JP2003510037A - Ｔ２ｒ、すなわち味覚受容体の新規ファミリー - Google Patents

Ｔ２ｒ、すなわち味覚受容体の新規ファミリー

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体の新規ファミリーについての核酸及びアミノ酸配列、そのような受容体に対する抗体、そのような核酸及び受容体を検出するための方法、及び味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体のモジュレーターについてのスクリーニング方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景： 本発明は、味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体の単離された核酸及びア
ミノ酸配列、そのような受容体に対する抗体、そのような核酸及び受容体を検出
するための方法、及び味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体のモジュレータ
ーについてのスクリーニング方法を提供する。
【０００２】 発明の背景： 味覚伝達（taste transduction）は、動物における化学的伝達（chemotransdu
ction）の最も洗練された形の１つである（例えば、Margolskee, BioEssays 15:
645-650 (1993); Avenet & Lindemann, J. Membrane Biol. 112: 1-8 (1989)
を参照のこと）。味蕾（gustatory）シグナルは、単純な後生物亜界（metazoans
）〜最も複雑な脊椎動物の動物界を通して見出され；その主要目的は、非揮発性
リガンドに対する信頼できるシグナル応答を提供することである。それらのモダ
リティーの個々は、受容体細胞脱分極、受容体又は作用可能性の生成、及び味蕾
求心性ニューロンシナプスでの神経伝達物質の開放を導く、受容体又はチャネル
により介在される明確なシグナル経路により介在されると思われる（例えば、Ro
per. Ann. Rev. Neurosci. 12: 329-353 (1989) を参照のこと。
【０００３】 物質は、５種の基本的な味覚成分、すなわち甘味、苦味、すっぱ味、塩味及び
うま味（グルタミン酸一ナトリウムの味覚）を有すると思われる（例えば、Kawa
mura & Kare, Introduction to Umami: A Basic Taste (1987); Kinnamon & Cum
mings, Ann. Rev. Physiol. 54: 715-731 (1992); Lindemann, Physiol. Rev. 7
6: 718-766 (1996); Stewartなど．，Am. J. Physiol. 272:1-26 (1997) を参照
のこと）。
【０００４】 ヒトにおける広範囲な精神物理学的研究は、舌の異なった領域が異なった味蕾
優先を示すことを報告している（例えば、Hoffmann, Menchen. Arch. Path. Ana
t. Physiol. 62:516-530 (1875); Bradleyなど., Anatomical Record 212: 246-
249 (1985); Miller & Reedy, physiol. Behav. 47: 1213-1219 (1990) を参照
のこと）。また、動物における多くの生理学的研究は、味覚受容体細胞が異なっ
た味覚体に選択的に応答することを示している（例えば、Akabasなど., Science
242: 1047-1050 (1988); Gilbertsonなど., J. Gen. Physiol. 100: 803-24 (1
992); Bernhardtなど., J. Physiol. 490: 325-336 (1996); Cummings など., J
. Neurophysiol. 75: 1256-1263 (1996) を参照のこと）。
【０００５】 哺乳類においては、味覚受容体細胞は、舌上皮における異なった乳頭中に分布
される味覚芽中に集中される。舌の最後部で見出される有郭乳頭は、100（マウ
ス）〜1000（ヒト）の味覚芽を含み、そして特に、苦み物質に対して敏感である
。舌の後側部縁に位置する葉状乳頭は、数ダース〜数百の味覚芽を含み、そして
すっぱ味及び苦味物質に対して敏感である。単一又は数個の味覚芽を含む真菌状
乳頭は、舌の前部で存在し、そして甘味味覚モダリティーを介在すると思われる
。
【０００６】 個々の味覚芽は、種に依存して、50〜150個の細胞、例えば前駆体細胞、支持
細胞及び味覚受容体細胞を含む（例えば、Lindemann, Physiol. Rev. 76: 716-7
66 (1996)を参照のこと）。受容体細胞は、脳幹及び視床においてシナップスを
通して皮質の味覚中心に情報を伝達する求心神経末端によりそれらの基部で神経
支配される。味覚細胞シグナル及び情報処理の機構の解明は、味覚の感覚の機能
、調節及び“味覚”を理解するために決定的である。
【０００７】 味覚細胞機能の神経物理学及び生理学について多くが知られているが、それら
の感覚シグナル受容体を介在する分子及び経路についてはほとんど知られていな
い（Gilbertson，Current Opin. Neurobiol. 3: 532-539 (1993) により再考さ
れる）。電気生理学的研究は、すっぱ味及び塩味味覚体が細胞の先端表面上の特
定の膜チャンネルを通してのH+及びNa+インオンの直接的な侵入により味覚細胞
機能を調節することを示唆する。すっぱ味化合物の場合、味覚細胞脱分極が、K+ チャネルのH+遮断（例えば、kinnamon など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85
: 7023-7027 (1988) を参照のこと）又はpH−感受性チャネルの活性化（例えば
、Gilbertsonなど., J. Gen. Physiol. 100: 803-24 (1992) を参照のこと）に
起因することが仮定され；塩伝達がアミロライド−感受性Na+チャネルを通して
のNa+の侵入により一部介在される（例えば、Heckなど．，Science23：403−405
（1984）；Brandなど., Brain Res. 207-214 (1955); Avenet など., Nature 33
1: 351-354 (1988)を参照のこと）。
【０００８】 甘味、苦味及びうま味伝達は、G−タンパク質−結合受容体（GPCR）シグナル
経路により介在されると思われる（例えば、Striemなど., Biochem. J. 260: 12
1-126 (1989); Bhaudrariなど., J. Neuros. 16: 3817-3826 (1996); Wong など
., Nature 381:796-800 (1996) を参照のこと）。混乱なことには、GPCRカスケ
ートのためのエフェクター酵素（例えば、Gタンパク質サブユニット、cGMPホス
ホジエステラーゼ、ホスホリパーゼC、アルデヒドシクラーゼ；例えば、Kinnamo
n & Margolskee, Curr. Opin. Newobiol. 6: 506-513 (1996) を参照のこと）が
存在するので、甘味及び苦味伝達のためのシグナル経路の多くのモデルが存在す
る。
【０００９】 しかしながら、味覚伝達に包含される特定の膜受容体、又は個々の味覚伝達経
路により活性化される多くの個々の細胞内シグナル分子についてはほとんど知ら
れていない。そのような分子の同定は、苦味アンタゴニスト、甘味アゴニスト及
び味覚の他のモジュレーターについての多くの薬理学的及び食品産業用途のため
に重要である。
【００１０】 同定されている１つの味覚−細胞特異的Gタンパク質は、ガスデュシン（Gustd
ucin）と呼ばれる（Mclaughinなど．，Nature 357: 563-569 (1992) を参照のこ
と）。このタンパク質は、ガスデュシン ノックアウトマウスはいくつかの甘味
及び苦味体に対する低められた感度を示すので（Wongなど．，Nature 381: 786-
800 (1996)）、そしてガスデュシンは多くの型の味覚乳頭の有意なサブセットの
細胞において発現されるので（McLaughinなど., Nature 357:563-569 (1992)）
、一定の甘味味覚の検出に包含されることが提案されている。さらに、ガスデュ
シンは、たぶん苦味受容体の活性化を通して、苦味化合物により味覚膜を刺激す
ることによって活性化され得る（Mingなど., PNAS96: 8933-8938 (1998)）。
【００１１】 最近、２種の新規GPCRが同定され、そして味覚細胞において特異的に発現され
ることが見出されている。TR1及びRT2と呼ばれるそれらの受容体タンパク質は、
味覚受容に直接的に関与すると思われるが（Hoonなど., Cell96: 541-551 (1999
)）、それらは単に、哺乳類味覚受容体細胞の画分において発現される。例えば
、いずれの遺伝子も、ガスデュシン−発現細胞において集中的に発現されない。
従って、追加の味覚関与のGPCRの発見が残存することが明白である。
【００１２】 哺乳類における遺伝子研究は、味覚の検出に関与する多くの遺伝子座を同定し
た。例えば、精神物理学的味覚研究は、ヒトが苦味物質PROP（６−ｎ−プロピル
チオウラシル）に対して味覚体、非味覚体及び超−味覚体として分離され得、そ
してPROP味覚が1つの優性対立遺伝子により付与され、そして非味覚体が2種の劣
性対立遺伝子を有し、そして味覚体が少なくとも1つの優性対立遺伝子を有する
ことを示している（Bartoshukなど., Physiol. Behav. 56 (6): 1165-71; 58: 2
03-204 (1994) を参照のこと）。最近、PROP味覚に関与する遺伝子座がヒト5p15
にマッピングされている（Reedなど., Am. J. Hum. Genet., 64 (5): 14780-80
(1999)）。しかしながら、5p15遺伝子座に存在するPROP味覚遺伝子はこれまでに
記載されている。
【００１３】 さらに、味覚に関与する多くの遺伝子がマウスにおいてマッピングされている
。例えば、苦味−味覚検出に関与する遺伝子クラスターが、マウスにおける染色
体６の領域にマッピングされている（Lushなど., Genet. Res. 66: 167-174 (19
95)）。
【００１４】 新規味覚受容体及び味覚シグナル分子の同定及び単離は、味覚伝達経路の薬理
学的及び遺伝子的調節の新規方法を可能にする。例えば、受容体及びチャネル分
子の利用は、味覚細胞活性の高い親和性アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニ
スト、及びモジュレーターについてのスクリーニングを可能にする。そのような
味覚調節化合物は、味覚を商品化するために医薬及び食品産業において有用であ
る。さらに、そのような味覚細胞特異的分子は、舌の味覚細胞と脳の味覚中枢に
導く味覚感覚ニューロンとの間で関係を解明する味覚局所解剖地図の生成におい
て非常に価値ある手段として作用することができる。
【００１５】 発明の要約： 本発明は、味覚−細胞特異的G−タンパク質結合受容体のファミリーをコード
する新規核酸を提供する。それらの核酸及びそれらがコードするポリペプチドは
、G−タンパク質味覚受容体の“T2R”ファミリーとして言及される。それらの受
容体はまた、G−タンパク質結合味覚受容体の“SF”ファミリーとしても言及さ
れる。GPCRのこの新規ファミリーは、味覚伝達経路の成分を包含する。特に、こ
のファミリーのメンバーは、苦味味覚の検出に包含される。
【００１６】 １つの観点において、本発明は、味覚細胞における味覚シグナルを調節する化
合物を同定するための方法提供し、ここで前記方法は、（ｉ）配列番号166, 配
列番号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170及び配列番号171から成る
群から選択された配列に対して50％以上のアミノ酸同一性を有する、味覚伝達G
−タンパク質結合受容体ポリペプチドと前記化合物とを接触せしめ；そして（ii
）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能的効果を決定する段階を含んで成
る。
【００１７】 もう１つの観点においては、本発明は、味覚細胞における味覚シグナルを調節
する化合物を同定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）配列番号
1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13,
配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24,
配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35,
配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46,
配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53,
配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62,
配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69,
配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75,
配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79,
【００１８】 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91
, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号1
03, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配
列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号1
25, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配
列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号1
47, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配
列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対
して60％以上のアミノ酸配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容
体ポリペプチドと前記化合物とを接触せしめ；そして（ii）前記ポリペプチドに
対する前記化合物の機能的効果を決定する段階を含んで。
【００１９】 もう１つの観点においては、本発明は、味覚細胞における味覚シグナルを調節
する化合物を同定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）配列番号
1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13,
配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24,
配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35,
配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46,
配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53,
配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62,
配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69,
配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75,
配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85
, 配列番号87, 配列番号89,
【００２０】 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号10
1, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列
番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123
, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列
番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145
, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列
番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択され
た配列を含んで成るポリペプチドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域
に対して60％以上のアミノ酸配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合
受容体の細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域を含んで成るポリペプチド
と前記化合物とを接触せしめ；そして（ii）前記ポリペプチドに対する前記化合
物の機能的効果を決定する段階を含んで成る。
【００２１】 １つの態様においては、前記ポリペプチドは、G−タンパク質結合受容体活性
を有する。もう１つの態様においては、前記機能的効果は、化学的効果である。
もう１つの態様においては、前記機能的効果は、物理的効果である。もう１つの
態様においては、前記機能的効果は、前記ポリペプチドの細胞外ドメイン又はト
ランスメンブラン領域への前記化合物の結合性を測定することによって決定され
る。もう１つの態様においては、前記機能的効果は、前記ポリペプチドへの放射
性ラベルされたGTPの結合性を測定することによって決定される。
【００２２】 もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、組換え体である。もう１つ
の態様においては、ポリペプチドは、細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領
域、又はキメラポリペプチドを形成する異種ポリペプチドに共有結合される細胞
外ドメイン及びトランスメンブラン領域の組み合わせを含んで成る。もう1つの
態様においては、ポリペプチドは、固相に共有又は非共有結合される。もう1つ
の態様においては、ポリペプチドは、ラット、マウス又はヒトからである。
【００２３】 もう１つの態様においては、ポリペプチドは細胞又は細胞膜において発現され
る。もう１つの態様においては、細胞は真核細胞である。もう１つの態様におい
ては、前記機能的効果は、前記ポリペプチドを発現する細胞の電気活性の変化を
決定することによって測定される。もう１つの態様においては、ポリペプチドに
対する化合物の機能的効果は、ポリペプチドを発現する細胞における細胞内cAMP
, cGMP, IP3又はCa2+の変化を測定することによって決定される。もう１つの態
様においては、細胞内Ca2+の変化は、細胞におけるFURA-2依存性蛍光の変化を検
出することによって検出される。もう１つの態様においては、前記細胞は、真核
細胞である。もう１つの態様においては、前記細胞は、HEK−283細胞である。
【００２４】 もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、ロドプシンタンパク質の少
なくとも約20個の連続したN−末端アミノ酸を含んで成る融合タンパク質である
。もう１つの態様においては、前記ロドプシンタンパク質はウシロドプシンであ
る。もう１つの態様においては、前記細胞は、Gα15を含んで成る。もう1つの態
様においては、ポリペプチドは細胞において発現され、そして前記ポリペプチド
が、苦味味覚剤の存在下で前記化合物と接触せしめられ、ここで前記化合物の存
在下で細胞に対する前記苦味味覚剤の機能的効果及び前記化合物の不在下で細胞
に対する前記苦味味覚剤の機能的効果の差異が、前記化合物が味覚細胞における
味覚シグナルを調節できることを示す。
【００２５】 もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号1, 配列番号3, 配
列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配
列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配
列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配
列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配
列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配
列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配
列番号65, 配列番号66,
【００２６】 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72
, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号7
9, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号9
1, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号
103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配
列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号1
25, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配
列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号1
47, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配
列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸
配列を含んで成る。
【００２７】 もう１つの態様においては、本発明は、配列番号166, 配列番号167, 配列番号
168, 配列番号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択された配列
に対して約50％以上のアミノ酸配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結
合受容体をコードする単離された核酸を提供する。 もう１つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体を
コードする単離された核酸を提供し、ここで前記核酸が、配列番号166, 配列番
号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群か
ら選択されたアミノ酸配列をコードする変性プライマー組と同じ配列に対して、
選択的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。
【００２８】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81
, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93
, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号
105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配
列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号1
27, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配
列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号1
49, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配
列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対して約60％以上
のアミノ配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする
単離された核酸を提供する。
【００２９】 もう１つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体を
コードする単離された核酸を提供し、ここで前記核酸は、配列番号78, 配列番号
80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号
92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番
号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番号114,
配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番
号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番号136,
配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番
号148, 配列番号150, 配列番号152,
【００３０】 配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列
番号163及び配列番号165から成る群から選択された配列を有する核酸に対して、
高い緊縮条件下で特異的にハイブリダイズするが、しかし配列番号2, 配列番号4
, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番号16,
配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番号29,
配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番号43,
配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61 及び配列番号6
3から成る群から選択された配列を有する核酸に対しては特異的にハイブリダイ
ズしない。
【００３１】 もう１つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体を
コードする単離された核酸を提供し、ここで前記受容体は、配列番号77, 配列番
号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番
号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列
番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113
, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列
番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135
, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列
番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158
, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドに対して約60％以上のアミノ酸配列同一性を有し
、
【００３２】 ここで前記核酸が、配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列
番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列
番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108,
配列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番
号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130,
配列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番
号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152,
配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番
号163及び配列番号165から成る群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸
に対して、
【００３３】 中位の緊縮条件下で選択的にハイブリダイズするが、しかし配列番号2, 配列
番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番
号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番
号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番
号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61 及び配
列番号63から成る群から選択されたヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列
に対して中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件下で選択にハイブリダイズする
。
【００３４】 もう１つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体の
細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域、又はその組み合わせをコードする
単離された核酸を提供し、ここで前記細胞ドメイン又はトランスメンブラン領域
は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号
87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号
99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配
列番号111, 配列番号113, 配列番号115,
【００３５】 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列
番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137
, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列
番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160
, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を含ん
で成るポリペプチドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域に対して約60
％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３６】 1つの態様においては、前記核酸は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81,
配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93,
配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号10
5, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列
番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127
, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列
番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149
, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列
番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合するが、
【００３７】 しかし配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番
号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番
号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番
号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番
号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番
号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番
号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番
号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番
号74, 配列番号75及び 配列番号 76から成る群から選択されたアミノ酸配列を有
するポリペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結
合しない受容体をコードする。
【００３８】 もう１つの態様のおいては、前記核酸は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号
81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号
93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番
号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115,
配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番
号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137,
配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番
号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160,
配列番号162, 配列番号164, 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番
号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ酸配列を
含んで成る受容体をコードする。
【００３９】 もう１つの態様においては、前記核酸が、配列番号78, 配列番号80, 配列番号
82, 配列番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号
94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列
番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116
, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列
番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138
, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列
番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159
, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群から選択されたヌクレ
オチド配列を含んで成る。 もう１つの態様のいては、核酸は、G−タンパク質結合受容体活性を有する受
容体をコードする。もう１つの態様においては、核酸はラット又はマウスからで
ある。
【００４０】 もう1つの態様においては、核酸は、キメラポリペプチドを形成する異種ポリ
ペプチドに結合される細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域をコードする
。もう1つの態様においては、前記核酸は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号8
1, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号9
3, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番
号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115,
配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番
号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137,
配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番
号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160,
配列番号162, 配列番号164, 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番
号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ酸配列を
含んで成るポリペプチドの細胞外ドメインをコードする。
【００４１】 もう１つの観点においては、本発明は上記核酸のいずれかを含んで成る発現ベ
クターを提供する。もう1つの観点においては、本発明は前記発現ベクターを含
んで成る単離された細胞を提供する。 もう1つの観点においては、本発明は、配列番号166, 配列番号167, 配列番号1
68, 配列番号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択された配列
に対して約50％以上のアミノ酸配列同一性を有する、単離された味覚伝達G−タ
ンパク質結合受容体を提供する。
【００４２】 もう1つの観点においては、本発明は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81,
配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93,
配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号1
05, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配
列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号1
27, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配
列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号1
49, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配
列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対して約60％以上
のアミノ配列同一性を含んで成る、単離された味覚伝達G−タンパク質結合受容
体を提供する。
【００４３】 もう1つの態様においては、前記受容体は、配列番号77, 配列番号79, 配列番
号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番
号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列
番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115
, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列
番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137
, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列
番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160
, 配列番号162, 配列番号164, 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列
番号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ酸配列
を含んで成る。
【００４４】 もう1つの態様においては、前記受容体は、配列番号77, 配列番号79, 配列番
号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番
号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列
番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115
, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列
番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137
, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列
番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160
, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を有す
るポリペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合す
るが、
【００４５】 しかし配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番
号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番
号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番
号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番
号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番
号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番
号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番
号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番
