronto para amplificação genética» Normalmente, são suficientes 0,1 pg ds ABN para ss prossguir para PCR, - _: X ΤΑ transfecoão nas células CHO ÍCCL &'it e CHO modificada por ausência de gene ds redutase desitírofoliada CDHFE-J â efectuada com iiposomas seguindo os

procedimentos da companhia produtora SltíCQ ou qtse fosfato dê

Cá&leleu - ' .< . - - ^;

As células cultivadas am melo de alfa-MEM es» soro fetal de bovino a 5X, no dia anterior à transfecpão afio tripsinizadas s replacadas da -forma a que no dia seguinte atinja® entra 70-S05C da confluência* Q ADN do plasmidio ã ser transfectsdo è diluído numa ' concentra são de 10 jig de ADN em 3B pi de água a que .são adicionados em seguida 5S pl de Lipofectirsa¹^ (S1BCQ), o total é colocado num- tubo de poliestireno» Passados 15 minutos de espera, esta mistura é adicionada âs células previamente lavadas num meia QPTI-MEW <SXBÇ33>.'As células são incubadas desta forma durante .8 horas,, a em seguida é adicionado o meio normal incluindo o soro de bovino fetal para continuar o crescimento,.

(M»......Tff-mlgcfija,, ew......Fosfato jjsjlál cia _u para,.se,

Os tampões para a transfscgão neste processo sãos BBS concentrado duas .vezes Í2 x BBS) e 0/25 Pí de Cloreto de Cálcio., O 2’ x BBS é preparado da forma seguintes são dissolvidos 3Í5 de ácido hl„Fl--bi=--2-<hidroxí©til>-2~£imino-stano-sulfônico. CCalbiocbsm)$ 280 de clorato de sódio e 1,5 «M de em. água e o pH é levado a à,5eaa seguida á filtrado o conjunto a 0,45 pm, enquanto sa prepara o 10 x CaClg como uma soluqão ds 2,5 H ds CaClg. λ

As células são colocadas em S x 10⁵.eéluXas/18 Cm de pIaca/10 ml de «seio de cultura e sao incubadas a 35°C durante toda a noite» São misturados 2® pg de plasmídio com 0,5 pl de 0,25 M de CâCl^ « 0,5 .ml ds 2 x BBS? a mistura é'incubada durante. íõ minutos ã temperatura eHblênte.. A mistura ê então instilada õõ mexo e o conjunto é incubado a NSSRS :3t<ds--C02.,/. iParsr ’eeobterem as células estávelmente transformadas com estes vectorss, é efectuada a cotransfecção por adição ao vsefccr da expressão cte hg-MSF o vector psV2hfeo numa proporção de 10 para 1« Dois dias apôs a transfecção, as células sao tripsinizsdas s colocadas an placas numa concentração des vazes inferior em comparação com a transfecção e é começada iesdiaiâfflarÃ© a selecção nas transformaçães estáveis com t mg/ml de sulfato de neomicina 6418 ÇSIBC6?» Os-transformantes são em seguida analisados por revelação de Southern para integração tía construção genética.

âajS—ÊMfiDSSssãfi r Todos os meios das células são mantidos para expressão em F12/BWE K-21 de Ham cem. ÍS n»M de {Hepes e X0X de soro tíe vitela. O seio é alterado todos os 3 dias e

BnMwsSbA ewâww &O- .;-T£.wws»w. -4S& @ .-- - cJíLtp s . «»&»· •f&cter híMáSF*

Foram preparados -3 vectores dif er entes μ o primeiro s o segundo são dois veeforss ae qus os elementos de regulação, respectivamente MMTV (Virus de Tumor Mamário ds Kate> Θ hMTlIA (metalotioneina humana lis), podem ser quimicamente induzidos- Desta forma é possível- expressar, de fena& controlável o gene de h0~WSF- Felq contrária, no terceiro vector, o hg-NSF ê clonado com o promotor SV4S (Vírus ds Símios 461.

