IT8948564A1 - Processo per la preparazione di costrutti genetici per l'espressione del fattore di crescita nervoso in cellule eucariote. - Google Patents
Processo per la preparazione di costrutti genetici per l'espressione del fattore di crescita nervoso in cellule eucariote. Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE DELLO STATO DELL'ARTE
A. IL FATTORE DI ACCRESCIMENTO NERVOSO (NGF)
Il fattore di accrescimento nervoso chiamato Nerve Growth Factor (NGF) ? stato dapprima scoperto nei tumori di sarcoma di topo (Levi-Montalcini, R. et al., J. Exp. Zool. 116:321, 1951) ed ? stato poi purificato e portato alla omogeneit? da ghiandole sottomandibolari salivari di topo maschio (Varon, S. et al., Biochemistry 6:2202, 1967) e dal veleno di serpente (Angeletti, R. H., Proc. Nati. Acad., Sci. USA 65:668, 1970). Molte altre fonti relativamente ricche di NGF sono state segnalate, compreso la prostata di cavia (Harper, G. P. et al., Nature 279:160, 1979) e la placenta umana (Goldstein, L. D. et al., Neurochem. Res. 3:175, 1978, Walker, P. et al., Life Science 26:195, 1980, brevetto Fidia 47745A88). Sono state trovate delle piccole quantit? di NGF in altri tessuti come per esempio il sistema nervoso centrale dei mammiferi (Varon, S., Discussions in Neuroscience, Voi. II, No. 3, 1985; Hefti, F. , et al., Neuroscience 14:55, 1985). Il rapporto fisiologico fra queste potenziali fonti di NGF ed i siti d'azione apparenti non ? molto chiaro, ma generalmente si suppone che l'NGF venga secreto dai vari tessuti periferici che richiedono l'innervazione da parte di quelle cellule che rispondono all'NGF.
L'NGF ottenuto da ghiandole sottomandibolari di topo ? quello maggiormente usato per gli studi sull'attivit? dell'NGF in vitro ed in vivo. E' stato determinato il range di attivit? biologica in vitro dell'NGF sia su cellule neuronali primarie che su linee cellulari clonate. Fra le cellule neuronali primarie che hanno risposto all'NGF in, vitro sono i neuroni sensoriali fetali (giorno fetale 8-12) da radici di ganglio spinale, neuroni fetali noradrenergici autonomici da ganglio simpatico, neuroni fetali colinergici dal setto e cellule surrenali cromaffini durante lo sviluppo. Mentre i neuroni sensoriali e simpatici dipendono dall 'NGF per sopravvivere e svilupparsi, i neuroni colinergici non sembrano avere bisogno dell'NGF per la sopravvivenza, ma soltanto per la loro differenziazione, cio? per l'espressione dei tratti fenotipici caratteristici legati al neurotrasmettitore. L'aggiunta di NGF a cellule surrenali cromaffini (derivate dalla cresta neuronaie) durante la prima fase del loro sviluppo causa l'espressione di fenotipi neuronali. Fra le linee cellulari che rispondono, come descritto in letteratura, all'NGF in vitro, si possono includere le cellule surrenali croniaffini derivate da tumori della cresta neuronaie, denominate cellule di feocromocitoma (PC12) e cellule di neuroblastoma umano. Dopo trattamento con BNGF queste cellule variano il loro comportamento passando da una fase fortemente proliferativa ad una condizione postmitotica.
Il fattore di accrescimento nervoso ottenuto da ghiandola sottomandibolare di topo ? quello maggiormente caratterizzato, anche sotto il profilo chimico ed immunochimico. L'NGF da ghiandole murine agisce come un complesso proteico di tipo 7S (peso molecolare circa 140.000 dalton) composto da tre diverse subunit? (?, ?,?) che coordinano un atomo di Zn+.
La parte pi? interessante della molecola 7S, relativamente alla attivit? biologica, ? costituita da due catene polipetidiche, ciascuna avente peso molecolare di 13,250 e formate da 118 aminoacidi. Ciascuna catena o monomero possiede tre ponti di solfuro, che formano legami covalenti tra due residui dell'aminoacido cisteina, i quali conferiscono una forte stabilit? alla struttura tridimensionale della proteina. I due monomeri dell'NGF uniti l'uno all'altro da legami deboli formano un dimero di peso molecolare di 26,500. E* stato dimostrato che al dimero chiamato 2.5S o convenzionalmente subunit? B ? associata l'attivit? biologica. Non ? noto se questa sia presente anche nel monomero. Le tecniche dell'ingegneria genetica hanno permesso di identificare il gene che codifica la molecola della subunit? ? dell'NGF (BNGF) (Scott, J. et al, Nature 302:538, 1983; Ullrich, A. et al, Nature 303:821, 1983). Il gene umano che codifica la molecola ? localizzato nel braccio corto del cromosoma I e codifica per la sintesi di una molecola molto pi? grande di quella di peso molecolare di 26,500 che costituisce la molecola biologicamente attiva. Il gene invia perci? istruzioni per la sintesi di un precursore NGF o pro-NGF di maggiori dimensioni. E* stato inoltre dimostrato che il gene della subunit? ? dell'NGF ? altamente conservato in specie differenti, dagli uccelli all'uomo (Meier, R. et al, EMBO J. 5:1489, 1986) .
La sequenza dei nucleotidi del BNGF di origine murine, umana, bovina e di pulcino, ha reso possibile un confronto fra i siti conservati e quelli non conservati di queste molecole e la loro relazione con l'attivit? biologica e 1'antigenicit?. La globale conservazione di BNGF durante l'evoluzione ? sorprendentemente alta. Dei 118 aminoacidi della forma matura di flNGF purificato da ghiandole sottomandibolari salivari di topo maschio, soltanto 16 aminoacidi sono cambiati nel BNGF bovino, 19 in quello di pulcino e 11 in quello umano mentre esistono solo 6 aminoacidi di differenza fra il BNGF bovino e quello umano. Tutti i residui della cisteina sono rigorosamente conservati in tutte le specie. La riduzione dei tre ponti S-S di BNGF causa la perdita completa della sua attivit? biologica. La discrepanza apparente fra l'alto livello di conservazione globale della sequenza di aminoacidi ed una non alta reattivit? crociata di tipo immunochimico ? dovuta al fatto che i cambiamenti degli aminoacidi fra le specie sono situati in specifici "cluster". Con i tracciati idropatici ? possibile dimostrare che questi cambiamenti avvengono quasi totalmente nei siti idrofilici considerati come potenziali determinanti antigenici. Una sola regione idrofila si ? rilevata strettamente conservata nelle molecole da NGF per tutte le specie finora studiate.
B. LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
La tecnologia del DNA ricombinante permette di costruire serie di vettori che sono in grado di esprimere proteine di interesse in larga quantit?. La tecnologia del DNA ricombinante permette ai biologi molecolari l'assemblaggio di sequenze di DNA ai fini di creare delle molecole ibride capaci di produrre la proteina di interesse. Il metodo fa uso di varie reazioni come tagli con enzimi di restrizione, l'unione dei frammenti cos? ottenuti con ligasi, la sintesi chimica di oligonucleotidi da assemblare ed altre metodologie disponibili dei diversi laboratori nel settore (Mariatis, T. et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SPring Laboratory NY, 1982). Ai fini di ottenere alti livelli di espressione, bisogna che gli elementi di DNA da assemblare presentino delle informazioni essenziali. Per esempio, una origine di replicazione, una selezione per antibiotici, un promotore di espressione, attivatori della trascrizione del gene di interesse ed altre caratteristiche note ai cultori della materia in oggetto. La combinazione di questi elementi in modo opportuno d? origine ad un plasmide, se il gene di interesse ? inserito naturalmente rispetto alle sequenze regolatorie della trascrizione e della traduzione e il risultante plasmide viene definito di espressione. Il plasmide o vettore di espressione ? cos? in grado di esprimere in cellule ospiti la proteina. La proteina pu? quindi essere ricavata attraverso un sistema di purificazione. Gli elementi (promotori) che controllano naturalmente l'espressione di molti geni come ad esempio i fattori di crescita, non sono molto forti nella loro espressione e vengono attivati solo in opportune condizioni naturali che spesso non sono conosciute. A questo fine si utilizzano promotori di cui si conosce l'attivit?, ad esempio virus della serie Papovavirus, oppure altre sequenze geniche promotrici conosciute. Gli elementi che si utilizzano per alti livelli di espressione sono quindi una combinazione di DNA di diversa origine (eucariota, batterica, virale, etc.) costituito alla fine da porzioni geniche diverse legate a formare un ibrido. L'attivit? di trascrizione e di traduzione di un gene dipende dalle opportune distanze tra le sequenze regolatorie e codificanti.
Fatta questa premessa, uno dei migliori modi che le sequenze regolatorie hanno di lavorare opportunamente ? che il gene introdotto sia posto nella stessa identica posizione del gene naturale. Un sistema usato ? quello in cui le sequenze regolatorie comprendono anche alcuni aminoacidi delle sequenze codificanti. L?unione con il gene introdotto d? origine a una proteina fusa. Se d'altra parte la porzione fusa viene successivamente rimossa ? possibile ottenere pi? alti valori biologici. Se non si utilizza la tecnica delle proteine di fusione, le tecnologie convenzionali per l'ottenimento di geni situati nelle strette vicinanze delle sequenze regolatorie dipendono dall?esistenza di opportuni siti di restrizione che ne permettano il clonaggio. Se non esistono siti compatibili nelle vicinanze ma siti diversi, ? possibile ottenere l'unione dei segmenti con la sintesi di un oligonucleotide o linker che contiene il sito di restrizione desiderato. Se non esistono nelle vicinanze dei siti di restrizione per permettere l'uso dei linker, allora si utilizza la tecnica di delezione del DNA con Bai 31 o SI. Questa possibilit? non permette una delezione precisa e ogni volta bisogna controllare tramite un sequenziamento diversi cloni per vedere quale ? quello pi? opportuno. Questi sistemi sono molto limitanti per il biologo molecolare e di conseguenza ? necessario sviluppare strategie alternative in funzione dell'avvento di nuove tecnologie quale quella della Polimerase Chain Reaction (PCR) (Saiki et al, Science 239:487, 1988; Scharf, S.J., Science 233: 1076, 1986).
Con questa tecnica ? possibile amplificare fino a 10 un segmento genico. Il principio si basa sull 'utilizzo di due oligonucleotidi che possono essere appaiati rispettivamente ognuno su uno dei filamenti di DNA da amplificare. La distanza che intercorre tra i due oligonucleotidi rispetto alla sequenza genica presa in esame d? le dimensioni della molecola da produrre. Questi due oligonucleotidi vengono costruiti in modo tale che all'interno della loro sequenza vi sia un sito di restrizione che ne permetta il successivo clonaggio. Questo sito di restrizione ? presente naturalmente oppure viene costruito ad hoc degenerando il minimo numero di basi. Questo approccio, che si pu? definire di mutagenesi sito-diretta, permette di costruire dei siti di restrizione nelle posizioni che il biologo molecolare decide a tavolino. La costruzione di siti compatibili con altri segmenti genici permette da una parte un facile cloneggio, ma soprattutto apre la possibilit? di unire in modo mirato diversi segmenti genetici. Si pu? definire questa tecnica come clonazione attraverso la mutagenesi diretta. In pratica attraverso la tecnologia del DNA ricombinante ? possibile esprimere polipeptidi eterologhi completi attraverso l'espressione diretta, o alternativamente si pu? esprimere il polipeptide eterologo fuso ad una porzione di sequenza amminoacidica di un polipeptide analogo. In generale, prodotti ottenuti in questo modo non sono biologicamente attivi (British Patent Application Pubi. N. 2007676A; Wenzel, American Scientist 68, 664, 1980).
La capacit? di isolare il gene limano della subunit? ? del fattore di accrescimento nervoso ci offre una importante possibilit?. E' possibile, attraverso la tecnologia del DNA ricombinante, produrre una quantit? sufficiente di questa rara proteina. Infatti, la proteina di accrescimento nervoso potrebbe essere ammessa come uso clinico nei trattamenti di varie malattie neurodegenerative. In questo senso esiste documentazione relativa all'ottenimento della fl subunit? dell'NGF attraverso le tecnologie del DNA ricombinante (Brevetto Europeo N. 0121388; Bruce, G. et al, Neurobiology of Aging 10:89, 1989; Hu, G. et al, Nucleic Acid Research 70:57, 1988; Edwards, R.H., Mol Celi Biol 8:2456, 1988; Emfors, P., Proc Nati Acad Sci 86:4756, 1989). Per la produzione, si scelgono cellule di mammifero piuttosto che batteri soltanto in quei casi dove l'espressione in cellule microbiche, molto meno costosa, non sia praticabile. Infatti ? molto pi? economico produrre certe proteine in linee batteriche come l'E.coli. ma generalmente questo sistema ospite/vettore riproduce fedelmente soltanto la sequenza lineare degli aminoacidi che compongono la proteina, ottenendo per? una sorta di massa insolubile dentro il batterio. Supposto che un dato prodotto possa essere preparato da questo materiale in maniera economicamente vantaggiosa, E,coli potrebbe essere il sistema di elezione, come nel caso di certe molecole pi? piccole, come gli interferoni ed alcune proteine di crescita animale dove ? praticabile un corretto "folding" della molecola in vitro. Questi sistemi sono redditivi al massimo nei casi che riguardano generalmente quelle proteine con un solo legame disolfuro e con peptidi o proteine il cui uso (come antigeni diagnostici o componenti di vaccini) non richiede una ben definita conformazione.