号74, 配列番号75及び 配列番号 76から成る群から選択されたアミノ酸配列を有
するポリペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結
合しない。もう1つの態様においては、前記受容体は、G−タンパク質結合受容体
活性を有する。もう１つの態様においては、前記受容体はラット又はマウスから
である。
【００４６】 もう1つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体の細
胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域、又はその組み合わせを含んで成る単
離されたポリペプチドを提供し、ここで前記細胞ドメイン又はトランスメンブラ
ン領域は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配
列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配
列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号10
9, 配列番号111, 配列番号113,
【００４７】 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列
番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135
, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列
番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158
, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミ
ノ酸配列を含んで成るポリペプチドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領
域に対して約60％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４８】 １つの態様においては、ポリペプチドは、配列番号77, 配列番号79, 配列番号
81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号
93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番
号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115,
配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番
号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137,
配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番
号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160,
配列番号162, 配列番号164, 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番
号169, 配列番号170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ酸配列を
含んで成るポリペプチドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域をコード
する。もう１つの態様においては、前記細胞外ドメイン又はトランスメンブラン
領域は、キメラポリペプチドを形成する異種ポリペプチドに共有結合される。
【００４９】 1つの観点においては、本発明は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配
列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配
列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対して約60％以上のア
ミノ酸配列同一性を有する受容体に選択的に結合する抗体を提供する。
【００５０】 もう1つの観点においては、本発明は、味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコ
ードする核酸を含んで成る発現ベクターを提供し、ここで前記受容体は味覚細胞
において発現され、前記受容体は、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対して約60％以上のア
ミノ酸配列同一性を有する。
【００５１】 もう１つの観点においては、本発明は発現ベクターによりトランスフェクトさ
れた宿主細胞を提供する。 もう１つの観点においては、本発明は、異種プロモーターに作用可能に結合さ
れる、ヒト味覚伝達Gタンパク質結合受容体をコードするポリヌクレオチド配列
を含んで成る発現カセットを提供し、ここで前記受容体が、配列番号1, 配列番
号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号
15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号
26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号
37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号
47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号
55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号
64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号
70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75及び 配列
番号 76から成る群から選択された配列に対して60％以上のアミノ酸同一性を有
するアミノ酸配列を含んで成る。
【００５２】 もう１つの態様においては、前記受容体は、前記ポリヌクレオチドが、配列番
号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号1
3, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号2
4, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号3
5, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号4
6, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号5
3, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号6
2, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号6
9, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号7
5及び 配列番号 76から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る受容体
をコードする請求項91記載の発現カセットから選択されたアミノ酸配列を含んで
成る。 もう1つの観点においては、本発明は、発現カッセイトを含んで成る単離され
た真核細胞を提供する。
【００５３】 発明の特定の記載： I.序説： 本発明は、味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体の新規ファミリーをコー
ドする核酸を提供する。それらの核酸及びそれらがコードする受容体は、味覚細
胞特異的Gタンパク質結合受容体の“T2R”ファミリーのメンバーとして言及され
る。それらの味覚細胞特異的GPCRは、味覚伝達経路、例えば苦味味覚伝達経路の
成分であり、そして物質、例えば苦味物質６−ｎ−プロピルチオウラシル（PROP
）、スクロースオクタアセテート（soa）、ラフィノースウンデカアセテート（r
oa）、シクロヘキシミド（cyx）、デナトニウム、銅グリシネート（Glb）及びキ
ニン（qui）の味覚検出に包含される。
【００５４】 それらの核酸は、味覚細胞において特異的に発現されるので、味覚細胞の同定
のために価値あるプローブを提供する。例えば、TR2ポリペプチド及びタンパク
質についてのプローブは、葉状、有郭及び真菌状乳頭に存在する味覚細胞、及び
喉頭蓋に存在する味覚細胞を同定するために使用され得る。特に、T2Rプローブ
は、苦味検出ガスデュシン発現味覚細胞を同定するために有用である。それらは
また、舌の味覚細胞と脳における味覚中枢に導く味覚感覚ニューロンとの間の関
係を解明する味覚トポグラフィー地図の生成のための手段としても作用する。さ
らに、核酸及びそれがコードするタンパク質は、味覚誘発された挙動性を切り離
すためのプローブとして使用され得る。
【００５５】 本発明はまた、それらの新規味覚細胞GPCRのモジュレーター、例えば活性化因
子、インヒビター、刺激体、エンハンサー、アゴニスト及びアンタゴニストにつ
いてのスクリーニング方法を提供する。そのような味覚伝達のモジュレーターは
、味覚シグナル経路の薬理学的及び遺伝子的調節のために有用である。それらの
スクリーニング方法は、味覚細胞活性の高い親和性アゴニスト及びアンタゴニス
トを同定するために使用され得る。次に、それらの調節化合物は、味覚を商品化
するために、例えば、食品又は薬剤の苦味味覚を低めるために、食品及び医薬産
業に使用され得る。従って、本発明は、味覚調節のためのアッセイを提供し、こ
こでT2Rファミリーのメンバーが、味覚伝達に対するモジュレーターの効果のた
めの直接的又は間接的レポーター分子として作用する。
【００５６】 GPCRは、例えば、リガンド結合、イオン濃度、膜電位、電流の流れ、イオン流
、転写、シグナル伝達、受容体−リガンド相互作用、第２メッセンジャー濃度を
、インビトロ、インビボ及びエクスビボで測定するために、アッセイにおいて使
用され得る。１つの態様においては、T2Rファミリーのメンバーは、第２レポー
ター分子、例えば緑色蛍光タンパク質への結合を通して、間接的なレポーターと
して作用することができる（例えば、Mistili & Spector, Nature Biotechnolog
y 15: 961-964 (1997) を参照のこと）。もう1つの態様においては、T2Rファミ
リーメンバーは、細胞において組換え的に発現され、そしてGPCR活性を通しての
味覚伝達の調節が、Ca2+レベル及び他の細胞内メッセージ、例えばcAMP, cAMP,
cGMP及びIP3の変化を測定することによってアッセイされる。
【００５７】 好ましい態様においては、T2Rポリペプチドは、分泌経路を通してその成熟及
び標的化を促進する異種の付随配列を有するキメラ受容体として真核細胞におい
て発現される。好ましい態様においては、異種配列は、ロドプシン配列、例えば
ロドプシンのN−末端フラグメントである。そのようなキメラT2R受容体は、いず
れかの真核細胞、例えばHEK−293細胞において発現され得る。好ましくは、細胞
は、細胞内シグナル経路、又はシグナルタンパク質、例えばホスホリパーゼCβ
にキメラ受容体を結合することができる、機能的Gタンパク質、例えばGα15を含
んで成る。そのような細胞におけるそのようなキメラ受容体の活性化は、いずれ
かの標準の方法を用いて、例えば細胞におけるFURA−２依存性蛍光を検出するこ
とにより細胞内カルシウムの変化を検出することにより検出され得る。
【００５８】 味覚伝達のモジュレーターをアッセイするための方法は、T2Rポリペプチド、
その一部、例えば細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域、又はその組み合
わせ、又はT2Rファミリーメンバーの１又は複数のドメインを含んで成るキメラ
タンパク質；卵母細胞又は組織培養細胞T2R遺伝子発現、又はT2Rフラグメント又
は融合タンパク質、例えばロドプシン融合タンパク質の発現；T2R遺伝子の転写
活性化；T2Rファミリーメンバーのリン酸化及び脱リン酸化；GPCRへのG−タンパ
ク質結合；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及び電導度変化；イオン流アッ
セイ；細胞内第２メッセンジャー、例えばcGMP, cAMP及びイノシトール三リン酸
の変化；細胞カルシウムレベルの変化；及び神経伝達物質開放の変化を用いての
インビトロリガンド結合アッセイを包含する。
【００５９】 最終的に、本発明は、味覚受容体細胞の味覚伝達調節及び特異的同定の調査を
可能にする、T2R核酸及びタンパク質発現を検出するための方法を提供する。T2R
ファミリーメンバーはまた、味覚受容体細胞、例えば、葉状、真菌状、有郭、及
び喉頭蓋味覚受容体細胞、特に、苦味−味覚受容、ガスデュシン発現細胞を同定
するための核酸プローブとして有用である。T2R受容体は、味覚受容体細胞を同
定するために有用なモノクローナル及びポリクローナル抗体を生成するために使
用され得る。味覚受容体細胞は、技法、例えば、mRNAの逆転写及び増幅、全RNA
又はポリA+ RNAの単離、ノザンブロット、ドットブロット、現場ハイブリダイ
ゼーション、RNアーゼ保護、S1消化、プロービングDNAマイクロチップアレイ、
ウェスターンブロット及び同様のものを用いて同定され得る。
【００６０】 T2R遺伝子は、関連する味覚細胞特異的G−タンパク質結合受容体の大きなファ
ミリーを含んで成る。そのゲノム内で、それらの遺伝子は、単独で又はいくつか
の遺伝子クラスターの１つ内に存在する。ヒトゲノム領域12p13に位置する１つ
の遺伝子クラスターは、少なくとも９個の遺伝子を含んで成り、そして7q31に位
置する第２クラスターは、少なくとも４個の遺伝子を含んで成る。合計すると、
50以上の異なったT2Rファミリーメンバー（例えば、いくつかの推定上の偽遺伝
子を包含する）が同定されている。ヒトゲノムは、40〜80もの多くの機能的ヒト
受容体をコードする、80〜120もの多くの異なったT2R遺伝子を含むことができる
。
【００６１】 T2R遺伝子のいくつかは、前にマッピングされた哺乳類味覚特異的遺伝子座に
関連している。例えば、ヒトT2R01は、正確には、物質PROPを味覚する能力下に
ある遺伝子座が前もってマッピングされているヒト間隔5p15に位置する。さらに
、ゲノム領域12p13に見出されるヒト遺伝子クラスターは、多くの苦味−味覚遺
伝子、例えばスクロースオクタアセテート、ルフィノースアセテート、シクロヘ
キシミド及びキニンを含むことが示されているマウス染色体６の領域に対応する
（例えば、Lushなど., Genet. Res. 6: 167-174 (1995) を参照のこと）。それ
らの関係は、T2R遺伝子が種々の物質、特に苦味物質の味覚検出に包含されるこ
とを示す。さらに、例７に示されるように、マウスT2R5はシクロヘキシミドに対
して特に受容性であり、そしてmT2R5遺伝子における突然変異がCyx表現型を生成
する。同様に、ヒトT2R4及びマウスT2R8は、デナトニウム及びPROPの両者に対し
て特に受容性である。
【００６２】 機能的には、T2R遺伝子は、味覚シグナル伝達に介在するためにG−タンパク質
と相互作用する、味覚伝達に包含される、関連する７種のトランスメンブランG
−タンパク質結合受容体のファミリーを含んで成る（例えば、Fong, Cell signa
l 8: 127 (1996); Baldwin, Curr. Opin Cell Biol. 6: 180 (1994) を参照のこ
と）。特に、T2RはGタンパク質ガスデュシンと、リガンド特異的態様で相互作用
する。
【００６３】 構造的には、T2Rファミリーメンバーのヌクレオチド配列（例えば、ラット、
マウス、及びヒトから単離された配列番号2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20
, 23, 25, 27, 29, 31, 34, 36, 38, 41, 43, 45, 52, 54, 57, 61, 63, 78, 80
, 82 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,
114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 14
2, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 163又は165）は、細
胞外ドメイン、７種のトランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインを含んで
成る関連するポリペプチドのファミリーをコードする。他の種からの関連するT2
Rファミリー遺伝子は、少なくとも約50個の長さのヌクレオチド、任意には100,
200, 500又はそれよりも長いヌクレオチドの領域にわたって、
【００６４】 配列番号配列番号2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 25, 27, 29, 31
, 34, 36, 38, 41, 43, 45, 52, 54, 57, 61, 63, 78, 80, 82 84, 86, 88, 90,
92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120,
122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 15
0, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 163又は165に対して、少なくとも約60％の
ヌクレオチド配列同一性を共有し、
【００６５】 又は少なくとも約25個の長さのアミノ酸、任意には50〜100個の長さのアミノ
酸領域にわたって、配列番号1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 24,
26, 28, 30, 32, 33, 35, 37, 39, 40, 42, 44, 46-51, 53, 55, 56, 58-60, 6
2, 64-77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107
, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 158, 160, 162又は164に
対して、少なくとも約60％のアミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードす
る。T2R遺伝子は、味覚細胞において特に発現される。
【００６６】 T2Rファミリーメンバーの特徴であるいくつかのコンセンサスアミノ酸配列又
はドメインがまた、同定されている。例えばT2Rファミリーメンバーは典型的に
は、配列番号166（例えば、配列番号１におけるアミノ酸位置16−35、及びT2Rト
ランスメンブラン領域１に対応する）、配列番号167（例えば、配列番号１にお
けるアミノ酸位置45−58、及びT2Rトランスメンブラン領域2に対応する）、配列
番号168（例えば、配列番号１におけるアミノ酸位置89−101、及びT2Rトランス
メンブラン領域3に対応する）、配列番号169（例えば、配列番号１におけるアミ
ノ酸位置102−119、及びT2Rトランスメンブラン領域3に対応する）、配列番号17
0（例えば、配列番号１におけるアミノ酸位置196−209、及びT2Rトランスメンブ
ラン領域5に対応する）、
【００６７】 又は配列番号1171（例えば、配列番号１におけるアミノ酸位置273−286、及び
T2Rトランスメンブラン領域7に対応する）に対して、少なくとも約50％、任意に
は、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％又はそれよりも高
い同一性を有する配列を含んで成る。従って、それらの保存されたドメインは、
％同一性、特異的ハイブリダイゼーション又は増幅、又はドメインに対して生じ
る抗体による特異的結合により、T2Rファミリーのメンバーを同定するために使
用され得る。
【００６８】 いくつかのT2R遺伝子は、お互い明らかなオルト体を表す。例えば、ヒトT2R01
（配列番号1, 2）、ラットT2R01（配列番号77, 78）及びマウスT2R19（配列番号
141, 142）は、明らかなオルト体である。さらに、ラットT2R08（配列番号91, 9
2）及びマウスT2R02（配列番号107, 108）は、アミノ酸配列レベルで約74％同一
であり、そしてヒトT2R13（配列番号24, 25）に対して、それぞれ少なくとも約5
0％同一である。ラットT2R03（配列番号81, 82）及びマウスT2R18（配列番号139
, 140）は、約92％同一であり、そしてヒトT2R116（配列番号30, 31）に対して
、それぞれ少なくとも約50％同一である。最後に、ヒトT2R04（配列番号7, 8）
及びマウスT2R08（配列番号119, 120）は、お互い、約67％同一である。
【００６９】 本発明はまた、本明細書に供給されるT2Rタンパク質の多形変異体も提供する
。例えば、配列番号77で示されるラットT2Rにおいては：アミノ酸位置７でのロ
イシン残基によりイソロイシン残基が置換されている変異体＃１；及びアミノ酸
位置20でのグリシン残基によりアラニン残基が置換されている変異体＃２が提供
される。 本発明はまた、配列番号79で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置２でのフェニルアラニン残基によりチロシン残基が置換されて
いる）；及び変異体＃２（アミノ酸位置62でのイソロイシン残基によりバリン残
基が置換されている）も提供する。
【００７０】 本発明はまた、配列番号81で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置179でのアスパラギン残基によりグルタミン残基が置換されて
いる）；及び変異体＃２（アミノ酸位置183でのメチオニン残基によりシステイ
ン残基が置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号83で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置４でのアラニン残基によりグリシン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置63でのイソロイシン残基によりロイシン残基が置
換されている）も提供する。
【００７１】 本発明はまた、配列番号85で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置56でのイソロイシン残基によりバリン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置57でのシステイン残基によりメチオニン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号87で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置４でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置５でのグリシン残基によりアラニン残基が置換
されている）も提供する。
【００７２】 本発明はまた、配列番号89で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置79でのグリシン残基によりアラニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置127でのリシン残基によりアルギニン残基が置換
されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号91で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置28でのバリン残基によりロイシン残基が置換されている）；及
び変異体＃２（アミノ酸位置80でのリシン残基によりアルギニン残基が置換され
ている）も提供する。
【００７３】 本発明はまた、配列番号93で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置75でのリシン残基によりアルギニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置251でのシステイン残基によりメチオニン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号95で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置48でのセリン残基によりトレオニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置49でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換
されている）も提供する。
【００７４】 本発明はまた、配列番号97で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置25でのアスパラギンサン残基によりグルタミン酸残基が置換さ
れている）；及び変異体＃２（アミノ酸位置100でのロイシン残基によりイソロ
イシン残基が置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号99で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置４でのトレオニン残基によりセリン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置74でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換
されている）も提供する。
【００７５】 本発明はまた、配列番号101で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置９でのグルタミン残基によりアスパラギン残基が置換されてい
る）；及び変異体＃２（アミノ酸位置18でのチロシン残基によりトリプトファン
残基が置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号103で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置26でのセリン残基によりトレオニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置８でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換
されている）も提供する。
【００７６】 本発明はまた、配列番号105で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置４でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置46でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号107で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置３でのセリン残基によりトレオニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置28でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換
されている）も提供する。
【００７７】 本発明はまた、配列番号109で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置26でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置50でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号111で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置4でのアラニン残基によりグリシン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置60でのトリプトファン残基によりフェニルアラニ
ン残基が置換されている）も提供する。
【００７８】 本発明はまた、配列番号113で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置62でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置244でのグリシン残基によりアラニン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号115で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置３でのトレオニン残基によりセリン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置123でのアルギニン残基によりリシン残基が置換
されている）も提供する。
【００７９】 本発明はまた、配列番号117で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置65でのグルタミン残基によりアスパラギン残基が置換されてい
る）；及び変異体＃２（アミノ酸位置68でのイソロイシン残基によりロイシン残
基が置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号119で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置２でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置４でのグルタミン酸残基によりアスパラギン
サン残基が置換されている）も提供する。
【００８０】 本発明はまた、配列番号121で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置16でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置46でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号123で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置９でのセリン残基によりトレオニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置14でのフェニルアラニン残基によりトリプトファ
ン残基が置換されている）も提供する。
【００８１】 本発明はまた、配列番号125で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置24でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置53でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号127で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置51でのトリプトファン残基によりフェニルアラニン残基が置換
されている）；及び変異体＃２（アミノ酸位置101でのリシン残基によりアルギ
ニン残基が置換されている）も提供する。
【００８２】 本発明はまた、配列番号129で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置４でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置52でのアラニン残基によりグリシン残基が置換
されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号131で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置150でのリシン残基によりアルギニン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置225でのバリン残基によりロイシン残基が置換
されている）も提供する。
【００８３】 本発明はまた、配列番号133で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置27でのイソロイシン残基によりロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置127でのアルギニン残基によりリシン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号135で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置102でのセリン残基によりトレオニン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置220でのアスパラギン酸残基によりグルタミン
酸残基が置換されている）も提供する。
【００８４】 本発明はまた、配列番号137で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置24でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置45でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号139で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置50でのイソロイシン残基によりロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置53でのグリシン残基によりアラニン残基が置
換されている）も提供する。
【００８５】 本発明はまた、配列番号141で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置76でのトレオニン残基によりセリン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置131でのロイシン残基によりイソロイシン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号143で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置98でのグリシン残基によりアラニン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置153でのトリプトファン残基によりフェニルアラ
ニン残基が置換されている）も提供する。
【００８６】 本発明はまた、配列番号145で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置８でのイソロイシン残基によりロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置100でのアラニン残基によりグリシン残基が
置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号147で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置52でのアラニン残基によりグリシン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置75でのロイシン残基によりバリン残基が置換され
ている）も提供する。
【００８７】 本発明はまた、配列番号149で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置44でのアルギニン残基によりリシン残基が置換されている）；
及び変異体＃２（アミノ酸位置49でのバリン残基によりロイシン残基が置換され
ている）も提供する。 本発明はまた、配列番号151で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置５でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置25でのグリシン残基によりアラニン残基が置
換されている）も提供する。
【００８８】 本発明はまた、配列番号153で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置７でのアスパラギン酸残基によりグルタミン酸残基が置換され
ている）；及び変異体＃２（アミノ酸位置60でのロイシン残基によりイソロイシ
ン残基が置換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号155で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置７でのバリン残基によりイソロイシン残基が置換されている）
；及び変異体＃２（アミノ酸位置23でのアラニン残基によりグリシン残基が置換
されている）も提供する。
【００８９】 本発明はまた、配列番号158で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置５でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置21でのグリシン残基によりアラニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号160で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置５でのバリン残基によりロイシン残基が置換されている）；及
び変異体＃２（アミノ酸位置23でのグリシン残基によりアラニン残基が置換され
ている）も提供する。
【００９０】 本発明はまた、配列番号162で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置22でのロイシン残基によりイソロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置34でのグリシン残基によりアラニン残基が置
換されている）も提供する。 本発明はまた、配列番号164で示されるT2Rタンパク質の多形変異体：変異体＃
１（アミノ酸位置49でのイソロイシン残基によりロイシン残基が置換されている
）；及び変異体＃２（アミノ酸位置76でのリシン残基によりアルギニン残基が置
換されている）も提供する。
【００９１】 T2Rヌクレオチド及びアミノ酸配列の特定領域が、TR2ファミリーメンバーの多
形変異体、種間相同体及び対立遺伝子を同定するために使用され得る。この同定
は、例えば緊縮ハイブリダイゼーション又はPCR（例えば、配列番号166−171を
コードするプライマーを用いる）及び配列決定下で、又は他のヌクレオチド配列
との比較のためにコンピューターシステムにおける配列情報を用いることによっ
て、インビトロで行われ得る。典型的には、T2Rファミリーの多形変異体及び対
立遺伝子の同定は、約25個又はそれ以上のアミノ酸、例えば50〜100個のアミノ
酸配列を比較することによって行われる。
【００９２】 少なくとも約60％又はそれ以上、任意には65％、70％、75％、80％、85％、又
は90−95％又はそれ以上のアミノ酸同一性は、典型的には、タンパク質がT2Rフ
ァミリーメンバーの多形変異体、種間相同体又は対立遺伝子であることを示す。
配列比較は、上記で論じられた配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて行われ
得る。T2Rポリペプチド又はその保存された領域に対して特異的に結合する抗体
はまた、対立遺伝子に、種間相同体及び多形変異体を同定するために使用され得
る。
【００９３】 T2R遺伝子の多形変異体、種間相同体及び対立遺伝子は、推定上のT2Rポリペプ
チドの味覚細胞特異的発現を試験することによって確かめられる。典型的には、
配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配
列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配
列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配
列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配
列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配
列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配
列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配
列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配
列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83,
配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95,
配列番号97, 配列番号99, 配列番号101,
【００９４】 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列
番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123
, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列
番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145
, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列
番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択され
たアミノ酸配列を有するT2Rポリペプチドは、T2Rファミリーメンバーの多形変異
体又は対立遺伝子の同定を示すために、推定上のT2Rタンパク質に比較して陽性
対照として使用される。多形変異体、対立遺伝子及び種間相同体は、G−タンパ
ク質結合受容体の７種のトランスメンブラン構造を保持することが予測される。
【００９５】 本発明はまた、苦味味覚体に応答性であるガスデュシン発現味覚細胞において
、ポリヌクレオチドの味覚細胞−特異的発現を駆動するために使用され得る、T2
Rプロモーターのためのヌクレオチド配列を提供する。 T2Rファミリーメンバーについてのヌクレオチド及びアミノ酸配列情報がまた
、コンピューターシステムにおいて味覚細胞特異的ポチペプチドのモデルを構成
するためにも使用され得る。続いて、それらのモデルは、T2R受容体タンパク質
を活性化し又は阻害することができる化合物を同定するために使用される。T2R
ファミリーマンバーの活性を調節するそのような化合物は、味覚伝達においてT2
R遺伝子の役割を調査するために使用され得る。
【００９６】 T2Rファミリーメンバーの単離は、G−タンパク質結合受容体味覚伝達のインヒ
ビター及び活性化因子をアッセイするために手段を提供する。生物学的活性のT2
Rタンパク質は、例えばR2R−依存性遺伝子の転写活性化；リガンド結合；リン酸
化及び脱リン酸化；G−タンパク質への結合；G−タンパク質活性化；調節分子結
合；電圧、膜電位及び導電率変化；イオン流；細胞内第２メッセンジャー、例え
ばcGMP、cAMP及びイノシトール三リン酸；細胞内カルシウムレベル；及び神経伝
達物質開放性を測定するインビボ及びインビトロアッセイを用いて、味覚トラン
スジューサー、特に苦味味覚トランスジューサーとしてT2Rのインヒビター及び
活性化因子を試験するために有用である。
【００９７】 T2Rファミンリーメンバーを用いて同定されるそのような活性化因子及びイン
ヒビターは、味覚伝達をさらに研究するために、及び特定の味覚アゴニスト及び
アンタゴニストを同定するために使用され得る。そのような活性化因子及びイン
ヒビターは、味覚を商品化するために、例えば食品又は医薬の苦味を低めるため
に、医薬及び食品剤として有用である。
【００９８】 本発明はまた、T2Rポリペプチドと相互作用し、そして/又はそれを調節する分
子を同定するために、アッセイ、好ましくは高処理アッセイを提供する。多くの
アッセイにおいては、T2Rファミリーメンバーの特定のドメイン、例えば細胞外
