IT9041557A1 - Processo per l'isolamento di un segmento di dna che codifica il fattore neuronotrofico ciliare umano - Google Patents

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BACKGROUND DELL*INVENZIONE ;A. IL FATTORE NEURONOTROFICO CILIARE ;Il ganglio ciliare (GC) contiene due popolazioni di neuroni, quelli ciliari e quelli coroidei, gli uni e gli altri colinergici. I neuroni GC innervano la muscolatura intrinseca dell'occhio nella coroide, nonché nel corpo ciliare e nell'iride. Durante lo sviluppo dell'embrione di pollo, circa metà dei neuroni GC muoiono nel momento (tra i giorni E8 e E15 di sviluppo embrionale) in cui i loro assoni stabiliscono una connessione con il territorio intraoculare di innervazione. ;Questa morte neuronaie è fortemente favorita dalla preliminare rimozione dell'occhio, mentre è significativamente ostacolata dal precedente impianto di un abbozzo oculare supplementare. Il sistema GC, pertanto, ci fornisce un chiaro esempio di un fenomeno di morte neuronaie correlato allo sviluppo, ed è stato utilizzato da Varon e collaboratori per verificare e convalidare l'ipotesi che i territori di innervazione contengono fattori trofici per i neuroni ad essi destinati. ;Neuroni dissociati da gangli ciliari di embrioni di pollo E8, seminati su un substrato appropriato e con un adatto medium di coltura, non sopravvivono se non viene aggiunto al medium uno speciale supplemento, talché si può utilizzare questo modello come test biologico per i fattori neuronotrofici ciliari in generale, e in particolare per quelli di natura proteica. Quando sono stati confrontati, sotto questo riguardo, estratti di vari tessuti embrionali di pollo E8, un terzo dell'attività CNTF totale dell'embrione è stato trovato nell'occhio, e tre quarti dell'attività propria dell’occhio è stata localizzata in una porzione da subdissezione comprendente la Coroide e l'Iridecorpo ciliare (la muscolatura intrinseca dell'occhio) oltre all'Epitelio Pigmentato, privo di CNTF (CIEP). Prove di sopravvivenza hanno dimostrato che una proteina solubile, dotata di attività trofica per i neuroni GC, (i) si trova in alta concentrazione nel territorio oculare da essi innervato, e (ìi) raggiunge la più alta attività specifica proprio in quella fase dello sviluppo (E8-E15) nella quale in vivo si decide il destino di questi neuroni. ;La purificazione del CNTF dell'embrione di pollo E15 comporta, oltre ad una subdissezione selettiva dei tessuti CIEP, un trattamento sequenziale del relativo estratto mediante cromatrografia a scambio ionico, ultracentrifugazione in gradiente di saccarosio, ed elettroforesi in condizioni riducenti su gradienti di gel di poliacrilamide sodiododecilsolfato (SDS). ;il CNTF purificato dall'occhio di embrione di pollo mostra, alla SDS-gel elettroforesi, una Mr (e quindi un peso molecolare presuntivo) di circa 21 kD. Le medesime dimensioni molecolari sono desumibili dal suo comportamento in gradiente di densità di saccarosio o dalla filtrazione su filtri molecolari, per la qual cosa è molto probabile che esse caratterizzino proprio la proteina nativa del CNTF, piuttosto che la subunità attiva di un complesso CNTF. Il peso molecolare di 21kD del CNTF dell’occhio di pollo, così come la sua carica netta negativa, lo differenziano nettamente dalla proteina beta-NGF della sottomascellare di topo. L’estratto di occhio di embrione di pollo, come lo stesso estratto CIEP, mostra anche una attività trofica (i) sui neuroni DRG di embrione di pollo E10 (ma non E8) e di topo neonato, e (ii) sui neuroni simpatici di pollo Eli e di gangli di ratto neonato - ciò che non sorprende eccessivamente, se si tiene conto del fatto che i territori di innervazione dei neuroni sensitivi e simpatici sono parzialmente sovrapposti a quelli dei neuroni GC. ;Gli stessi neuroni DRG e quelli simpatici, d'altra parte, sono sensibili all'effetto trofico del CNTF purificato dell'occhio di pollo, nonostante che il CNTF sia stato selezionato per la sua attività trofica sui neuroni GC. In conclusione, questo nuovo fattore è rappresentato da una proteina attiva