Le protei'ne terapeutiche, alle quali appartiene il fattore di accrescimento nervoso (BNGF), richiedono una corretta conformazione per essere attive ed utilizzabili e hanno bisogno anche dell?assenza di risposta antigenica. Il processo di ottenimento potrebbe comprendere per la proteina ottenuta da DNA ricombinante la glicosilazione, la formazione di corretti legami disolfuri ed altre modificazioni post-trasduzionali . La linea batterica E.coli non ? in grado di soddisfare queste esigenze, mentre le cellule eucariote di mammifero ed i lieviti lo sono. La potenziale applicazione del BNGF umano come farmaco, ottenuto tramite biotecnologia, deve prendere in considerazione questi problemi.
L'attivit? dell?NGF ? stata dimostrata dipendere dalla forma dimerica, cio? dall'assemblaggio di due polipetidi analoghi di 118 aminoacidi. La riduzione con ? mercaptoetanolo fa decadere l?attivit? biologica praticamente a zero. Tentativi di rinaturazione dei tre ponti di disolfuro fanno si che il riassemblaggio delle cisteine dia origine, dal punto di vista statistico, ad una molecola con struttura corretta ed uguale alla corrispondente a quella naturale con una probabilit? di 1 su 15. Di conseguenza l'ottenimento della molecola in E.coli non garantisce l'omologia della struttura e la sua applicazione come farmaco nell'uomo. Infatti, dopo aver purificato all'omogeneit? l'NGF umano prodotto da E.coli. questo dimostra in immunoblotting, mediante anticorpi policlonali specifici per il QNGF murino, una serie di bande che non sono imputabili alla forma dimerica biologicamente attiva. Inoltre, l'attivit? biologica di questa miscela di strutture e forme si ? dimostrata essere 10 volte inferiore rispetto all'analoga forma umana purificata da fonte naturale come la placenta. Questo approccio di clonazione ed ottenimento del fattore di accrescimento nervoso in E.coli. se da una parte produce alti livelli di espressione della proteina di interesse, produce una serie di molecole non esatte che somministrate in vivo potrebbero dare origine ad effetti secondari come ad esempio ad anticorpi che andrebbero a riconoscere e bloccare l'attivit? biologica della molecola presente naturalmente. Nello stesso tempo il clonaggio della molecola matura in E.coli presenta una metionina iniziale non rimovibile che ? sicuramente immunogenica, perch? posta in una parte esposta della molecola. Un altro approccio ? relativo al clonaggio del prepro NGF in cellule eucariotiche e consiste nello sfruttare l'attacco delle peptidasi specifiche presenti naturalmente nelle cellule eucariotiche per ottenere la molecola matura. In particolare la clonazione ? effettuata su cellule di ovaio di criceto cinese (CHO). Dalla letteratura corrente non ? stato ancora sequenziato il clone genomico intero dell'NGF umano ma ? stato dimostato che il gene si estende per pi? di 10 kda (Ullrich, A. et al, Nature 303:821, 1983). Il gene cos? esteso non permette un clonaggio convenzionale partendo da questa intera sequenza genomica. L'approccio ? quello di clonare una porzione del cDNA che contenga solo le porzioni codificanti della proteina. Al momento non ? stato ancora isolato il cDNA completo per NGF umano (mancano alcune sequenze al 5') ma si conoscono molte informazioni dei messaggeri di NGF di altra origine (topo, bovino, pulcino, etc) (Meier, R. et al, EMBO J 5:1489, 1986; Selby, H.J., J of Neuron Research 18:293, 1987) che possono portare a deduzioni interessanti. Il gene dell'NGF di topo ? presente in singola copia e produce almeno quattro diversi messaggeri di dimensioni diverse (Selby, M.J. et al, Mol Celi Biol 7:3057, 1987). Questa loro differente dimensione si riflette soprattutto nel differente codone AUG di partenza, quelli pi? importanti sono a -187 e a -121 rispetto alla proteina matura. Questi messaggeri sono presenti in differente abbondanza relativa rispetto a diversi tessuti. Quelli che iniziano a -187 sono 10 volte pi? abbondanti nella ghiandola sottomandibolare rispetto a quelli che iniziano a -121.
Tuttavia diverse evidenze hanno dimostrato che la pi? consistente percentuale dei messaggeri di NGF espressi nel cervello utilizzano proprio gli AUG a -121.
Partendo da queste evidenze, nel nostro caso il fiNGF umano ? stato clonato partendo proprio dalla metionina a -121. Analisi del profilo di idropaticit? hanno dimostrato che gli aminoacidi tra -121 e -104 possono funzionare come leader peptide (Fig. 1), indicando che la proteina pu? essere secreta. Per ottenere la proteina matura esiste una peptidasi specifica che permette di ottenere la sequenza aminoacidica da 1 e a 118 che corrisponde al peptide biologicamente attivo. Questa peptidasi contenuta nelle cellule che normalmente sintetizzano NGF ? stata dimostrata essere contenuta anche nelle cellule AT-20. Infatti, introducendo in 'queste cellule un vettore costituito da un Vaccinia Virus preproNGF di origine murina, esse sono in grado di secernere NGF maturo permettendo la produzione di una molecola di 14 kda in gel in condizioni denaturanti e riducenti (Edwards, R . H . , Mol Celi Biol 8 : 2456 , 1988) .
Figura 1
Profilo di idropaticit? del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana, secondo il metodo descritto (Hopp et al, Proc Nati Acad Sci USA 78:3824, 1981). La posizione indicata come -121/-104 identifica il leader peptide mentre la posizione indicata come 1/+118 indica la sequenza aminoacidica del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? B, di origine umana (Ullrich et al, Nature 303:821, 1983).
In funzione delle precedenti esperienze di ottenimento della subunit? ? del fattore di crescita nervoso, sopra descritte, abbiamo affrontato in modo innovativo la costruzione di uno o pi? vettori utilizzabili in cellule eucariote. Per eseguire il clonaggio del preproNGF abbiamo utilizzato la tecnica della PCR, con la quale abbiamo creato dei siti compatibili con diversi vettori di espressione, e abbiamo situato questi siti di restrizione in modo da mantenere il pi? naturale possibile le distanze tra le sequenze regolatorie e le sequenze codificanti, situazione del tutto diversa dai costrutti genetici precedentemente descritti in letteratura per l'espressione della subunit? ? del fattore di crescita nervoso. La porzione del prepro NGF ? stata unita a una sequenza di NGF umano maturo (hfiNGF) modificato, acquistato presso la British Biotechnology Ltd (Oxford - Gran Bretagna), nel quale sono stati creati dei siti di restrizione per permettere la successiva mutagenesi. Per lo scopo dell'invenzione, la presenza di questi siti di restrizione non deve considerarsi di fatto limitante, come non deve essere considerata limitante l'origine del gene.