、トランスメンブラン又は細胞内ドメイン又は領域が使用される。多くの態様に
おいては、細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域、又はその組み合わせは
、固体支持体に結合され、そして例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニス
ト、又はR2Rポリペプチドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域に結合
し、そして/又はその活性を調節することができるいずれか他の分子を単離する
ために使用される。
【００９９】 ある態様においては、T2Rポリペプチドのドメイン、例えば細胞外、トランス
メンブラン又は細胞内ドメインは、異種ポリペプチドに融合され、それにより、
キメラポリペプチド、例えばGタンパク質結合受容体活性を有するキメラポリペ
プチドが形成される。そのようなキメラポリペプチドは、例えばT2Rポリペプチ
ドのリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト又は他のモジュレーターを同定する
ために、アッセイにおいて有用である。さらに、そのようなキメラポリペプチド
は、新規リガンド結合特異性、調節のモード、シグナル伝達経路又は他のそのよ
うな性質を有する新規味覚受容体を創造するために、又はリガンド結合特異性、
調節のモード、シグナル伝達経路、等の新規組み合わせを有する新規味覚受容体
を創造するために有用である。
【０１００】 T2R核酸の検出及びT2Rポリペプチドの発現方法はまた、味覚細胞を同定し、そ
して舌のトポロジー地図、及び脳における味覚感覚ニューロンに対する舌味覚受
容体細胞の関係を創造するためにも有用である。特に、T2Rを検出する方法は、
苦味味覚体に対して敏感な味覚細胞を同定するために使用され得る。ヒトT2R遺
伝子をコードする遺伝子の染色体位置決定は、T2Rファミリーメンバーにより引
き起こされ、そしてそれに関係する疾病、突然変異及び形質を同定するために使
用され得る。
【０１０１】 II.定義： 本明細書において使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、それ
に帰する意味を有する。 “味覚細胞”とは、舌、例えば葉状、真菌状及び有郭細胞の味覚芽を形成する
ためにグループに組織化される神経上皮細胞を包含する（例えば、Roperなど.,
Ann. Rev. Neurosci. 12: 329-353 (1989) を参照のこと）。味覚細胞はまた、
口蓋、及び味覚細胞を含むことができる他の組織、例えば食道及び胃の細胞も包
含する。
【０１０２】 “T2R”とは、味覚細胞、例えば葉状、真菌状及び有郭細胞、及び口蓋、食道
及び胃の細胞において発現されるG−タンパク質結合受容体のファミリーの１又
は複数のメンバーを言及する（例えば、Hoonなど., Cell 96: 541-551 (1999)
を参照のこと；これは引用により本明細書に組み込まれる）。このファミリーは
また、“SFファミリー”としても言及される（例えば、USSN09/393,634号を参照
のこと）。そのような味覚細胞は、それらが特定の分子、例えばガスデュシン、
味覚細胞特異的Gタンパク質、又は他の味覚特異的分子を発現するので、同定さ
れ得る（McLaughinなど., Nature357:563-569 (1992)）。T2Rファミリーメンバ
ーは、味覚伝達のための受容体として作用する能力を有する。T2Rファミリーメ
ンバーはまた、味覚受容体又は“SF”ファミリーのための“GR”ファミリーとし
ても言及される。
【０１０３】 “T2R”核酸は、“G−タンパク質結合受容体活性”を有する７種のトランスメ
ンブラン領域を有するGPCRのファミリーをコードし、例えばそれらは、細胞外刺
激に応答してG−タンパク質に結合し、そして酵素、例えばホスホリパーゼC及び
アデニル酸シクラーゼの刺激を通しての第２メッセンジャー、例えばIP3、cAMP
、cGMP及びCa2+の生成を促進する（GPCRの構造及び機能の記載については、例え
ばFong、前記及びBaldwin、前記を参照のこと）。一定のT2Rファミリーメンバー
間の関係を提供するデンドログラムは、図２として提供されている。それらの核
酸は、味覚細胞、特に苦味覚体に対して応答するガスデュシン−発現味覚細胞に
おいて発現されるタンパク質をコードする。単一の味覚細胞は、多くの異なった
T2Rポリペプチドを含むことができる。
【０１０４】 従って、用語“T2R”とは、（１）約25個のアミノ酸、任意には50〜100個のア
ミノ酸の窓にわたって、配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列
番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列
番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列
番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列
番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列
番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列
番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列
番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列
番号73, 配列番号74,
【０１０５】 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号8
3, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号9
5, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番
号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番号117,
配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127, 配列番
号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番号139,
配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149, 配列番
号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番号162,
及び配列番号164に対して、約60％のアミノ酸配列同一性、任意には約75, 80, 9
0又は90％のアミノ酸配列同一性を有し；
【０１０６】 （２）配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番
号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番
号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番
号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番
号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番
号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番
号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番
号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番
号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91,
【０１０７】 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号1
03, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配
列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号1
25, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配
列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号1
47, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配
列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸
配列及び保存的に修飾されたその変異体を含んで成る免疫原に対して生ぜしめら
れた抗体に対して特異的に結合し；
【０１０８】 （３）配列番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号
12, 配列番号14, 配列番号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号
25, 配列番号27, 配列番号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号
38, 配列番号41, 配列番号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号
57, 配列番号61 ，配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番
号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番
号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102,
【０１０９】 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列
番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124
, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列
番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146
, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列
番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群
から選択された配列、及び保存的に修飾されたその変異体に対して、緊縮条件下
で特異的にハイブリダイズする（少なくとも100、任意には少なくとも約500-100
0個のヌクレオチドのサイズと）；
【０１１０】 （４）配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170
及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約5
0％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含んで成り；又は（５）配列番号1
66, 配列番号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170又は配列番号171を
コードする変性プライマー組と同じ配列に対して、緊縮条件下で特異的にハイブ
リダイズするプライマーにより増幅される、多形変異体、対立遺伝子、変異体及
び種間相同体を言及する。
【０１１１】 トポロジー的感覚のGPCRは、“N−末端ドメイン”、“細胞外ドメイン”、７
種のトランスメンブラン領域、細胞質及び細胞外ループを含んで成る“トランス
メンブランドメイン”、“細胞質ドメイン”及び“C−末端ドメイン”を有する
（例えば、Hoonなど., Cell96: 541-551 (1999)；Buck & Axel, Cell 65: 175-1
87 (1991) を参照のこと）。それらのドメインは、当業者に知られている方法、
例えば疎水性及び親水性ドメインを同定する配列分析プログラムを用いて構造的
に同定され得る（例えば、Stryer, Biochemistry (3rd ed. 1988); 又は多くの
インターネットに基づく配列分析プログラム、例えばdot. Imgen. Bcm. Tmc. Ed
uで見出されるそれらのいずれかを参照のこと）。そのようなドメインは、キメ
ラタンパク質を製造するために、及び本発明のインビトロアッセイ、例えばリガ
ンド結合アッセイのために有用である。
【０１１２】 従って、“細胞外ドメイン”は、細胞膜から生成され、そして細胞の細胞外表
面に暴露されるT2Rポリペプチドのドメインを言及する。そのようなドメインは
、細胞の細胞外表面に暴露される“N末端ドメイン”、及び細胞の細胞外表面に
暴露されるトランスメンブランドメインの細胞外ループ、すなわちトランスメン
ブラン領域２及び３との間の、及びトランスメンブラン領域４及び５との間のル
ープを包含する。“N末端ドメイン”領域は、N−末端で開始し、そしてトランス
メンブランドメインの開始に隣接する領域まで延長する。それらの細胞外ドメイ
ンは、インビトロリガンド結合アッセイ（可溶性及び固相の両者）のために有用
である。さらに、下記に記載されるトランスメンブラン領域はまた、細胞外ドメ
インと組合して又は単独でリガンドを結合することができ、そして従って、イン
ビトロリガンド結合アッセイのためにも有用である。
【０１１３】 ７種のトランスメンブラン“領域”を含んで成る“トランスメンブランドメイ
ン”は、形質膜内にあるT2Rポリペプチドのドメインを言及し、そしてまた、ト
ランスメンブランドメイン“領域”としても言及される。その対応する細胞質（
細胞内）及び細胞外ループも包含することができる。７種のトランスメンブラン
領域、及び細胞外及び細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:
105-132 (1982) 又はStryer、前記に記載のようにして、標準の方法を用いて同
定され得る。
【０１１４】 “細胞質ドメイン”とは、細胞の内部に面するT2Rタンパク質のドメイン、例
えば“C末端ドメイン”及びトランスメンブランドメインの細胞内ループ、例え
ばトランスメンブラン領域１及び２間での及びトランスメンブラン領域３及び４
間での細胞内ループを言及する。“C末端ドメイン”は、最後のトランスメンブ
ランドメインの末端及びタンパク質のC−末端まで及び、そして通常、細胞質内
に位置する領域を言及する。
【０１１５】 “生物学的サンプル”とは、本明細書において使用され得る場合、１又は複数
のT2Rタンパク質をコードする１又は複数のT2R核酸を含む生物学的組織又は流体
のサンプルである。そのようなサンプルは、ヒト、マウス及びラットから単離さ
れた組織、及び味覚細胞を含むことができる他の組織、例えば食道及び胃を包含
するが、但しそれらだけには限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の断
片、例えば組織学的目的のための凍結された断片を包含することができる。生物
学的サンプルは典型的には、真核生物、例えば昆虫、原生動物、鳥、魚、爬虫類
及び好ましくは、哺乳類、例えばラット、マウス、ウシ、犬、テンジュクネズミ
又はウサギ、及び最も好ましくは、霊長類、例えばチンパンジー又はヒトから得
られる。
【０１１６】 “GPCR活性”とは、シグナルを伝達するGPCRの能力を言及する。そのような活
性は、G−タンパク質又は任意のG−タンパク質、例えばGα15、及び酵素、例え
ばPLCにGPCR（又はキメラGPCR）を結合し、そして細胞内カルシウムの上昇性を
、（Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175-15180 (1995)）を用いて
測定することによって、異種細胞において測定され得る。受容体活性は、蛍光Ca 2+ −インジケーター色素及び蛍光測定イメージングを用いて、［Ca2+］のリガン
ド−誘発された変化を記録することによって効果的に測定され得る。任意には、
本発明のポリペプチドは、感覚伝達、任意には味覚細胞における味覚伝達に包含
される。
【０１１７】 T2Rファミリーメンバー介在性味覚伝達を調節する化合物を試験するためのア
ッセイにおける、用語“機能的効果”とは、レポーターの影響下に、間接的に又
は直接的にあるいずれかのパラメーター、例えば機能的、物理的及び化学的効果
の決定を包含する。それは、リガンド結合、イオン流の変化、膜電位、電流の流
れ、転写、G−タンパク質結合、GPCRリン酸化又は脱リン酸化、シグナル伝達、
受容体−リガンド相互作用、第２メッセンジャー濃度（例えば、cAMP, cGMP, IP
3又は細胞内Ca2+）、インビトロ、インビボ及びエクスビボを包含し、そしてま
た、他の生理学的効果、例えば神経伝達物質又はホルモン開放の上昇又は低下も
包含する。
【０１１８】 “機能的効果を決定する”とは、T2Rファミリーメンバーの影響下に間接的又
は直接的にあるパラメーター、例えば機能的、物理的及び化学的効果を高めるか
又は下げる化合物についてのアッセイを意味する。そのような機能的効果は、当
業者に知られているいずれかの手段、例えば分光特徴（例えば、蛍光、吸光度、
屈折率）の変化、流体力学（例えば、形状）、クロマトグラフィー又は溶解性特
性、パッチクランピング、電圧感受性色素、全体の細胞電流、放射性同位体流出
、誘発マーカー、卵母細胞T2R遺伝子発現；組織培養細胞T2R発現；T2R遺伝子の
転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及び導電度変化；イオン流ア
ッセイ；細胞内第２メッセンジャー、例えばcAMP, cGMP及びイノシトール三リン
酸（IP3）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質開放及び同様
のものにより測定され得る。
【０１１９】 T2R遺伝子又はタンパク質の“インヒビター”、“活性化因子”及び“モジュ
レーター”は、味覚伝達のためのインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定
される阻害、活性化又は調節分子、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニス
ト及びそれらの相同体及び擬似体を言及するために交換可能的に使用される。イ
ンヒビターは、例えば刺激を部分的に又は完全に阻止し、活性化を低め、防止し
、遅延し、味覚伝達を不活性化し、脱感作し、又はダウンレギュレートするため
に結合する化合物、例えばアンタゴニストである。活性化因子は、例えば活性化
を刺激し、高め、開放し、活性化し、増強し、味覚伝達を感作するか又はアップ
レギュレートするために結合する化合物、例えばアゴニストである。
【０１２０】 モジュレーターは、例えば、活性化因子又はインヒビターを結合する細胞外タ
ンパク質（例えば、疎水性キャリヤーファミリーのエブネリン及び他のメンバー
）；G−タンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の脱活性化及び脱感作に関与す
る、ロドプシンキナーゼ及びβアドレナリン受容体キナーゼの相同体）；及び受
容体を脱活性化し、そして脱感作するアレスチン−様タンパク質と受容体との相
互作用を変更する化合物を包含する。モジュレーターは、例えば変更された活性
を有する、T2Rファミリーメンバーの遺伝子的に修飾された型、及び天然に存在
する及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小さな化学分子及び同
様のものを包含する。
【０１２１】 インヒビター及び活性化因子についてのそのようなアッセイは、例えば味覚体
、例えば苦味味覚体の存在下で、細胞又は細胞膜においてT2Rファミリーメンバ
ーを発現し、推定上のモジュレーター化合物を適用し、そして次に、上記のよう
にして、味覚伝達に対する機能的効果を決定することを包含する。可能性ある活
性化因子、インヒビター又はモジュレーターにより処理されるT2Rファミリーメ
ンバーを含んで成るサンプル又はアッセイが、阻害の程度を試験するために、イ
ンヒビター、活性化因子又はモジュレーターを有さない対照サンプルに比較され
る。
【０１２２】 対照サンプル（インヒビターにより処理されていない）は、100％の相対的T2R
活性値を割り当てられる。T2Rの阻害は、対照に対するT2R活性値が約80％、任意
には50％又は25％〜0％である場合に達成される。T2Rの活性化は、対照に対する
T2R活性値が110％、任意には150％、200〜500％又は1000〜3000％以上である場
合に達成される。 “生物学的活性”のT2Rとは、味覚受容体細胞における味覚伝達、特に苦味味
覚伝達に包含される、上記のようなGPCR活性を有するT2Rを言及する。
【０１２３】 用語“単離された”、“精製された”又は“生物学的に純度”とは、その天然
の状態で見出される場合、通常付随する成分を実質的に有さない物質を言及する
。純粋及び均質性は典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミドゲル
電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される。調製物に存在
する優性種であるタンパク質が実質的に精製される。特に、単離されたT2R核酸
は、T2R遺伝子を端に有し、そしてT2R以外のタンパク質をコードする読み取り枠
から分離される。用語“精製された”とは、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル
において実質的に１つのバンドを生ぜしめることを示す。特に、核酸又はタンパ
ク質は少なくとも85％、任意には少なくとも95％及び任意には少なくとも99％純
粋であることを意味する。
【０１２４】 “核酸”とは、一本又は二本鎖形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチド及びそのポリマーを言及する。この用語は、合成的であり、天然に存在
し、そして天然に存在せず、対照核酸として類似する結合性質を有し、そして対
照ヌクレオチドに類似する態様で代謝される、既知のヌクレオチド類似体又は修
飾された主鎖残基又は連鎖を含む核酸を包含する。そのような類似体の例は、ホ
スホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホ
スホネート、２−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（PNA）を包含す
るが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２５】 特にことわらない限り、特定の核酸配列はまた、暗黙のうちに、保存的に修飾
されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、並びに明らかに
示される配列を包含する。特に、縮重コドン置換は、1又は複数の選択された（
又はすべての）コドンの第３位置が混合された塩基及び/又はデオキシイノシン
残基により置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzerな
ど., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsukaなど., J. Biol. Chem. 260
: 2605-2608 (1985); Rossohiniなど., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）
。用語、核酸は、遺伝子、cDNA, mRNA、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチ
ドにより交換可能的に使用される。
【０１２６】 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”とは、アミノ酸残基
のポリマーを言及するために本明細書において交換可能的に使用される。この用
語は、１又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的
化学擬似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及
び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【０１２７】 用語“アミノ酸”とは、天然に存在する及び合成のアミノ酸、及び天然に存在
するアミノ酸に類似する態様で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸擬似体を言
及する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードされるそれらのもの、及び後
で修飾されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグ
ルタメート、及びO−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在する
アミノ酸と同じ基本的化学構造、例えば水素に結合されるαカルボキシル、カル
ボキシル基、アミノ基及びR基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシ
ン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを言及する。その
ような類似体は、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプ
チド主鎖を有するが、しかし天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保
持する。アミノ酸擬似体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、しかし
天然に存在するアミノ酸に類似する態様で機能する構造を有する化合物を言及す
る。
【０１２８】 アミノ酸は、IUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推薦さ
れる、それらの通常知られている３文字記号又は１文字記号により、本明細書に
おいては言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容できる１文
字コードにより言及され得る。
【０１２９】 “保存的に修飾された変異体”は、アミノ酸及び核酸配列の両者に適用される
。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体とは、同一又は実質的
に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコ
ードしない場合、実質的に同一の配列を言及する。遺伝子コードの縮重のために
、多数の機能的に同一の核酸は、いずれかの所定のタンパク質をコードする。例
えば、コドンGCA, GCC, GCG及びGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。
従って、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、コドンは、コード
されるポリペプチドを変更しないで、記載されるそれらの対応するコドンのいず
れかに変更され得る。
【０１３０】 そのような核酸変動は、保存的に修飾された変動の１つの種である“サイレン
ト変動”である。ポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列はまた、核酸のあ
らゆる可能なサイレント変動を記載する。当業者は、核酸における個々のコドン
（通常、メチオニンのための唯一のコドンであるAUG、及び通常、トリプトファ
ンのための唯一のコドンであるTGGを除く）は、機能的に同一の分子を生成する
ために修飾され得る。従って、ポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレン
ト変動は、個々の記載される配列において絶対的である。
【０１３１】 アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされる配列における単一のアミノ
酸又は低％のアミノ酸を変更し、付加し又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペ
プチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的
に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす“保存的に修飾された変異
体”であることを理解するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存
的置換の表は、当業界において良く知られている。そのような保存的に修飾され
た変異体が、本発明の多形変異体、種間相同体及び対立遺伝子の他に存在し、そ
してそれらを排除しない。
【０１３２】 次の８種のグループはそれぞれ、お互いのための保存性置換であるアミノ酸を
含む： １）アラニン（A）、グリシン（G）； ２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）； ３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）； ４）アルギニン（R）、リシン（K）； ５）イソロイシン（I）ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）； ６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）； ７）セリン（S）、トレオニン（T）；及び ８）システイン（S）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Protein (1984
) を参照のこと）。
【０１３３】 高分子構造、例えばポリペプチド構造は、種々の構成レベルで記載され得る。
この構造の一般的な議論に関しては、例えばAlbertsなど., molecular Biology
of the Cell (3rd ed., 1994) 及びCantor and Schimmel, Biophsical Chemisit
ry Part I : The Conformation of Biological Macromolecules (1980) を参照
のこと。“一次構造”とは、特定ペプチドのアミノ酸配列を言及する。“二次構
造”とは、ポリペプチド内の局部的に指図された三次構造を言及する。
【０１３４】 それらの構造は、ドメインとして通常知られている。ドメインは、ポリペプチ
ドのコンパクト単位を形成し、そして典型的には、50〜350個の長さのアミノ酸
であるポリペプチドの一部である。典型的なドメインは、低級構造の部分、例え
ばβ−シート及びα−ヘリックスの長さから製造される。“第三構造”とは、ポ
リペプチドモノマーの完全な３次元構造を言及する。“第四構造”とは、独立し
た第三単位の非共有結合により形成される三次元構造を言及する。異方性用語は
また、エネルギー用語としても知られている。
【０１３５】 “ラベル”又は“検出できる成分”は、分光、光化学、生化学、免疫化学又は
化学的手段により検出できる組成物である。例えば、有用なラベルは、32P、蛍
光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAに通常使用されるような）、ビオ
チン、ジゴキシゲニン、又はハプテン、及びペプチド中に放射性ラベルを組み込
むことによって検出できるようにされ得、又はペプチドと特異的に反応する抗体
を検出するために使用され得るタンパク質を包含する。
【０１３６】 “ラベルされた核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”は、プローブの存在が
プローブに結合されるラベルの存在を検出することによって検出され得るよう、
ラベルに、リンカー又は化学的結合を通して共有結合されるか、又はイオン、フ
ァン・デル・ワールス、静電又は水素結合を通して非共有結合されるものである
。
【０１３７】 本明細書において使用される場合、“核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”
とは、１又は複数のタイプの化学結合を通して、通常、相補的塩基対合を通して
、通常、水素結合形成を通して、相補的配合の標的拡散に結合できる核酸として
定義される。本明細書において使用される場合、プローブは、天然の（すなわち
、A, G, C又はT）、又は修飾された塩基（７−デアザグアノシン、イノシン、等
）を包含する。さらに、プローブにおける塩基は、ホスホジエステル結合以外の
結合により、それがハイブリダイゼーションを妨害しない限り、連結され得る。
【０１３８】 従って、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりもむしろ
ペプチド結合により連結されるペプチド核酸であり得る。プローブが、ハイブリ
ダイゼーション条件の緊縮性に依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠い
ている標的配列を結合できることは、当業者により理解されるであろう。プロー
ブは任意には、同位体、発光団、色原体により直接的にラベルされ、又はストレ
プタビジン複合体が後で結合することができるビオチンにより間接的にラベルさ
れる。プローブの存在又は不在についてアッセイすることによって、選択配列又
は副配列の存在又は不在を検出することができる。
【０１３９】 用語“組換え”とは、細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用され
る場合、前記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸又はタンパク質の
導入、又は生来の核酸又はタンパク質の変更により修飾されているか、又は細胞
がそのようにして修飾された細胞に由来するかを示す。従って、例えば、組換え
細胞は、細胞の生来（非組換え）形内に見出されない遺伝子を発現するか、又は
他方では、異常に発現されるか、過少発現されるか又はまったく発現されない生
来の遺伝子を発現する。
【０１４０】 用語“異種”とは、核酸の一部に関して使用される場合、核酸が、天然におい
てお互い同じ関係で見出されない複数の副配列を含んで成ることを示す。例えば
、核酸は、新規の機能的核酸を製造するために整列された関連のない遺伝子から
の複数の配列、例えば１つの源からのプロモーター及びもう１つの源からのコー
ド領域を用いて、典型的には組換え的に生成される。同様に、異種タンパク質は
、タンパク質が天然においてお互い同じ関係で見出されない複数の副配列（例え
ば、融合タンパク質）を含んで成ることを示す。
【０１４１】 “プロモーター”とは、核酸の転写を方向づける核酸制御配列のアレイとして
定義される。本明細書において使用される場合、プロモーターは、例えばポリメ
ラーゼII型のプロモーター、すなわちTATA要素の場合、転写の開始部位近の必要
な核酸配列を包含する。プロモーターはまた任意には、転写の開始部位から数千
の塩基対離れて位置する遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を包含する。“
構成”プロモーターとは、ほとんどの環境及び成長条件下で活性的であるプロモ
ーターである。“誘発性”プロモーターとは、環境又は成長調節下で活性的であ
るプロモーターである。用語“操作可能的に連結された”とは、核酸発現制御配
列（例えば、プロモーター、又は転写因子結合部位のアレイ）と、第２核酸配列
（ここで、発現制御配列が第２配列に対応する核酸の転写を方向づける）との間
での機能的連鎖を言及する。
【０１４２】 “発現ベクター”とは、宿主細胞において特定の核酸転写を可能にする一連の
特定の核酸要素により、組換え的に又は合成的に生成された核酸構造体である。
発現ベクターは、プラスミド、ウィルス又は核酸フラグメントの一部であり得る
。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに操作可能的に連結される、転写
されるべき核酸を包含する。
【０１４３】 複数の核酸又はポリペプチド配列における用語“同一の”又は％“同一性”と
は、比較窓、又は次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動的一列整
列及び眼による調査により測定されるような企画された領域にわたっての最大の
対応性について比較され、そして一列整列される場合、同じである複数の配列又
は副配列又はドメインを言及するか、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオ
チドの特定された百分率（％）（すなわち、特定された領域にわたって、50％の
同一性、任意には、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％又
はそれよりも高い同一性）を有する。次に、そのような配列は、“実質的に同一
”であると言われる。この定義はまた、試験配列の補体も言及する。任意には、
同一性は、少なくとも約50個の長さのアミノ酸又はヌクレオチドである領域、又
はより好ましくは、75〜100個の長さのアミノ酸又はヌクレオチドである領域に
わたって存在する。
【０１４４】 配列比較のためには、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される対照
配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び対照配列が
コンピューターに入力され、副配列座標が、必要により企画され、そして配列ア
ルゴリズムプログラムパラメーターが企画される。デフォールトプログラムパラ
メーターが、BLASTN及びBLASTNPプログラムについて下記に記載のようにして使
用され、又は他のパラメーターが企画され得る。次に、配列比較アルゴリズムが
、プログラムパラメーターに基づいて、対照配列に対しての試験配列について％
配列同一性を計算する。
【０１４５】 “比較窓”とは、本明細書において使用される場合、配列が、２種の配列が最
適に列挙整列された後、同じ数の連続位置の対照配列に比較される、200〜600、
通常約50〜約200、より通常には約100〜約150から成る群から選択された連続位
置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を包含する。比較のための配列
の一列整列方法は、当業界において良く知られている。
【０１４６】 比較のための配列の最適一列整列は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. M
ath. 2: 482 (1981)の局部相同アルゴリズムにより、Needleman ＆ Wunsch, J.
Mol. Biol. 48: 443 (1970) の相同一列整列アルゴリズムにより、Pearson & Li
pman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性方法についての
調査により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施（Wisconsi
n Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., M
adison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）により、又は手動一列整
列及び可視的調査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausube
l など., eds. 1995 supplement)）により行われ得る。
【０１４７】 ％配列同一及び配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの好まし
い例は、それぞれ、Altschulなど., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) 及
びAltschulなど., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載される、BLAST及
びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、Nati
onal Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
を通して入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長
さのワードと整列される場合、いくつかの陽性−値の限界評点Tと適合するか又
はそれを満たす、問題の配列における長さWの短いワードを同定することによっ
て、高い評点の配列対（HSP）を同定することを包含する。
【０１４８】 Tは、隣接ワード評点限界として言及される（Altschulなど., 前記）。それら
の初期隣接ワードヒットは、それらを含む長いHSPを見出すために調査を開始す
るための種として作用する。このワードヒットは、累計整列評点が高められる限
り、個々の配列にそって両方向に延長される。累計評点は、ヌクレオチド配列に
関しては、パラメーターM（適合する残基の対についてのリワード評点；常に＞0
）及びN（ミスマッチ残基についてのペナルティー評点；常に＜0）を用いて計算
される。アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累計評点を計算するた
めに使用される。個々の方向へのワードヒットの延長は、次の場合、停止される
：累計整列評点が、達成される最大値から量X、低下する場合；累計評点が、１
又は複数の負の評点残基整列の蓄積のために、ゼロ又はそれ以下になる場合；又
はいずれかの配列の終結に達する場合。
【０１４９】 BLASTアルゴリズムパラメーターW， T及びXが、一列整列の感度及び速度を決
定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、デフォールトと
して、11のワードレングス（wordlength）(W), 10の期待値（E）、M＝5，N＝4，
及び両鎖の比較を決定する。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムは、デ
フォールトとして、３のワードレングス及び10の期待値（E）を使用し、そしてB
LOSUM62評点マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 10915 (1989) を参照のこと）は、50の一列整列（B）、10の期待値（E）、
M＝5，N＝4及び両鎖の比較を使用する。
【０１５０】 有用なアルゴリズムのもう１つの例はPILEUPである。PILEUPは、関係及び％配
列同一性を示すために、前進性対様一列整列を用いて、関連する配列のグループ
から複数配列一列整列を創造する。それはまた、一列整列を創造するために使用
されるクラスター関係を示す樹形曲線又はデンドログラムをプロットする（例え
ば、図２を参照のこと）。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 35
1-360 (1987) の前進性一列整列方法の単純化を使用する。使用される方法は、H
iggins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989) により記載される方法に類似する
。そのプログラムは、それぞれ、5,000個の最大長のヌクレオチド又はアミノ酸
の300までの配列を整列することができる。
【０１５１】 複数一列整列方法は、２種の整列された配列のクラスターを生成する、２種の
最も類似する配列の対様一列整列により開始する。次に、このクラスターは、次
の最も関連する配列又は整列された配列のクラスターに整列され得る。２種の配
列のクラスターは、２種の個々の配列の対様一列整列の単純な延長により整列さ
れる。最終一列整列は、一連の前進性対様一列整列により達成される。
【０１５２】 このプログラムは、配列比較の領域について、特定の配列及びそれらのアミノ
酸又はヌクレオチド座標を企画することによって、及びプログラムパラメーター
を企画することによって実施される。PILEUPを用いて、対照配列は、次のパラメ
ーター：デフォールトギャップ重量（3.00）、デフォールトギャップ長重量（0.
