CN101654676A - 核酸分子和鉴别gpr84活性调节剂的方法 - Google Patents

核酸分子和鉴别gpr84活性调节剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了编码CD36、Gqi9和G蛋白偶联受体84(GPR84)蛋白的分离的核酸以及共表达CD36、Gqi9和GPR84蛋白的载体和重组宿主细胞在鉴别GPR84活性调节剂中的应用。

Description

核酸分子和鉴别GPR84活性调节剂的方法
发明背景
在整个动物王国中，从简单的后生动物到最复杂的脊椎动物，都存在味觉信号转导。据信味觉是由受体介导的，即促代谢受体或收缩性受体。表达味觉受体的细胞在接触某些化学刺激时，除极化产生动作电位，由动作电位触发感觉而引起味觉。这样，味觉受体特异性识别能够引起特定味觉的分子。这些分子在这里也被称为“促味剂”。许多味觉受体属于7个跨膜受体的超家族(Hoon等，(1999)Cell，96：451；Adler等，(2000)Cell，100：693)，也称为G蛋白偶联受体(GPCR)。据信其他味道是由通道蛋白介导的。
许多这些受体的生物化学分析和分子克隆揭示了关于这些受体功能的基本原理。例如，美国专利5,691,188描述了配体如何结合GPCR，假定该受体发生构象变化而导致G蛋白的活化。G蛋白包括三个亚单位：脒基核苷酸结合α亚单位、β亚单位和γ亚单位。当GDP结合时，G蛋白以异质三联体形式存在，即Gαβγ复合物。当GTP结合时，α亚单位从异质三联体解离，形成Gβγ复合物。当Gαβγ复合物与细胞膜中活化的G蛋白偶联受体可操作地相关联时，GTP对结合的GDP的交换速率增加，结合的Gα亚单位从Gαβγ复合物解离的速率增加。因此，游离的Gα亚单位和Gβγ复合物能够将信号传递到各种信号转导通路的下游元件。这些事件形成不同细胞信号转导现象的多样性的基础，包括例如鉴别为神经感觉(例如味觉和/或嗅觉)的信号转导现象。
据信哺乳动物具有5种基本的味觉样态，甜、苦、酸、咸和鲜(谷氨酸钠的味道)。例如参见，Kinnamon等，(1992)Ann.Rev.Physiol.54：715-31；Lindemann(1996)Physiol.Rev.76：718-66；Stewart等，(1997)Am.J Physiol.272：1-26。大量动物的生理学研究表明，味觉受体细胞可以对不同的化学刺激选择性地作出响应。例如参见，Akabas等，(1988)Science 242：1047-50；Gilbertson等，(1992)J.Gen.Physiol.100：803-24；Bernhardt等，(1996)J.Physiol.490：325-36；Cummings等，(1996)J.Neurophysiol.75：1256-63。
关于味觉细胞功能的精神物理和生理学大多已知。因此，新型味觉受体和味觉信号转导分子的鉴别与分离将实现味道转导通路的化学和遗传调节的新方法。例如，利用受体和通道分子可以实现高亲和力激动剂、拮抗剂、反相激动剂和味觉活性调节剂。这些味觉调节性化合物可用于药品和食品工业以改善各种消费品的味道，或阻断不希望的味道，例如在某些药物中。
各种人和其他真核化学感受受体的完整或部分序列是已知的。参见例如，Pilpel和Lancet(1999)Protein Science 8：969-977；Mombaerts(1999)Annu.Rev.Neurosci.22：487-50；Wang等，(2006)J.Biol.Chem.M608019200。也可见于，美国专利5,874,243，WO 92/17585，WO 95/18140，WO 97/17444，WO 99/67282和WO 2007/027661。此外，已进行G蛋白偶联受体如GPR84的配体的鉴别。参见Wang等，(2006)同上；WO 2007/027661；和美国专利申请号2007/0196867。
发明概述
本发明涉及一种编码CD36、Gqi9和/或G蛋白偶联受体84(GPR84)蛋白的分离的核酸分子。本发明也包括能使CD36、Gqi9和GPR84诱导型或组成型表达的表达载体，以及共表达CD36、Gqi9和GPR84蛋白的分离的重组宿主细胞。
本发明还涉及鉴别GPR84活性调节剂的方法。该方法包括使共表达CD36、Gqi9和GPR84蛋白的重组宿主细胞与测试化合物相接触并测定测试化合物对GPR84活性的功能性影响从而鉴别GPR84的调节剂。
发明详述
本发明提供了编码G蛋白偶联受体84(GPR84)、CD36和Gqi9的分离核酸分子及其在鉴别GPR84的配体(例如激动剂和拮抗剂)中的应用。具体说，本发明涉及作为脂肪味受体的GPR84及其在模拟脂肪味的化合物的筛选试验中的应用。
本文所用术语“分离”表示核酸分子时是指不同于天然存在的纯化或浓缩状态的核酸分子。根据本领域技术人员已知的各种方法和过程，本文所述的核酸分子可以是分离的或者与它们通常不相关的结构或化合物相关联。
GPR84已被鉴定为中链游离脂肪酸的受体(Wang等，(2006)同上)。许多物种中存在GPR84蛋白，包括人、小鼠、大鼠等，根据本发明可使用编码这些蛋白质中任何一种的核酸分子。在这方面，本发明包括表1所列编码GPR84蛋白的核酸分子。
表1
  来源   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：   ％相同性*
  智人(Homosapiens)   NP_065103   1   NM_020370   2   100％
  小鼠(Musmusculus)   NP_109645   3   NM_030720   4   85.4％
  大鼠(Tarrusnorvegicus)   NP_001102979   5   NM_001109509   6   83.8％
  牛(Bos Taurus)   NP_001033657   7   NM_001038568   8   89.6％
*％相同性基于与人GPR84蛋白的比对。
在一些实施方式中，核酸分子编码人G2R84蛋白。在其它实施方式中，核酸分子编码SEQ ID NO：1的人GPR84蛋白。在具体实施方式中，编码人GPR84蛋白的核酸分子如SEQ ID NO：9所示。
功能上说，本文所述的GPR84蛋白是相关的7个跨膜区的G蛋白偶联受体家族的成员，据信参与味觉转导。结构上说，GPR84家族成员的核苷酸序列可编码相关蛋白，包括胞外区、7个跨膜区和胞质区。来自其他物种的相关GPR84家族成员在长度至少约50个氨基酸残基，任选100、200、300或更多个氨基酸残基的区域内与SEQ ID NO：1，3，5或7有至少约为60％、70％、80％或90％的蛋白质序列相同性。