su almeno tre tipi di neuroni, due dei quali sono sensibili anche all'NGF. Tenuto conto del suo peso molecolare, il CNTF dell’occhio di pollo promuove la metà della massima sopravvivenza di neuroni GC di pollo E8, di neuroni DRG di pollo E10 e di neuroni simpatici di pollo Eli alla concentrazione di 10—11— 10-12M, con una attività specifica che è dello stesso ordine di grandezza di quella che l'NGF purificato della sottomascellare di topo mostra nei riguardi dei suoi bersagli neuronali, DRG e simpatici. Nessuna delle attività trofiche proprie del CNTF di occhio di pollo è bloccata o legata da anticorpi diretti contro la subunità beta dell'NGF della sottomascellare di topo . ;;ALTRE SORGENTI DI CNTF ;Fattori trofici per i neuroni GC, come per quelli DRG e simpatici, sono stati ottenuti da varie altre fonti, che spaziano da estratti tessutali e da liquidi di lesione (vedi oltre) a inedia condizionati da varie colture cellurali. Questa ultima fonte del materiale, il "medium colturale condizionato", ha, rispetto agli estratti tessutali, il vantaggio di facilitare l'identificazione delle "fonti cellulari". Peraltro, per le basse concentrazioni di attività trofica che se ne possono ricavare, questi media condizionati rappresentano sorgenti poco adatte alla preparazione di proteine purificate ad azione trofica, in effetti, i media condizionati da colture di muscolo cardiaco sono stati i primi materiali (e, subito dopo, quelli di muscolo scheletrico) nei quali sia stata dimostrata la presenza di CNTF; anche estratti di cuore bovino sono stati presi in considerazione come possibile materiale di partenza, ma la completa caratterizzazione del loro CNTF non è stata possibile. La presenza di un CNTF nel cuore e nel muscolo scheletrico induce a ritenere che esso possa agire su neuroni colinergici viscero- e somatomotori diversi da quelli (GC) che innervano i muscoli intrinseci dell’occhio: tuttavia, è finora mancata una comparazione sistematica tra i CNTF dell'occhio, del cuore e dei muscoli scheletrici, riguardo sia alla caratteristiche molecolari che allo spettro dei loro bersagli neuronali. ;Anche i media condizionati da colture cellulari neurogliali, sia periferiche (Schwann) che centrali (astroglia), mostrano attività trofiche, distinte dall'NGF, per i neuroni ciliari e per quelli dei gangli delle radici dorsali e simpatici, il che rappresenta un argomento decisamente a favore di un possibile ruolo della neuroglia come fonte di fattori neuronotrofici in vivo. Williams e collaboratori hanno dimostrato che, a differenza degli estratti di tessuti del SNC, quelli di nervo sciatico di ratto adulto hanno un contenuto molto elevato di CNTF, con attività specifica pari a quella del CIEP dell'occhio di pollo E15 (circa 20.000 unità trofiche/mg di proteina). L'attività CNTF risulta elevata anche negli estratti di nervi o di radici motorie pure e sensitive pure, a dimostrazione che nessun criterio differenziale ci autorizza a correlare l'attività del nervo con i territori specifici di innervazione, piuttosto che con le cellure di Schwann contenute nella sua compagine, o in aggiunta a queste. Manthorpe e collaboratori hanno purificato a livello analitico il CNTF del nervo di ratto, rilevando una carica negativa leggermente minore ed un peso molecolare leggermente superiore (24kD) rispetto al CNTF purificato dall'occhio di pollo. E' attualmente in corso la purificazione su scala preparativa del CNTF dei mammiferi. ;;UN NUOVO METODO PER VISUALIZZARE MOLECOLE DI CNTF ATTIVO DA SORGENTI GREZZE. ;Carnow e collaboratori hanno ideato recentemente un metodo per coltivare neuroni selezionati di ganglio ciliare su di un substrato di nitrocellulosa, e per visualizzare le cellule sopravviventi in relazione alla loro capacità di convertire un colorante di colore giallo (MTT) in un prodotto blu. I neuroni seminati senza CNTF aderiscono e restano vitali per qualche ora, ma dopo 24 ore nessun neurone vitale è più dimostrabile nella Coltura; media arricchiti con CNTF permettono, invece, la sopravvivenza a 24 ore di pressoché tutti i neuroni