10）及び計量された末端ギャップを用いて、％配列同一性関係を決定するために
、他の試験配列に比較される。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ
、例えばバージョン、7.0（Devereauxなど., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (19
84) から入手できる。
【０１５３】 ２種の核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一である表示は、第１の核酸に
よりコードされるポリペプチドが、下記に記載されるように、第２の核酸により
コードされるポリペプチドに対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に交差反応す
ることである。従って、ポリペプチドは典型的には、第２のポリペプチドと実質
的に同一であり、ここで２種のペプチドは保存性置換によってのみ異なる。２種
の核酸配列が、下記に記載されるように、実質的に同一である表示は、２種の分
子又はそれらの補体が緊縮条件下でお互いハイブリダイズすることである。２種
の核酸配列が実質的に同一であるさらにもう1つの表示は、同じプライマーが配
列を増幅するためにしようされ得ることである。
【０１５４】 用語“選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする”とは、配列が複合体混
合物（例えば、全細胞又はライブラリーDNA又はRNA）において存在する場合、緊
縮ハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみの結
合、複合体化、又はハイブリダイゼーションを言及する。
【０１５５】 用語“緊縮はイブレダイゼーション条件”とは、プローブが典型的には、他の
配列を含まない、核酸の複雑な混合物においてその標的副配列にハイブリダイズ
するであろう条件を言及する。緊縮条件は配列−依存性であり、そして異なった
環境下で異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイ
ズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する集中的なガイドは、Tijssen, T
echniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucle
ic Probes, “Overview of Principles of hybridization and the strategy of
nucleic acid assays” (1993) に見出される。
【０１５６】 一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度pHで、特定の配列に関して、熱
溶融点（Tm）よりも約５〜10℃低くなるよう選択される。Tmは、標的物に対して
相補的なプローブの50％が平衡（Tmで標的配列は過剰に存在するので、プローブ
の50％が平衡で支配される）で、標的配列にハイブリダイズする温度である（定
義されたイオン強度、pH及び核酸濃度下で）。緊縮条件は、塩濃度がpH7.0〜8.3
で、約1.0M以下のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオ
ン濃度（又は他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、10〜50個
のヌクレオチド）に関して、少なくとも約30℃及び長いプローブ（例えば、50個
以上のヌクレオチド）に関して、少なくとも約60℃であるそれらの条件であろう
。
【０１５７】 緊縮条件はまた、不安定剤、例えば、ホルムアミドの添加により達成され得る
。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションに関しては、陽性シグナルはバック
グラウンドの少なくとも２倍、任意にはバックグラウンドハイブリダイゼーショ
ンの10倍である。典型的な緊縮ハイブリダイゼーション条件は次の通りである：
50％ホルムアミド、５×SSC及び１％SDS、42℃でのインキュベーション、又は５
×SSC、１％SDS、65℃でのインキュベーション、0.2×SSCでの洗浄を伴なう、及
び0.1％SDS、65℃。そのようなハイブリダイゼーション及び洗浄段階は、例えば
、1, 2, 5, 10, 15, 30, 60分又はそれ以上の間、行われ得る。
【０１５８】 緊縮条件下でお互いハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペ
プチドが実質的に同一である場合、実質的に同一である。例えば、これは、核酸
のコピーが、遺伝子コードにより可能にされる最大のコドン縮重を用いて創造さ
れる場合に生じる。そのような場合、核酸は典型的には、中位の緊縮ハイブリダ
イゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な“中位の緊縮ハイブリダイ
ゼーション”とは、40％のホルムアミド、１MのNaCl、1％のSDSの緩衝液におけ
る37℃でのハイブリダイゼーション、及び45℃での１×SSCによる洗浄を包含す
る。
【０１５９】 そのようなハイブリダイゼーション及び洗浄段階は、例えば1, 2, 5, 10, 15, 30, 60分又はそれ以上の間、行われ得る。正のハイブリダイゼーションは、バ
ックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、他のハイブリダイゼーショ
ン及び洗浄条件が類似する緊縮性の条件を提供するために使用され得ることを容
易に理解するであろう。
【０１６０】 “抗体”とは、抗原を特異的に結合し、そして認識する、免疫グロブリン遺伝
子及びそのフラグメントからの骨格領域を含んで成るポリペプチドを言及する。
認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ不変領域遺
伝子、及び無数の免疫グルブリン可変領域遺伝子を包含する。L鎖はκ又はλと
して分類される。H鎖は、それぞれ、免疫グルブリンクラス、IgG、IgM、IgA、Ig
D及びIgEとして定義される、γ、μ、α、δ又はεとして分類される。
【０１６１】 典型的な免疫グルブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含んで成る。個々
のテトラマーは、２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、個々の対は１つの
“L”鎖（約25kDa）及び１つの“H”鎖（約50−70kDa）を有する、個々の鎖のN
−末端は、抗原認識を主に担当する。約100〜110又はそれ以上にアミノ酸の可変
領域を定義する。用語可変L鎖（VL）及び可変H鎖（VH）は、それぞれ、それらの
L鎖及びH鎖を言及する。
【０１６２】 抗体は、例えば、損なわれていない免疫グロブリンとして、又は種々のペプチ
ダーゼによる消化により生成される、十分に特徴づけられた多数のフラグメント
として存在する。従って、例えば、ペプシンは、F(ab)’2、すなわちそれ自体、
ジスルフィド結合によりVH−CH1に連結されるL鎖であるFabのダイマーを生成す
るために、ヒンジ部におけるジスルフィド結合下で抗体を消化する。F(ab)’2は
、ヒンジ部におけるジスルフィド結合を分解するために温和な条件下で還元され
、それにより、F(ab)’2ダイマーがFab’モノマーに転換される。Fab’モノマー
は、実質的に、ヒンジ部の一部を有するFabである（Fundamontal Immunology (P
aul など., 3rd ed., 1993) を参照のこと）。
【０１６３】 種々の抗体フラグメントが損なわれていない抗体の消化に関して定義されてい
るが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的に、又は組換えDNA方法を用
いることによって、新たに合成され得ることを理解するであろう。従って、用語
“抗体”とは、本明細書において使用される場合、完全な抗体の修飾により生成
される抗体フラグメント、又は組換えDNA方法を用いて新たに合成されたそれら
の抗体フラグメント（例えば、一本鎖Fv）、又はファージ表示ライブラリーを用
いて同定されるそれらの抗体フラグメントを包含する（例えば、McCaffertyなど
., Nature 348: 552-554 (1990) を参照のこと）。
【０１６４】 モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製に関しては、当業界において知
られているいずれかの技法が使用され得る（例えば、Kohler & Milstein, Natur
e 256: 495-497 (1975); Kozborなど., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole
など., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985) を参
照のこと）。一本鎖抗体の生成技法（アメリカ特許第4,946,778号）が、本発明
のポリペプチドに対する抗体を生成するよう適合され得る。また、トランスジェ
ニックマウス又は他の生物、例えば哺乳類が、ヒト適合された抗体を発現するた
めに使用され得る。他方では、ファージ表示技法が、選択された抗原に対して特
異的に結合する抗体及びヘテロマーFabフラグメントを同定するために使用され
得る（例えば、McCaffertyなど., Nature 348: 552-554 (1990); Marksなど., B
iotechnology 10: 779-783 (1992) を参照のこと）。
【０１６５】 “キメラ抗体”とは、（ａ）不変領域又はその一部が、変更され、置換され、
又は交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が、異なった又は変更され
た種類、エフェクター機能及び/又は種、又はキメラ抗体に新しい性質を付与す
る完全に異なった分子、例えば酵素、トキシン、ホルモン、成長因子、薬剤、等
の不変領域に連結され；又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なった又は変更
された抗原特異性を有する可変領域により変更され、置換され、又は交換される
、抗体分子である。
【０１６６】 “抗−T2R”抗体とは、T2R遺伝子、cDNA又はその副配列によりコードされるポ
リペプチドを特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントである。 用語“イムノアッセイ”とは、抗原を特異的に結合する抗体を使用するアッセ
イである。イムノアッセイは、抗原を単離し、標的化し、そして/又は定量化す
るための特定の抗体の特異的結合性質の使用により特徴づけられる。
【０１６７】 用語“抗体に対して特異的に（選択的に）結合する”、又は“特異的に（選択
的に）免疫反応する”とは、タンパク質又はペプチドに関する場合、タンパク質
及び他の生物学的物質の異種集団におけるタンパク質の存在の決定因子である結
合反応を言及する。従って、企画されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗
体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定のタンパク質に結合し、そして
サンプルに存在する他のタンパク質に、有意な量で、実質的に結合しない。その
ような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性
について選択される抗体を必要とする。
【０１６８】 例えば、特定の種、例えばラット、マウス又はヒトからのT2Rファミリーメン
バーに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体は、T2Rタンパク質又はその免
疫原部分と特異的に免疫反応し、そしてT2Rタンパク質のオルト体又は多形変異
体及び対立遺伝子を除いて、他のタンパク質とは免疫反応しないそれらのポリク
ローナル抗体のみを得るために選択され得る。この選択は、他の種又は他のT2R
分子から、T2R分子と交差反応する抗体を控除することによって達成され得る。T
2R GPCRファミリーメンバーのみを認識するが、しかし他のファミリーからのGPC
Rは認識しない抗体がまた選択され得る。
【０１６９】 種々のイムノアッセイ型が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を
選択するために使用され得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、通常、タ
ンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用される（例えば、特
定の免疫活性を決定するために使用され得るイムノアッセイ型及び条件の記載に
ついては、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) を参照の
こと）。典型的には、特定の又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又は
ノイズの少なくとも２倍、及びより典型的には、バックグラウンドの10〜100倍
以上であろう。
【０１７０】 １つの態様においては、配列番号166−171に対応する免疫原ドメインは、T2R
ファミリーのポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を生ぜしめるために使
用される。 用語“選択的に結合する”とは、上記で定義されたように、他の核酸と“選択
的にハイブリダイズする”核酸の能力、又は上記で定義されたように、タンパク
質に対して選択的に（又は特異的に）結合する抗体の能力を言及する。
【０１７１】 “宿主細胞”とは、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製又は発現
を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば、E.コリ、又は真核
細胞、例えば酵母、昆虫、両生類、又は哺乳類細胞、例えば、CHO, HeLa, HEK-2
93及び同様のもの、例えば培養された細胞、外植片、及びインビボ細胞を包含す
る。
【０１７２】 III.T2Rファミリーメンバーをコードする核酸の単離： A.一般的な組換えDNA方法： 本発明は、組換え遺伝学の分野における通常の技法に依存する。本発明に使用
するための一般的な方法を開示する基本的なテキストは、Sambrookなど., Molec
ular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed., 1989); Kriegler Gene Transfe
r and Expresson: A Laboratory Manual (1990); 及びCurrent Protocols in Mo
lecular Biology (Ausubelなど., eds., 1994) を包含する。
【０１７３】 核酸に関しては、サイズはキロ塩基（kb）又は塩基対（bp）のいずれかにより
与えられる。それらは、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定
された核酸、又は公開されたDNA配列から誘導された推定値である。タンパク質
に関しては、サイズはキロドルトン（kDa）又はアミノ酸残基番号により与えら
れる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、誘導さ
れたアミノ酸配列、又は公開されたタンパク質配列からの推定値である。
【０１７４】 市販されていないオリゴヌクレオチドは、Van Devanterなど., Nucleic Acids
Res. 12: 6159-6168 (1984) に記載のようにして、自動合成機を用いて、まず
、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981) により記
載される固相ホスホラミジットトリエステル方法に従って、化学的に合成され得
る。オリゴヌクレオチドの精製は、生来のアクリルアミドゲル電気泳動、又はPe
arson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149に記載のようにして、アニオン交換H
PLCのいずれかにより行われる。 クローン化された遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、Wallaceなど.
, Gene 16: 21-26 (1981) の二本鎖鋳型を配列決定するための鎖終結方法を用い
て、クローニングの後に確かめられ得る。
【０１７５】 B.T2Rファミリーメンバーをコードするヌクレオチド配列の単離のためのクロ
ーニング方法： 一般的に、T2Rファミリーメンバーをコードする核酸配列及び関連する核酸配
列相同体が、プローブによるハイブリダイゼーションによりcDNA及びゲノムDNA
ライブラリーからクローン化され、又はオリゴヌクレオチドプライマーによる増
幅技法を用いて単離される。例えば、T2R配列は典型的には、核酸プローブによ
りハイブリダイズすることによって、哺乳類核酸（ゲノム又はcDNA）ライブラリ
ーから単離され、ここで前記配列は、配列番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列
番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番号16, 配列番号18, 配列
番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番号29, 配列番号31, 配列
番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番号43, 配列番号45, 配列
番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61，
【０１７６】 配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番号86
, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98
, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列
番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120
, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列
番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142
, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列
番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163
及び配列番号165から誘導され得る。T2RファミリーメンバーのためのRNA及びcDN
Aが単離され得る適切な組織は、舌組織、任意には味覚芽組織又は個々の味覚細
胞である。
【０１７７】 プライマーを用いての増幅技法がまた、DNA又はRNAからのT2R配列を増幅し、
そして単離するためにも使用され得る。例えば、次のアミノ酸配列をコードする
変性プライマーがT2R遺伝子の配列を増幅するために使用され得る：配列番号166
, 167, 168, 169, 170又は171（例えば、Dioffenfach & Dveksler, PCR Primer:
A Laboratory Manual (1995) を参照のこと）。それらのプライマーは、例えば
十分な長さの配列、又は１〜数百のヌクレオチドのプローブを増幅するために使
用され得、次に前記プローブは十分な長さのT2Rクローンについて哺乳類ライブ
ラリーをスクリーンするために使用される。上記のようにして、そのようなプラ
イマーは、十分な長さの配列、又は次に、例えばライブラリーから十分な長さの
配列を単離するために使用され得るプローブを単離するために使用され得る。
【０１７８】 T2Rをコードする核酸がまた、プローブとして抗体を用いて、発現ライブラリ
ーから単離され得る。そのようなポリクローナル又はモノクローナル抗体は、配
列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列
番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列
番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列
番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列
番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列
番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列
番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列
番号69, 配列番号70, 配列番号71,
【０１７９】 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号7
7, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号8
9, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号1
01, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配
列番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号1
23, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配
列番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号1
45, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配
列番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164の配列を用いて生ぜし
められ得る。
【０１８０】 T2Rファミリーメンバーに対して実質的に同一である、多形変異体、対立遺伝
子及び種間相同体は、T2R核酸プローブ、及びオリゴヌクレオチドを用いて、緊
縮ハイブリダイゼーション条件下で、ライブラリーをスクリーニングすることに
より単離され得る。他方では、発現ライブラリーは、T2R相同体を認識し、そし
てその相同体に選択的に結合する、抗血清、又はT2Rポリペプチドに対して製造
された、精製された抗体により、発現された相同体を免疫学的に検出することに
よって、T2Rファミリーメンバー及びT2Rファミリーメンバー多形変異体、対立遺
伝子及び種間相同体をクローン化するために使用され得る。
【０１８１】 cDNAライブラリーを製造するために、T2R mRNAに富んでいる源、例えば舌組織
又は単離された味覚芽を選択すべきである。次に、mRNAが、逆転写酵素を用いて
、cDNA中に転写され、組換えベクター中に連結され、そして増殖、スクリーニン
グ及びクローニングのために、組換え宿主中にトランスフェクトされる。cDNAラ
イブラリーを製造し、そしてスクリーニングするための方法は、良く知られてい
る（例えば、Gubler & Hoffman, Gene 25: 263-269 (1983); Sambrookなど., 前
記；Ausubelなど., 前記を参照のこと）。
【０１８２】 ゲノムライブラリーに関しては、DNAは、組織から抽出され、そして機械的に
剪断され、又は酵素的に消化され、約12−20kbのフラグメントが生成される。次
に、フラグメントは、所望するサイズから、グラジエント遠心分離により分離さ
れ、そしてバクテリオファージλベクターにおいて構成される。それらのベクタ
ー及びファージは、インビトロでパッケージングされる。組換えファージが、Be
nto & Davis, Science 196: 180-182 (1977) に記載のようにして、プラークハ
イブリダイゼーションにより分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、
一般的にGrunsteinなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 3961-3965 (1975)
に記載のようにして行われる。
【０１８３】 T2R核酸及びその相同体を単離するための他の方法は、合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーの使用、及びRNA又はDNA鋳型の増幅を組合す（アメリカ特許第4,68
3,195号及び第4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicat
ions (Innisなど., eds. 1990) を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）及
びリガーゼ鎖反応（LCR）のような方法は、mRNA, cDNA, ゲノムライブラリー又
はcDNAライブラリーから直接的に、T2R遺伝子のアミノ酸配列を増幅するために
使用され得る。変性オリゴヌクレオチドは、本明細書において提供される配列を
用いて、T2Rファミリーメンバー相同体を増幅するために企画され得る。
【０１８４】 制限エンドヌクレアーゼ部位が、プライマー中に導入され得る。ポリメラーゼ
鎖反応又は他のインビトロ増幅方法はまた、例えば発現されるべきタンパク質を
コードする核酸配列をクローン化するために、生理学的サンプルにおけるT2R−J
コードmRNAの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を製造す
るために、核酸配列決定のために、又は他の目的のために有用である。PCR反応
により増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製され、そして適切なベクタ
ー中にクローン化され得る。
【０１８５】 T2Rファミリーメンバーの遺伝子発現はまた、当業者に知らされている技術、
例えばmRNAの逆転写及び増幅、全RNA又はポリA+ RNAの単離、ノザンブロット、
ドットブロット、現場ハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護、プロービングDN
Aマイクロチップアレイ、及び同様の技法により分析され得る。１つの態様にお
いては、高密度オリゴヌクレオチド分析技法（例えば、GeneChipTM）が、本発明
のGPCRの相同体及び多形バージョンを同定するために使用される。
【０１８６】 同定される相同体が既知の疾病に連結される場合、それらは生物学的サンプル
における疾病の検出における診断用手段としてGeneChipTM と共に使用され得る
。例えばGunthandなど., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869-876 (1998); K
ozalなど., Nat. Med. 2: 753-759 (1996); Matsonなど., Anal. Biochem. 224:
110-106 (1995); Lockhartなど., Nat. Biotechnol. 14: 1675-1680 (1996); G
ingerasなど., Genome Res. 8: 435-448 (1998); Haciaなど., Nucleic Acids R
es. 26: 3865-3866 (1998)を参照のこと。
【０１８７】 合成オリゴヌクレオチドは、プローブとして使用するための又はタンパク質の
発現のための組換えT2R遺伝子を構成するために使用され得る。この方法は、遺
伝子のセンス及びアンチセンスの両者を表す、通常40−120bpの長さの一連のオ
ーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いて行われる。次に、それらのDNAフ
ラグメントがアニーリングされ、連結され、そしてクローン化される。他方では
、増幅技法は、T2R核酸の特定の副配列を増幅するために、正確なプライマーと
共に使用され得る。次に、その特定の副配列が発現ベクター中に連結される。 T2R遺伝子をコードする核酸は典型的には、複製及び/又は発現のために、真核
又は原核細胞中への形質転換の前、中間ベクター中にクローン化される。それら
の中間ベクターは典型的には、原核ベクター、例えばプラスミド又はシャトルベ
クターである。
【０１８８】 任意には、T2Rポリペプチド又はそのドメインを含んで成るキメラタンパク質
をコードする核酸は、標準の技法に従って製造され得る。例えば、ドメイン、例
えばリガンド結合ドメイン（例えば、細胞外ドメインのみ、細胞外ドメイン＋ト
ランスメンブラン領域又はトランスメンブラン領域のみ）、細胞外ドメイン、ト
ランスメンブランドメイン（例えば、７個までのトランスメンブラン領域、及び
対応する細胞外及び細胞質ゾルループを含んで成るドメイン）、トランスメンブ
ランドメイン、及び細胞質ドメイン、活性部位、サブユニット結合領域、等が、
異種タンパク質に共有結合され得る。例えば、細胞外ドメインは、異種GPCRトラ
ンスメンブランドメインに連結され、又は異種GPCR細胞外ドメインはトランスメ
ンブランドメイン連結され得る。選択の他の異種タンパク質は、緑色蛍光タンパ
ク質、β−gal、 グルタメート受容体及びロドプシン前配列を包含する。
【０１８９】 C.原核生物又は真核生物における発現： クローン化された遺伝子又は核酸、例えばT2Rファミリーメンバーをコードす
るそれらのcDNAの高レベル発現を得るためには、典型的には、転写を方向づける
ための強いプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、及びタンパク質コードの
核酸に関しては、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中に
T2R配列をサブクローン化する。適切な細菌プロモーターは、当業者において良
く知られており、そして例えば、Sambrookなど., 及びAusubelなどに記載されて
いる。
【０１９０】 T2Rタンパク質を発現するための細菌発現システムは、例えばE.コリ、バチル
スsp. 及びサルモネラから入手できる（Palvaなど., Gene 22: 229-235 (1983);
Moshachなど, Nature 302: 543-545 (1983)）。そのような発現システムのため
のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現シ
ステムは、当業界において良く知られており、そしてまた、市販されている。１
つの態様においては、真核発現ベクターは、アデノウィルスベクター、アデノ−
結合ベクター又はレトロウィルスベクターである。
【０１９１】 異種核酸の発現を方向づけるために使用されるプロモーターは、特定の適用に
依存する。プロモーターは任意には、それはその天然の設定において転写開始部
位からであるので、異種転写開始部位からほぼ同じ距離に位置する。当業界にお
いて知られているように、この距離におけるいくらかの変動は、プロモーター機
能の損失を伴なわないで適応され得る。
【０１９２】 プロモーターの他に、発現ベクターは典型的には、宿主細胞におけるT2R−コ
ードの核酸の発現のために必要とされるすべての追加の要素を含む転写単位又は
発現カセットを含む。従って、典型的な発現カッセトは、T2R、及び転写体の効
果的なポリアデニル化のために必要とされるシグナルをコードする核酸配列に操
作可能的に連結されるプロモーター、リボソーム結合部位、及び翻訳終結を含む
。
【０１９３】 T2Rをコードする核酸配列は典型的には、形質転換された細胞によるコードさ
れたタンパク質の分泌を促進するために、分解可能シグナルペプチド配列に連結
され得る。そのようなシグナルペプチドは、中でも、組織プラスミノーゲン活性
化因子、インスリン及びニューロン成長因子、並びにヘリオチス・ビレスセンス
（Heliothis virescens）の幼若ホルモンエステラーゼからのシグナルペプチド
を包含する。カセットの追加の要素は、エンハンサー、及びゲノムDNAが構造遺
伝子として使用される場合、イントロ、並びに機能的スプライスドナー及び受容
体を包含することができる。
【０１９４】 プロモーターカセットの他に、発現カセットはまた、効果的な終結を提供する
ために構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。その終結領域は、プ
ロモーター配列と同じ遺伝子から得られるか、又は異なった遺伝子から得られる
。 細胞中に遺伝子的情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特
に決定的ではない。真核又は原核細胞における発現のために使用される従来のベ
クターのいずれでも使用され得る。標準の細菌発現ベクターは、プラスミド、例
えばpBR322基材のプラスミド、pSKF, pET23D及び融合発現システム、例えばGST
及びLacZを包含する。エピトープ標識はまた、便利な単離方法を提供するための
組換えタンパク質、例えばc−mycに付加され得る。
【０１９５】 真核ウィルスからの調節要素を含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベク
ター、例えばSV40ベクター、乳頭腫ウィルスベクター、及びEpstein−Barrウィ
ルスに由来するベクターにおいて使用される。他の典型的な真核ベクターは、pM
SG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, バキュロウィルスpDSVE, 及びSV40初期
プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ
乳癌ウィルスプロモーター、Rous肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロ
モーター、又は真核細胞における発現のために効果的であることが示されている
他のプロモーターの指図下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクタ
ーを包含する。
【０１９６】 いくつかの発現システムは、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えばネオマイ
シン、ヒミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、及びジ
ヒドロ葉酸レダクターゼを有する。他方では、ポリヘドリンプロモーター又は他
の強いバキュロウィルスプロモーターの指図下でT2Rファミリーメンバーをコー
ドする配列と共に、昆虫細胞におけるバキュロウィルスベクターを用いての高収
率発現システム（遺伝子増幅を包含しない）がまた適切である。
【０１９７】 典型的には、発現ベクターに包含される要素はまた、E.コリにおいて機能する
レプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にするために抗生物質
耐性をコードする遺伝子、及び真核配列の挿入を可能にするためのプラスミドの
非必須領域におけるユニーク制限部位を包含する。選択される特定の抗生物質耐
性遺伝子は決定的ではなく、当業界において知られている多くの耐性遺伝子のい
ずれでも適切である。原核配列は任意には、それらが、必要なら、真核細胞にお
けるDNAの複製を妨害しないよう選択される。
【０１９８】 標準のトランスフェクション方法が、次に、標準の技法を用いて精製される多
量のT2Rタンパク質を発現する、細菌、哺乳類、酵母又は昆虫細胞系を生成する
ために使用される（例えば、Colleyなど., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (
1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182
(Deutscher, ed., 1990) を参照のこと。真核及び原核細胞の形質転換は、標準
の技法に従って行われる（例えば、Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977);
Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wuなど., ed
s. （1983) を参照のこと）。
【０１９９】 宿主細胞中に外来性ヌクレオチド配列を導入するための良く知られている方法
のいずれかが使用され得る。それらは、リン酸カルシウムトランスフェクション
、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マ
イクロインジェクション、血漿ベクター、ウィルスベクター、及び宿主細胞中に
クローン化されたゲノムDNA, cDNA, 合成DNA又は他の外来性遺伝子材料を導入す
るための他の良く知られている方法のいずれかの使用を包含する（例えば、Samb
rookなど., 前記を参照のこと）。使用される特定の遺伝的構築方法は、T2R遺伝
子を発現することができる宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を都合良く導入
することができることが単に必要である。
【０２００】 １つの好ましい態様においては、pEAK10哺乳類発現ベクター（Edge Biosystem
s, MD）を用いてEF−１αプロモーターに操作可能的に連結されるT2Rをコードす
るポリヌクレオチドが使用される。そのようなベクターは、いずれかの標準の方
法、例えばLipofectAMINE（Lifetechnologies）を用いてのトランスフェクショ
ンを用いて、細胞、例えばHEK−293細胞中に導入され得る。 発現ベクターが細胞中に導入された後、トランスフェクトされた細胞が、T2R
ファミリーメンバーの発現を好む条件下で培養され、下記標準の技法を用いて、
培養物から回収される。
【０２０１】 IV.T2Rポリペプチドの精製： いずれかの天然に存在する組換えT2Rポリペプチドが、機能的アッセイへの使
用のために精製され得る。任意には、組換えT2Rポリペプチドが精製される。天
然に存在するT2Rポリペプチドが、例えば哺乳類組織、例えば舌組織及びT2R相同
体の他の源から精製される。組換えT2Rポリペプチドは、いずれかの適切な細菌
又は真核発現システム、例えばCHO細胞又は昆虫細胞から精製される。
【０２０２】 T2Rタンパク質は、標準の技法、例えば硫酸アンモニウムのような物質による
選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー、免疫精製方法及び他の方法により、実
質的な純度に精製され得る（例えば、Scopes, Protein Purification: Principl
es and Practice (1982); アメリカ特許第4,673,641号；Ausubelなど., 前記；
及びSambrookなど., 前記を参照のこと）。
【０２０３】 多くの方法が、組換えT2Rファミリーメンバーが精製される場合、使用され得
る。例えば、確立された分子付着性質を有するタンパク質は、T2Rポリペプチド
に可逆的に融合され得る。適切なリガンドにより、T2Rは、精製カラムに選択的
に吸着され、そして次に、比較的純粋な形でカラムから開放され得る。次に、融
合されたタンパク質は酵素活性により除去される。最終的に、T2Rタンパク質は
、免疫親和性カラムを用いて精製され得る。
【０２０４】 A．組換え細胞からのT2Rタンパク質の精製： 組換えタンパク質は、形質転換された細菌又は真核細胞、例えばCHO細胞又は
昆虫細胞により、典型的にはプロモーター誘発の後、多量に発現され；しかし発
現は構成的であり得る。TPTGによるプロモーター誘発は、誘発できるプロモータ
ーシステムの1つの例である。細胞は、当業界における標準の方法に従って増殖
される。新鮮な又は凍結された細胞は、タンパク質の単離のために使用される。
【０２０５】 細菌において発現されたタンパク質は、付溶性凝集体（“封入体”）と形成す
ることができる。いくつかのプロトコールが、T2R封入体の精製のために適切で
ある。例えば、封入体の精製は典型的には、細菌細胞の破壊による、例えば50mM
のトリス/HCl, pH7.5, 50mMのNaCl, 5mMのMgCl2, 1mMのDTT, 0.1mMのATP及び1mM
のPMSFの緩衝液におけるインキュベーションによる、封入体の抽出、分離及び/
又は精製を包含する。細胞懸濁液は、フレンチプレスに２〜３回通すことにより
溶解され、ポリトロン（Brinkman Instruments）を用いて均質化され、又は氷上
で音波処理され得る。細菌を溶解する他の方法は、当業者に明らかである（たと
えば、Sambrookなど., 前記；Ausubelなど., 前記を参照のこと）。
【０２０６】 必要なら、封入体は溶解され、そしてその溶解された細胞懸濁液は典型的には
、所望しない不溶性物質を除去するために遠心分離される。封入体を形成したタ
ンパク質は、相溶性緩衝液による希釈又は透析により復元され得る。適切な溶媒
は、ウレア（約４M〜約８M）、ホルムアミド（少なくとも約80％、v/vに基づく
）及びグアニジン塩酸塩（約４M〜約８M）を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。
【０２０７】 凝集体−形成タンパク質を溶解できるいくつかの溶媒、例えばSDS（ドデシル
硫酸ナトリウム）、70％蟻酸は、免疫原性及び/又は活性の欠失を伴なうタンパ
ク質の不可逆的変性の可能性のために、この方法への使用のためには不適切であ
る。グアニジン酸塩及び類似する剤は変性されるが、この変性は不可逆的ではな
く、そして復元は、変性剤の除去（例えば、透析による）又は希釈に基づいて発
生し、免疫学的及び/又は生物学的活性タンパク質の再形成を可能にする。他の
適切な緩衝液は、当業者に知られている。T2Rポリペプチドは、Ni−NTAアガロー
スゲルによる標準の分離技法により、他の細菌性タンパク質から分離される。
【０２０８】 他方では、細菌ペリプラズムからT2Rポリペプチドを精製することは可能であ
る。細菌の溶菌の後、T2Rタンパク質が細菌のペリプラズム中に輸送される場合
、その細菌のペリプラズム画分は、当業界に知られている他の方法の他に、冷浸
透ショックにより単離され得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離する
ためには、細菌細胞は、ペレットを形成するために遠心分離される。ペレットは
、20％スクロースを含む緩衝液に再懸濁される。細菌を溶解するためには、細菌
が遠心分離され、そしてペレットが氷冷却された5mMのMgSO4に再懸濁され、そし
て氷浴において約10分間、保持される。細胞懸濁液を遠心分離し、そして上清液
をデカントし、そして保存する。上清液に存在する組換えタンパク質は、当業者
に良く知られている標準の分離技法により宿主タンパク質から分離され得る。
【０２０９】 B．T2Rポリペプチドを精製するための標準タンパク質分離技法： 溶解性分別： しばしば、初期段階として、特にタンパク質混合物が複合体である場合、初期
の塩分別は、興味ある組換えタンパク質から、所望しない宿主細胞タンパク質（
又は細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを分離することができる。好ま
しい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物に
おける水の量を効果的に低めることによって、タンパク質を沈殿せしめる。次に
、タンパク質は、それらの溶解性に基づいて沈殿する。より疎水性のタンパク質
ほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する傾向がある。
【０２１０】 典型的なプロトコールは、タンパク質溶液への飽和硫酸アンモニウムの添加を
包含し、その結果、得られる硫酸アンモニウム濃度は20〜30％である。この濃度
は、ほとんどの疎水性タンパク質を沈殿せしめるであろう。次に、沈殿物が廃棄
され（興味あるタンパク質が疎水性でない場合）、そして硫酸アンモニウムが、
興味あるタンパク質を沈殿せしめることが知られている濃度まで、上清液に添加
される。次に、沈殿物が緩衝液に溶解され、そして過剰の塩が、必要なら、透析
又はジアフィルトレーションを通して除去される。タンパク質の溶解性に依存す
る他の方法、例えば冷エタノール沈殿法は、当業者に良く知られており、そして
複合体タンパク質混合物を分別するために使用され得る。
【０２１１】 サイズ示差濾過： T2Rタンパク質の分子量が、異なった孔サイズの膜（例えば、Amicon又はMilli
pore膜）を通しての限外濾過を用いて、大きなサイズ及び小さなサイズのタンパ
ク質からそれらを単離するために使用され得る。最初の段階として、タンパク質
混合物は、興味あるタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔
サイズの膜を通して限外濾過される。次に、限外濾過の保持物が、興味あるタン
パク質の分子量よりも高い分子量カットオフを有する膜に対して限外濾過される
。組換えタンパク質が膜を通して濾液中に通されるであろう。次に、濾液が下記
のようにしてクロマトグラフィー処理され得る。
【０２１２】 カラムクロマトグラフィー： T2Rタンパク質はまた、そのサイズ、実効表面電荷、疎水度、及びリガンドに
ついての親和性に基づいて、他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパ
ク質に対して生ぜしめられた抗体が、カラムマトリックスに接合され、そしてタ
ンパク質が免疫精製され得る。それらの方法のすべては、当業界において良く知
られている。クロマトグラフィー技法は、いずれかの規模で及び多くの異なった
製造業者（例えば、Pharmacia Biotech）からの装置を用いて行われ得ることは
、当業者に明らかであろう。
【０２１３】 V．T2Rポリペプチドの免疫学的検出： 核酸ハイブリダイゼーション技法を用いてのT2R遺伝子の検出及び遺伝子発現
の他に、T2Rを検出するために、例えば味覚受容体細胞、特に苦味味覚受容体細
胞及びT2Rファミリーメンバーの変異体を同定するためにイムノアッセイを使用
することができる。イムノアッセイは、T2Rを定量的に又は定性的に分析するた
めに使用され得る。適用できる技法の一般的な概観は、Harlow & Lane, Antibod
ies: A Laboratory Manual (1988) において見出され得る。
【０２１４】 A．T2Rファミリーメンバーに対する抗体： T2Rファミリーメンバーと特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナ
ル抗体の生成方法は，当業者に知られている（例えば、Coligan, Current Proto
cols in Immunology. (1991); Harlow & Lane, 前記；Goding, Monoclonal Anti
bodies: Principles and Practice (2nd. ed., 1986); 及びKohler & Milstein,
Nature 256: 496-497 (1975) を参照のこと）。そのような技法は、ファージ又
は類似するベクターによる組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗
体調製、及びウサギ又はマウスを免疫化することによるポリクローナル及びモノ
クローナル抗体の調製を包含する（例えば、Huseなど., Science 246: 1275-128
1 (1989); Wardなど., Nature 341: 544-546 (1989) を参照のこと）。
【０２１５】 多くのT2R含有免疫原が、T2Rファミリーメンバーと特異的に反応する抗体を生
成するために使用され得る。例えば、組換えT2Rタンパク質又はその抗原性フラ
グメントが、本明細書に記載のようにして単離される。適切な抗原性領域は、T2
Rファミリーのメンバーを同定するために使用される保存されたモチーフ、例え
ば配列番号166, 167, 168, 169, 170及び171を包含する。組換えタンパク質は、
上記のようにして、真核又は原核細胞において発現され、そして一般的に上記の
ようにして生成され得る。
【０２１６】 組換えタンパク質は、モノクローナル又はポリクローナル抗体の生成のために
好ましい免疫原である。他方では、本明細書に開示される配列に由来し、そして
キャリヤータンパク質に接合される合成ペプチドが、免疫原として使用され得る
。天然に存在するタンパク質はまた、純粋又は不純な形のいずれかで使用され得
る。次に、生成物は、抗体を生成できる動物中に注射される。モノクローナル又
はポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するためにイムノアッセ
イへの続く使用のために、生成され得る。
【０２１７】 ポリクローナル抗体の生成方法は、当業者に知られている。マウス（例えば、
BALB/Cマウス）又はウサギの近交系が、標準のアジュバント、例えばフロイント
アジュバント、及び標準の免疫化プロトコールを用いて、タンパク質により免疫
化される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験血液を取り、そしてT2
Rに対する反応性の力価を決定することによってモニターされる。免疫原に対す
る抗体の適切に高い力価が得られる場合、血液が動物から集められ、そして抗血
清が調製される。タンパク質に対して反応性の抗体を富化するための抗血清のさ
らなる分別が、所望により行われ得る（Harlow & Lane, 前記を参照のこと）。
【０２１８】 モノクローナル抗体は、当業者に知られている種々の技法により得られる。手
短には、所望する抗原により免疫化された動物からの脾臓細胞が、骨髄腫細胞と
の融合により不滅化される（Kohlar & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519
(1976) を参照のこと）。不滅化のもう１つの方法は、Epstein Barr ウィルス
、腫瘍遺伝子又はレトロウィルス、又は当業界に知られている他の方法による形
質転換を包含する。
【０２１９】 単一の不滅化された細胞から発生するコロニーは、抗原に対する所望する特異
性及び親和性の抗体の生成についてスクリーンされ、そしてそのような細胞によ
り生成されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔中への注射を包
含する種々の技法により増強され得る。他方では、Huseなど., Science 246: 12
75-1281 (1989) により概略される一般的なプロトコールに従って、ヒトB細胞か
らDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体又
はその結合フラグメントをコードするDNA配列を単離することができる。
【０２２０】 モノクローナル抗体及びポリクローナル血清が集められ、そしてイムノアッセ
イ、例えば固体支持体上に固定された免疫原による固相イムノアッセイにより、
免疫原タンパク質に対して滴定される。典型的には、104又はそれ以上の力価を
有するポリクローナル抗血清が選択され、そして競争結合イムノアッセイを用い
て、非−T2Rタンパク質、又は他の生物からの他のT2Rファミリーメンバー又は他
の関連するタンパク質に対するそれらの交差反応性について試験される。特定の
ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1μM、よ
り通常には少なくとも約1μM、任意には少なくとも約0.1μM又はそれ以上のKdを
伴なって結合するであろう。
【０２２１】 T2Rファミリーメンバー特異的抗体が入手されると、個々のT2Rタンパク質は、
種々のイムノアッセイ方法により検出され得る。免疫学的及びイムノアッセイ方
法の再考に関しては、Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7 th ed. 1991) を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、Enzyme Immu
noassay (Maggio, ed., 1980); 及びHarlow & Lane, 前記に広く再考されている
、いくつかの遠心分離法のいずれかにより行われ得る。
【０２２２】 B．免疫学的結合アッセイ： T2Rタンパク質は、多くの良く認識されている免疫学的結合アッセイのいずれ
かを用いて検出され、そして/又は定量化され得る（例えば、アメリカ特許第4,3
66,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；及び第4,837,168号を参照のこと）
。一般的なイムノアッセイの再考に関しては、Methods in Cell Biology: Antib
odies in Cell Biology, vol. (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunol
ogy (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991) を参照のこと。免疫学的結合アッセ
イ（又はイムノアッセイ）は、典型的には、選択のタンパク質又は抗原に対して
特異的に結合する抗体を使用する（この場合、T2Rファミリーメンバー又はその
抗原性副配列）。抗体（例えば、抗−T2R）は、当業者に良く知られ、そして上
記のような多くの手段のいずれかにより生成され得る。
【０２２３】 イムノアッセイはまた、しばしば、抗体及び抗原により形成される複合体に対
して特異的に結合し、そしてそれをラベリングするためにラベリング剤を使用す
る。ラベリング剤はそれ自体、抗体/抗原複合体を含んで成る成分の１つであり
得る。従って、ラベリング剤は、ラベルされたT2Rポリペプチド又はラベルされ
た抗−T2R抗体であり得る。他方では、ラベリング剤は、抗体/T2R複合体に対し
て特異的に結合する第３の成分、例えば第２抗体であり得る（第２抗体は典型的
には、第１抗体が由来する種の抗体に対して特異的である）。
【０２２４】 免疫グロブリン不変領域を特異的に結合できる他のタンパク質、例えばタンパ
ク質A又はタンパク質Gはまた、ラベリング剤として使用され得る。それらのタン
パク質は、種々の種からの免疫グロブリン不変領域と強い非免疫学的反応性を示
す（例えば、Kronvalなど., J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973); Akerstromな
ど., J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985) を参照のこと）。ラベリング剤は、
検出できる成分、例えばビオチン（これに、もう１つの分子、例えばストレプタ
ビジンが特異的に結合できる）により変性され得る。種々の検出できる成分は、
当業者に良く知られている。
【０２２５】 アッセイを通して、インキュベーション及び/又は洗浄段階は、試薬の個々の
組み合わせの後に必要とされる。インキュベーション段階は、約５秒〜数時間、
任意には約５分〜24時間である。しかしながら、インキュベーション時間は、ア
ッセイ型、抗原、溶液の体積、濃度及び同様のものに依存するであろう。通常、
アッセイは、周囲温度で行われるが、但しそれらは、一定の温度範囲、例えば10
℃〜40℃の範囲で行われ得る。
【０２２６】 非競争アッセイ型： サンプルにおけるT2Rタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競争又
は非競争のいずれかであり得る。非競争イムノアッセイは、抗原の量が直接的に
測定されるアッセイである。1つの好ましい“サンドイッチ”アッセイにおいて
は、抗−T2R抗体が、それらが固定される固体支持体に直接的に結合され得る。
それらの固定された抗体は、試験サンプルに存在するT2Rタンパク質を捕獲する
。
【０２２７】 従って、次にT2Rタンパク質は、ラベリング剤、例えばラベルを担持する第２T
2R抗体により固定される。他方では、第２抗体は、ラベルを欠失することができ
るが、しかしそれは、第２抗体が由来する種の抗体に対して特異的なラベルされ
た第３抗体により結合され得る。第２又は第３抗体は典型的には、検出できる成
分、例えばビオチン（これに、もう1つの分子、例えばストレプタビジンが特異
的に結合する）により変性され、検出できる成分が提供される。
【０２２８】 競争アッセイ型： 競争アッセイにおいて、サンプルに存在するT2Rタンパク質の存在は、サンプ
ルに存在する未知のT2Rタンパク質により、抗−T2R抗体から置換された（競争除
去された）、既知の添加された（外因性）T2Rタンパク質の量を測定することに
よって、間接的に測定される。1つの競争アッセイにおいては、既知量のT2Rタン
パク質がサンプルに添加され、そして次に、サンプルが、T2Rの特異的に結合す
る抗体と接触せしめられる。
【０２２９】 抗体に結合される外因性T2Rタンパク質の量は、サンプルに存在するT2Rタンパ
ク質の濃度に反比例する。特に好ましい態様においては、抗体が固体支持体上に
固定される。抗体に結合されるT2Rタンパク質の量は、T2R/抗体複合体に存在す
るT2Rタンパク質の量を測定することによって、又は他方では、残存する複合体
化されなかったタンパク質の量を測定することによって決定され得る。T2Rタン
パク質の量は、ラベルされたT2R分子を供給することによって検出され得る。
【０２３０】 ハプテン阻害アッセイは、もう1つの好ましい競争アッセイである。このアッ
セイにおいては、既知のT2Rタンパク質が固体支持体上に固定される。既知量の
抗−T2R抗体がサンプルに添加され、そして次に、サンプルが固定されたT2Rと接
触せしめられる。既知の固定されたT2Rタンパク質に結合されたT2R抗体の量は、
サンプルに存在するT2Rタンパク質の量に反比例する。再び、固定された抗体の
量は、抗体の固定された画分、又は溶液に残る抗体の画分のいずれかを検出する
ことによって検出され得る。検出は、抗体がラベルされる場合、直接的であり、
又は上記のように、抗体に対して特異的に結合するラベルされた成分の続く添加
により間接的であり得る。
【０２３１】 交差反応性の決定： 競争結合型でのイムノアッセイがまた、交差反応性決定のために使用され得る
。例えば、配列番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番
号12, 配列番号14, 配列番号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番
号25, 配列番号27, 配列番号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番
号38, 配列番号41, 配列番号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番
号57, 配列番号61 ，配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列
番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90,
【０２３２】 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号1
02, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配
列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号1
24, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配
列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号1
46, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配
列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号165により少
なくとも部分的にコードされるタンパク質は、固体支持体に固定され得る。
【０２３３】 タンパク質（例えば、T2Rタンパク質及び相同体）が、固定された抗原への抗
血清の結合について競争するアッセイに添加される。固定されたタンパク質への
抗血清の結合についての添加されたタンパク質の競争する能力が、配列番号2,
配列番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配
列番号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配
列番号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配
列番号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61 ，
配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番号86,
配列番号88,
【０２３４】 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号10
0, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列
番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122
, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列
番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144
, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列
番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号1
65によりコードされるT2Rポリペプチドのそれ自体と競争する能力に比較される
。
【０２３５】 上記タンパク質についての％交差反応性は、標準の計算を用いて計算される。
上記列挙される、個々の添加されたタンパク質との10％以下の交差反応性を有す
るそれらの抗血清が選択され、そしてプールされる。交差反応する抗体は任意に
は、考慮される添加されたタンパク質、例えばおおよそ関連する相同体による免
疫吸収により、プールされた抗血清から除去される。さらに、T2Rファミリーメ
ンバーを同定するために使用される保存されたモチーフを表す次のアミノ酸配列
を含んで成るペプチドが、交差−反応性の決定に使用され得る：配列番号166,
配列番号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170又は配列番号171。
【０２３６】 次に、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清が、T2Rファミリーメンバー
のたぶん対立遺伝子又は多形変異体であると思われる第２タンパク質を、免疫原
タンパク質（すなわち、配列番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番
号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番
号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番
号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番
号54, 配列番号57, 配列番号61 ，配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列
番号82, 配列番号84, 配列番号86,
【０２３７】 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98
, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列
番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120
, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列
番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142
, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列
番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163
及び配列番号165によりコードされるT2Rタンパク質）に比較するために、上記の
ような競争結合イムノアッセイに使用される。
【０２３８】 この比較を行うためには、２種のタンパク質が広範囲の濃度でそれぞれアッセ
イされ、そして固定されたタンパク質への抗血清の結合を50％阻害するために必
要とされる個々のタンパク質の量が決定される。結合の50％を阻害するのに必要
とされる第２タンパク質の量が、結合の50％を阻害するのに必要とされる、配列
番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号
14, 配列番号16, 配列番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号
27, 配列番号29, 配列番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号
41, 配列番号43, 配列番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号
61 ，配列番号63，配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番
号86, 配列番号88, 配列番号90,
【０２３９】 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号1
02, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配
列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号1
24, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配
列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号1
46, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配
列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号165によりコ
ードされるタンパク質の量の10倍以下である場合、前期第２タンパク質は、TR2
免疫原に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合すると言わ
れる。
【０２４０】 配列番号166−171に対して生ぜしめられた抗体はまた、T2RファミリーのGPCR
に対してのみ特異的に結合するが、しかし他のファミリーからのGPCRに対しては
結合しない抗体を調製するためにも使用され得る。 T2Rファミリーの特定のメンバー、例えばT2R01に対して特異的に結合するポリ
クローナル抗体は、他のT2Rファミリーメンバーを用いて、交差反応性抗体を控
除することによって製造され得る。種−特異的ポリクローナル抗体は、類似する
態様で製造され得る。例えば、ヒトT2R01に対して特異的な抗体は、オルト体配
列、例えばラットR2R01又はマウスT2R19と交差反応する抗体を控除することによ
って製造され得る。
【０２４１】 他のアッセイ型： ウェスターンブロット（イムノブロット）分析は、サンプルにおけるT2Rタン
パク質の存在を検出し、そして定量化するために使用される。この技法は一般的
に、分子量に基づいてのゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離し、適切
な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は
誘導体化されたナイロンフィルター）に、前記分離されたタンパク質を移し、そ
してT2Rタンパク質を特異的に結合する抗体とサンプルとをインキュベートする
ことを含んで成る。抗−T2Rポリペプチド抗体は、固体支持体上のT2Rポリペプチ
ドに特異的に結合する。それらの抗体は、直接的にラベルされ得、又は他方では
、従って、抗−T2R抗体に対して特異的に結合する、ラベルされた抗体（例えば
、ラベルされた羊抗−マウス抗体）を用いて検出され得る。