- ClgBSâaJS-VstE. ds....ÊaSTlã5S&...s!dSS vector pBSS foi adquirido da Pharmacia I €Up$$âl&, Suécia).* De acordo coo aã especificagães da coepanhia, o gane a introduzir deve ser inserido s® sítios de clonapSo múltiplos entre as sítios de restrição Nhe I e Sal ;

, í» 0 gene é transladada pelo seu primeiro ftIJSs neste caso o g.

! factor de crescimento dos nervos está sob o controlo do j proaotor de HíTfVLTP C^tíMouse Maemary Tumor Vírus Longy ··;'.· i Terei nal. Repsat)» A actividade desta promotor goda ser induzida por administração de glucocorticôides, por exemplo, daxametasona, Ma transcrição» pequeno t~antígénio SW4S e poliadsnilato por meio do grande t-arsti génio SV4j3« Este plasmídío também contém 3 I bacteriano da xantina guanina - fosforibo-siltransf erase Cxgptí que é utilizada para escolher as células de CHQ Kl j ί! estavelsante transformâvsís» .

' : i - _ . - , · · r · : .1 :

j Para permitir uma soXonaçã» neste --T ! plasmídio do prepro MSP, é .utilizada -â técnica de FCR, com a qual é criado um sítio de restrição imediatamsnte antes do

AUS inicial de forma a ffíS.ttcc r' as distancias tantes as l J sequência de regulação e as ' sequências ds codificação da i prepro MSP tornando-as tão naturais quanto possível». São sin~ d ¹ tetísados dois oligonucleótidoss o primeiro, entee as bases ^; ^{9122 3 9147 <UUrfeh A}-“^fciu™ ^{2tBí 881} ’^19SB!’ , ter a seguinte emsequBncias . . ' p i Mst Ser Met. teu Ph© 3 μ 3^?«CATAQeeTA ATS TCC ATS TTS TTC T₃

As bases antes do AíJS inicial, tal ’ como acima referido, são k «itadas ,.e em seguida, o oligonucleófcido aintôtizasdo tem a .

seguinte sequências ' - . _ ’ d

Xbai Het Ser Hat Leu Phe _ ? S^?TST CIAS A;3T ATS TCC ATS TTS TTC t₃ ,i, Esta oligonucleótido é designado por CXbaD» 0 segunda , ! oligonucleótido» que compreende as bases entre 9521 s 9342 f g (Ullrlch, A», Mature SSSsSEi, 1983), ê ccwapíementar a esta 1

sequência para permitir a técnica de rCR e tem a seguinte sequências/ · ' ÍBPsÉPISO'· ».»,..í-?r'- . ' - · .

Este oligonucleótido eoniés no seu interior o sítíõ ECOftl que é capaz de permitir a ligação ds prepro N8F ao N8F ©aduro. Este oligonucleõtído foi designado por (ECORI)» , □s dois oligonucleétidos sao sintetizados rntffi sintetizados de oligonudeótidos as -Fase sólida coe 'o processo de fasforaati dites seguindo os procedi mentos convenci anais do Sintetlsador de AON 330B CApplied Biosystms, USA)» Eles sãos Caí tratadas a 55 ~C durante 12 horas sm NH3? <b>.levados á secura numa centrifugadora de vazio? ící ressuspensos em acetato de amónio 2,5 M? íd) precipitados ctaa 3 yolumas ds etanol frio HSPCLe Cs) revelados co© etanol frio a 80% e ressuspensos em agua. A concentração dos dois aligortucleâtidos é avaliada co© u© espectro·? stôraetro» O procedimento tíe amplificação é efectuado num AispHf icador de «Psrfcin EI mer Cetus DMA Termal Çycler” s os reagentes utilizados para a amplificação são os tío dispositivo parecido de »MA^m AMplyfer ÍPerki Elmer-fetusí. Waste dispositivo ê resumidaraente-utilizada uma mistura com 200 μΝ de cada oligorsuclsótído, 0,5 μΗ de cada oligonucls-ôtido dATP, dTTP, dCTP, dSTP β'Ί,ί pg da AON humano e tampão de re£U_ çao para uma aistura total de 100 μΐ co® 0,5 Lí de TAQ polimerase, o canjimto é. coberto co© õleo de parafina para evitar a evaporação. A reacção de amplificação é efectuada por operação do instrumento durante 35 ciclos no caso, de ADN humano» Cr ciclo em ambos os casos é o seguintes 1 minuto a 94^§C, 2 minutos a 45-0, 3 minutos a 72*0« 0 fragmento amplificado de