aderenti. Lo stesso risultato è stato ottenuto impregnando in precedenza la striscia di nitrocellulosa con un medium contenente CNTF, e seminandovi quindi, dopo averla risciacquata accuratamente, i neuroni GC con un medium privo di CNTF; inoltre, quando il CNTF veniva pre-applicato a porzioni limitate del substrato di nitrocellulosa, i neuroni sopravvivevano soltanto sulle zone pretrattate, cioè su quelle che avevano legato il CNTF . ;Gli estratti tessutali con attività CNTF possono ora essere sottoposti ad elettroforesi su gel di SDS-poliacrilamide, e i polipeptidi così separati trasferiti elettronicamente su nitrocellulosa, il risultante "blot" conterrà i polipeptidi originari, separati per tutta la lunghezza della striscia come erano nel gel SDS, ma senza questo intorno. A questo punto, i blot saranno saggiati su neuroni di ganglio ciliare in un medium privo di CNTF: le bande di neuroni sopravviventi indicheranno i polipeptidi dotati di attività CNTF. Una scansione al microscopio ottico per tutta la lunghezza della striscia di nitrocellulosa consentirà così una facile identificazione delle regioni positive per le cellule vitali ed anche, se necessario, una valutazione quantitativa del fattore attraverso il conteggio del numero di neuroni presenti nelle singole regioni. Questo metodo è stato applicato a tre estratti grezzi contenenti attività CNTF: il CIEP di occhio di pollo, il nervo sciatico di ratto e il "liquido da lesione" del SNC di ratto (vedi oltre). L'estratto oculare mostra una singola proteina di 21 kD, in accordo con i dati desunti dal suo prodotto di purificazione; l’estratto del nervo di ratto mostra un CNTF di peso molecolare maggiore, e precisamente di 24 kD; il liquido di lesione del SNC di ratto mostra infine di contenere un singolo polipeptide con attività CNTF, il cui peso molecolare coincide con i 24 kD del fattore del nervo di ratto. ;Questi risultati suggeriscono che in futuro si potrà stabilire quante differenti molecole proteiche sono responsabili delle attività CNTF già descritte, senza la necessità di pervenire ad una purificazione finale per ciascuna di esse. Ad esempio, le differenze di peso molecolare tra il CNTF di occhio di embrione di pollo E15 e quello di nervo di ratto adulto o di SNC potrebbero riflettere soltanto differenze di specie, di età e/o di provenienza tessutale. L'applicazione della nuova tecnica ad estratti di differenti tessuti (come il cuore, il muscolo scheletrico, il nervo, il cervello), di differenti animali (il pollo, il ratto, il bue e l'uomo) e in differenti stadi dello sviluppo (embrionale, neonatale, giovani adulti, animali vecchi) dovrebbe quindi fornirci una "catalogo" di proteine con attività CNTF, corredato di un elenco delle loro varie provenienze. L'impiego come sonde di neuroni DRG o simpatici potrebbe indicarci se tutti i CNTF, come quello di occhio di pollo, sono dotati di attività trofica anche per questi altri tipi di cellule gangliari. ;Varianti di questa tecnica prevedono l'impiego di strisce di nitrocellulosa da gel elettroforetici, atte a risolvere i polipeptidi in relazione alla carica anziché allè dimensioni delle subunità, e/o ad evitare la possibile denaturazione da parte del detergente SDS; tali varianti sono pertanto utili per studiare fattori neuronotrofici diversi dai CNTF. ;La tecnica "blot e coltura" permette di realizzare un altro vantaggio, di notevole importanza biologica, che cioè i fattori neuronotrofici apportano il loro sostegno trofico essendo legati ad una superficie. Le implicazioni di questo fatto verranno discusse più avanti, quando si prenderanno in considerazione i meccanismi molecolari dell'effetto neuronotrofico . Ulteriori recenti informazioni sono riportate nell'articolo di M. Manthorpe et al., Ciliary Neuronotrophic Factors in Nerve Growth Factors R.A. Rush Ed ., Ibro Handbook Series: Methods in thè Neurosciences, Voi 12 pag. 31-56. ;;B. LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE ;La tecnologia del DNA ricombinante permette di costruire serie di vettori che sono in grado di esprimere proteine di interesse