【０２４２】 他のアッセイ型は、特定の分子（例えば、抗体）を結合するように企画された
リポソームを使用し、そして封入された試薬又はマーカーを開放するリポソーム
イムノアッセイ（LIA）を包含する。次に、開放された化学物質が、標準の技法
に従って検出される（Monroeなど., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)
を参照のこと）。
【０２４３】 非特異的結合の削減： 当業者は、イムノアッセイにおける非特異的結合を最少にすることが、しばし
ば所望されることを理解するであろう。特に、アッセイが固体支持体上に固定さ
れた抗原又は抗体を包含する場合、支持体に対する非特異的結合の量を最少にす
ることが所望される。そのような非特異的結合を削除するための手段は、当業者
に良く知られている。典型的には、この技法は、タンパク質性組成物による支持
体の被覆を包含する。特に、タンパク質組成物、例えばウシ血清アルブミン（BS
A）、脱脂粉乳及びゼラチンが広く使用され、そして脱脂粉乳が最も好ましい。
【０２４４】 ラベル： アッセイに使用される特定のラベル又は検出できるグループは、それがアッセ
イに使用される抗体の特異的結合を有意に妨害しない限り、本発明の決定的な観
点ではない。検出できるグループは、検出できる物理的又は化学的性質を有する
いずれかの材料であり得る。そのような検出できるラベルは、イムノアッセイの
分離において良く開発されており、そして一般的に、そのような方法において有
用なラベルのほとんどは本発明に適用され得る。
【０２４５】 従って、ラベルは、分光、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学的又は化
学的手段により検出できるいずれかの組成物である。本発明において有用なラベ
ルは、磁気ビーズ（例えば、DYNABEADSTM）、蛍光色素（例えば、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、Texasレッド、ローダミン、及び同様のもの）、放射性
ラベル（例えば、3H, 125I, 35S, 14C又は32P）、酵素（例えば、ホースラディ
シュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISAに通常使用される他
のもの）、及び比色ラベル、例えばコロイド状金又は着色されたガラス又はプラ
スチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）を包
含する。
【０２４６】 ラベルは、当業界において良く知られている方法に従って、アッセイの所望す
る成分に直接的又は間接的に結合され得る。上記に示されるように、広範囲の種
類のラベルが使用され、そしてラベルの選択は、必要とされる感度、化合物との
接合の容易性、安定性必要条件、入手できる装置及び処理規定に依存する。
【０２４７】 非放射性ラベルは、しばしば、間接的手段により達成される。一般的に、リガ
ンド分子（例えば、ビオチン）が、分子に共有結合される。次に、リガンドが、
もう１つの分子（例えば、ストレプタビジン）に結合し、ここでこの分子は、検
出でき、又はシグナルシステム、例えば検出できる酵素、蛍光化合物、又は化学
発光化合物に共有結合される。リガンド及びそれらの標的物は、T2Rタンパク質
を認識する抗体、又は抗−T2Rを認識する第２抗体といずれか適切な組み合わせ
で使用され得る。
【０２４８】 分子はまた、例えば酵素又は蛍光団との結合により、シグナル生成化合物に直
接的に接合され得る。ラベルとしての興味ある酵素は主として、ヒドロラーゼ、
特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグルコシダーゼ又はオキシドターゼであ
ろう。蛍光化合物は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導
体、ダンシル、ウンベリフェロン、等を包含する。化学発光化合物は、ルシフェ
リン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを包含する。
使用され得る種々のラベリング又はシグナル生成システムの再考に関しては、ア
メリカ特許第4,391,904号を参照のこと。
【０２４９】 ラベルを検出するための手段は、当業者に良く知られている。従って、例えば
、ラベルが放射性ラベルである場合、検出手段はシンチレーションカウンター、
又はオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを包含する。ラベルが
蛍光ラベルである場合、それは、適切な光の波長により蛍光色素を励起し、そし
て得られる蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、視覚的に、写真
不フィルムにより、電子検出機、例えば電荷連結装置（CCD）又は光電子増倍管
の使用により、及び同様のものにより検出され得る。
【０２５０】 同様に、酵素ラベルは、酵素のための適切な基質を提供し、そしてその得られ
る反応生成物を検出することによって検出され得る。最終的に、単純な比色ラベ
ルが、ラベルにより結合される色彩を観察することによって、単純に検出され得
る。従って、種々のデップスティックアッセイにおいては、接合された金はしば
しば、ピンク色に見え、そして種々の接合されたビーズはビーズの色に見える。
【０２５１】 いくつかのアッセイ型は、ラベルされた成分の使用を必要としない。例えば、
凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合、抗
原−被覆された粒子が、標的抗体を含んで成るサンプルにより凝集される。この
型においては、成分はラベルする必要はなく、そして標的抗体の存在は、単純な
視覚調査により検出される。
【０２５２】 VI．T2Rファミリーメンバーのモジュレーターについてのアッセイ： A．T2Rタンパク質活性についてのアッセイ： T2Rファミリーメンバー及びそれらの対立遺伝子及び多形変異体は、味覚伝達
、例えば苦味味覚伝達に関与するG−タンパク質結合受容体である。T2Rポリペプ
チドの活性は、例えばリガンド結合（例えば、放射性リガンド結合）、第２メッ
センジャー（例えば、cAMP, cGMP, IP3, DAG又はCa2+）、イオン流、リン酸化レ
ベル、転写レベル、神経伝達物質レベル及び同様のものを測定する、機能的、化
学的及び物理的効果を決定するために種々のインビトロ及びインビボアッセイを
用いて、評価され得る。さらに、そのようなアッセイは、T2Rファミリーメンバ
ーのインヒビター及び活性化因子について試験するために使用され得る。モジュ
レーターはまた、T2R受容体の遺伝子的に変更されたバージョンでもあり得る。
味覚伝達活性のそのようなモジュレーターは、味覚を商品化するために、例えば
苦味味覚の検出を変性するために有用である。
【０２５３】 アッセイのT2Rタンパク質は典型的には、配列番号1, 配列番号3, 配列番号5,
配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17,
配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28,
配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39,
配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48,
配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56,
配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65,
配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70,
【０２５４】 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 7
6, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号8
7, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号9
9, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列
番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121
, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列
番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143
, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列
番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164の配列を
有するポリペプチド又は保存的に修飾されたその変異体から選択される。
【０２５５】 他方では、アッセイのT2Rタンパク質は、真核生物に由来し、そして配列番号1
, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13,
配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24,
配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35,
配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46,
配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53,
配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62,
配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69,
配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73,
【０２５６】 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号8
1, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号9
3, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番
号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115,
配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番
号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137,
配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番
号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160,
配列番号162, 及び配列番号164に対してアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸副
配列を包含する。
【０２５７】 一般的に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも60％、任意には少なくとも70％
〜85％、任意には少なくとも90〜95％であろう。任意には、アッセイのポリペプ
チドは、T2Rタンパク質のドメイン、例えば細胞外ドメイン、トランスメンブラ
ン領域、トランスメンブランドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン
、サブユニット結合ドメイン、活性部位及び同様のものを含んで成る。T2Rタン
パク質又はそのドメインのいずれかが、本明細書に記載されるアッセイに使用さ
れるキメラタンパク質を創造するために、異種タンパク質に共有結合され得る。
【０２５８】 T2R受容体活性のモジュレーターは、上記に記載のようにして、組換え又は天
然に存在するT2Rポリペプチドを用いて試験される。タンパク質は、単離され、
細胞において発現され、細胞に由来する膜において発現され、組織又は動物にお
いて発現され得る。例えば、舌スライス、舌からの分離された細胞、形質転換さ
れた細胞、又は膜が使用され得る。調節は、本明細書に記載されるインビトロ又
はインビボアッセイの1つを用いて試験される。
【０２５９】 味覚伝達はまた、十分な長さのT2R−GPCR又はキメラ分子、例えば異種シグナ
ル伝達ドメインに共有結合されるT2R受容体の細胞外ドメイン又はトランスメン
ブラン領域又はその組み合わせ、又はR2R受容体のトランスメンブラン及び/又は
細胞質ドメインに共有結合される異種細胞外ドメイン及び/又はトランスメンブ
ラン領域を用いて、溶性又は固体状態反応によりインビトロで試験され得る。さ
らに、興味あるタンパク質のリガンド−結合ドメインは、リガンド結合をアッセ
イするために溶性又は固体状態反応においてインビトロ使用され得る。多くの態
様においては、T2Rポリペプチドのすべて又は一部、及びT2Rの膜への局在化を促
進する追加の配列、例えばロドプシン例えばロドプシンタンパク質のN−末端フ
ラグメントを含んで成るキメラ受容体が製造されるであろう。
【０２６０】 T2Rタンパク質、ドメイン又はキメラタンパク質に対するリガンド結合は、溶
液において、固相に結合される二層膜において、脂質単層において又は小胞にお
いて試験され得る。モジュレーターの結合は、例えば分光特徴（例えば、蛍光、
吸光、屈折率）、流体力学（例えば、形状）、クロマトグラフィー又は溶解性質
を用いて試験され得る。
【０２６１】 受容体−G−タンパク質相互作用はまた、試験され得る。例えば、受容体へのG
−タンパク質の結合、又は受容体からのその開放が試験され得る。例えば、GTP
の不在下で、活性化因子は、Gタンパク質（すべての３種のサブユニット）と受
容体との強い複合体の形成を導くであろう。この複合体は、上記に示されるよう
に、種々の手段で検出され得る。そのようなアッセイは、例えば強い複合体を形
成するGTPの不在下で受容体及びGタンパク質に活性化因子を付加することによっ
て、インヒビターについて調査し、そして受容体−Gタンパク質複合体の解離を
見ることによってインヒビターについてスクリーンするために改良され得る。GT
Pの存在下で、他の２種のGタンパク質サブユニットからのGタンパク質のαサブ
ユニットの開放性は、活性化の基準として作用する。
【０２６２】 特に好ましい態様においては、T2R−ガスデュシン相互作用が、T2R受容体活性
化の機能としてモニターされる。例IXに示されるように、マウスT2Rは、ガスデ
ュシンとの強いシクロヘキシミド−依存性カップリングを示す。ガスデュシンと
T2R受容体とのそのようなリガンド依存性カップリングは、T2Rファミリーのいず
れかのメンバーのモディファイアーを同定するためのマーカーとして使用され得
る。
【０２６３】 活性化された又は阻害されたG−タンパク質は、標的酵素、チャネル及び他の
エフェクタータンパク質を変更するであろう。この種類の例は、可視システムに
おけるトランスデュシンによるcGMPホスホジエステラーゼ、刺激G−タンパク質
によるアデニル酸シクラーゼ、Gq及び他の同起源Gタンパク質によるホスホリパ
ーゼC、及びGi及び他のGタンパク質による種々のチャネルの調節の活性化である
。下流結果、例えばホスホリパーゼCによるジアシルグリセロール及びIP3の生成
、及びIP3によるカルシウム移動度が試験され得る。
【０２６４】 好ましい態様においては、T2Rポリペプチドは、その成熟及び分泌経路を通し
ての標的化を促進する異種カペロン配列を有するキメラ受容体として真核細胞に
おいて発現される。好ましい態様において、異種配列は、ロドプシン配列、例え
ばロドプシンのN−末端フラグメントである。そのようなキメラT2R受容体は、い
ずれかの真核細胞、例えばHEK−293細胞において発現され得る。好ましくは、細
胞は、機能的Gタンパク質、例えば細胞内シグナル経路、又はシグナルタンパク
質、例えばホスホリパーゼCβにキメラ受容体をカップリングできるCα15を含ん
で成る。そのような細胞におけるそのようなキメラ受容体の活性化は、いずれか
の標準方法を用いて、例えば細胞いおけるFURA−２依存性蛍光を検出することに
よって細胞内カルシウムの変化を検出することによって検出され得る。
【０２６５】 活性化されたGPCR受容体は、受容体のC−末端（及びたぶん、他の部位）をリ
ン酸化するキナーゼのための基質になる。従って、活性化因子は、シンチレーシ
ョンカウンターによりアッセイされ得る、受容体へのγ−ラベルされたGTPから
の32Pの移行を促進するであろう。C−末端のリン酸化は、アレスチン−様タンパ
ク質の結合を促進し、そしてG−タンパク質の結合を妨げるであろう。キナーゼ/
アレスチン経路は、多くのGPCR受容体の脱感作化において目的の役割を演じる。
例えば、味覚受容体の持続期間を調節する化合物は、所望する味覚の延長又は不
快な味覚を止める手段として有用である。GPCRシグナル伝達及びシグナル伝達を
アッセイするための方法の一般的な再考に関しては、例えばMethods in Enzymol
ogy, vols. 237 and 238 (1994) and volume 96 (1983); Bourneなど., Nature
10: 349: 117-27 (1991); Bourneなど., Nature 348: 125-32 (1990); Pitcher
など., Annu. Rev. Biochem. 67: 653-92 (1998) を参照のこと。
【０２６６】 可能性あるT2Rタンパク質インヒビター又は活性化因子により処理されるサン
プル又はアッセイが、調節の程度を試験するために、試験化合物を含まない対照
サンプルに比較される。そのようなアッセイは、特定の受容体を活性化すること
が知られている苦味味覚体の存在下で行われ得、そして苦味−味覚体−依存性活
性化の調節がモニターされる。対照サンプル（活性化因子又はインヒビターによ
り処理されていない）は、100の相対的T2R活性値を割り当てられる。T2Rタンパ
ク質の阻害は、対照に対するT2R活性値が約90％、任意には50％、任意には25〜0
％である場合に達成される。T2Rタンパク質の活性化は、対照に対するT2R活性値
が110％、任意には150％、200〜500％又は1000〜2000％である場合に達成される
。
【０２６７】 イオン流の変化は、T2Rタンパク質を発現する細胞又は膜の分極化（すなわち
、電位）の変化を決定することによって評価され得る。細胞分極化の変化を決定
するための１つの手段は、電圧―クランプ及びパッチ−クランプ技法、例えば細
胞−結合されたモード、“インサイドーアウト”モード及び“完全細胞”モード
による電流の変化（それにより、分極化の変化を測定する）を測定することによ
ってである（例えば、Ackermanなど., New Engl. J. Med 336:1575-1595 (1977)
を参照のこと）。
【０２６８】 完全細胞電流は便利には、標準の方法を用いて決定される（例えば、Hamilな
ど．，Pflugers. Archiv. 391: 85 (1981) を参照のこと）。他の既知のアッセ
イは、放射性ラベルされたイオン流アッセイ、及び電圧−感受性色素を用いての
蛍光アッセイを包含する（例えば、Vestergarrd−Bogindなど., J. Membrane Bi
ol. 88: 67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol. 4: 269-277 (1997); D
anielなど., J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991); Holevinskyなど., J.
Membrane Biology 137: 59-70 (1994) を参照のこと）。一般的に、試験される
べき合成物は、１pM〜100mMの範囲で存在する。
【０２６９】 ポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果は、上記いずれかのパラメータ
ーを試験することによって測定され得る。GPCR活性に影響を及ぼすいずれかの適
切な生理学的変化は、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価す
るために使用され得る。その機能的結果が損なわれていない細胞又は動物を用い
て決定される場合、また、種々の効果、例えば伝達物質放出、ホルモン放出、既
知の及び特徴づけられていない遺伝子マーカー（例えば、ノザンブロット）の転
写的変化、細胞代謝、例えば細胞増殖の変化又はpH変化、及び細胞内第２メッセ
ンジャー、例えばCa2+、IP3、cGMP又はcAMPの変化を測定することができる。
【０２７０】 G−タンパク質結合受容体についての好ましいアッセイは、受容体活性を報告
するためにイオン又は電圧感受性色素により負荷される細胞を包含する。そのよ
うな受容体の活性を決定するためのアッセイはまた、試験された化合物の活性を
評価するために、負又は正の対照として他のG−タンパク質結合受容体のための
アゴニスト及びアンタゴニストを使用することができる。調節化合物（例えば、
アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいては、細胞質又
は膜電圧におけるイオンのレベルの変化は、それぞれ、イオン感受性又は膜電圧
蛍光インジケーターを用いてモニターされるであろう。
【０２７１】 イオン感受性インジケーター及び電圧の中で、使用さえ得るプローブは、Mole
cular Probes 1997 Catalogに開示されるそれらのものである。G−タンパク質結
合受容体に関しては、不規則のG−タンパク質、例えばGα15及びGα16が、選択
のアッセイにおいて使用され得る。（Wilkieなど., Proceeding Acad. USA 88:
10049-10053 (1991)）。そのような不規則のG−タンパク質は、広範囲の受容体
のカップリングを可能にする。
【０２７２】 受容体活性化は典型的には、続く細胞内現象、例えばカルシウムイオンの細胞
内貯蔵物を開放する第２メッセンジャー、例えばIP3の上昇を開始する。いくつ
かのG−タンパク質結合受容体の活性化は、ホスファチジルイノシトールのホス
ホリパーゼC−介在加水分解を通してイノシトール三リン酸（IP3）の形成を刺激
する（Berridge & Irvine, Nature 321:315-21 (1984)）。IP3は、細胞内カルシ
ウムイオン貯蔵物の開放を刺激する。
【０２７３】 従って、細胞質カルシウムイオンレベルの変化、又は第２メッセンジャーレベ
ル、例えばIP3の変化は、G−タンパク質の結合受容体機能を評価するために使用
され得る。そのようなG−タンパク質結合受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵
物からの及びイオンチャネルの活性化を通しての寄与の結果として、高められた
細胞質カルシウムレベルを示すことができ、この場合、任意には、キレート化剤
、例えばEGTAにより補充されたカルシウム−フリーの緩衝液においてそのような
アッセイを行う必要はないけれども、内部貯蔵物からのカルシウム開放に起因す
る蛍光応答を区別することが所望される。
【０２７４】 他のアッセイは、活性化される場合、酵素、例えばアデニル酸シクラーゼを活
性化するか、又は阻害することによって、細胞内環状ヌクレオチド、例えばcAMP
又はcGMPのレベルの変化をもたらす受容体の活性を決定することを包含すること
ができる。環状ヌクレオチド−ゲートイオンチャネル、例えば桿状光受容体細胞
チャネル、及びcAMP又はcGMPの結合による活性化に基づいてカチオンに対して透
過できる嗅覚ニューロンチャネルが存在する（例えば、Altenhofenなど., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 9868-9872 (1991) 及びDhallanなど., Nature 347:
184-187 (1990) を参照のこと）。
【０２７５】 受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの低下をもたらす場合、アッセイに
おける細胞に受容体−活性化化合物を添加する前、細胞内環状ヌクレオチドレベ
ルを高める剤、例えばホルスコリン（forskolin）に対して細胞を暴露すること
が好ましい。このタイプのアッセイのための細胞は、環状ヌクレオチド−クレー
トイオンチャネルをコードするDNA、GPCRホスファターゼ、及び活性化される場
合、細胞質において環状ヌクレオチドレベルの変化を引き起こす受容体（例えば
、一定のグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン
受容体、セロトニン受容体及び同様のもの）をコードするDNAによる宿主細胞の
同時トランスフェクションにより製造され得る。
【０２７６】 好ましい態様においては、T2Rタンパク質活性は、ホスホリパーゼCシグナル伝
達経路に受容体を連結する不規則G−タンパク質と共に、異種細胞においてT2R遺
伝子を発現することによって測定される（Offermanns & Simon, J. Biol. Chem.
270: 15175-15180 (1995) を参照のこと）。任意には、前記細胞系は、HEK−29
3（天然において、T2R遺伝子を発現しない）であり、そして不規則G−タンパク
質はGα15である（Offermanns & Simon, 前記）。味覚伝達の調節は、T2Rタンパ
ク質と結合する分子の投与を通してT2Rシグナル伝達経路の調節に応答して変化
する、細胞内Ca2+レベルの変化を測定することによってアッセイされる。Ca2+レ
ベルの変化は任意には、蛍光Ca2+インジケーター色素及び蛍光測定イメージング
を用いて測定される。
【０２７７】 1つの態様においては、細胞内cAMP又はcGMPの変化は、イムノアッセイを用い
て測定され得る。Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175-15180 (199
5) に記載される方法が、cAMPのレベルを決定するために使用され得る。また、F
elley−Boscoなど., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11: 159-164 (1994)
に記載される方法は、cGMPのレベルを決定するために使用され得る。さらに、cA
MP及び/又はcGMPを測定するためのアッセイキットが、アメリカ特許第4,115,538
号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【０２７８】 もう１つの態様においては、ホスファチジルイノシトール（PI）加水分解は、
アメリカ特許第5,436,128号（引用により本明細書に組み込まれる）に従って分
析され得る。手短には、アッセイは、3H−ミオイノシトールによる48又はそれ以
上の間の細胞のラベリングを包含する。ラベルされた細胞は、試験化合物により
１時間、処理される。処理された細胞は、溶解され、そしてイノシトールリン酸
がイオン交換のクロマトグラフィーにより分離され、そしてシンチレーションカ
ウンティングにより定量化された後、クロロホルム−メタノール−水により抽出
する。折りたたみ刺激は、緩衝液対照の存在下でのcpmに対するアゴニストの存
在下でのcpmの割合を計算することによって決定される。同様に、折りたたみ阻
害は、緩衝液対照（アゴニストを含んでも又は含まなくても良い）の存在下での
cpmに対するアンタゴニストの存在下でのcpmの割合を計算することによって決定
される。
【０２７９】 もう1つの態様においては、転写レベルは、シグナルに伝達に対する試験化合
物の効果の評価するために測定され得る。興味あるT2Rタンパク質を含む宿主細
胞は、いずれかの相互反応をもたらすために十分な時間、試験化合物と接触せし
められる。そのような相互作用をもたらすための時間は、例えば時間の推移を進
行せしめ、そして時間の関数として転写のレベルを測定することによって実験的
に決定され得る。転写の量は、当業者に適切であることが知られているいずれか
の方法を用いることによって測定され得る。例えば、興味あるタンパク質のmRNA
発現は、ノザンブロットを用いて検出され得、又はそれらのポリペプチド生成物
は、イムノアッセイを用いて同定され得る。
【０２８０】 他方では、レポーター遺伝子を用いての、転写に基づくアッセイは、アメリカ
特許第5,436,128号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようして使
用され得る。レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼで
あり得る。さらに、興味あるタンパク質は、第２レポーター、例えば緑色蛍光タ
ンパク質への結合を通して間接的レポーターとして使用され得る（例えば、Mist
ili & Spector, Nature Biotechnology 15: 961-964 (1997) を参照のこと）。
【０２８１】 次に、転写の量が、試験化合物の不在下での同じ細胞における転写の量に比較
され、又はそれは、興味あるタンパク質を欠いている実質的に同一の細胞におけ
る転写の量と比較され得る。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が調製されるが
、しかし異種DNAの導入により修飾されていない同じ細胞に由来することができ
る。転写の量のいずれかの差異は、試験化合物が興味あるタンパク質の活性を、
いくらかの態様で変更していることを示す。
【０２８２】 B．モジュレーター： T2Rファミリーメンバーのモジュレーターとして試験される化合物は、いずれ
かの化学的小化合物、又は生物学的存在物、例えばタンパク質、糖、核酸又は脂
質であり得る。他方では、モジュレーターは、T2R遺伝子の遺伝子的に変更され
たバージョンであり得る。典型的には、試験化合物は、化学的小分子及びペプチ
ドであろう。実質的にいずれの化合物でも、本発明のアッセイにおいて可能性あ
るモジュレーター又はリガンドとして使用され得るが、但し最も頻繁には、水溶
液又は有機（特に、DMSO−基材の）溶液に溶解され得る化合物が使用される。
【０２８３】 アッセイは、アッセイ段階を自動化し、そして典型的には、同時に行われる（
例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上でのマイクロタ
イター型において）、アッセイにいずれかの便利な源からの化合物を供給するこ
とによって、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするよう企画される。
化合物の多くの次のような供給者が存在することが理解されるであろう：Sigma
（St. Louis, MO）、Aldrich（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich (St. Louis, M
O), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland) 及び同様のも
の。
【０２８４】 1つの好ましい態様においては、高処理量スクリーニング方法は、多数の可能
性ある治療化合物（可能性あるモジュレーター又はリガンド化合物）を含む結合
化学ライブラリー又はペプチドライブラリーを供給することを包含する。次にそ
のような“結合化学ライブラリー”又は“リガンドライブラリー”は、所望する
特徴的活性を示すそれらのライブラリーメンバー（特に、化学的種又はサブクラ
ス）を同定するために、本明細書に記載のようにして、１又は複数のアッセイに
おいてスクリーンされる。このようにして同定された化合物は、従来の“先導化
合物”として作用することができ、又はそれ自体、可能性ある又は実際的な治療
剤として使用され得る。
【０２８５】 結合化学ライブラリーは、多くの化学“構築ブロック”、例えば試薬を組合す
ことによって、化学的合成又は生物学的合成により生成される種々の化合物の収
集物である。例えば、線状結合化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラ
リーは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数
）についてあらゆる可能な態様で１組の化学的構築ブロック（アミノ酸）を組合
すことによって形成される。数百万の化合物は、化学的構築ブロックのそのよう
な結合性混合物を通して合成され得る。
【０２８６】 結合化学ライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に良く知られてい
る。そのような結合化学ライブラリーは、ペプチドライブラリーを包含するが、
但しそれらだけには限定されない（例えば、アメリカ特許第5,010,175号；Furka
, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) 及びHoughtonなど., Nature
354: 84-88 (1991) を参照のこと）。種々の化学ライブラリーを生成するために
は、他の化学物質がまた使用され得る。
【０２８７】 そのような化学物質は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定され
ない：ペプトイド（例えば、PCT公開WO91/19735号）、コードされたペプチド（
例えば、PCT公開WO93/20242号）、ランダムバイオ−オリゴマー（例えば、PCT公
開WO92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、アメリカ特許第5,288,514号）
、ダイバーソマー（diversomer）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン及び
ジペプチド（Hobbsなど., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）
、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaなど., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (19
92)）、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド擬似体（Hirschmannなど.