30® pb foi purificado sm gel de Agãrose de Baixo Ponto de Foste (MuSieveí utilizando o dispositivo da SEMBCLEAN™ ÍBIO 181 £nc._r La dolla, CA, USA) para dissolver a- agarose» 0 ADW í& cortado com enzimas de restrição Xbal e EcoRl e repurificados como acima referido» 0 fragmento assim purifiçado â/ danado em sítios de Xbal a de EcoRI do vedar pGEM4 (Promega)» 0 plasmidio obtido é designado por pSEM4Xba~NSF«

- 18 ¹ Este plssmídio ípSEH^Xba-f®⁷) é cortado @® HindlII-EcoRI e. o fragmmto de 308 pb» quando purificado, â danado nos sitie® HxndlXI-EcoRI do vector pUCtSBBS26 (British Biotechnology Ltd. Oxford» Reino Unido>. O pUCíSBBS26 contem a gene do h|3-N0F construído e® blocos, isto ê, dentro da sua sequencia sãc criados sitios de restrição que não são naturais-e portanto torna.® possível a soíastitulÇão de determinados domínios, isto é, por outras palavras, eles permitem a mufcagánsse. 0 vector obtido > designada por pUCIShHSFC» Este vector á car Lado cam BamH! e a

1»ϊ1·φ·ίάβ%θ8&ρ* '·' S-'t - ·- 'IsS#' --·-'-?sSâOl^jSeSiS· í*Í£Sfc

Wi ÇSÍÍS 1*8?·- _- _-S^rLílí»; ;. &?5·ϊ^··%π}> .--- _r 5*4^-.'- vLL*í>ií- . iiJcdí: Cxcd^c? - -. O'«w?KlenaH» Ela á cortada cm Xbal e o fragmento de 758 ' pb'ê purificado por seio ds gel de agarosã. Este fragmento é donado entre os sítios Nbsí s Smal do vector de expressão pfBS» 0 diagrama resumo para se . obter este vector, designado por pMSSphWBF» á apresentado na Figura 2, enquanto a representação e® diagrama do mesmo .vector é indicada na Figura 3.

ÍU3_a^H3nagãoj}aJ&Sgb_Ld^^

- ' ' ? - · ' - < . . ~ . ·· ~ - - - - / . ri. ’ ~

Este vector á obtido dada que a metalofeioneina ila CHTIIal pode ser induzida com Zn** ou com Cd** ou co® outros iões ds metais pesados, s portanto a '-aís expressão pode ser controlada. Alá® disso, para poianciar a expressão deste promotor, ê adicionado o potsneiador 8ν4Β ns exi:_reí-5fidade 3’ do promotor ds MTIIa» enquanto que o pequeno t-antigênio e o poliA do SV48 são sempre utilizados para csrfeae políadenilaÇãa. Em primeiro lugar o promotor da metalationsina é ligado ao prspro htô-NSF da forma seguintes o prooertâr. da metalotioneina é isolado do plasmídio CpbMTIlAÍ par corte ce® as enzimas de restrição HindIII e BamH! íKarín, H., Naturs 299s797, Í.9S2) o fragmento ds S*-l pfa compreendendo o promotor è clonado nos sítios HindlII-BamHI do vector pSEK4 íRromega Madlson, WI, USA>„ Este vector ê designado por ρβΕΗ^ίιΗΤΠό. Esta parte do promotor estenris-se a 3^;r com alguns códãss naturais, contem α primeiro câdão do AOS da «ationína ® imediatamente em seguida encontra-se o sítio ds