in larga quantità. La tecnologia del DNA ricombinante permette ai biologi molecolari l'assemblaggio di sequenze di DNA ai fini di creare delle molecole ibride capaci di produrre la proteina di interesse. Il metodo fa uso di varie reazioni come tagli con enzimi di restrizione, l'unione dei frammenti così ottenuti con ligasi, la sintesi chimica di oligonucleotidi da assemblare ed altre metodologie disponibili dei diversi laboratori nel settore (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SPring Laboratory NY, 1982). Ai fini di ottenere alti livelli di espressione, bisogna che gli elementi di DNA da assemblare presentino delle informazioni essenziali. Per esempio, una origine di replicazione, una selezione per antibiotici, un promotore di espressione, attivatori della trascrizione del gene di interesse ed altre caratteristiche note ai cultori della materia in oggetto. La combinazione di questi elementi in modo opportuno dà origine ad un plasmide, se il gene di interesse è inserito naturalmente rispetto alle sequenze regolatorie della trascrizione e della traduzione e il risultante plasmide viene definito di espressione. Il plasmide o vettore di espressione è così in grado di esprimere la proteina in cellule ospiti, che possono essere di origine eucariota o procariota. La proteina può quindi essere ricavata attraverso un sistema di purificazione. Gli elementi (promotori) che controllano naturalmente l’espressione di molti geni come ad esempio i fattori di crescita, non sono molto forti nella loro espressione e vengono attivati solo in opportune condizioni naturali che spesso non sono conosciute. A questo fine si utilizzano promotori di cui si conosce l'attività, ad esempio virus della serie Papovavirus, oppure altre sequenze geniche promotrici conosciute. Gli elementi che si utilizzano per alti livelli di espressione sono quindi una combinazione di DNA di diversa origine (eucariota, batterica, virale, etc.) costituito alla fine da porzioni geniche diverse legate a formare un ibrido. ;Se le tecniche utilizzate per isolare proteine con nuove attività biologiche prevedono convenzionalmente l'isolamento della proteina stessa tramite sistemi di purificazione da liquidi biologici, non sempre le quantità di proteina che si possono ottenere ne permettono i successivi usi per studiarne le struttura, le funzioni e soprattutto le applicazioni. Ai fini di ottenere quindi delle quantità apprezzabili di proteina, si possono utilizzare le tecnologie del DNA ricombinante per clonare la proteina stessa in un vettore di espressione. A volte, ed è il caso della presente invenzione, non vi è una conoscenza della struttura primaria della proteina e non è possibile un clonaggio convenzionale. Nel caso del CNTF, le sole conoscenze valide al momento sono che il gene di coniglio e di ratto è stato isolato e ne è stata determinata la relativa sequenza nucleotidica (K.A. Stòckli et al., Nature, voi. 342, 1989, pag. 920-923; Leu-Fen H. Lin et al., Science, voi. 246, 1989, pag. 1023-1025). ;Date queste premesse, convenzionalmente si potrebbe isolare il CNTF umano usando come sonda proprio uno di questi due geni e scrinare una banca di geni umani da cDNA o DNA genomico. ;Questi sistemi sono molto limitanti per il biologo molecolare e di conseguenza è necessario sviluppare strategie alternative in funzione dell'avvento di nuove tecnologie quale quella della Polimerase Chain Reaction (POR) (Saiki et al, Science 239:487, 1988; Scharf, S.J., Science 233: 1076, 1986). ;Con questa tecnica è possibile amplificare fino a 10® un segmento genico. Il principio si basa sull 'utilizzo di due oligonucleotidi che possono essere appaiati rispettivamente ognuno su uno dei filamenti di DNA da amplificare. La distanza che intercorre tra i due oligonucleotidi rispetto alla sequenza genica presa in esame dà le dimensioni della molecola da produrre. Questi due oligonucleotidi vengono costruiti in modo tale che all'interno della loro sequenza vi sia un sito di restrizione che ne permetta il successivo clonaggio. Questo sito di restrizione è presente naturalmente