, J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーの類
似有機合成物（Chenなど., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴ
カルバメート（Choなど., Science 261: 1303 (1993)）、及び/又はペプチドホ
スホネート（Campbellなど., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、
【０２８８】 核酸ライブラリー（Ausubel, Berger及びSambrook；すべて前記）、ペプチド
核酸ライブラリー（例えば、アメリカ特許第5,539,083号）、抗体ライブラリー
（Vaughnなど., Nature Biotechnology, 14 (3): 309-314 (1996) 及びPCT/US96
/10287号）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangなど., Science, 274: 1520
-1522 (1996) 及びアメリカ特許第5,593,853号を参照のこと）、有機小分子ライ
ブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C & EN, Jam 18, p. 33 (1993);
イソプレノイド、アメリカ特許第5,569,588号；チアゾリジノン及びメタチザノ
ン、アメリカ特許第5,549,974号；ピロリジン、アメリカ特許第5,525,735号及び
第5,519,134号；モルホリノ化合物、アメリカ特許第5,506,337号；ベンゾジアゼ
ピン、アメリカ特許第5,288,514号及び同様のもの）。
【０２８９】 結合ライブラリーの調製のための装置は市販されている（例えば、357MPS, 39
0MPS，Advanced Chem Tech, louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 4
33A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Phus, Millipore, Bedford,
MAを参照のこと）。さらに、多くの結合ライブラリーは、それら自体市販されて
いる（例えば、CamGenex, Princeton, N. J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3
D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 等を参照
のこと）。
【０２９０】 C．固体状態及び可溶性高処理量アッセイ： １つの態様において、本発明は、分子、例えばドメイン、例えばリガンド結合
ドメイン、細胞外ドメイン、トランスメンブランドメイン（例えば、７種のトラ
ンスメンブラン領域及び細胞質ゾルループを含むドメイン）、トランスメンブラ
ンドメイン及び細胞質ドメイン、活性部位サブユニット結合領域、等；キメラ分
子を創造するために異種タンパク質に共有結合されているドメイン；又はT2Rタ
ンパク質を発現する細胞又は組織（天然に存在するか又は組換えのいずれか）を
用いての溶性アッセイを提供する。もう１つの態様においては、本発明は、高処
理量型での固相に基づくインビトロアッセイを提供し、ここでドメイン、キメラ
分子、T2Rタンパク質、又はT2Rを発現する細胞又は組織が固相支持体に結合され
る。
【０２９１】 本発明の高処理量アッセイにおいては、数千の異なったモジュレーター又はリ
ガンドを１日でスクリーンすることが可能である。特に、マイクロタイタープレ
ートの個々のプレートが、選択された可能性あるモジュレーターに対する別のア
ッセイを行うために使用され得、又は濃度又はインキュベーション時間の効果が
観察される予定である場合、５〜10個のウェルごとに、単一のモジュレーターを
試験することができる。従って、単一の標準のマイクロタイタープレートは、約
100（例えば、96）のモジュレーターをアッセイすることができる。1536個のウ
ェルプレートが使用される場合、単一のプレートは約100〜約1500の異なった化
合物を容易にアッセイすることができる。１日当たり数種の異なったプレートを
アッセイすることが可能であり；アッセイは、本発明の統合されたシステムを用
いて、約6,000〜20,000の異なった化合物をスクリーンすることが可能である。
つい最近、試薬操作へのミクロ流体アプローチが開始されている。
【０２９２】 興味ある分子は、共有又は非共有結合、例えば標識を通して、直接的又は間接
的に、固体状態成分に結合され得る。標識は、いずれの種類の成分ででもあり得
る。一般的に、標識（標識結合剤）を結合する分子は固体支持体に固定され、そ
して興味ある標識された分子（例えば、興味ある味覚伝達分子）は、標識及び標
識結合剤の相互作用により固体支持体に結合される。
【０２９３】 多くの標識及び標識結合剤が、文献に記載される既知の分子相互作用ウェルに
基づいて使用され得る。例えば、標識が天然の結合剤、例えばビオチン、タンパ
ク質A、又はタンパク質Gを有する場合、それは、適切な標識結合剤（アビジン、
ストレプタビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、等）と共に使
用され得る。天然の結合剤、例えばビオチンを用いての分子に対する抗体はまた
、広く利用でき且つ適切な標識結合剤であり；SIGMA Immunochemicals 1998カタ
ログSIGMA, St. Louis MO を参照のこと）。
【０２９４】 同様に、いずれかのハプテン又は抗原性化合物は、標識/標識結合剤対を形成
するために適切な抗体と組み合わして使用され得る。数千の特定抗体が市販され
ており、そして多くの追加の抗体が文献に記載されている。例えば、１つの通常
の形状においては、標識は第１抗体であり、そして標識結合剤は、第１抗体を認
識する第２抗体である。抗体−抗原相互反応の他に、受容体−リガンド相互作用
がまた、標識及び標識−結合剤として適切である。
【０２９５】 例えば、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト（例えば、細胞受容体
−リガンド相互作用、例えばトランスフェリン、ｃ−kit、ウィルス受容体リガ
ンド、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体及
び抗体）、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミ
リー及び同様のもの；例えば、Pigott & Power, The Adhesion Molecular Facts
Book I (1993) を参照のこと。
【０２９６】 同様に、毒素及びヘビ毒素、ウィルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン
誘導体、ステロイド、等）、細胞内受容体（例えば、種々の小リガンド、例えば
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンD；ペプチドの効果を介
在する）、薬剤、レクチン、糖、核酸（線状及び環状ポリマー形状）、オリゴ糖
、タンパク質、リン脂質及び抗体が、種々の細胞受容体とすべて相互作用するこ
とができる。
【０２９７】 合成ポリマー、例えばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ
ウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレン、スルフィド、ポリ
シクロキサン、ポリイミド及びポリアセテートがまた、適切な標識又は標識結合
剤を形成することができる。多くの他の標識/標識結合剤対がまた、この開示の
再考に基づいて当業者に明らかなように、本明細書に記載されるアッセイシステ
ムにおいても有用である。
【０２９８】 通常のリンカー、例えばペプチド、ポリエーテル及び同様のものはまた、標識
として作用することができ、そしてポリペプチド配列、例えば約５〜200個のア
ミノ酸のポリGly配列を包含する。適切な柔軟なリンカー又は、当業者に知られ
ている。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymer
s, Inc. Huntsville, Alabamaから入手できる。それらのリンカーは任意には、
アミド連鎖、スルフィドリル連鎖、又はヘテロ官能性連鎖を有する。
【０２９９】 標識結合剤は、現在入手できる種々の方法のいずれかを用いて、固体支持体に
固定される。固体支持体は、標識結合剤の一部として反応する表面に化学基を固
定する化学試薬に支持体のすべて又は一部を暴露することによって、誘導体化さ
れるか又は官能化される。例えば、より長い鎖部分への結合のために適切である
基は、アミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基を包含する。アミノ
アルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランは、種々の表面、例えばガラス表
面を官能化するために使用され得る。そのような固相生物ポリマーアレイの構成
は、文献において十分に記載されている。
【０３００】 例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963) (例えば、ペ
プチドの固相合成を記載する)；Geysenなど., J. Immun. Meth. 102: 259-274 (
1987) (ピン上での固相成分の合成を記載する)；Frank & Doring, Tetrahedron
44: 6031-6040 (1988) (セルロースデスク上での種々のペプチド配列の合成を記
載する)；Fodorなど., Science, 251: 767-777 (1991); Sheldonなど., Clinica
l Chemistry 39 (4) 718-719 (1993); 及びKozalなど., Nature Medicine 2(7):
753-759 (1996) ( すべては、固体支持体に固定された生物ポリマーのアレイを
記載する)を参照のこと。支持体に標識結合剤を固定するための非化学的アプロ
ーチは、他の通常の方法、例えば加熱、UV放射線による架橋、及び同様のものを
包含する。
【０３０１】 D．コンピューターに基づくアッセイ： T2Rタンパク質活性を調節する化合物についてのさらにもう１つのアッセイは
、コンピューター助力の薬剤企画をを包含し、ここでコンピューターシステムは
、そのアミノ酸配列によりコードされる構造情報に基づいてT2Rタンパク質の三
次元構造を生成するために使用される。入力アミノ酸配列は、タンパク質の二次
、三次及び四次構造モデルを生成するために、コンピュータープログラムにおけ
る予定されたアルゴリズムと、直接的に及び活動的に相互作用する。次に、タン
パク質構造のモデルが、リガンドを結合する能力を有する構造の領域を同定する
ために試験される。次に、それらの領域が、タンパク質に結合するリガンドを同
定するために使用される。
【０３０２】 タンパク質の三次構造モデルは、少なくとも10個のアミノ酸残基のタンパク質
、アミノ酸配列、又はT2Rポリペプチドをコードする対応する核酸配列を、コン
ピューターシステムに入力することによって生成される。前記ポリペプチド又は
そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１−165のいずれ
か、及びその保存的に修飾された型であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質の
構造体情報をコードする、タンパク質の一次配列又は副配列を表す。
【０３０３】 アミノ酸配列の少なくとも10個の残基（又は、10個のアミノ酸をコードするヌ
クレオチド配列）が、コンピューターキーボードからコンピューターシステム、
すなわち電子貯蔵媒体（例えば、磁気デスケット、テープ、カートリッジ及びチ
ップ）、光媒体（例えば、CD ROM）、インターネットサイト及びRAMにより分離
される情報（但し、それらだけには限定されない）を包含するコンピューター読
み取り媒体中に入力される。次に、タンパク質の三次元構造モデルが、当業者に
知られているソフトフェアを用いて、アミノ酸配列及びコンピューターシステム
の相互作用により生成される。
【０３０４】 アミノ酸配列は、興味あるタンパク質の二次、三次及び四次構造を形成するた
めに必要な情報をコードする一次構造を表す。ソフトフェアは、構造モデルを生
成するために、一次配列によりコードされる一定のパラメーターを調べる。それ
らのパラメーターは、“エネルギー用語”として言及され、そして主に、静電ポ
テンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接近性表面及び水素結合を包含する。二
次エネルギーの用語は、ファン・デル・ワールカスポテンシャルを包含する。生
物学的分子は、エネルギーを累積形で最少にする構造を形成する。従って、コン
ピューターは、二次構造モデルを創造するために、一次構造又はアミノ酸配列に
よりコードされるそれらの用語を用いる。
【０３０５】 次に二次構造によりコードされるタンパク質の三次構造が、二次構造のエネル
ギー用語に基づいて形成される。この点で使用者は、追加の変数、例えばタンパ
ク質が膜結合されるか又は可溶性であるかにかかわらず、身体中でのその位置、
及びその細胞位置、例えば細胞質、表面又は核位置を入力することができる。二
次構造のエネルギー用語と共にそれらの変数が、三次構造のモデルを形成するた
めに使用される。三次構造のモデルにおいては、コンピュータープログラムは、
二次構造の疎水性面と同様のものとを、及び二次構造の親水性面と同様のものと
を適合せしめる。
【０３０６】 構造体が生成されると、可能性あるリガンド結合領域が、コンピューターシス
テムにより同定される。可能性あるリガンドのための二次元構造は、上記のよう
にして、化合物のアミノ酸又はヌクレオチド配列、又は化学式を入力することに
よって生成される。次に、可能性あるリガンドの三次元構造が、タンパク質に結
合するリガンドを同定するために、T2Rタンパク質のその構造に比較される。タ
ンパク質とリガンドとの間の結合親和性は、リガンドがタンパク質の結合の増強
された可能性を有することを決定するために、エネルギー用語を用いて決定され
る。
【０３０７】 コンピューターシステムは、T2R遺伝子の突然変異、多形変異体、対立遺伝子
及び種間相同体をスクリーニングするためにも使用される。そのような突然変異
は、疾病状態又は遺伝的形質に関連することができる。上記のように、GeneChip TM 及び関連する技法はまた、突然変異、多形変異体、対立遺伝子及び種間相同
体をスクリーニングするためにも使用され得る。変異体が同定されると、診断ア
ッセイが、そのような突然変異誘発された遺伝子を有する患者を同定するために
使用され得る。
【０３０８】 突然変異誘発されたT2R遺伝子の同定は、T2R遺伝子の第１の核酸又はアミノ酸
配列、例えば配列番号１−165のいずれか、又は保存的に修飾されたその型の入
力の受容を包含する。前記配列は、上記のようにして、コンピューターシステム
中に入力される。次に、第１核酸又はアミノ酸配列が、第１の配列に対してこの
実質的な同一性を有する第２の核酸又はアミノ酸配列に比較される。その第２配
列が、上記態様で、コンピューターシステム中に入力される。第１及び第２配列
が比較されると、配列間のヌクレオチド又はアミノ酸差異が同定される。そのよ
うな配列は、種々のT2R遺伝子の対立遺伝子差異、及び疾病状態及び遺伝的形質
に関連する突然変異を表すことができる。
【０３０９】 IX. 投与及び医薬組成物： 味覚モジュレーターは、味覚の調節、例えば苦味味覚のインビボでの調節のた
めに哺乳類対象に直接的に投与され得る。投与は、処理されるべき組織、任意に
は舌又は口腔との最終的な接触のためのモジュレーター化合物を導入するために
通常使用されるいずれかの経路によってである。味覚モジュレーターは、任意に
は、医薬的に許容できるキャリヤーと共に、いずれかの適切な態様で投与される
。そのようなモジュレーターを投与するための適切な方法は入手でき、そして当
業者に良く知られており、そして１つ以上の経路が特定の組成物を投与するため
に使用され得るが、特定の経路はしばしば、もう１つの経路よりも、より一層の
即効性を提供することができる。
【０３１０】 医薬的に許容できるキャリヤーは、投与される特定の組成物により、及び組成
物を投与するために使用される特定の方法により一部決定される。従って、本発
明の医薬組成物の広範囲の種類の適切な配合物が存在する（例えば、Remingtons
’ Pharmaceutical Science, 17th ed., 1985を参照のこと）。 味覚モジュレーターは、単独で又は他の適切な生物と組合して、吸入を通して
投与されるエーロゾル配合物（すなわち、それらは“噴霧化”され得る）に製造
され得る。エーロゾル配合物は、加圧された、許容できる噴射剤、例えばジクロ
ロジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のものの中に配置され得る。
【０３１１】 投与のために適切な配合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び配合物を等
張性にする溶質を含むことができる、水性及び非水性溶液、及び懸濁剤、溶解剤
、増粘剤、安定剤及び保存剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁液を包
含する。本発明の実施においては、組成物は、例えば経口、局部、静脈内、腹腔
内、膀胱内又は鞘内投与され得る。任意には、組成物は、経口又は鼻腔内投与さ
れる。化合物の配合物は、単位用量又は複数用量の密封された容器、例えばアン
プル及びバイアルにおいて提供され得る。溶液及び懸濁液は、前に記載された種
類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。モジュレータはまた、調製され
た食品又は薬剤の一部として投与され得る。
【０３１２】 本発明に関して、患者に投与される用量は、時間にわたって対象における有益
な応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、使用される特定の味覚モ
ジュレーターの効率、及び対照の状態、並びに処理される体重又は表面積により
決定されるであろう。用量のサイズは、特定の対象における特定の化合物又はベ
クターの投与に付随するいずれかの副作用の存在、性質及び程度により決定され
るであろ。
【０３１３】 投与されるモジュレーターの有効量の決定においては、医者は、モジュレータ
ーの循環血漿レベル、モジュレーターの毒性及び抗−モジュレーター抗体の生成
を評価することができる。一般的に、モジュレーターの用量は、典型的な対照に
関して、約１ng/kg〜10mg/kgである。 投与のためには、本発明の味覚モジュレーターは、モジュレーターのLD−50、
及び種々の濃度でのインヒビターの副作用により決定される割合で投与され得る
。投与は、１回の用量又は分割された用量を通して達成され得る。
【０３１４】 VII.キット： T2R遺伝子及びそれらの相同体は、味覚受容体細胞を同定するための、法医学
的及び起源的決定のための及び味覚伝達を試験するための有用な手段である。T2
R核酸、例えばT2Rプローブ及びプライマーに対して特異的にハイブリダイズする
T2Rファミリーメンバー特異的試薬、及びT2Rタンパク質、例えばT2R抗体に対し
て特異的に結合するT2R特異的試薬が、味覚細胞発現及び味覚伝達調節を試験す
るために使用される。
【０３１５】 サンプルにおけるT2RファミリーメンバーのためのDNA及びRNAの存在について
の核酸アッセイ、例えばサザン分析、ノザン分析、ドットブロット、RNアーゼ保
護、S1分析、増幅技法、例えばPCR及びLCR、及び現場ハイブリダイゼーションは
、当業者に知られている。現場ハイブリダイゼーションにおいては、標的核酸は
、続く解釈及び分析のための細胞形態を保存しながら、細胞内でのハイブリダイ
ゼーションのために入手できるその細胞周囲から生成される。
【０３１６】 次の文献は、現場ハイブリダイゼーションの技術の概観を提供する：Singerな
ど., Biotechniques 4: 230-250 (1986); Haase など., Methods in Virology,
vol. VII, pp. 189-226 (1984); 及びNucleic Acid Hybridization: A Practica
l Approach (Hames など., eds. 1987)。さらに、T2Rタンパク質は、上記の種々
のイムノアッセイ技法により検出され得る。試験サンプルは典型的には、正の対
照（例えば、組換えT2Rタンパク質を発現するサンプル）及び負の対照に比較さ
れる。
【０３１７】 本発明はまた、T2Rファミリーメンバーのモジュレーターについてスクリーニ
ングするためのキットを提供する。そのようなキットは、容易に入手できる材料
及び試薬から調製され得る。例えば、そのようなキットは、１又は複数の次の材
料を含んで成る：T2R核酸又はタンパク質、反応管、及びT2R活性を試験するため
の説明書。任意には、キットは、生物学的活性のT2R受容体を含む。広範囲の種
類のキット及び成分は、キットの意図された使用者及び使用者の特定の必要性に
依存して、本発明に従って調製され得る。
【０３１８】 実施例 次の例は、例示目的であって、本発明を限定するものではない。当業者は、実
質的に類似する結果を得るために変更され又は修飾され得る種々の非決定的パラ
メーターを容易に認識するであろう。
【０３１９】例I：T2R遺伝子ファミリーの同定 ： ヒトにおける最近の遺伝子連鎖研究は、苦味物質６−ｎ−プロピル−２−チオ
ウラシルに応答する能力に関係する、5p15での遺伝子座を同定した（PROP；Reed
など., Am. J. Hum. Genet. 64: 1478-1480 (1999)）。PROP感度の差異が苦味味
覚受容体における機能的差異に影響を及ぼすかどうかを決定するために、DNA配
列データベースを、この位置での候補体トランスメンブランタンパク質をコード
する遺伝子について調べた。この間隔からの６種の配列決定されたヒトゲノムBA
Cクローン（受託番号AC003015を参照のこと）に及ぶ450kbのDNAにおける読み取
り枠の分析は、5p15.2での新規GPCR（T2R１）を同定した。T2R１は、推定上の７
種のトランスメンブランセグメント、及びGPCRにしばしば存在するいくつかの保
存された残基を有する（Probstなど., DNA Cell Biol. 11:1-20 (1992)）。
【０３２０】 T2R１を用いての、T2R１−関連配列により反復されたコンピューター調査は、
19個の追加のヒト受容体（12個の十分な長さ及び７個の偽遺伝子）を示した。十
分な長さのhT2Rを、ゲノムDNAのPCR増幅により単離した。十分な長さのhT2Rを、
低い緊縮性（50−55℃、１×SSCでの洗浄）下で、ラット有郭cDNAライブラリー
（Hoonなど., Cell, 96: 541-551 (1999)）及びマウスBACフィルターアレイ（Ge
nome Systems）をプローブするために使用した。サザンブロットハイブリダイゼ
ーション実験を、非冗長性組の陽性BACを同定し、そしてBACのオーバーラッピン
グを指図するために使用した。
【０３２１】 T2R（また、“SF”としても知られている）としても言及されるそれらの新規
受容体は、VIR鋤鼻受容体及びオプシンにより特徴づけられるGPCRのスーパーフ
ァミリーに属するT1Rに比較して（Hoonなど., Cell, 96: 541-551 (1999)）、T2
Rは、単に短い細胞外N−末端を有した。T2Rファミリーの個々のメンバーは、30
−70％のアミノ酸同一性を示し、そして最初の３個の及び最後のトランスメンブ
ランセグメントにおいて、及びまた、第２細胞質ループにおいて高く保存された
配列モチーフを共有する。T2R間の最も異なった領域は、トランスメンブランヘ
リックス中に一部、延長する細胞外セグメントである。たぶん、T2Rの高い程度
の変動性は、多くの構造的に異なったリガンドを認識する必要性に影響を及ぼす
。多くの他のGPCR遺伝子のように、T2Rは、コード領域を中断するイントロンを
含まない。
【０３２２】例II：ヒトR2R遺伝子の構成 ： 同定されたヒトT2R遺伝子を、３種の染色体上に配置し、そしてしばしば、先
端から末端までのアレイとして構成する。例えば、４種の受容体遺伝子を、7q31
からの単一のPACクローン内にクラスター化し、そして９種を12p13からのBACク
ローン内にクラスター化する。いくつかの追加のヒトT2Rが９種の遺伝子T2Rクラ
スターをオーバーラップする、部分的に配列決定されたBACクローン内に見出さ
れるように、それらのアレイに多くのヒトT2Rが存在する。
【０３２３】 所定のアレイ内で、比較的関連する受容体（例えば、hT2R13, hT2R14及びhT2R