•restrição BamHl. Para permitir a clcoação tía prepro bS-WBF .' j cca ssta promotor utilizando a oetionina inicial da promotor tíe Mfi*ÍXa_r ê construído um aliqonaeleâtido entre as bases h. %35 e 9ià8 íUilrieft,- A., Mature 3iS3«82i, 19S3> criando um í sitíe de restrição BamHI justaoents após o AUS inicial que '. peralta a ligação do gene em fasé» 0 oligonuclsàtido p sintetizado co» a seguinte.sequências

Met Ssr Met Leu Phe Tyr Thr }.,eu lie

5*TS TO AT-S TT6 TTG TAC ACT CT6 ATC AC₃é lavado á segnínts sequências ^TSB ATO ATWTTCTACACTCTeATCAGg Este oligonucleótido ê designado por BamBl» As bases eodificadas compreendem «ma alteração também da sequência de aSinoãcidos? realmente, o segundo e o terceiro aminoácidos al ter aiar-se, respectivaíssnte, de Asp para Ser e de Pro para Met. Confcuda, esta alteração não tem muita influência no po*fiT. de hidropaticitíade e- a molécula ê segregada norJ malaente» . . - . .. ' - , .. .

Este olígonucleótído, Juntamente com ò. qligesnucleótido EcoRl,, è utilizada para amplificar o prepro MSP da forma acima referida. 0 fragmenta purificada é cartada es BsírHí e EcoRI e era seguida á cionado entre ss sítios de restrição de HsmWI e Eccfti dã vector pSEM4hMTl'£a. O vector é designado pôr pShMTphíMISF,

Para se obter o poiegciador tactívador) de SV48, este último ê tomado dç? plasoídio PMSSpbMBF da forma seguintes o vector PMSSpbWfeP è cortada com Ba&HI e eo seguida B*erterssSa -é copiada se 3’ com a polimerase de Klenow. Em seguida ele ê cortado com HindllX @ o fragmenta de 30® pb âcionado em pí3EM3 entre os sítios de restrição Waal s Hindlíí. 0 vector obtido foi designado por p8SV4S« ®!N « i ®íi ’ Para aa gfciar o vector do SMpre^I©. ©sfragmentos da forma seguintes o vector pMSBphLSF é cortado · ~ 28 ~ '

Íl.

Coe» ao enzimas de restrição EcoRI s BamHI ε o fragmento de 138® pb ê ' purificada» Q vector pShWTphNSF ê cortado com as enzimas HindiIl-EcoRI e o fragmento tía itS® pb é purificado» Bstes ftals fragmentos são clonados ee conjunto no vector pBSV48 entra os sítios ds restrição HindiII e BamHI» 0 diagrama resumo para se obterem estes vectores ds expressão designado por pSW4@0MTph«SF ê apresentado na Figura 4, enquanto que a representação em diagrama do mesmo vector é indicada na Figura 5»

Ests vector, pSVWITphNBF, é estável men ta L i introduzido nas células} CHO Kl ' co®« dupla transfecção em ; conjunto com o plasmítíio pSV^fen e*escolhido da forma acima L referida por neomicina 8418 (8IBGQ,· BRU 1 mg/ml» Este plasmídio é cotransfectado coo o plaseídio ohWt para se obter , r a selecção das colónias que contém um elevado nãíssro de cópias» Neste caso, as células CHO Kl sãs expostas durante 24 horas am 50 mH tíe sulfato tíe zinco para induzirem a síntese da metalotioneina e escolhidas coe cloreto ds cádmio partindo de uma concentração de 2,5 pH atê 2« As células contendo ua elevada nâmero de cópias do hMBF são utilizadas para a expressão da molécula,- . ' ;

staua«4;4/4x :