oppure viene costruito ad hoc degenerando il minimo numero di basi. Questo approccio, che si può definire di mutagenesi sito-diretta, permette di costruire dei siti di restrizione nelle posizioni che il biologo molecolare decide a tavolino. La costruzione di siti compatibili con altri segmenti genici permette da una parte un facile clonaggio, ma soprattutto apre la possibilità di unire in modo mirato diversi segmenti genetici. E’ stata costruita una serie di oligonucleotidi con sequenze basate sulla conoscenza del gene di coniglio e di ratto. ;Si può definire questa tecnica come clonazione attraverso la mutagenesi diretta. In pratica attraverso la tecnologia del DNA ricombinante è possibile esprimere polipeptidi eterologhi completi attraverso l'espressione diretta, o alternativamente si può esprimere il polipeptide eterologo fuso ad una porzione di sequenza amminoacidica di un polipeptide analogo. In generale, prodotti ottenuti in questo modo non sono biologicamente attivi (British Patent Application Pubi. N. 2007676A; Wenzel, American Scientist 68, 664, 1980). ;Il CNTF rappresenta uno dei molti fattori di crescita attualmente studiati per individuare la specificità della loro attività biologica e per il loro ottenimento mediante la tecnologia del DNA ricombinante o altre tecnologie di purificazione ed estrazione. Tali fattori di crescita, ivi compreso il CNTF, possono essere usati terapeuticamente in situazioni di mantenimento, prevenzione, recupero della funzione nervosa, in condizioni patologiche acute o croniche, anche di tipo neurodegenerativo ed immunoneurodegenerativo che coinvolgono i sistemi nervosi quali quello periferico, centrale e vegetativo. ;;;RIASSUNTO DELL’INVENZIONE ;La presente invenzione è relativa al processo per ottenere ed isolare un segmento di DNA umano che codifica una porzione del CNTF umano, all'identificazione della sua sequenza di basi ed alla correlazione con gli aminoacidi corrispondenti. ;Oggetto della presente invenzione sono pure le preparazioni farmaceutiche comprendenti come sostanze attive uno o più dei nuovi complessi tra il fattore di crescita CNTF e un ganglioside naturale o uno dei suoi derivati o analoghi semisintetici o un suo sale. Tali preparazioni farmaceutiche possono essere destinate all'uso orale, rettale, parenterale, locale, inalatorio, intracerebrale. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle. Per l'uso parenterale ed intracerebrale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o atte a infusioni o iniezioni endovenose o intracerebrali e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi e come polveri liofilizzate dei composti attivi da unirsi ad uno o più recipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, convenienti per gli usi suddetti e di osmolarità compatibile con i liquidi fisiologici. Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma creme o unguenti per uso topico; per l'uso inalatorio entrano in considerazione preparazioni in forma di spray, per esempio spray nasali. ;Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all'uomo o all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le soluzioni, gli spray, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipenderà dall'indicazione, dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta. ;L'invenzione comprende pure l’uso terapeutico di tutti i nuovi complessi dei gangliosidi o dei derivati con il fattore di crescita CNTF per le indicazioni già sopra menzionate. I dosaggi giornalieri all’uomo per via iniettiva (sottocutanea o intramuscolare o intracerebrale) variano da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per kg di peso corporeo. ;;;DESCRIZIONE DETTAGLIATA ;Di seguito viene descritto dettagliatamente come è stato preparato l’oggetto della presente invenzione. Queste descrizioni, mentre servono ad illustrarla, non sono da considerare limitative dell'invenzione, e tutte le variazioni che sarebbero evidenti all'esperto nell'arte sono da considerare in essa comprese. ;Gli attacchi sulle catene del DNA con gli enzimi di restrizione sono stati eseguiti come dalle specifiche delle case produttrici. In generale 1 pg di plasmide è stato tagliato con 1 U di enzima in 20 pi di soluzione; la temperatura e il tempo di incubazione dipendevano dall'enzima usato, in generale 1 hr a 37°C. Dopo incubazione, i plasmidi e i segmenti genetici sono stati purificati sempre in un gel di Agarosio LMP Agarose (BRL - Stati Uniti d'America) in 40 mM Tris HC1, 20 mM Sodio Acetato, 1 mM EDTA e quindi eluiti dall'agarosio con il kit GENECLEAN (BIO 101 Ine, La Jolla, CA - USA). Per le ligasi è stata usata la ligasi T4 alla concentrazione di 1 U per 0.5 pg di DNA in una reazione di 20 pi a 13°C per 12 ore . Le analisi per confermare la corretta sequenza nel plasmide sono state effettuate trasformando sempre in cellule HB101 e i trasformanti selezionati in piastre di Agarosio in LB (Luria Bertani) medium con antibiotico ampicillina 50 pg/ml . I plasmidi contenuti nelle HB101 sono stati cresciuti in LB, 100 pg/ml di ampicillina e sono stati purif icati , sia per le piccole che le grandi preparazioni , con il kit dello Quiagen (DIAGEN GmbH, Dusseldorf - Germania Federale) . I vettori di clonaggio sono stati preparati dalle cellule batteriche con i l metodo dello Quiagen. Il DNA per le reazioni di PCR è stato preparato nel seguente modo da placenta umana a termine. Un pezzo 0.4 cm di villi coriali è stato sminuzzato con un paio di forbici e sospeso in 700 jul di 50 mM Tris/HCl pH 7.8 , 100 mM EDTA, 100 mM NaCl , 1% SDS . A questo, sono stati successivamente aggiunti 35 pi di proteinase (K 100 ug/ml) ed è stato incubato per una notte a 55°C. Sono quindi stati aggiunti 20 pi di una soluzione a 13 pg/ml di RNAase A ed è stato incubato per altre 2 ore . Sono state poi eseguite due estrazioni con fenolo e due con cloroformio . Il DNA è stato poi fatto precipitare su un capillare di vetro per aggiunta di 1 volume di isopropanolo. A questo punto sono stati eseguiti alcuni passaggi con etanolo al 70% e al 100% ed è stato fatto asciugare. Il DNA è stato sciolto in tampone (10 mM Tris/HCl pH 7.4, 1 mM EDTA), lasciandolo in lenta agitazione in provetta. Dopo alcune ore, il DNA sciolto era pronto per l'amplificazione genica. Normalmente 0.1 jig di DNA sono stati sufficienti per procedere alla PCR. ;Per permettere il clonaggio in un plasmide del segmento del CNTF umano ci siamo basati sulla sequenza nucleotidica del CNTF di coniglio ottenuto tramite la GENEBANK con numero di accesso M29828. Da questa sequenza abbiamo sintetizzato due oligonucleotidi. Il primo, tra le basi 123 e 147, avrebbe dovuto comprendere la seguente sequenza: ;5 ’CAGGGCCTGAACAAGAACATCAAC3, ;La ottava base è stata mutata per permettere la creazione di un sito Apal e facilitarne il successivo clonaggio: ;Apal ;5 'CAGGGCCCGAACAAGAACATCAAC3, ;Questo oligonucleotide è stato chiamato Apal. ;Il secondo oligonucleotide, che comprende le basi tra 581 e 600, è complementare a questa sequenza per permettere la PCR e avrebbe dovuto avere la seguente sequenza: ;5’CTACATTTCCTTGACGTTAGg, ;Dalla parte del 5‘ è stato aggiunto un sito di restrizione Sali per facilitare il successivo clonaggio, per cui abbiamo sintetizzato la seguente sequenza : ;Sali ;5■TAGTGCACTACATTTCCTTGACGTTAG3, ;I due oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un sintetizzatore di oligonucleotide in fase solida con il metodo dei fosforamiditi seguendo le procedure standard dell'apparecchio 330B DNA Synthesizer (Applied Biosystems - USA). Sono stati trattati a 55eC per 12 ore in NH^ e quindi portati a secco in una centrifuga a vuoto. Sono stati risospesi in ammonio acetato 2.5 M e quindi precipitati con 3 volumi di etanolo freddo (-20°C). Sono stati rilavati con etanolo freddo all'80% e risospesi in acqua. La concentrazione dei due oligonucleotidi era stata valutata allo spettrofotometro. La procedura di amplificazione è stata eseguita su un Perkin Elmer Cetus DNA Termal Cycler Amplificator ed i reagenti usati per l’amplificazione erano quelli del relativo kit DNA AMplyfer (Perkin Elmer-Cetus). Brevemente, è stata usata una miscela con 200 pM di ogni