GPR84氨基酸序列的特定区域可用于鉴别GPR84家族成员的多态性变体，种间同系物和等位基因。这种鉴别可体外进行，例如在严格杂交条件下或PCR(如，采用编码GPR84共有序列的引物)，或通过使用计算机系统中的序列信息与其他核苷酸序列进行比对。单一物种群体内GPR84基因的不同等位基因也可用于确定等位基因序列的差异是否与群体成员间的味觉差异有关。经典的PCR型扩增和克隆技术可用于分离同源基因，例如简并足以检测物种间的相关基因的引物，通常比单一物种内GPR84家族的共生同源成员具有更高水平的相同性。
通常，GPR84家族的多态性变体和等位基因的鉴别可通过比较约25个氨基酸或更多，例如50-100个氨基酸的氨基酸序列来进行。至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95-99％，或更高的氨基酸相同性通常表明，蛋白质是T1R家族成员的多态性变体、种间同系物、或等位基因。序列比对可采用任何常规序列对比算法进行。特异性结合GPR84多肽的抗体或其保守区域也可用于鉴别等位基因、种间同系物和多态性变体。
本发明的一个方面中，GPR84核苷酸序列如下：
atgtggaacagctctgacgccaacttctcctgctaccatgagtctgtgctgggctatcgttatgttgcagttagctggggggtggtggtggctgtgacaggcaccgtgggcaatgtgctcaccctactggccttggccatccagcccaagctccgtacccgattcaacctgctcatagccaacctcacactggctgatctcctctactgcacgctccttcagcccttctctgtggacacctacctccacctgcactggcgcaccggtgccaccttctgcagggtatttgggctcctcctttttgcctccaattctgtctccatcctgaccctctgcctcatcgcactgggacgctacctcctcattgcccaccctaagctttttccccaagttttcagtgccaaggggatagtgctggcactggtgagcacctgggttgtgggcgtggccagctttgctcccctctggcctatttatatcctcgtacctgtagtctgcacctgcagctttgaccgcatccgaggccggccttacaccaccatcctcatgggcatctactttgtgcttgggctcagcagtgttggcatcttctattgcctcatccaccgccaggtcaaacgagcagcacaggcactggaccaatacaagttgcgacaggcaagcatccactccaaccatgtggccaggactgatgaggccatgcctggtcgtttccaggagctggacagcaggttagcatcaggaggacccagtgaggggatttcatctgagccagtcagtgctgccaccacccagaccctggaaggggactcatcagaagtgggagaccagatcaacagcaagagagctaagcagatggcagagaaaagccctccagaagcatctgccaaagcccagccaattaaaggagccagaagagctccggattcttcatcggaatttgggaaggtgactcgaatgtgttttgctgtgttcctctgctttgccctgagctacatccccttcttgctgctcaacattctggatgccagagtccaggctccccgggtggtccacatgcttgctgccaacctcacctggctcaatggttgcatcaaccctgtgctctatgcagccatgaaccgccaattccgccaagcatatggctccattttaaaaagagggccccggagtttccataggctccattag。
本发明的一个方面中，GPR84氨基酸序列如下：
MWNSSDANFSCYHESVLGYRYVAVSWGVVVAVTGTVGNVLTLLALAIQPKLRTRFNLLIANLTLADLLYCTLLQPFSVDTYLHLHWRTGATFCRVFGLLLFASNSVS ILTLCLIALGRYLLIAHPKLFPQVFSAKGIVLALVSTWVVGVASFAPLWPIYILVPVVCTCSFDRIRGRPYTTILMGIYFVLGLSSVGIFYCLIHRQVKRAAQALDQYKLRQASIHSNHVARTDEAMPGRFQELDSRLASGGPSEGISSEPVSAATTQTLEGDSSEVGDQINSKRAKQMAEKSPPEASAKAQPIKGARRAPDSSSEFGKVTRMCFAVFLCFALSYIPFLLLNILDARVQAPRVVHMLAANLTWLNGCINPVLYAAMNRQFRQAYGSILKRGPRSFHRLH。
除GPR84之外，本发明的核酸分子还编码由G蛋白αq亚单位组成的嵌合鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，其中C-端9个残基被G蛋白质αi亚单位的对应部分取代。该嵌合G蛋白称为Gqi9，是本领域已知的，参见Parmentier等，(1998)Mol.Pharmacol.53(4)：778-86；Perroy等，((2001)J.Biol.Chem.276：45800-45805)对于磷脂酶C的偶联受体的描述。通过示例的方式，GENBANK登录号NP_002063.2(SEQ ID NO：10)所示Gq亚单位的9个C端氨基酸残基被G蛋白αi亚单位的9个C端氨基酸残基，即被Asn-Asn-Leu-Lys-Asp-Cys-Gly-Leu-Phe(SEQ ID NO：11)取代。虽然本发明中优选采用人Gq亚单位，但也可使用非人Gq亚单位。例如，表2所列的Gq亚单位适用于本发明。
表2
  来源   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：  ％相同性*
  智人   NP_002063   10   NM_002072   12   100％
  小鼠   NP_032165   13   NM_008139   14   99.7％
  大鼠   NP_112298   15   NM_031036   16   99.4％
*％相同性基于与人Gq蛋白亚单位的比对。
根据本发明使用的Gq亚单位优选在长度至少约50个氨基酸残基，任选地长度100、200、300或更多个氨基酸残基的区域内与SEQ ID NO：10，13或15具有至少约90％蛋白质序列相同性。如GPR84所述，可采用许多常规方法，采用严格杂交条件或抗体交叉反应来鉴别相关序列。
在本发明的一个方面中，下文所示为嵌合蛋白——人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(q)α亚单位，其最后的9个残基被鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)α亚单位所取代：