Partendo da questo presupposto noi abbiamo successivamente' clonato il prepro hI3NGF sotto il controllo di diversi promotori SV40 (Simian Virus 40), MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus), hMTIIa (human Metallotioneina IIa). Queste sequenze geniche introdotte in plasmidi sono state poi transfettate in cellule CHO, dimostrando che anche queste cellule sono in grado di produrre nel terreno di coltura il polipetide hfiNGF nella sua forma biologicamente attiva. Questo prepro NGF si ? dimostrato essenziale nell'assemblaggio della molecola, permettendo l'espressione della sola ? subunit? e dimostrando che l'intero costrutto genetico era da cosiderarsi corretto.
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione ? relativa al processo per l'ottenimento della subunit? fi dell'NGF umano mediante vettori di espressione, tali che esista una distanza naturale fra le sequenze regolatorie e quelle codificanti la proteina in oggetto, vettori da impiegare su linee cellulari eucariote, ad esempio chiamate CHO, le quali permettono di ottenere sul terreno di coltura la forma matura della subunit? fi del fattore di crescita nervoso umano (hfiNGF), in assenza di uno o pi? aminoacidi fusi al polip?ptide, diversi da quelli presenti nella sua sequenza naturale. Il polipeptide cos? ottenuto dimostra attivit? biologica impiegato sulle appropriate cellule bersaglio.
Il hBNGF descritto nella presente invenzione pu? essere utilizzato per il mantenimento o la prevenzione della perdita della funzione nervosa, per il suo recupero in condizioni patologiche di tipo cronico o acuto, in situazioni neurodegenerative anche in fasi tardive di patologie acute, come deficienze cerebrovascolari, infettive, infiammatorie, compressive, metaboliche e in situazioni di modulazione del sistema immunitario. Il polipeptide ottenuto ? privo inoltre di altre proteine contaminanti di origine umana, che potrebbero presentare attivit? biologiche non desiderate.
L'invenzione ? indirizzata inoltre ai costrutti genetici che possono essere impiegati per le transfezioni cellulari ivi comprese quelle impiantabili in vivo. Alcuni di questi costrutti possono produrre a livello locale specificatamente la forma attiva del fattore di crescita umano in funzione. di una dieta somministrata, cio? ? possibile mantenere sotto controllo il gene.
L'invenzione ? indirizzata inoltre alla linea cellulare trasformata, che contiene i vettori in oggetto, ed alle sue colture che producono il hBNGF. Oggetto della presente invenzione sono pure le preparazioni farmaceutiche comprendenti come sostanze attive uno o pi? dei nuovi complessi tra unit? ? del fattore neuronotrofico e un ganglioside naturale o uno dei suoi derivati o analoghi semisintetici o un suo sale. Tali preparazioni farmaceutiche possono essere destinate all'uso orale, rettale, parenterale, locale, inalatorio, intracerebrale. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle. Per l'uso parenterale ed intracerebrale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o atte a infusioni o iniezioni endovenose o intracerebrali e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi e come polveri liofilizzate dei composti attivi da unirsi ad uno o pi? recipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, convenienti per gli usi suddetti e di osmolarit? compatibile con i liquidi fisiologici. Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma creme o unguenti per uso topico; per l'uso inalatorio entrano in considerazione preparazioni in forma di spray, per esempio spray nasali.
Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all'uomo o all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le soluzioni, gli spray, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipender? dall'indicazione, dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta.
L'invenzione comprende pure l'uso terapeutico di tutti i nuovi complessi dei gangliosidi o dei derivati con l'unit? ? del fattore di crescita nervoso NGF per le indicazioni gi? sopra menzionate. I dosaggi giornalieri all'uomo per via iniettiva (sottocutanea o intramuscolare o intracerebrale) variano da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per kg di peso corporeo.
I seguenti esempi illustrano la preparazione dei nuovi composti, il procedimento per la loro preparazione, le preparazioni farmaceutiche e il loro uso.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Di seguito viene descritto dettagliatamente come si possono preparare ed utilizzare gli oggetti della presente invenzione. Queste descrizioni, mentre servono ad illustrarla, non sono da considerare limitative dell'invenzione, e tutte le variazioni che sarebbero evidenti all'esperto nell'arte sono da considerare in essa comprese.
Gli attacchi sulle catene del DNA con gli enzimi di restrizione sono stati eseguiti come dalle specifiche delle case produttrici. In generale 1 pg di plasmide ? stato tagliato con 1 U di enzima in 20 pi di soluzione; la temperatura e il tempo di incubazione dipendevano dall'enzima usato, in generale 1 hr a 37?C. Dopo incubazione i plasmidi e i segmenti genetici sono stati purificati sempre in un gel di Agarosio LMP Agarose (BRL - Stati Uniti d'America) in 40 mM Tris HC1, 20 mM Sodio Acetato, 1 mM EDTA e quindi eluiti dall?agarosio con il kit GENECLEAN (BIO 101 Ine, La Jolla, CA - USA). Per le reazioni di ricopiatura al 5? il DNA ? stato trattato per 15 minuti a 15?C con 10 U di Polimerasi (Klenow). Per le ligasi ? stata usata la ligasi T4 alla concentrazione di 1 U per 0.5 ?g di DNA in una reazione di 20 ?l a 13?C per 12 ore. Le analisi per confermare la corretta sequenza nel plasmide sono state effettuate trasformando sempre in cellule HB101 e i trasformanti selezionati in piastre di Agarosio in LB (Luria Bertani) medium con antibiotico ampicillina 50 ?g/ml. I plasmidi contenuti nelle HB101 sono stati cresciuti in LB, 100 ?g/ml di ampicillina e sono stati purificati, sia per le piccole che le grandi preparazioni, con il kit dello Quiagen (DIAGEN GmbH, Dusseldorf - Germania Federale). I vettori di espressione sono stati preparati dalle cellule batteriche con il metodo dello Quiagen. Il DNA per le reazioni di PCR ? stato preparato nel seguente modo da placenta umana a termine. Un pezzo 0.4 cm di villi coriali ? stato sminuzzato con un paio di forbici e sospeso in 700 ?l di 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS. A questo, sono stati successivamente aggiunti 35 ?? di proteinase (K 100 ?g/ml) ed ? stato incubato per una notte a 55?C. Sono quindi stati aggiunti 20 ?? di una soluzione a 13 ??/??? di RNAase A ed ? stato incubato per altre 2 ore. Sono state poi eseguite due estrazioni con fenolo e due con cloroformio. Il DNA ? stato poi fatto precipitare su un capillare di vetro per aggiunta di 1 volume di isopropanolo. A questo punto sono stati eseguiti alcuni passaggi con etanolo al.70% e al 100% ed ? stato fatto asciugare. Il DNA ? stato sciolto in tampone (10 mM Tris/HCl pH 7,4, 1 mM EDTA), lasciandolo in lenta agitazione in provetta. Dopo alcune ore, il DNA sciolto era pronto per l'amplificazione genica. Normalmente 0.1 ?g di DNA sono stati sufficienti per procedere alla PCR. Le transfezioni sulle cellule CHO (CCL 61) e CHO modificate per assenza di gene deidrofolato riduttasi (DHFR-) sono state effettuate con il metodo dei liposomi seguendo le procedure della casa produttrice GIBCO oppure con calcio fosfato.