oligonucleotide, 0.5 uM di ogni nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP e 0.1 ug di DNA umano e buffer di reazione in una miscela totale di 100 pi con 0.5 U di TAQ polimerasi, il tutto ricoperto con olio di paraffina per non permettere l’evaporazione. La reazione di amplificazione è stata condotta impostando lo strumento per 35 cicli nel caso da DNA umano. Il ciclo in entrambi i casi era il seguente: 1 min. a 94°C, 2 min. a 45°C, 3 min. a 72°C. Il frammento amplificato di 482 bp è stato purificato in un gel di Agarosio (NuSieve) Low Melting utilizzando il kit GENECLEANTM (BIO 101 Ine, La Jolla, CA - USA) per sciogliere l'Agarosio. Il DNA è stato tagliato con gli enzimi di restrizione Apal e Sali e ripurificato come sopra. Il frammentato così purificato è stato clonato nei siti Apal e Xhol del vettore pGEM-7Zf(+) (Promega). ;Il segmento amplificato è stato sequenziato con i primer del pUC/M13 che mappano in questo plasmide tra 2941-2957 e 158-174. ;Sequenziato in entrambi i sensi, ha dato la seguente seguenza: ; ; Come si può vedere, la traduzione della seconda riga dà origine ad un gene contiguo senza nessun codone di stop, se non alla fine del gene. E' stata così definita la seguente sequenza proteica contigua ;; ;;; Questa sequenza aminoacidica è stata allineata secondo il metodo di Needleman-Wunsch con le sequenze di CNTF di coniglio e di ratto. L’alta omologia di sequenza peptidica che si ottiene indica con ragionevole certezza che il segmento che noi abbiamo isolato corrisponde al CNTF umano. ; ;; Attraverso un confronto tra il profilo di idropaticità del segmento da noi clonato e quello di coniglio e di ratto, si dimostra che i cambiamenti aminoacidici nella catena del segmento da noi clonato sostanzialmente non incidono sul profilo generale del polipeptite. ;Queste due evidenze sostanzialmente dimostrano che il segmento da noi clonato corrisponde al fattore neuronotrof ico ciliare umano. ; ;;; L I ;SO J _ I ;100 ISO ;;Figura 1 ;Profili di idropaticità ottenuti dalle sequenze aminoacidiche relative al CNTF delle specie indicate a lato della figura, secondo i valori di Hopp et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 78:3824, 1981, ;;COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE ;La formulazione delle composizioni farmaceutiche contenenti la molecola CNTF umano derivata dal DNA ricombinante, descritta a questo riguardo senza e possibilmente anche con gangliosidi e fosfolipidi, comprende metodi già conosciuti per la preparazione di composizioni accettabili dal punto di vista farmaceutico, somministrabili al paziente, le qua ;li permettono che una quantità effettiva della molecola CNTF sia combinata in una miscela con un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Veicoli adatti e la loro formulazione comprendente altre proteine sono descritte, per esempio, nel libro "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons*s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Questi veicoli comprendono "formulazioni di deposito" iniettabili .

In base a quanto sopra, la formulazione farmaceutica comprende, sebbene non in maniera esclusiva, soluzioni di fattore di crescita CNTF o sue polveri liofilizzate in associazione a uno o più veicoli o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, e contenuti in mezzi tamponati a pH idoneo, ed isosmotici con i liquidi fisiologici. Nel caso di preparazioni liofilizzate, possono essere utilizzati eccipienti di sostegno come per esempio, ma non esclusivamente, mannitolo o glicina, e saranno fornite idonee soluzioni tamponate del volume desiderato in modo da ottenere adeguate soluzioni tamponate isotoniche aventi il pH desiderato. Soluzioni simili possono essere usate per le composizioni farmaceutiche della molecola CNTF ottenuta da DNA ricombinante in soluzioni isotoniche del volume desiderato e includono, ma non esclusivamente, l'uso di soluzioni tamponate fisiologiche con fosfato o citrato a concentrazioni idonee in modo da ottenere ogni volta preparazioni farmaceutiche isotoniche del pH desiderato, per esempio, pH neutro.