atgactctggagtccatcatggcgtgctgcctgagcgaggaggccaaggaagcccggcggatcaacgacgagatcgagcggcagctccgcagggacaagcgggacgcccgccgggagctcaagctgctgctgctcgggacaggagagagtggcaagagtacgtttatcaagcagatgagaatcatccatgggtcaggatactctgatgaagataaaaggggcttcaccaagctggtgtatcagaacatcttcacggccatgcaggccatgatcagagccatggacacactcaagatcccatacaagtatgagcacaataaggctcatgcacaattagttcgagaagttgatgtggagaaggtgtctgcttttgagaatccatatgtagatgcaataaagagtttatggaatgatcctggaatccaggaatgctatgatagacgacgagaatatcaattatctgactctaccaaatactatcttaatgacttggaccgcgtagctgaccctgcctacctgcctacgcaacaagatgtgcttagagttcgagtccccaccacagggatcatcgaatacccctttgacttacaaagtgtcattttcagaatggtcgatgtagggggccaaaggtcagagagaagaaaatggatacactgctttgaaaatgtcacctctatcatgtttctagtagcgcttagtgaatatgatcaagttctcgtggagtcagacaatgagaaccgaatggaggaaagcaaggctctctttagaacaattatcacatacccctggttccagaactcctcggttattctgttcttaaacaagaaagatcttctagaggagaaaatcatgtattcccatctagtcgactacttcccagaatatgatggaccccagagagatgcccaggcagcccgagaattcattctgaagatgttcgtggacctgaacccagacagtgacaaaattatctactcccacttcacgtgcgccacagacaccgagaatatccgctttgtctttgctgccgtcaaggacaccatcctccagaacaacctgaaggactgcggcctcttctaa。
在本发明的一个方面中，Gqi9的氨基酸序列如下：
MTLESIMACCLSEEAKEARRINDEIERQLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSGYSDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVEKVSAFENPYVDAIKSLWNDPGIQECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVLRVRVPTTGIIEYPFDLQSVI FRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIMFLVALSEYDQVLVESDNENRMEESKALFRTI ITYPWFQNSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAQAAREFILKMFVDLNPDSDKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQNNLKDCGLF。
本发明核酸分子中还包括编码CD36的序列。已提出GPR120和CD36形成脂肪酸接收的独立途径(Matsumura等，(2007)Biomed.Res.28：49-55)。而且，考虑CD36还与GPR84在脂肪酸转运和饮食脂质的传感中联合起作用。因此，本发明涵盖CD36与GPR84和Gqi9的共表达。虽然本发明优选采用人CD36，但也可使用非人CD36。例如，表3所列的CD36蛋白适用于本发明。
表3
  来源   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：   GENBANK氨基酸序列登录号   SEQIDNO：  ％相同性*
  智人   NP_001001547   17   NM_001001547   18   100％
  小鼠   NP_031669   19   NM_007643   20   86.4％
  大鼠   NP_113749   21   NM_031561   22   87.9％
*％相同性基于与人CD36蛋白的比对。
既然本文所述的CD36蛋白用作脂肪酸转运蛋白，本发明涵盖了在长度至少约50个氨基酸残基，任选地长度100、200、300或更多个氨基酸残基的区域内与SEQ ID NO：17，19或21具有至少约90％蛋白质序列相同性的其他CD36蛋白。
本发明的一个方面中，CD36核苷酸序列如下：
atgggctgtgaccggaactgtgggctcatcgctggggctgtcattggtgctgtcctggctgtgtttggaggtattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaagttgtcctcgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagacagttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagcaacattcaagttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaaatgtaacccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatcttcgaaccttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctgtggcagctgcatcccatatctatcaaaatcaatttgttcaaatgatcctcaattcacttattaacaagtcaaaatcttctatgttccaagtcagaactttgagagaactgttatggggctatagggatccatttttgagtttggttccgtaccctgttactaccacagttggtctgttttatccttacaacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataagtaaagttgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcctattgggaaagtcactgcgacatgattaatggtacagatgcagcctcatttccaccttttgttgagaaaagccaggtattgcagttcttttcttctgatatttgcaggtcaatctatgctgtatttgaatccgacgttaatctgaaaggaatccctgtgtatagatttgttcttccatccaaggcctttgcctctccagttgaaaacccagacaactattgtttctgcacagaaaaaattatctcaaaaaattgtacatcatatggtgtgctagacatcagcaaatgcaaagaagggagacctgtgtacatttcacttcctcattttctgtatgcaagtcctgatgtttcagaacctattgatggattaaacccaaatgaagaagaacataggacatacttggatattgaacctataactggattcactttacaatttgcaaaacggctgcaggtcaacctattggtcaagccatcagaaaaaattcaagtattaaagaatctgaagaggaactatattgtgcctattctttggcttaatgagactgggaccattggtgatgagaaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttggcctgatagaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtttgttgcttttatgatttcatattgtgcatgcagatcgaaaacaataaaataa。
在本发明的一个方面中，CD36的氨基酸序列如下：
MGCDRNCGLIAGAVIGAVLAVFGGILMPVGDLLIQKTIKKQVVLEEGTIAFKNWVKTGTEVYRQFWIFDVQNPQEVMMNSSNIQVKQRGPYTYRVRFLAKENVTQDAEDNTVSFLQPNGAIFEPSLSVGTEADNFTVLNLAVAAASHIYQNQFVQMILNSLINKSKSSMFQVRTLRELLWGYRDPFLSLVPYPVTTTVGLFYPYNNTADGVYKVFNGKDNISKVAIIDTYKGKRNLSYWESHCDMINGTDAASFPPFVEKSQVLQFFSSDICRSIYAVFESDVNLKGIPVYRFVLPSKAFASPVENPDNYCFCTEKIISKNCTSYGVLDISKCKEGRPVYISLPHFLYASPDVSEPIDGLNPNEEEHRTYLDIEPITGFTLQFAKRLQVNLLVKPSEKIQVLKNLKRNYIVPILWLNETGTIGDEKANMFRSQVTGKINLLGLIEMILLSVGVVMFVAFMISYCACRSKTIK。
本发明蛋白质的氨基酸序列可通过编码核酸序列的推定翻译来鉴别。这些氨基酸序列和编码核酸序列可采用许多方法相互比较或与其他序列进行比较。
例如，在序列比对中，通常一个序列用作参比序列，测试序列与其进行比较。采用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，如果需要设定坐标轴，然后指定序列算法程序参数。可使用BLASTN和BLASTP程序的默认程序参数，如下所述，或者指定参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的百分序列相同性。
本文所用“比较窗”包括在毗连位置数例如20-600，通常约50-200或约100-150个位置中的任一个区段内，最佳排列后将序列与相同毗连位置数的参比序列进行比较。用于比较的序列的排列方法是本领域所公知的。用于比较的序列的最佳排列可通过以下方法实现，例如Smith和Waterman的局部同源性算法((1981)Adv.Appl.Math.2：482)，Needleman和Wunsch的同源性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)，Pearson和Lipman的搜索相似性方法((1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：2444)，这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传软件包(Visconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机公司(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊)，或通过手动比对和视觉检查(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)(1995)Ausubel等编，增补本)。
适用于测定百分序列相同性的算法的一个优选的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，参见Latched等，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等，(1990)J.Mol Biol.215：403-410的描述。进行BLAST分析的软件通过生物技术信息国立中心公众可得。该算法包括首先通过鉴别询问序列中长度W的短字来鉴别高得分序列对(HSP)，与数据库序列中相同长度的字对齐时匹配或满足某一正值阈得分T。T表示邻域字得分阈值(Altschul等，(1990)同上；Altschul等，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402)。这些初始邻域字值(wordhit)用作启动搜索的种子以发现包含它们的较长的HSP。该字值沿各个序列双向延伸直到累积比对得分增加。累积得分是采用核苷酸序列，参数M(对于一对匹配的残基的犒赏得分；总是＞0)计算的。对于氨基酸序列，采用评分矩阵来计算累积得分。当累积比对得分从其最大实现的值下降量X时；由于一种或多种负评分残基比对的累积而导致累积得分变成零或零以下时；或者到达序列末端时，字值沿各个方向的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值为：字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝4，两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP采用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 89：10915)为：比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，Nz＝4，两条链的比较。