TRANSFEZIONE CON LIPOSOMI
Le cellule cresciute in alfa-MEM con 5% di siero fetale bovino, il giorno prima della transfezione sono state tripsinizzate e ripiastrate affinch? il giorno dopo raggiungessero il 70-80% della confluenza. Il DNA plasmidico da transfettare ? stato diluito alla concentrazione di 10 ?g di DNA in 50 pi di H20 a cui si sono stati poi aggiunti 50 ?l di Lipofectin (GIBCO), il tutto in tubo di polistirene. Dopo 15 minuti di attesa questa mistura ? stata aggiunta alle cellule che erano state precedentemente lavate con medium OPTI-MEM (GIBCO). Le cellule sono state incubate in questo modo per 8 ore, e successivamente il medium normale compreso di siero fetale bovino ? stato aggiunto per continuare la crescita.
METODO DI TRANSFEZIONE CON CALCIO FOSFATO PER OTTENERE STABILI TRASFORMATI
I buffer per la transfezione in questo metodo sono: BBS due volte concentrato (2 x BBS) e 0.25 M CaCl2. il 2 x BBS ? stato preparato in questo modo: 50 mM di acido N-N-Bis 2 (idrossieti1)-2-amino etansulfonico (Calbiochem); 280 mM NaCl e 1.5 mM Na2HP04 sono stati sciolti in acqua e il pH ? stato portato a 6.5 e quindi il tutto filtrato a 0.45 ?m, mentre il 10 x CaCl2 ? stato preparato come soluzione di 2.5 M di CaCl2?
Le cellule sono state seminate 5 x 10 cell/10 era piastra/10 mi di medium di crescita e incubate a 35?C per una notte. 20 jig di plasmide sono stati miscelati con 0.5 ?l 0.25 M CaCl2 e 0.5 mi di 2xBBS; la mistura ? stata incubata per 15 minuti a temperatura ambiente. La mistura ? stata quindi aggiunta goccia a goccia al medium ed il tutto ? stato incubato per una notte a 35?C in 3% di Co2? Per ottenere delle cellule stabilmente trasformate con i nostri vettori ? stata eseguita una cootransfezione aggiungendo al vettore esprimente hBNGF il vettore pSV2Neo in un rapporto 10 a 1. Due giorni dopo la transfezione, le cellule sono state tripsinizzate e seminate in piastre alla concentrazione dieci volte inferiore rispetto a quella della transfezione ed immediatamente si ? iniziata la selezione degli stabili trasformati con 1 mg/ml di G418 neomicina sulfate (Gibco). I trasformanti sono stati successivamente analizzati in Southern Blot per l'integrazione del costrutto genico .
Espressione
Tutti i medium delle cellule sono stati mantenuti per l'espressione in Ham's F12/DME H-21 con 15 mM Hepes e 10% di Fetal Calf Serum. Il medium ? stato cambiato ogni tre giorni e sostituito con medium fresco senza siero per la purificazione dell'hBNGF.
DESCRIZIONE DELLA COSTRUZIONE DEI VETTORI DI ESPRESSIONE
Sono stati eseguiti tre vettori diversi; il primo e il secondo sono due vettori nei quali gli elementi regolatori, rispettivamente MMTV (Mouse Mammary Tumor virus) e hMTIIa (human Metallotioneina Ila), possono essere indotti chimicamente. In questo modo ? possibile esprimere del gene hBNGF e mantenerlo sotto controllo. Nel terzo vettore invece si ? clonato lo hBNGF sotto il promotore SV40 (Simian Virus 40).
CLONAGGIO NEL VETTORE DI ESPRESSIONE oMSG
Il vettore pMSG ? stato acquistato dalla Pharmacia (Uppsala, Sweden). Come da specifiche della casa, il gene da introdurre deve essere inserito nei siti multipli di clonaggio tra i siti di restrizione Nhe I e Sai I. Il gene viene tradotto dal suo primo AUG; in questo caso il fattore di accrescimento nervoso ? sotto controllo del promotore del MMTV LTR (Mouse Mammary Tumor Virus Longy Terminal Repeat) . L'attivit? di questo promotore pu? essere indotta dalla somministrazione di glucocorticoidi, ad esempio dexametasone. Nel trascritto avviene lo "splicing" per mezzo del SV40 small t antigen (antigene t piccolo) e poliadenilato per mezzo del SV40 large t antigen (antigene t grande). Questo plasmide contiene altres? il gene batterico della xantina-guanina fosforibosiltransferasi (xgpt) che viene usato per selezionare le cellule CHO KI stabilmente trasformate. Per permettere un clonaggio in questo plasmide del prepro NGF ? stata usata la tecnica della PCR, con la quale si ? creato un sito di restrizione appena prima dell'AUG iniziale in modo da mantenere il pi? naturale possibile le distanze tra le sequenze regolatorie e sequenze codificanti del prepro NGF. Sono stati sintetizzati due oligonucleotidi: il primo, tra le basi 9122 e 9147 (Ullrich, A., Nature 303:821, 1983), avrebbe dovuto avere la seguente sequenza
Le basi prima dell'AUG iniziale sono state, come abbiamo detto, mutate e quindi l'oligo sintetizzato ha la seguente sequenza:
Questo oligonucleotide ? stato chiamato (Xbal). Il secondo oligonucleotide, che comprende le basi tra 9521 e 9342 (Ullrich, A., Nature 303:821, 1983), ? complementare a questa sequenza per permettere la PCR ed ha la seguente sequenza
Questo oligonucleotide contiene al suo interno il sito ECORI per poter permettere l'unione del preproNGF all'NGF maturo. Questo oligonucleotide ? stato chiamato (ECORI).