La formulazione farmaceutica comprende inoltre, ma senza essere limitata ad esse, supposte per la somministrazione rettale con eccipienti lipofilici, ad esempio, idrosolubili, autoemulsivi di tipo glicogelatina o altro. In queste preparazioni, il fattore di crescita CNTF ottenuto da DNA ricombinante può essere presente in quantità varianti fra lo 0.01% e 1'1% in peso dell'intero eccipiente. Le supposte possono contenere, senza essere limitate ad esse, quantità idonee di acetilsalicilato.

Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione, e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni:

1. Un segmento isolato di DNA umano, che rappresenta essenzialmente una sequenza del DNA che codifica il fattore neuronotrofico ciliare umano (CNTF).

2. il DNA isolato di cui alla rivendicazione 1, che codifica la sequenza aminoacidica:

Claims (1)

1. Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione, e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni: 1. Un segmento isolato di DNA umano, che rappresenta essenzialmente una sequenza del DNA che codifica il fattore neuronotrofico ciliare umano (CNTF). 2. il DNA isolato di cui alla rivendicazione 1, che codifica la sequenza aminoacidica:

   3. Il DNA isolato di cui alla rivendicazione 1, che è costituito dalla sequenza di nucleotidi:

   4. Il DNA isolato di cui alle rivendicazioni 1-3, che rappresenta una regione dal gene che codifica il fattore neuronotrof ico ciliare umano (CNTF). 5. Il DNA isolato di cui alle rivendicazioni 1-4, che rappresenta una sequenza aminoacidica essenziale per l'ottenimento del polipeptide del fattore neuronotrof ico ciliare umano (CNTF), nella forma biologicamente attiva. 6. Il DNA isolato di cui alle rivendicazioni 1-4, che rappresenta una sequenza di nucleotidi es senziale per il processo di espressione del fattore neuronotrofico ciliare umano (CNTF) in cellule ospiti. 7. Un processo per la preparazione del segmento di DNA di cui alla rivendicazione 1. 8. Un processo di cui alla rivendicazione 6, dove la cellula ospite è d'origine procariota. 9. Un processo di cui alla rivendicazione 6, dove la cellula ospite è di origine eucariota. 10. Un processo di cui alle rivendicazioni 6-9 per l'ottenimento del fattore neuronotrofico ciliare umano (CNTF), privo di proteine umane contaminanti . 11. Un processo di cui alla rivendicazione 10, che permette la produzione di preparazioni farmaceutiche. 12. Un processo di cui alla rivendicazione 11, dove nella preparazione farmaceutica sono presenti come sostanze attive uno o più dei nuovi complessi tra il fattore di crescita CNTF e un ganglioside naturale o un suo derivato o analogo semisintetico o un suo sale. 13. Un processo di cui alle rivendicazioni 11 e 12, dove la preparazione farmaceutica è destinata alla somministrazione all'uomo o all'animale. 14. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via parentale. 15. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via intracerebrale. 16. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via orale. 17. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via rettale. 18. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via locale o topica. 19. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è somministrabile per via inalatoria. 20. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è da utilizzarsi per il mantenimento della funzione nervosa. 21. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica è da utilizzarsi per la prevenzione della perdita della funzione nervosa. 22. Un processo di cui alle rivendicazioni 11-12, dove la preparazione farmaceutica si può utilizzare per il recupero della funzione nervosa in condizioni patologiche acute o croniche. 23. Un processo di cui alla rivendicazione 22, dove le condizioni patologiche sono di tipo acuto come deficienze cerebrovascolari, infettive, infiammatorie, compressive, metaboliche. 24. Un processo di cui alla rivendicazione 22, dove le condizioni patologiche sono di tipo cronico neurodegererativo, anche in fasi tardive delle patologie acute. 25. L'uso di una forma farmaceutica di cui alle rivendicazioni 11-12 per il trattamento di condizioni neuropatologiche date dall'invecchiamento del sistema nervoso o di malattie che attaccano il sistema immunitario. 26. L'uso di una forma farmaceutica di cui alle rivendicazioni 11-12 per la modulazione del sistema immunitario.