有用的算法的另一个例子是PILEUP。PILEUP采用进行性配对比对产生来自相关序列组的多重序列比对以显示关系和百分序列相同性。它还绘制所谓的“树”或“树图”，显示用于产生比对的成簇关系。PILEUP采用Fang和Doolittle((1987)J.Mol.Evol.35：351-360)的进行性比对方法的简化形式。所用方法类似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS 5：151-153)所述的方法。程序可比对至多300个序列，各自的最大长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序从两个最相似序列的配对比对开始，产生两个比对序列的簇。然后将该簇与下一最相关序列或比对序列的簇进行比对。两个序列簇通过两个单独序列的配对比对的简单延伸进行比对。最终的比对可通过一系列进行性配对比对来实现。该程序的运行包括：指定具体序列及其氨基酸或核苷酸坐标轴中用于序列比较的区域，并指定程序参数。采用PILEUP，将参比序列与其他测试序列进行比较以确定百分序列相同性关系，参数如下：默认间隙权重(3.00)，默认间隙长度权重(0.10)和加权端隙。PILEUP可从GCG序列分析软件包(Devereaux等，(1984)Nuc.Acids Res.12：387-395)获得。
如本文所示，采用BLASTP算法进行的本发明人蛋白质序列与公共序列数据库中的所有已知蛋白质的比较表明，与人序列具有至少约80％氨基酸相同性的其他GPR84、Gq亚单位和CD36蛋白具有强同源性。
作为直接氨基酸或核酸序列比较的替代方式，合适的GPR84、Gq亚单位和CD36蛋白可通过严格杂交条件下的核酸分子(例如，表1-3所示的核酸分子或其探针)与其他种类的核酸(例如，基因组或cDNA序列)的杂交来鉴别。短语“严格杂交条件”表示通常在核酸的复杂混合物中，探针可与其靶序列杂交但不与其他序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，不同环境中不同。较长的序列在较高的稳定性同源性杂交。核酸杂交的详细指导参见Tijssan(1993)，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Hybridization with NucleicProbes(生物化学与分子生物学技术，与核酸探针的杂交)，“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原理综述与核酸分析战略)”。通常，选定的严谨条件为在规定的离子强度、pH下，比特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)(靶序列过量，Tm下，平衡时50％的探针被占据)。严谨条件是盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH 7.0-8.3，对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约为30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度至少约为60℃。严谨条件也可通过加入去稳定剂甲酰胺来实现。为实现选择性或特异性杂交，正信号是背景的至少2倍，任选10倍。示例性的杂交严谨条件如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃孵育(或5×SSC，1％SDS，在65℃孵育)，在65℃用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤。这种杂交和洗涤步骤可进行例如1、2、5、10、15、30、60分钟或更长时间。
严谨条件下未能相互杂交的核酸如果它们所编码的多肽实质相关，则这些核酸仍然实质相关。例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并产生核酸拷贝时发生上述情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括37℃在40％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的缓冲液中杂交，以及45℃在1×SSC中洗涤。这种杂交和洗涤步骤可进行例如1、2、5、10、15、30、60分钟或更长时间。阳性杂交是背景的至少2倍。本领域普通技术人员容易明白，可采用替代的杂交和洗涤条件来提供类似的严谨性条件。
由本发明可知，编码本发明GPR84、Gq亚单位和CD36蛋白的核酸分子可根据本领域公知的方法从许多来源分离得到，例如遗传工程改造、扩增、合成和/或重组表达。本发明蛋白质的分离和表达过程如下所述。采用PCR引物扩增编码GPR84、Gq亚单位和CD36蛋白核酸，可任选地产生和筛选这些核酸文库以鉴别适用于蛋白质表达的核酸。扩增方法是本领域所公知的，包括例如聚合酶链反应，PCR(《PCR方案，方法与应用指导》(PCR Protocols，a Guideto Methods and Applications)(1990)，Innis编，学术出版社(Academic Press)，纽约)；和《PCR策略》(PCR Strategies)(1995)，Innis编，学术出版社(AcademicPress，Inc.)，纽约)；连接酶链反应(LCR)(参见例如，Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science 241：1077；Barringar(1990)，Gene 89：117)；转录扩增(参见例如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)；自动维持序列复制(参见例如，Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)；Qβ复制酶(Q Betareplicase)扩增(参见例如，Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)；自动Q-β复制酶扩增试验(参见例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其他RNA聚合酶-介导的技术(例如，NASBA；看基因公司(Cangene)，安大略省米西索加(Mississauga，Ontario))。引物可设计成保留感兴趣蛋白质的原始序列。