I due oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un sintetizzatore di oligonucleotide in fase solida con il metodo dei fosforamiditi seguendo le procedure standard dell'apparecchio 330B DNA Synthesizer (Applied Biosystems - USA). Sono stati trattati a 55?C per 12 ore in NH3 e quindi portati a secco in una centrifuga a vuoto. Sono stati risospesi in ammonio acetato 2.5 M e quindi precipitati con 3 volumi di etanolo freddo (-20?C). Sono stati rilavati con etanolo freddo all'80% e risospesi in acqua. La concentrazione dei due oligonucleotidi era stata valutata allo spettrofotometro. La procedura di amplificazione ? stata eseguita su un Perkin Elmer Cetus DNA Termal Cycler Amplificator ed i reagenti usati per l'amplificazione erano quelli del relativo kit DNATM AMplyfer (Perkin Elmer-Cetus). Brevemente ? stata usata una miscela con 200 pM di ogni oligonucleotide, 0.5 pM di ogni nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP e 0.1 pg di DNA umano e buffer di reazione in una miscela totale di 100 pi con 0.5 U di TAQ polimerasi, il tutto ricoperto con olio di paraffina per non permettere l'evaporazione. La reazione di amplificazione ? stata condotta impostando lo strumento per 35 cicli nel caso da DNA umano. Il ciclo in entrambi i casi era il seguente: 1 min a 94?C, 2 min a 45?C, 3 min a 72?C. Il frammento amplificato 300 bp ? stato purificato in un gel di Agarosio (NuSieve) Low Melting utilizzando il kit GENE-CLEAN? (BIO 101 Inc, La Jolla, CA - USA) per sciogliere l'Agarosio. Il DNA ? stato tagliato con gli enzimi di restrizione XbaI e EcoRI e ripurificato come sopra. Il frammentato cos? purificato ? stato clonato nei siti XbaI e EcoRI del vettore pGEM4 (Promega) . Il plasmide ottenuto ? stato chiamato pGEM4Xba-NGF. Questo plasmide ? stato tagliato HindIII-EcoRI e il frammento di 300 bp, una volta purificato, ? stato clonato nei siti HindIII-EcoRI del vettore pUC18BBG26 (British Biotechnology Ltd, Oxford - UK). Il plasmide pUC18BBG26 contiene il gene dell?hBNGF costruito a cassette, cio? all'interno della sua sequenza sono stati creati dei siti di restrizione non naturali che permettono quindi la sostituzione di determinati domini e cio?, in 'altre parole, ne permettono la mutagenesi. Il vettore ottenuto ? stato chiamato pUC18hNGFC. Questo vettore ? stato tagliato con BamHI ed ? stata ricopiata l?estensione al 5 primo con Klenow polimerasi. Successivamente ? stato tagliato XbaI e il frammento di 760 bp ? stato purificato da un gel di Agarosio. Questo frammento ? stato clonato tra i siti Nhel e Smal del vettore di espressione pMSG. Lo schema riassuntivo per l'ottenimento di questo vettore, chiamato pMSGphNGF, ? riportato in Figura 2, mentre la rappresentazione schematica del medesimo vettore ? indicata in Figura 3.
Figura 2
Rappresentazione schematica della costruzione del vettore di espressione pMSGphNGF.
Figura 3
Rappresentazione schematica del vettore di espressione di pMSGphNGF.
CI.ONAGGIO DELL?NGF SOTTO IL CONTROLLO DELLA METAL-LOTIONEINA
Questo vettore ? stato eseguito perch? la metallotioneina Ila (MTlla) pu? essere indotta con Zn<++ >o con Cd<++ >o con altri ioni di metalli pesanti, quindi pu? essere controllata la sua espressione. Per potenziare l'espressione di questo promotore ? stato inoltre aggiunto lo SV40 enhancer al 5' del promotore della MTIIa, mentre si utilizza sempre lo "small t antigen" e il poliA dell'SV40 per lo "splicing" e la poliadenilazione. Dapprima ? stato unito il promotore della metallotioneina al prepro hBNGF in queto modo: il promotore della metallotioneina ? stato isolato dal plasmide (phMTIIa) tagliando con gli enzimi di restrizione HindllI e BamHI (Karin, H., Nature 299:797, 1982}, il frammento 841bp comprendente il promotore ? stato clonato nei siti HindIII-BamHI del vettore pGEM4 (Promega Madison, WI - USA). Questo vettore ? stato chiamato pGEM4hMTIla. Questa porzione di promotore si estende al 3' con alcuni codoni naturali e contiene il primo codone della metionina AUG e subito dopo si trova il sito di restrizione BamHI. Per permettere il clonaggio del prepro hBNGF sotto questo promotore utilizzando la metionina iniziale del promotore della hMTIIa, ? stato costruito un oligonucleotide tra le basi 9133 e 9160 (Ullrich, A., Nature 303:821, 1983) creando un sito di restrizione BamHI appena dopo AUG iniziale che ne permettesse la messa in fase del gene. L?oligonucleotide sintetizzato che doveva avere la seguente sequenza:
? stato mutato in questa sequenza:
Questo oligonucleotide ? stato chiamato BamHI. Le le basi cambiate comportano un cambiamento anche della sequenza aminoacidica; infatti, il 2? e 3? aminoacido cambiano rispettivamente da Asp in Ser e da Pro in Met. Questo cambiamento non ha peraltro molta influenza nel profilo di idropaticit? e la molecola viene secreta normalmente.
Questo oligonucleotide, insieme all'oligonucleotide EcoRI, ? stato usato per amplificare il preproNGF come sopra. Il frammento purificato ? stato tagliato BamHI e EcoRI e quindi clonato tra i siti di restrizione BamHI e EcoRI del vettore pGEM4 hMTIIa. Il vettore ? stato chiamato pGhMTphNGF.
Per ottenere l'enhancer (attivatore) dell'SV40, questo ? stato ricavato dal plamside pMSGF nel seguente modo: il vettore pMSG ? stato tagliato BamHI e quindi ricopiata l'estensione al 5' con Klenow polimerasi. Successivamente ? stato tagliato con HindIII e il frammento di 500 bp ? stato clonato in pGEM4 tra i siti di restrizione Nael e HindIII. Il vettore ottenuto ? stato chiamato PGSV40.
Per ottenere il vettore di espressione si ? proceduto all'unione dei pezzi ricavati di cui sopra in una unione tripla di frammenti nel seguente modo: il vettore pMSGphNGF ? stato tagliato con gli enzimi di restrizione EcoRI e BamHI e il frammento di 1500 bp ? stato purificato. Il vettore pGhHTphNGF ? stato tagliato con gli enzimi di Hindlll-EcoRI e il frammento di 1100 bp ? stato purificato. Questi due frammenti sono stati clonati insieme nel vettore pGSV40 tra i siti di restrizione HindIII e BamHI. Lo schema riassuntivo per l'ottenimento di questo vettore di espressione chiamato pSV40MTphNGF ? riportato in Figura 4, mentre la rappresentazione schematica del medesimo vettore ? indicata in Figura 5.
Figura 4
Rappresentazione schematica della costruzione del vettore di espressione pSV40MTphNGF.