□ plasmídio p0EM4XbaMF ê cortado coe enzimas de restrição. Hindil! e EcoRI e o fragmento de 300 pb é substituído no vector pSV4Q MT pbífBF 'entre os sítios de :jf restrição Hindil! e EcoRI» 0 diagrama. ds resumo para este vector, designado por p8V40phNBF, é apresentado -na Figura 6, enquanto que a representação so diagrama do mosao , vector é indicada na Figura 7» ', . Este é ue vector de constituição padrão ’ em qw© as sequências de regulação são atribuídas ao •ipromotor/potenciador SV40» Este 'vector ê estávelmente co- “

transf set ado em células CHQ Kl coe plasmídio pSVSNeo s as clone-s que produzem a β-polipêptida da fsctdr de cresci isenta das nervos eSe analisado®»...Ι- /' ; t 7/ 7 gr' - α §g,lecgãa,_d_ag......Cél.y 1 as......de.....CHQ....Kl dh-fr Para sa obter a amplificação tía gene do ^Ί' vector anterior - em CHQ Kl Bfhr-, o vector é modificado J[. posteriormente por cl coação do gene de DHFR-í a montante do gene ds hIMBF,. 0 vector psU2dhfr que codifica para DHPRf foi cortado em HindiΙΪ e em seguida a extensão ê copiada em 5^:r ΐ com polímeras®, Em seguida ele é cortado em BamHI e o l· fragmento de ISQQ pfa ê clonado nos' sítios de restrição Xhol, tornados cegos com polímerase da forma acima mencionada, e BamHI no vector pSV40hNBF» Desta forma é criado - o plasmídio ' dé expressão-selseção pSV4ShhfSF, 0 diagrama r síaumo - pat a se J obter aste vector é apresentado ns Figura 8» !

- Esta plasmídio é transfsetado normalmente nas células CHQ Kl num meio alfa HEM sem nueleõsidos com 102 do soro fetal de vaca» Passados dois dias, as células sao tripsinizarías e lavadas a 1/10'da concentração anterior e ô iniciada a ampliação com 1® μΐ-i ds MTX ímetofcrexatoí até 53® μΜ„ As células que sobrevivia© ás mais altas concentraçSes ds

WTX são utilizadas para a expressão do hhKSF,

Os .estudos in vitro para determinar a actividade biológica no meio de cultura da linha de células CIO apôs insôr-iaa.tde, w'- dos três vectortáS acima descritos, após a sua estabilização, são conduzidos em células fetais de eraaafinama PC-12 ÍSreene L.ft» e col.₅ Rev, Heurosci» 3a3S3, [<

i;

Í9S2>«. ã especificidade da reacção é verificada utilizando um eia de cultura em que as linhas de células CHQ não transformadas são cultivadas ou bloqueando'® actividade do . - ' ' ^: T^: 1Α^: 7^λ ' - · 7 ^:1 ; . ; “

H

hS-MSF presente ne meie de cultura ee® anticorpos policlonaís @®p@eífiCQS ppra o NSHF de origem murína,au de eriges bovina»

As três linhas de células transformadas s- estabílixadas cem ;

os vectores individuais acímadescritos produza© a sufounídada do N0F humano numa forma biologicamente activa. ‘ Ί fé ç te-Ç/é; te' :éra<te- - //. . j - :-ÍL·

Ê888M«Bs^.SãÊ&íte ji O hfS-NSF da presente invenção poda ser formulado de acorde com, os processes conhecidos para a :} produção de composições farmaceuticamente úteis» A formulação ,' de composições farmacêuticas contende a molécula NSF humana '}; Csubunidade-βί derivada de ADN recombinante, descrita neste aspecto sem e também possivelmente com gangliósidos e