或者，引物可编码保守取代(例如，疏水取代疏水残基)或功能良性取代(例如，不阻碍质膜插入，导致肽酶裂解，导致受体异常折叠等)的氨基酸残基。一旦扩增，根据本领域已知的方法单独或以文库形式克隆核酸。事实上，操纵核酸的技术，例如在序列中产生突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交等是科技文献和专利文献中公开描述的。参见例如，Sambrook编，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版)，第1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)和Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)(1997)Ausubel编，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约。
作为扩增和/或克隆的替代方式，可根据公知的化学合成技术来合成本发明的核酸，例如参见Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)NucleicAcids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)10 Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109所述。然后，合成互补链并使该连在适当条件下退火在一起而获得双链DNA片段，或者采用具有适当引物序列的DNA聚合酶，通过加入互补链而获得双链DNA片段。
一旦获得，将编码GPR84、Gq亚单位和CD36蛋白的核酸引入重组蛋白表达的表达载体中。根据指定用途(例如，在表型或配体结合试验中)，可采用任何表达载体系统，除哺乳动物细胞外，包括例如细菌、酵母、昆虫或植物系统。如本文所用，术语“表达载体”表示用于在任意细胞，包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中，组成型或诱导型表达本发明核酸分子的任何重组表达系统。该术语包括线性或环形表达系统。该术语包括保持游离或整合到宿主细胞基因组内的表达系统。该表达系统具有自身复制的能力，或者不具有，即在细胞中仅短暂表达。该术语包括仅含有重组核酸转录所需最少元件的重组表达盒。
为实现重组蛋白表达，要求本发明核酸可操作地连接于转录或翻译控制元件，例如转录和翻译引发序列，、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列和用于将DNA转录成RNA的其他序列。在重组核酸分子和载体的结构中，启动子可操作地连接一个或多个本发明的核酸分子，以介导所需核酸在细胞或组织的所有类型或亚类中的表达。“启动子”定义为介导核酸转录的核酸阵列。如本文所用，启动子包括阵列开始位置附近的必需核酸序列，例如对于聚合酶II型启动子来说是TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻抑物元件，它们可离开阵列开始位置差不多几千个碱基对的距离。在具体实施方式中，采用组成型或诱导型启动子。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。组成型启动子的例子包括但不限于：P-肌动蛋白启动子和CMV启动子、“诱导型”启动子是在环境或发育调节中具有活性的启动子。诱导型启动子的例子包括但不限于：人c-fos启动子、类固醇诱导型启动子如糖皮质激素-诱导型启动子和小分子诱导型启动子如四环素调节的启动子。术语“可操作地连接”表示核酸表达控制序列(例如启动子，或转录因子结合位置的阵列)与第二核酸分子之间的功能性连接，其中表达控制序列介导对应于第二序列的核酸的转录。
根据本发明的一些实施方式，将编码GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串联引入一个表达载体中，用于在宿主细胞中以单独蛋白质的形式表达。在其它实施方式中，将编码GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子各自引入不同的表达载体中，用于在宿主细胞共表达。在另一些实施方式中，采用编码GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子的各种组合的两个表达载体(例如，一个表达载体包含GPR84和Gqi9核酸，另一个表达载体包含CD36核酸)。此外，还考虑本发明蛋白质可以融合蛋白的形式表达，例如GPR84-Gqi9融合蛋白。
将编码GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串联引入表达载体，用于在宿主细胞中共表达单独的蛋白质的情况下，一些实施方式包括使用一种用于调节所有三种蛋白质的表达的启动子。这样，编码G2R84、CD36和Gqi9的核酸分子相互间被内部核糖体进入位点(IRES)隔离。IRES元件已知来自病毒和哺乳动物基因(Martinez-Salas(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10：458-64)，并且也已在小合成寡核苷酸的筛选中鉴别(Vankatesan和Dasgupta(2001)Mol.Cell.Biol.21：2826-37)。已详细分析来自脑心肌炎病毒的IRES(Mizuguchi等，(2000)Mol.Ther.1：376-82)。IRES是导致转录的RNA中真核核糖体可结合并启动翻译的结构的DNA中的编码元件。IRES能够从单个RNA分子产生两种或更多种蛋白质(第一种蛋白质是5’-端封端结构处结合RNA的核糖体的翻译得到的，(Martinez-Salas(1999)同上)。
或者，其他实施方式包括将编码GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串联引入一个表达载体中，其中各个蛋白质的编码序列具有其各自的调节序列。这样，本发明的具体实施方式包括顺序含有以下序列的核酸分子：启动子1→CD36编码序列→多聚腺苷酸信号→启动子2→Gai9编码序列→多聚腺苷酸信号→启动子3→GPR84编码序列→多聚腺苷酸信号，其中启动子1-3可相同或不同，或者诱导型或组成型。
将表达载体，用于共表达GPR84、CD36或Gqi9蛋白的单独的表达载体，或者含有编码GPR84、CD36和Gqi9蛋白的核酸的一个表达载体引入宿主细胞基因组中或引入胞质或细胞核中，通过科技文献和专利文献领域所公知的各种常规技术进行表达。例如参见，Roberts，(1987)Nature 328：731；和Sambrook编，(1989)同上)。来自生物试剂和实验设备生产商的产品信息也提供了关于已知的生物方法的信息。载体可从天然来源分离，从诸如ATCC或GENBANK文库等来源获得，或者通过合成或重组方法制备。