Figura 5
Rappresentazione schematica del vettore di espressione pSV4 OMTphNGF.
Questo vettore ? stato introdotto stabilmente nelle cellule CHOKI come doppia transfezione insieme al plasmide pSV2Neo e selezionati come sopra attraverso la neomicina G418 (GIBCO - BRL) 1 mg/ml. Per ottenere la selezione delle colonie contenenti un alto numero di copie, ? stato cotransfettato questo plasmide con il plasmide phMT. In questo caso le cellule CHO KI sono state esposte per 24 ore in 50 mM Zinco Sulfato per indurre la sintesi della metallotioneina e selezionate con cadmio cloruro iniziando alla concentrazione 2.5 ?? fino a 20 ??. Le cellule contenenti un alto numero di copie dell'hNGF sono state usate per espressione della molecola.
CLONAGGIO DELL'NGF SOTTO IL PROMOTORE ENHANCER DELL 'SV40
Il plasmide pGEM4XbaNGF ? stato tagliato con gli enzimi di restrizione HindIII ed EcoRI e il frammento di 300 bp ? stato rimpiazzato nel vettore pSV40 MT phNGF tra i siti di restrizione HindIII ed EcoRI. Lo schema riassuntivo per l'ottenimento di questo vettore, chiamato pSV40phNGF ? riportato in Figura 6, mentre la rappresentazione schematica del medesimo vettore ? indicata in Figura 7.
Figura 6
Rappresentazione schematica della costruzione del vettore di espressione pSV40phNGF.
Figura 7
Rappresentazione schematica del vettore di espressione di pSV40phNGF.
Questo ? un vettore costitutivo classico nel quale le sequenze regolatorie sono deputate all'SV40 promotore/enhancer . Questo vettore ? stato cotransfettato stabilmente nelle cellule CHOKI con il plasmide pSV2Neo e sono stati analizzati i cloni producenti il polipetide ? del fattore di crescita nervoso.
SELEZIONE NELLE CELLULE CHO KI dhfr-Per ottenere l'amplificazione genica del vettore precedente nelle cellule CHO KI Dhfr?, il vettore ? stato modificato ulteriormente clonando a monte del gene dell'hNGF il gene del DHFR+. il vettore pSV2dhfr codificante il DHFR+ ? stato tagliato HindIII e quindi ricopiata l'estensione al 5' con polimerasi, poi ? stato tagliato BamH e il frammento da 1800 bp ? stato clonato nei siti di restrizione Xhol fatto "blunt" con polimerasi come sopra e BamHI nel vettore pSV40hNGF. In questo modo ? stato creato il plasmide di espressioneselezione pSV40hNGF. Lo schema riassuntivo per l'ottenimento di questo vettore ? riportato in Figura 8.
Figura 8
Rappresentazione schematica della costruzione del vettore di espressione pSV40hNGF.
Questo plasmide ? stato transfettato normalmente nelle cellule CHO KI in un alfa MEM medium senza nucleosidi con 10% di siero fetale di mucca. Dopo due giorni le cellule sono state tripsinizzate e riportate a 1/10 della concentrazione precedente e l'amplificazione ? cominciata con 10 pM di MTX (Methotrexate) fino a 500 ??. Le cellule che sono sopravvissute alle pi? alte concentrazioni di MTX sono state usate per l'espressione dell'hNGF.
DETERMINAZIONE DELL'ATTIVIT?' BIOLOGICA
Studi in vitro per determinare l'attivit? biologica nel terreno di coltura della linea cellulare CHO dopo l'inserimento di uno dei tre vettori sopra descritti, dopo loro stabilizzazione, sono stati condotti in cellule fetali di feocromocitoma PC-12 (Greene L.A. et al, A. Rev. Neurosci. 3:353, 1982). La specificit? della reazione ? stata verificata impiegando un terreno di coltura dove crescevano le linee CHO non trasformate o bloccando l'attivit? di hBNGF presente nel terreno di coltura con anticorpi policlonali specifici per il BNGF di origine murine o di origine bovina. Le tre linee cellulari trasformate e stabilizzate con i singoli vettori sopra descritti hanno prodotto la subunit? ?? dell'NGF umano in forma biologicamente attiva .
COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE
La formulazione delle composizioni farmaceutiche contenenti la molecola NGF (subunit? B) umano derivata da DNA ricombinante, descritta a questo riguardo senza e possibilmente anche con gangliosidi e fosfolipidi, comprende metodi gi? conosciuti per la preparazione di composizioni accettabili dal punto di vista farmaceutico, somministrabili al paziente, le quali permettono che una quantit? effettiva della molecola hNGF sia combinata in una miscela con un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Veicoli adatti e la loro formulazione comprendente altre proteine sono descritte, per esempio, nel libro "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons 's Pharmaceutical Sciences, mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Questi veicoli comprendono "formulazioni di deposito" iniettabili.
In base a quanto sopra, la formulazione farmaceutica comprende, sebbene non in maniera esclusiva, soluzioni di fattore di crescita nervoso o sue polveri liofilizzate in associazione a uno o pi? veicoli o'diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, e contenuti in mezzi tamponati a pH idoneo, ed isosmotici con i liquidi fisiologici. Nel caso di preparazioni liofilizzate, possono essere utilizzati eccipienti di sostegno come per esempio, ma non esclusivamente, mannitolo o glicine, e saranno fornite idonee soluzioni tamponate del volume desiderato in modo da ottenere adeguate soluzioni tamponate isotoniche aventi il pH desiderato. Soluzioni simili possono essere usate per le composizioni farmaceutiche della molecola di fattore di crescita nervoso ottenuto da DNA ricombinante in soluzioni isotoniche del volume desiderato e includono, ma non esclusivamente, l'uso di soluzioni tamponate fisiologiche con fosfato o citrato a concentrazioni idonee in modo da ottenere ogni volta preparazioni farmaceutiche isotoniche del pH desiderato, per esempio, pH neutro.
La formulazione farmaceutica comprende inoltre, ma senza essere limitata ad esse, supposte per la somministrazione rettale con eccipienti lipofilici, ad esempio, idrosolubili, autoemulsivi di tipo glicogelatina o altro. In queste preparazioni, il fattore di crescita nervoso ottenuto da DNA ricombinante pu? essere presente in quantit? varianti fra lo 0.'01% e l'1% in peso dell'intero eccipiente. Le supposte possono contenere, senza essere limitate ad esse, quantit? idonee di acetilsalicilato.