,] fosfolipidosj compreende os processos anteriormente já ç conhecidos para a preparação de composiçoes que são ç aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, susceptíveis de Hserem administradas a u® paciente, e que torna possível ι combinar u«â quantidade eficaz da molécula de hWSF numa ξ mistura - cora ub veículo aceitável . do ponto de vista farmacêutico. Os veículos adequados e as suas fortnulaçSee compreendendo outras proteínas são descritas,· por exemplo, em p “Remingtonte Rharmaceutical Sciences” íRemíngtorr s Pharma* ceutical Sciences, Bacfe Puhlíshing Company, Easton, Pa., Estados Unidos da -América, 1985/„ Estes veículos compreendem j “formulações de depósito” injectáveis»

Com base no acima mencionado, a formo* p lação farmacêutica compreenda, embora não exclusivamente, J soluçSes do factor de crescimento dos nervos ou os seus pós. H. liof i lixados em associação cd® u© ou mais veículos ou diluentes aceitáveis do ponte ds vista farmacêutico, e : contende em meios tamponados a u® pH adequado, ε isosmóticõs ca® as liquidas fisiológicos» hfo casa ds composições liofilízadss, pode® ser utilizados excipisntes ds suporte, tais como, por exemplo mas não exclusivamente, manitol eu í glkicinina, e serão proporcionadas soluções tamponadas ’ . õ /<_ - ra ;-/Q ra-- --, - -- - - ^; j

sdsqwagtaa tío volume pretendida para á obtenção ds soluções isotónicas tamponadas adequadas possuindo o pí-í desejável. · Scrtufiõs seeelhantes podes ser utilizadas para solupSes farmacêuticas para composições farmacêuticas da molécula do factor de crescimento dos nervos obtido de ADN recombinante. em soluções isotónicas do.volume pretendido e incluindo, mas não erclusívafflsnts, a utilização de soíuÇÕes -fisiológicas tamponadas com fosfato ou citrato em concentrações adequadas para a® afetar, de cada vez, composições farmacêuticas isotónicas com o pH desejado, por exemplo, pH neutro*

A formulação farmacêutica compreende alntfã, mas sem contudo se limitar a isso, supositórios para a administração rectal com excipientes liofiltzados, por exeaplo,.. solúveis em âgua, autoemulsionantes do --tipo glicogeiatina ou atro. Nestas composições, s factor de crescimento dos nervos obtido a partir det ADW recombinante pode estarpressnte em quanfcidaes variando entre S,@í% e i,l% era peso do excipiente total» Os supositórios podem conter-, sem contudo se limitar a isso» quantidades adequadas da salicá lato de acetilo»

Estas composições farmacêuticas podara ser dirigidas à administração oral, rectal, parentérica» local, por inalação, intra-cereferal« Deste modo, elas podem estar na forma sólida _ ou semi sólida, por eremplo» drageias, comprimidos, opêrculos gelatinosos, cápsulas, supositórios, cápsulas ds gelatina macia.. Para a utilização parentérica e intracsrsbraí, pode® ser utilizadas formas para administração intramuscular, subcutânea ou adequadas para infusões ou injecções intravenosas ou' intracsrebraís e dssta forma podem «er soluções de compostos activos e pôs liofilizadas dos conpaatos actiwaa a sers» Mijados a u» ou «eia excipientes ou diluentes qua são aceitáveis sob o ponto, de vista farmacêutico, adequados para as utilizações acima mencionadas e com a osmolaridadecompatível com os líquidos fisiológicos* FâFS utilização local, as composições era forma de cremes ou unguentos são consideradas para utilização tópica? para

- :é técrjté» W/-; Cé?