本发明的核酸可以在细胞中稳定或短暂维持的表达盒或载体(包括质粒和病毒)中表达(例如游离型表达系统)。可将选择标记物引入表达盒和载体中，以赋予转化细胞和序列以可选择的表型。例如，选择标记物可编码游离型维持与复制，从而不再要求整合到宿主基因组中。例如，标记物可编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(如，氯磺隆(chlorosulfuron))以实现用所需DNA序列转化的那些细胞的选择(参见例如，Blondelat-Rouault(1997)，Gene 190：315-317；Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281：992-997)。
本发明范围内还包括用于共表达本发明蛋白质的重组宿主细胞。据称本发明的蛋白质“共表达”，因为用编码GPR84、CD36或Gqi9蛋白的核酸转染时，宿主细胞转录和翻译GPR84、CD36或Gqi9蛋白。“宿主细胞”表示包含表达载体并且支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母，昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。
如上所述，宿主细胞可以是哺乳动物或非哺乳动物细胞，优选哺乳动物宿主细胞。
可使用将本发明表达载体引入宿主细胞的任何公知的方法。这些方法包括：利用磷酸钙转染、凝聚胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、等离子体载体，病毒载体以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传物质引入宿主细胞的任何其他公知方法(参见例如，Sambrook等，同上)。将表达载体引入宿主细胞之后，在有利于本发明蛋白质的表达的条件下培养经转染的细胞。共表达来自一个或多个表达载体的GPR84、CD36或Gqi9蛋白的本发明的宿主细胞可用于分析脂肪酸转运和感应饮食脂质以及鉴别调节GPR84活性的试剂的方法中。
因此，本发明也提供了筛选GPR84活性调节剂的方法，例如活化剂、抑制剂、刺激剂、增强剂、激动剂和拮抗剂。这些GPR84活性的调节剂可用于味觉信号转导途径的药理学、化学和遗传调节。这些筛选方法可用于鉴别味细胞活性的高亲和力激动剂和拮抗剂。这些调节性化合物可以在食品和药品工业中用于定制味道，例如调节食品的味道。
GPR84活性的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”可互换使用，表示用本发明试验鉴别的抑制性、活化性或调节性分子。抑制剂是例如结合，部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟活化、灭活、脱敏或下调GPR84活性的化合物，例如拮抗剂。活化剂是例如结合、刺激、提高、打开、活化、促进、增强活化、致敏、或上调GPR84活性的化合物，例如激动剂。调节剂也包括例如改变受体与结合活化剂或抑制剂、G蛋白或激酶的胞外蛋白间相互作用的化合物。抑制剂或活化剂的试验包括例如，在细胞或细胞膜中表达GPR84、CD36和Gqi9，施加假定的调节剂化合物，然后测定对味觉转导的功能性影响。将对潜在的活化剂、抑制剂或调节剂的试验结果与没有抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品进行比较，以检查GPR84活性的调节程度。将对照样品(未用调节剂处理)的相对GPR84活性值设定为100％。当GPR84活性值相对于对照约为80％，任选地50％或25-0％时，实现GPR84的抑制。当GPR84活性值相对于对照为110％，任选地150％，任选地200-500％，或1000-3000％时，实现GPR84的活化。
因此，本发明提供了检测和表征味觉调节的试验，其中使用GPR84作为报告分子以确定调节剂对脂肪酸味觉转导的功能性影响。试验内容中调节GPR84活性的测试化合物的“功能性影响”包括间接或直接地受到受体影响，例如功能、物理和化学影响的任何参数的确认。包括配体结合、离子流的改变、膜电位、电流量、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如，cAMP、cGMP、1P3或胞内Ca2+)。
试验内容中“确定功能性影响”表示在GPR84的影响，例如功能、物理和化学影响下，间接或直接地增加或降低参数的化合物的试验。这些功能性影响可通过本领域技术人员已知的任何方式进行测定，例如分光光度特征的改变(例如荧光、吸收度、折射率)、流体动力学特征(例如，形状)、色谱特征或溶解度特性；膜片钳；压敏染料；全细胞电流；放射性同位素通量；诱导型标记物；配体结合试验；电压、膜地位和导电性改变；离子流试验；胞内第二信使如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3)的改变；胞内钙水平的改变；等等。
味觉受体结合促味剂并启动化学刺激向电信号的转导。活化或抑制的G蛋白质将改变目标酶、通道和其他效应蛋白的性质。一些例子是视觉系统中转运蛋白导致的cGMP磷酸二酯酶的活化，刺激性G蛋白导致的腺苷酸环化酶的活化，Gq和其他关联G蛋白导致的磷脂酶C的活性，以及Gi和其他G蛋白导致的各种通道的调节。也可由磷脂酶C导致的二酰甘油和IP3的产生，IP3导致的钙运动来检查下游结果。因此，在一个实施方式中，通过检测宿主细胞中FURA-2-依赖性荧光监测胞内钙的变化来检测GPR84的活化。
活化的GPCR受体成为将受体C端尾部(以及可能的其他位点)磷酸化的激酶的底物。因此，活化剂可促进32P从γ标记的GTP转移到受体，可用闪烁计数器进行分析。C端尾部的磷酸化将促进抑制蛋白(arrestin)样蛋白质的结合并干扰与G蛋白质的结合。激酶/抑制蛋白途径在许多GPCR受体的脱敏过程中起关键作用。例如，调节味觉受体持续时间的化合物保持活性可用作延长所需味道或切断令人不快味道的方式。GPCR信号转导的一般综述以及分析信号转导的方法可参见例如，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第237和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等，(1991)Nature 10：349：117-27；Boume等，(1990)Nature 348：125-32；Pitcher等，(1998)Annu.Rev.Biochem.67：653-92。