Essendo l'invenzione cosi descritta, ? chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo, sono comprese nell'ambito delle seguenti rivendicazioni:
Claims (37)
- rivendicazioni: 1. Un processo per la preparazione di costrutti genetici, formati da basi del DNA, i quali sono costituiti da: a) la sequenza genica codificante il polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? 8 (QNGF), di origine umana nella sua forma conosciuta come matura; b) questa sequenza genica ? fusa nella sua posizione 5* alla sequenza naturale del prepro del BNGF umano; c) la sequenza genica codificante il BNGF urna-no ? fusa nella sua posizione 3' con una sequenza di poliadenilazione e di splicing; d) il prepro del BNGF umano presente nel costrutto genetico ? fuso nella sua posizione 5' agli elementi regolatori promoterenhancer in modo tale che non ci siano basi del DNA in numero inferiore o superiore a quelle necessarie al funzionamento del costrutto genetico stesso, cio? ? disposto in maniera precisa e senza alcuna approssimazione.
- 2. Un processo per l'ottenimento di un costrutto genetico descritto nella rivendicazione 1, dove gli elementi regolatori promoter-enhancer sono quelli dell?SV-40.
- 3. Un processo per l?ottenimento di un costrutto genetico descritto nella rivendicazione 1, dove gli elementi regolatori promoter-enhancer sono quelli del Mouse Mammary Tumor Virus.
- 4. Un processo per l'ottenimento di un costrutto genetico descritto nella rivendicazione 1, dove gli elementi regolatori promoter sono quelli della Metallotioneina Ila umana ed enhacer quelli del SV40.
- 5. Un processo per l'ottenimento di un costrutto genetico secondo le rivendicazioni 1 e 2, la cui sequenza ? riportata in Figura 3.
- 6. Un processo per l'ottenimento di un costrutto genetico secondo le rivendicazioni 1 e 3, la cui sequenza ? riportata in Figura 5.
- 7. Un processo per l?ottenimento di un costrutto genetico secondo le rivendicazioni 1 e 4, la cui sequenza ? riportata in Figura 7.
- 8. Un processo per l'ottenimento di costrutti genetici rivendicati da 1 a 7, dove la sequenza del gene codificante il fattore di crescita umano, subunit? ? (BNGF), nella sua forma matura, pu? anche presentare siti di restrizione non presenti nel gene naturale del medesimo polipeptide.
- 9. Un processo di preparazione di vettori di espressione rivendicati da 1 a 7, i quali singolarmente sono capaci di esprimere il polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana attraverso cellule trasformate nel loro terreno di coltura.
- 10. Una coltura cellulare ricombinante capace di esprimere il polipetide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana, nella sua forma matura, ottenuto mediante trasformazione di una linea cellulare eucariota con i singoli vettori rivendicati da 1 a 8.
- 11. Una linea cellulare ricombinante in accordo con la rivendicazione 10, la quale ? definita come cellule di ovaio di criceto cinese (CHO).
- 12. Un processo per ottenere una linea cellulare rivendicata in 11, che permetta di ottenere con il vettore rivendicato in 1, 2, 5 il polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana, biologicamente attivo e il suo recupero dal terreno di coltura.
- 13. Un processo per ottenere una linea cellulare rivendicata in 11, che permetta di ottenere con il vettore rivendicato in 1, 3, 6 il polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana, biologicamente attivo e il suo recupero dal terreno di coltura.
- 14. Un processo per ottenere una linea cellulare rivendicata in 11, che-permetta di ottenere con il vettore rivendicato in 1, 4, 7 il polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? ?, di origine umana, biologicamente attivo e il suo recupero dal terreno di coltura.
- 15. Un processo per l'ottenimento secondo la rivendicazione 12 del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? 8, di origine umana, nella forma biologicamente attiva in assenza di uno o pi? aminoacidi fusi alla sequenza aminoacidica della forma matura ad oggi conosciuta.
- 16. Un processo per l'ottenimento secondo la rivendicazione 13 del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? 8, di origine umana, nella forma biologicamente attiva in assenza di uno o pi? aminoacidi fusi alla sequenza aminoacidica della forma matura ad oggi conosciuta .
- 17. Un processo per l'ottenimento secondo la rivendicazione 14 del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? 8, di origine umana, nella forma biologicamente attiva in assenza di uno o pi? aminoacidi fusi alla sequenza aminoacidica della forma matura ad oggi conosciuta.
- 18. Un processo per l'ottenimento del polipeptide secondo le rivendicazioni da 15 a 17 in un terreno di coltura dove ? presente la sola sua forma matura della subunit? 8.
- 19. Un processo per l'ottenimento del polipeptide nella forma matura secondo le rivendicazioni da 15 a 17, dove non ? necessario scindere la subunit? ? da altre subunit? che possono costituire la sua struttura naturale.
- 20. Un processo per l?ottenimento del polipeptide del fattore di crescita nervoso, subunit? B, nella sua forma biologicamente attiva mediante un sistema che non prevede la contaminazione di altri prodotti o proteine di origine umana.
- 21. Un processo che, seguendo la preparazione del detto polipeptide, permette la produzione di preparazioni farmaceutiche.
- 22. Un processo in accordo con la rivendicazione 21 dove nella preparazione farmaceutica ? presente un ganglioside naturale o un suo derivato o analogo semisintetico o un suo sale.
- 23. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22, dove la preparazione farmaceutica ? destinata alla somministrazione all'uomo o al-1'animale .
- 24. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via parentale.
- 25. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via intracerebrale.
- 26. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via orale.
- 27. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via rettale.
- 28. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via locale o topica.
- 29. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? somministrabile per via inalatoria.
- 30. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? da utilizzarsi per il mantenimento della funzione nervosa .
- 31. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica ? da utilizzarsi per la prevenzione della perdita della funzione nervosa.
- 32. Un processo in accordo con le rivendicazioni 21 e 22 dove la preparazione farmaceutica si pu? utilizzare per il recupero della funzione nervosa in condizioni patologiche acute o croniche.
- 33. Un processo in accordo con la rivendicazione 32 dove le condizioni patologiche sono di tipo acuto come deficienze cerebrovascolari, infettive, infiammatorie, compressive, metaboliche.
- 34. Un processo in accordo con la rivendicazione 32 dove le condizioni patologiche sono di tipo cronico neurodegenerativo, anche in fasi tardive delle patologie acute.
- 35. L'uso di una forma farmaceutica secondo le rivendicazioni 21 e 22 per il trattamento di condizioni neuropatologiche date dall'invecchiamento del sistema nervoso o di malattie che attaccano il sistema immunitario.
- 36. L'uso di una forma farmaceutica secondo 'le rivendicazioni 21 e 22 per la modulazione del sistema immunitario.
- 37. Un processo per la preparazione di costrutti genetici di cui alla rivendicazione 1, utilizzabili per le transfezioni cellulari su cellule da impiegare nell'impiantazione in vivo in diversi distretti o in organi o in parti di questi, costrutti mediante i quali ? possibile mantenere sotto controllo esterno 1'espressiot ne del gene.
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