As composições desta invenção podam ssr utilizadas para a administração ao homem ou a animais» Elas contém preferivelmente entre 0,®15S s 10X do componente activo para soluções, pulverizações, unguentos e creses e íU a 180K © preferivelmente de 5% a 5®Z do composto activo para as composições na forma sólida,, A dosagem de administração dependerá da indicação, do efeito desejado θ do modo de administração escolhida.

A invenção- também compreende a utilização terapêutica de todos os novos complexos de gangliósidos ou derivados com a subunidade-rl do factor docrescimento dos nervos WSF para as indicações Já-acima mencionadas. A dosagem diâriá-.para o homem por injecção (subcutânea, intramuscular ou intracerebrall varia ds entra 8,03 mg © 5 mg da substância activa por Kg de peso cerpõrao.

Tendo sido a. invenção assim descrita, ê óbvio qus estes processos podem ser modificados ds várias maneiras» Estas modificações não devam ser consideradas como desvios do espírito e âmbito da invenção e todas as «etdifIcâÇBes que poderão ssr evidentes a um especialista são consideradas como compreendidas dentro do âmbito das reivindicações anexas» ' ,

Processo para a preparação de uo vector de expressão que codifica para o d-hfeu (Factor de Crescimento doa ttervoál·' humana para expressão ee células de mamíferos adequadas transformadas com o referido vector» cujo vector compreendas

a> uma primeira · sequência de ASN que codifica para o 0-NSF huaaoo, -// λ : - - d f. r.

fe) uma segunda sequência de ADN que codifica £3 OlH¹ «3. Ο £3 jã*·”*

-WSF humano e é fundido ao terminal 5’ da referida primeira Sequência de ASM, e — V c> uns elemento regulador potenciadca- do promotor dírectãfffSnte fundido ao terminal 5’ da referida segunda sequência de ADN» .. caracterizado pors.

ft> preparar-se um primeira fragmenta de ABN de 300 pb possuindo «m podto de restrição ECoRI para permitir a ligação co® prepra W6F,

0> clonar-ss o referido primeira fragmenta de ADN de 300 pb entre os sitia de restrição HindIII e ECcíU de um primeiro plasmídio contendo o .gene que codifica para o S-NSF humana para produzir um segundo plamidia,

O cortar-se o referido segundo plasmidio em BamHI e Xbal para produzir um fragmento de 7Â& pb,. DJ danar-se o referido- fragmento ds Tá® ph para um plasmítíio contendo u® promotor para o gene β-NSF humano para produzir ua terceira plasmídio,

E>'.cortar-se o referido terceiro plasmídio para isolar um fragmento contendo um gene WSF que contém o referido promotor β a ref ar ido gene ís-N0F humano,

F) danar-se o referido fragmento, contando o gene NSF s a sequência prepro «2-NSF de ADN para «® palsmídio para produzir I» plsssídio contendo o referido- promotor adjacente à sequência prepro g-MBF de ADN e qus por sus. vaz é adjacente ao referido gene humano fHNSF.

Processo para preparação de u® vsctcr de es pressão qus codifica para o ft-NSF humana caracterizado pors o) preparar—ss um aligonude-á ti do Xfeal possuindo a sequência

S²TST CTAS ASAT ATS TCC ATO TTO TTO T 3 ilJ . preparar ~se um oiigortudeâiido ECoRI possuindo a sequência

- •eeaBFfiéhâATT f»Tr^SjeT13fitTSSí3«l* •St»'O t3{3O£7O Hrí t ί Ο ι bolz J Uo t OU·tO »»

c) clonarem-se os referidos oligonucleôtídos Xísal e ECoRI para ue vector p0EH4 nos pontos de restrição XbaX s ECoRI para produzir n® plasmidio p.QBí4Xbâ~M8F₅ d> eortar-w o referido plasmídio pSEM4Xba~M8F em ttindin e J ECsRÍ para produzir u» primeiro fragmento de 300 pb, ί