如上所述，可进行离子流分析以确定化合物是否能够调节GPR84活性。离子流的变化可通过测定表达GPR84蛋白的细胞或膜的离子极化(即电位)来评价。测定细胞极化变化的一种方式是用压片钳和膜片钳技术测量电流变化(从而测量极化的改变)(参见例如，Ackerman等，(1997)New Engl.J Med.30336：1575-1595)。采用表征方法可方便地测定全细胞电流。其他已知的试验包括：放射性标记的离子流试验和利用压敏染料的荧光试验(参见例如，Vestergarrd-Bogind等，(1988)J.Membrane Biol.88：67-75；Gonzales & Tsien(1997)Chem.Biol.4：269-277；Daniel等，(1991)J.Pharmacol.Meth.25：185-193；Holevinsky等，(1994)J.Membrane Biology 137：59-70)。一般来说，待测化合物的浓度在从1pM到100mM的范围内。
测试化合物对GPR84功能的影响可通过检查上述任一种参数来测定。影响GPCR活性的任何合适的生理学变化可用于评价测试化合物对GPR84的影响。用完整细胞或动物测定功能结果时，也可测量诸如递质释放、激素释放、已知和未表征遗传标记物的转录变化(northern印迹)、细胞代谢改变(例如细胞生长或pH变化)、胞内第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的变化等各种影响。
GPCR的优选试验包括负载离子或压敏染料以报告受体活性的细胞。测定这种受体活性的试验也可采用其他G蛋白偶联受体的已知激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照以评价测试化合物的活性。在鉴别调节性化合物(例如激动剂、拮抗剂)的试验中，使用离子敏感或膜电压荧光指示剂分别检测胞质中离子水平或膜电压的变化。可使用的离子敏感指示剂和电压探针包括在分子探针(Molecular Probes)1997目录中列出的那些。
其他试验包括测定受体活性，当受体活化时，通过激活或抑制诸如腺苷酸环化酶之类的酶，可导致胞内环状核苷酸如cAMP或cGMP的水平发生变化。存在环状核苷酸门控离子通道，例如杆状感光细胞通道和嗅神经元通道，cAMP或cGMP结合后阳离子可渗透(例如参见，Altenhofan等，(1991)Proc.Natl Aced.Sci.USA 88：9868-9872和Dhallan等，(1990)Nature 347：184-187)。试验中，当受体活化导致环状核苷酸水平降低时，优选使细胞暴露于能够增加胞内环状核苷酸水平的试剂，例如福斯高林(forskolin)，然后在细胞中加入受体活化化合物。该类试验中的细胞可以是用环状核苷酸包围的(cyclic nucleotide-crated)离子通道编码DNA、GPCR磷酸酶和受体(例如，某些谷氨酸盐受体、蕈毒碱乙酰胆碱受体、多巴胺受体、5-羟色胺受体等)编码DNA共转染宿主细胞制备的，所述受体激活后可导致胞质中环状核苷酸水平改变。
此外，荧光标记的脂肪酸经CD36的摄取可用作活性标志。该试验可从分子装置公司(Molecular Devices)(加利福尼亚州桑尼维尔(Sunnyvale，CA))等来源商业获得，与FLIPR一起使用。
也可使用表达GPR84的非人动物进行受体分析。这种表达可用于确定测试化合物在体内是否能够特异性结合哺乳动物味觉跨膜受体多肽，该过程包括使测试化合物与用本发明核酸分子稳定或短暂转染的非人动物相接触，并通过测试化合物与受体多肽的特异性结合来确定动物对测试化合物是否有反应。
用本发明载体转染或感染的动物尤其适用于鉴别和表征能够结合特定或一组受体的促味剂/配体的试验。这些表达人化学感应受体序列的载体感染的动物可用于促味剂的体内筛选及其对细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或对行为的影响。
感染/表达核酸和载体的方法是本领域公知的。通过许多方式可测定各种单细胞、器官或整个动物的参数。通过递送感染试剂，例如腺病毒表达载体，本发明核酸分子例如可以在动物味觉组织中表达。
检测为GPR84调节剂的化合物可以是任何小分子化学物质或生物实体，例如蛋白质、核酸或脂质。通常，测试化合物是小化学分子和肽。本发明的试验中基本上任何化学物质都可用作潜在的调节剂或配体，虽然常常使用溶于水性或有机(尤其是基于DMASO的)溶液的化合物。将设计试验成筛选大型化学物质文库，该过程包括自动进行试验步骤并由任何方便来源向试验提供化合物，通常平行进行(例如，在机器试验中在微量滴定板上采取微量滴定模式)。应理解，存在许多化合物的供应商，包括西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))，阿尔德里奇公司(Aldrich)(密苏里州圣路易斯)，西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)，FCBA公司(FlukaChemika-Biochemica Analytika)(瑞士布咨(Buchs，Switzerland))等。
在一个优选的实施方式中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在治疗化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后在如上所述的一种或多种试验中筛选这些文库，以鉴别那些具有所需特征性活性的文库成员(具体的化学类型或亚类)。所鉴别的化合物可用作常规的“先导化合物”或者其本身可用作潜在的或实际的治疗剂。根据本发明鉴别的GPR84调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或其成分中，从而以所需方式调节产品、组合物、成分的味道。

Claims (7)

1.一种编码CD36、Gqi9和G蛋白偶联受体84(GPR84)蛋白的分离的核酸分子。
2.包含如权利要求1所述的核酸分子的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述CD36、Gqi9和GPR84的表达为诱导型。
4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述CD36、Gqi9和GPR84的表达为组成型。
5.一种共表达CD36、Gqi9和GPR84蛋白的分离的重组宿主细胞。
6.一种鉴别GPR84调节剂的方法，所述方法包括使如权利要求5所述的重组宿主细胞与测试化合物相接触，并测定所述测试化合物对GPR84活性的功能性影响，从而鉴别GPR84的调节剂。
7.通过权利要求6所述方法鉴别的GPR84的调节剂。
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