θ) clonar-se o referido primeiro fragmento de 300 pb nos 7 pontes de rsstriysn MíndlII-ECoRI de um plasmídio ρϋΕ18ΒΒΘ26 para produzir pUCISnMSFc, l· f J cortar-ss o referido pUCi8nN8Fc e® BseHX e Xbal para i[ produzir wa fragmento de 76® pb,_; !

g> clonar-se o fragmento de 760 pb nos ponto© Mhel e Smal de I. ue vector pMSS para pc«beir u© plasmidio ptfôSphWeF, h> 1solar-se u» fragmento contendo ue proeotor da f mstalotioneâna Xla- (MTIXai por corte de pBR322 com HindiXX e BaéHX,\ ' . - i> clanar-ss o referido fragmento contendo u® promotor- MTÍIa nu® vector p8EM4 nos sítios HindiΪΪ e BamHX para produzir um vector pSBWiMTIIa, ' ;

Jí cortar -se uma sequência ds prepro. MBF de ADW co© BamHX e ECoRX, e clonar-se o fragmento resultante entre os pontos ds restrição BamHÍ s ECoRI de p6EM4hRTXIa para produzir pBhHTphHQF, . ,

k) ewtar-s»· o - com BamHX, copiar-se a extensão 5’ cos polímeras© de Xsolow, cortar-se cosi HinXIX s clonar-se o '! fragmento resultante de SQgipfo entre os pontos 'de restrição MáBT © HintiXXI de pSEXT para produzir pGSWh s 1> cortar-se pShMTpbWQF com HindiXI © EGoRI para produzir um primeiro frwnento, cortar-se pMSSphhiBF co» ECoRI e BamHI para produzir um segundo fragmento, e clonar-se os referidos primeira e segundo fragmentos entre os pontos HindiII e BamHl de pSSV40 para produzir pSVWfTphWQF.

Claims

Proçsssõ de -acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um vector. de expressão replicâvel eargu® β referido elemento regulador é o promotor do Virus do Tumor da Mama da Rata CHMTV)« g» que ο 'referida elemento regulador é o promotor da «atai st lanei na IXa humana íhMTIIAl /;

Processo tíe acordo ooa a reivindicação 1 caracterizado par se obter um vector de expressão replicâvel o» que a referido elemento regulador é o promotor SV40.

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Processo caracterizada por se expressar ^:numa célula hospedeiro recombinante transformada com u© ' Hfa jar-í-u*-rin f-í“í»t« nirssl rtttfiatf* rí^cc tr&i ui ndíriiflnisus 1 »V K?i», <i-fc?í Uft K5jõk<5í>ç sSS&ístt .. 0*5; ç®v-»®iáí .í4-fe · .^£Sfé3s r ν -- 31-.-.

~3 a recupsrar-se o Ô-W6F humano assim obtido»

Λ-'ΌβΒΡβό.

por se expressai- a célula hospedeira recombinante de acordo coo a reivindicação A e recuperar-se o g-MBF humano assim obtido. ..

™ SÉ.- ... ......

: · Processo para a pre^arapâo de .|»m'

ÍdCMpesiÇão farmacêutica caracterizado por se incorporar como - - . d . .. . : ^: . d - d - ·' < . -d- · d d . .

ingrediente activo um polipéptido quando preparado de acordo

J| com a reivindicação A, isento de proteínas contaeinantes de I erigem humana em associação co® um veículo ou diluente JfarBaseuticaseota sceitâvsl» <.-dprspsrãÇSs.- -da . osa—

Processo pars composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um polipéptido quando preparado tíe acordo com a reivindicação 7, isento ds proteínas contamínantes de origem humana em associação com um veículo oy diluente fareacsuticamente aceitável» .rfrSfel '

-T-. «es®·

A requerente reivindica - a prioridade ‘ da pedido Italiano apresentada a» 16 tíe Novembro de Í9S9, «b õ nômero 48564 A/89„

Lisboa, 15 de Novembro de 1W0