15）及び非常に異なった受容体（例えば、hT2R3及びhT2R4）の両者を包含する。
受容体の類似性は非常に可変性である。このタイプの構成はマウスにおいて代表
され（下記を参照のこと）、そしてヒト、マウス、ハエ及び回虫における嗅覚受
容体遺伝子に関して観察されたゲノム構成に類似する（Rouquierなど., Nat. Ge
net. 18: 243-250 (1998); Sullivanなど., PNAS93: 844-888 (1996); Clyneな
ど., Neuron 22: 327-388 (1999); Wosshallなど., Cell 96: 725-736 (1999);
Troemelなど., Cell 83 : 207-218 (1995)）。
【０３２４】 この遺伝子ファミリーのサイズの推定値を得るために、種々のゲノム源を試験
した。Genome Sequence Survey データベース（gss）の分析は、12種の部分T2R
配列を生成した。このデータベースはヒトゲノムの約14％の実質的ランダムのサ
ンプリングを表すので、この数は、ヒトゲノムに約90のT2R遺伝子が存在するこ
とを示す。終了された（nr）及び終了されていない高処理ヒトゲノム配列データ
ベースの類似する調査は、36個の十分な長さの及び15個の部分T2R配列を生成し
た。それらのデータベースは、ゲノム配列の約50％を含み、またそれは、ゲノム
における約100個のT2R遺伝子も示す。
【０３２５】 この分析は入手できるデータベースの品質、及びヒトゲノムにおける、T2Rの
クラスター化された非ランダム分析のために不正確であり得ることを認識すれば
、T2Rファミリーは、80〜120のメンバーから成ることが推定される。しかしなが
ら、十分な長さのヒトT2Rの1/3以上が偽遺伝子であり；従って、機能的ヒト受容
体の最終の数は有意に低い（すなわち、40〜80）。これは、ヒト嗅覚受容体に関
して観察されたものに類似し；ここで、多くの遺伝子は偽遺伝子であるように見
える（Rouquierなど., Nat. Genet. 18: 243-250 (1998)）。
【０３２６】例III：T2R遺伝子は苦味味覚に関与する遺伝子座に連結される ： 甘味及び苦味試験の遺伝学はマウスにおいて集中的に研究されており、ここで
甘味及び苦味味覚体に対する応答に影響を及ぼす多くの遺伝子座が挙動性味覚−
選択アッセイによりマッピングされている（Warren and Lewis, Nature 227: 77
-78 (1970); Fuller, J. Hered. 65: 33-66 (1974)）。
【０３２７】 マウス染色体６の遠位端は、Soa（スクロースオクタアセテートのための；Cap
elessなど., Behav. Genet. 22: 655-663 (1992)）、Rua（ラフィノースウンデ
カアセテート；Lush，Genet. Res. 47: 117-123 (1986)）、Cyx（シクロヘキシ
ミド；Lush and Holland, Genet. Res. 52: 207-212 (1988)）及びQui (キニン
；Lush, Genet. Res. 44: 151-160 (1984)) を包含する一群の苦味遺伝子を含む
。組換え研究は、それらの４種の遺伝子座がお互いに、及びPro（唾液プロリン
に富んでいるタンパク質；Azenなど., Trends Genet. 2: 199-200 (1986)）に密
接に連結されることを示した。ヒト９遺伝子T2Rクラスターは、３個の散在され
たPRP遺伝子、及びマウス染色体６苦味クラスターと相同である間隔の地図を含
む。
【０３２８】 マウス染色体６苦味クラスターとT2Rとの間の関係を定義するために、多数の
マウスT2R遺伝子を単離し、そしてそれらのゲノム構成及び物理的及び遺伝子地
図位置を決定した。ヒトT2Rによりマウスゲノムライブラリーをスクリーニング
することにより、28のマウスT2Rを含む61のBAC−クローンを単離した。マウス及
びヒト受容体は、有意なアミノ酸配列相異性を示すが、しかし受容体のこの新規
ファミリーのメンバーに共通する配列型を共有する。マウスT2Rを、マウス/ハム
スター放射線ハイブリッドパネル（Research Genetics）を用いて、及びC57BL/6
J×DBA/2J組換え近交系（Jackson Laboratory）のパネルにおける単一のヌクレ
オチド多形現象の株分布パターンを試験することにより、マッピングした。
【０３２９】 それらの研究は、マウス遺伝子が少数のゲノム位置でのみクラスター化される
ことを示した。マウスT2Rを含む個々のゲノム間隔は、次のその密接したヒト相
対物を含む間隔と相同である：mT2R8及びhT2R4, mT2R18及びhT2R16, 及びmT2R16
, 及びmT2R19及びhT2R1。ヒト/マウス受容体のそれらの３組の実質的にオルト性
の対のうち、ヒトT2R1及びT2R16遺伝子は、ヒト苦味感覚に密接に関係する位置
を染色体上に位置ずける（Conueallyなど., Jum. Hered. 26: 267-271 (1976);
Reedなど., Am. J. Hum. Genet. 64: 1478-1480 (1999)）。残る25のmT2Rはすべ
て、染色体６の遠位端に位置し、そして少なくとも400kbに及ぶ３個のBACコンチ
グ（contigs）により表される。
【０３３０】 Prp及び苦味―クラスターはまた、マウス染色体６の遠位端に位置するので、
それらがT2Rのこのアレイ内に位置するかどうかを決定した。DBA/2×C57BL/6組
換え近交系パネルの分析は、すべたの３種のBAC−コンチグ内の受容体がPrp及び
苦味クラスターにより同時−分離することを示した。さらに、マウスPrp遺伝子
を単離し（受託番号M23236号；D6Mit13を含む）、そしてそれが大きな染色体6 T
2Rクラスター内に存在することが示された。それらの結果は、T2Rが苦味感覚に
密接に関係する遺伝子座に密接して連結されることを示す。
【０３３１】例IV：T2Rが味覚受容体細胞において発現される ： 舌上皮は、次の３種の型の乳頭に味覚芽を含んでいる：舌の最後部での有郭乳
頭、舌の後側端での葉状乳頭、及び舌表面の前半分じゅうに分布される真菌状乳
頭。口腔の他の部分または、味覚芽を有し；それらは、geschmackstreifenとし
て知られている領域、及び喉頭蓋における口蓋上皮において特に卓越している。
T2Rの発現のパターンを試験するために、現場ハイブリダイゼーションを、種々
の味覚乳頭の断片を用いて行った。使用されるプローブが味覚組織において発現
されたことを確かめるために、ラット有郭cDNAライブラリーをスクリーンし、14
のラットT2R cDNAの単離を導き、それらの個々のマウスゲノムクローンのオルト
体である。
【０３３２】 現場ハイブリダイゼーションを行うために、組織を成熟ラット及びマウスから
得た。発現パターンの性別−特異的差異は観察されず、従って雄及び雌動物は交
換可能的に使用された。新鮮な凍結された断片（16μm）を、シラン化されたス
ライドに結合し、そして（Hoonなど., Cell, 96: 541-551 (1999)）に記載のよ
うにして、現場ハイブリダイゼーションのために調製した。すべての現場ハイブ
リダイゼーションを高い緊縮性（ハイブリダイゼーション、５×SSC、50％ホル
ムアミド、65−72℃；洗浄、0.2×SSC、72℃）下で行った。シグナルを、ジゴキ
シゲニンに対するアルカリホスファターゼ接合抗体及び標準の色原体基質（Boeh
ringer Mannheim）を用いて進行せしめた。可能な場合、プローブは、現場ハイ
ブリダイゼーションのために使用される緊縮性下で観察されなかった、T2R間で
の可能性ある交差−ハイブリダイゼーションを最少にするために広範囲の3’−
非翻訳配列を含んだ。
【０３３３】 それらの実験は、T2Rが舌及び口蓋上皮の味覚受容体細胞において選択的に発
現されることを示した。個々の受容体は、断片における味覚芽当たり平均２個の
細胞にハイブリダイズする。それらの実験に使用される断片は、1/5〜1/3の深さ
の味覚芽を含むので、これは合計６〜10の陽性細胞/味覚芽/プローブ（又は味覚
芽における細胞の約15％）に影響を及ぼす。一連の断片の実験は、有郭乳頭のす
べての味覚芽が、それらの個々のプローブのために陽性である細胞を含むことを
示した。従って、比較できる結果が11のラットT2Rに関して観察され、そしてマ
ウス断片においては、17種の異なったmT2Rプローブとハイブリダイズした。
【０３３４】 葉状、geschmackstreifen及び喉頭蓋味覚芽における類似する研究は、個々の
受容体プローブがまた、あらゆる味覚芽における約15％の細胞をラベルすること
を示した。対照的に、T2Rはまれに、真菌状乳頭において発現された。11種の異
なったT2Rプローブを用いての数百の真菌状味覚芽の試験は、すべての真菌状乳
頭のわずか10％がT2R−発現細胞を含むことを示した。興味あることには、T2Rを
発現する少数の真菌状味覚芽は、複数の陽性細胞を規則的に含む。
【０３３５】 実際、それらの乳頭における陽性細胞の数は、口腔の他の領域からの味覚芽に
見られる陽性細胞の数とは有意に異ならない。さらに、T2R−発現細胞を含む真
菌状乳頭は一般的にクラスター化するように見える。この予測できない発現は、
味覚コードの理論についての重要な手掛かりを提供することができる。鼓索神経
の一本の線維が真菌状味覚芽における複数の細胞を刺激し、そしてその同じ線維
がしばしば隣接する乳頭に影響を及ぼすことが知られている（Miller, J. Comp.
Neurol. 158: 155-166 (1974)）。たぶん、真菌状乳頭におけるT2R−陽性味覚
受容体細胞及び味覚芽の非ランダム分布は、類似する細胞間での結合の地図に影
響を及ぼす。 ノザン分析及び現場ハイブリダイゼーションは、T2Rが味覚組織外では広く発
現されないことを示した。
【０３３６】例V：個々の受容体細胞は複数のT2R受容体を発現する ： 上記結果は、いずれかの所定のT2Rが有郭、葉状及び口蓋味覚芽の細胞の約15
％で発現されることを示した。囓歯動物ゲノムに30以上のT2Rが存在する場合、
味覚細胞は、１つより多くの受容体を発現すべきである。いかに多くの受容体が
いずれかの細胞において発現されるか、及びどの画分の味覚受容体細胞がT2Rを
発現するかを決定するために、２，５又は10個の受容体の種々の混合物によりラ
ベルされた有郭細胞の数を、その対応する個々のプローブによりラベルされたそ
れらの数と比較した。
【０３３７】 複数の一連の断片における陽性細胞を計数することによって、混合されたプロ
ーブによりラベルされた味覚細胞の数（約20％）がいずれかの個々の受容体によ
りラベルされたその数（約15％）よりもわずかに高いことが決定された。驚くべ
きことではないが、シグナル強度は、混合されたプローブハイブリダイゼーショ
ンにおいて有意に高められた。類似する結果が、有郭乳頭を包含する口腔のほか
の領域からの味覚芽において観察された。同時発現を直接的に示すために、二重
ラベリング実験を、区別してラベルされたcDNAプローブの収集物を用いて行った
。
【０３３８】 二重ラベル蛍光検出するために、プローブを、フルオレセイン又はジゴキシゲ
ニンのいずれかによりラベリングした。アルカリホスファターゼ接合の抗−フル
オレセイン抗体（Amersham）及びホースラディシュ−ペルオキシダーゼ接合の抗
−ジゴキシゲニン抗体を、ファースト−レッドオ及びチラミン蛍光原基質と組合
して使用した（Boehringer Mannheim and New England Nuclear）。それらの実
験においては、大部分の細胞は、複数の受容体を発現することが見出された。
【０３３９】例VI：T2R遺伝子がガスデュシン−発現細胞において選択的に発現する ： 前記結果は、T2Rが味覚受容体細胞の約30％で発現されることを示した。区別
的にラベルされたT1R及びT2Rプローブによる現場ハイブリダイゼーションは、そ
れらの２種の種類の受容体の発現においてオーバーラップが存在しないことを示
した。ガスデュシンはまた、複数サブセットの味覚受容体細胞においても発現さ
れるが、しかし大部分、T1Rとは同時−発現されない（Hoonなど., Cell, 96：54
1-551 (1999)）。T2Rがガスデュシン細胞において発現されるかどうかを決定す
るために、現場ハイブリダイゼーションを、区別的にラベルされたT2R及びガス
デュシンリボプローブを用いて行った。それらの実験は、T2Rが舌及び口蓋味覚
芽のガスデュシン−陽性細胞において独占的に発現されることを示した。
【０３４０】 有郭、葉状及び口蓋味覚芽におけるガスデュシン細胞の約1/3は、10種のT2Rプ
ローブの混合物によりラベルされず、このことは、すべてのガスデュシン−発現
細胞はT2Rを発現しないことを示唆した。それらの細胞は、他の、たぶんより離
れて関連する受容体を発現することができ、又は異なった発生段階で存在するこ
とができた。真菌状味覚においては、その情況はまったく異なる。わずか10％の
真菌状味覚がT2R陽性細胞を含むので、舌の前方における大部分のガスデュシン
−陽性細胞が受容体のT2Rファミリーのメンバーを同時発現するようには見えな
い。従って、たぶん、真菌状乳頭のガスデュシン−陽性細胞において発現される
追加の組の受容体が存在する。
【０３４１】例VII：T2Rの機能的発現 ： T2Rは、Gα15，すなわちホスホリパーゼCβに対して広範囲の受容体を結合す
ることが示されているG−タンパク質α−サブユニットと共に発現された（Offer
manns and Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175-80 (1995); Krautwurstなど., C
ell 95: 917-926 (1998)）。このシステムにおいては、受容体活性化は、FURA−
2カルシウム−インジケーター色素を用いて単一の細胞レベルでモニターされ得
る、細胞内カルシウム [Ca2+]iの上昇を導く（Isienなど., Cell Calcium 6: 14
5-157 (1985)。Gα15カップリングを試験し、そして最適化するために、Gαi−
結合されたμ−オピオイド受容体（Reisine, Neuropharm. 34: 463-472 (1995)
）及びGαq−結合されたmGluR1受容体（Masuなど., Nature 349: 760-765 (1991
)）を使用した。HEK−293細胞中へのそれらの受容体のトランスフェクションは
、強いアゴニスト−選択性及びGα15−依存性Ca2+応答を生成した（図１）。
【０３４２】 多くの研究は、多くのGPCR、特に感受受容体が分泌経路を通しての成熟及び標
的化のために特定の“カペロン”を必要とすることを示して来た（Bakerなど.,
Embo. J. 13: 4886-4895 (1994); Dwyerなど., Cell 93: 455-466 (1998)）。最
近、Krautwurstなど. (Cell 95: 917-926 (1998))は、ロドプシンの最初の20個
のアミノ酸及び種々の囓歯動物嗅覚受容体から成るキメラ受容体を生成した。そ
れらは形質膜に標的化され、そしてHEK−293細胞において臭気剤として機能する
。
【０３４３】 ロドプシン配列がまた、形質膜へのT2Rの標的化を助けることができるかどう
かを決定するために、ロドプシン−T2Rキメラ（rho-T2R）を構成した。それらの
融合タンパク質の発現は、ウシロドプシンの最初39個のアミノ酸がHEKK−293細
胞の形質膜へのT2Rの標的化において非常に効果的であることを示した（図２）
。類似する結果が、11のヒト及び16の囓歯動物T2Rにより得られた（下記参照の
こと）。T2R発現のレベルをさらに増強するために、rho−T2Rを、強いEF−１α
プロモーターの制御下に配置し、そしてGα15を発現する修飾されたHEK−293細
胞中にエピソームプラスミドとして導入した（pEAKrapid細胞）。
【０３４４】 架橋オーバーラップPCR延長技法を用いて、ヒト及び囓歯動物T2Rコード配列と
整合して、ウシロドプシンの最初の39個のアミノ酸を含むrho−T2Rキメラを生成
した（Mehta and Singh, Biotechniques 26: 1082-1086 (1996)）。すべての受
容体を、PEAK1O哺乳類発現ベクター中にクローン化した（Edge Biosystems, MD
）。修飾されたHEK−293細胞（PEAKrapid細胞細胞；Edge BioSystems, MD）を、
5％ウシ胎児血清、100μg/mlのゲンタマイシン硫酸（Fisher）、１μg/mlのAmph
otericin B 及び2mMのGlutaMax I (Lifetechnologies) により補充されたUltraC
ulture培地（Bio Whittaker） において37℃で増殖し、そして維持した。
【０３４５】 トランスフェクションのために、細胞を、マトリゲル被覆された24−ウェル培
養プレート又は35mm記録チャンバー上に接種した。37℃で24時間後、細胞をOpti
MEM培地（Lifetechnologies）により洗浄し、そしてLipofectAMINE試薬（Lifete
chnologies）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、GF
Pレポータープラスミドの同時トランスフェクションにより推定し、そして典型
的には70％以上であった。免疫蛍光染色及び活性アッセイを、トランスフェクト
の36〜48時間後に行った。
【０３４６】 免疫染色のために、トランスフェクトされた細胞を、被覆されたガラスカバー
スリップ上で増殖し、氷冷却された２％パラホルムアルデヒドにおいて20分間、
固定し、１％BSAによりブロックし、そして抗−ロドプシンmAb B6−30の１：10
00倍希釈溶液を含むブロッキング緩衝液において４〜６時間、４℃でインキュベ
ートした（Hargraveなど., Exp. Eye. Res. 42: 363-373 (1986)）。キメラ受容
体発現を、FITC−結合されたロバ抗−マウス第２抗体（Jackson Immunochemical
）を用いて、可視化した。
【０３４７】 ２種の平行した手段を用いて、T2Rのためのリガンドを同定した。１つの手段
においては、ランダム組のヒト、ラット及びマウスT2R受容体を選択し、そして
次のものを含む（試験される最大濃度で示されている）、合計55の苦味及び甘味
味覚体に対して、それぞれ試験した：5mMのアリストロキン酸、5mMのアトロピン
、5mMのブルシル、5mMのカフェイン酸、10mMのカフェイン、1mMのクロロキン、5
mMのシクロヘキシミド、10mMの安息香酸デナトニウム、5mM（−）エピカテシン
、10mMのL−ロイシン、10mMのL−リシン、10mMのMgCl2、5mMのナリンギン、10mM
のニコチン、2.5mMのパパバリン塩酸塩、
【０３４８】 3mMのフェニルチオカルバミド、10mMの６−ｎ−プロピルチオウラシル、1mMの
キナクリン、1mMのキニン塩酸塩、800mMのラフィノースウンデカアセテート、3m
Mのサリシン、5mMのスパルテイン、5mMの硝酸ストリキニン、3mMのスクロールオ
クタアセテート、2mMのテトラエチルアンモニウム塩化物、10mMのL−チロシン、
5mMのヨヒンビン、それぞれ10mMのL−グリシン、L−アラニン、D−トリプトファ
ン、L−フェニルアラニン、L−アルギニン、ナトリウムサッカリン、アスパルテ
ーム、シクラミン酸ナトリウム、アセスルフェームK、それぞれ150mMのスクロー
ス、ラクトース、マルトース、D−グルコース、D−フルクトース、D−ガラクト
ース、D−ソルビトール、0.1％のモネリン、0.1％のタウマチン。
【０３４９】 追加の甘味味覚体は、150μMのアリターム、1.8mMのズルチン、800μMのステ
ビオシド、1.9mMのシアノスーザン、600μMのネオヘスペリジン二塩酸塩、10mM
のキシリトール、9.7mMのH−Asp−D−CTMCP、70μMのN−Dmb−L−Asp−L−Phe−
Ome、及び12μMのN−Dmb−L−Asp−D−Val−（ｓ）−αメチルベンジルアミドで
あった。それらのアッセイにおいては、機能的カップリングは、次の４種の基準
に基づいて評価された：味覚体選択性、一次的な特異性、及び受容体−及びGタ
ンパク質−依存性。第２の手段は、特定の味覚体により候補体受容体を連結する
ためにマウスにおける苦味感覚の遺伝学に基づくデータに依存した。
【０３５０】 30年近く前、マウスの種々の近交系株が苦味化合物スクロース−オクタアセテ
ートに対するそれらの感受性において異なることが最初に報告された（Worren a
nd Lewis, Nature 227: 77-78 (1970)）。従って、多くの研究は、この株の差異
が単一の遺伝子座（Soa）での対立を遺伝子変動によることを示した（whitney a
nd Harder, Behav. Genet. 16: 559-574 (1986); Capelessなど., Behav. Genet
. 22: 655-663 (1992)）。それらの発見は、種々の苦味味覚体、例えばラフィノ
ースウンデカアセテート（Rua）、シクロヘキシミド（Cyx）、銅グリシネート（
Glb）及びキニン（Qui）に対する感受性に影響を及ぼす追加の遺伝子座に拡張さ
れた（Lush, Genet. Res. 44: 151-160 (1984);Lush, Genet. Res. 47: 117-123
(1986), Lush and Holland, (1988)）。
【０３５１】 遺伝子マッピング実験は、Soa, Rua, Cyx, Qui及びGlb遺伝子座が、染色体６
の遠位端でクラスター化されることを示した（Lush and Holland, Genet. Res.
52: 207-212 (1988); Capelessなど., Behav. Genet. 22: 655-663 (1992)）。
マウスにおける苦味−関連遺伝子座への種々のT2R遺伝子の上記局在化の観点か
ら、このアレイからのT2R受容体を、対応するrho−mT2Rキメラとして構成し、そ
して不規則Gα15タンパク質を発現するHEK−293細胞中にそれぞれトランスフェ
クトした。FURA−２による細胞の負荷の後、スクロースオクタアセテート、ラフ
ィノースウンデカアセテート、キニン及びシクロヘキシミドに対する応答をアッ
セイした。
【０３５２】 トランスフェクトされた細胞を、1mMのピルビン酸ナトリウム及び10mMのHEPES
、pH7.4を含むハンクス平衡塩溶液（アッセイ緩衝液）により１度、洗浄し、そ
して２μMのFURA−２ AM (Molecular Brobes) により室温で１時間、負荷した。
負荷溶液を除去し、そして細胞を、200μlのアッセイ緩衝液において１時間イン
キュベートし、AMエステルの分解を可能にした。ほとんどの実験に関しては、単
一のrho−T2Rを発現する細胞を含む24−ウェル組織プレートを、200μlの２×味
覚体溶液により刺激した（次のセックションを参照のこと）。
【０３５３】 [Ca2+]i変化を、TILLイメージングシステム（T.I.L.L. Photonics GmbH）と共
に10×/0.5対物レンズを備えたNikon Diaphot 200顕微鏡を用いてモニターした
。蛍光像の取得及び分析は、TILL−Visionソフトウエアを使用した。一般的に、
[Ca2+]iを、340nm及び380nmで200m秒間、細胞を連続的に照射し、そして冷却さ
れたCCDカメラを用いて、510nmで蛍光放射線をモニターすることによって、80〜
120秒間、測定した。F340/F380の比を、[Ca2+]iを測定するために分析した。
【０３５４】 活性化及び脱活性化の運動学を、浴灌流システムを用いて測定した。細胞を、
150μlのマイクロ灌流チャンバー上に接種し、そして試験溶液を、ピコスプリツ
アー装置（General Valve, Inc.）により加圧−押し出した。流速を、４〜５時
間以内で浴の完全な交換を確保するよう調節した。mT2Rの場合、全カメラ視野を
、細胞の70％以上がシクロヘキシミドに対して応答したので、測定した。mT2R8
及びhT2R4に関しては、個々における興味ある100の領域を、個々の実験のために
平均した。
【０３５５】 mT2R5を発現する細胞は、シクロへキサミドに対して特異的に応答した（図３
）。この応答は、ほぼすべてのトランスフェクトされた細胞において存在し、そ
してそれらの成分のいずれかを欠いている細胞は、5000倍高いシクロヘキシミド
濃度でされ、[Ca2+]i変化を誘発しないので、受容体−及びGα15−依存性であっ
た。このカップリングシステムについて予測されるように、味覚体誘発された[C
a2+]iの上昇は、類似する結果が通常ゼロの[Ca2+]outで得られるので、内部貯蔵
体からの開放のためであった。
【０３５６】 シクロヘキシミドによるmT2R5の活性化は、この受容体は、それらの生物学的
に適切な作用範囲を越える濃度でさえ、いずれかの他の味覚体に応答しないので
、非常に選択的である（Saroli, Naturwissenschaften 71: 428-9 (1984); Glen
dinning, Behav. Neurosci. 113: 840-854 (1994)）(図4a, b)。シクロヘキシミ
ドはヒトにとって中位の苦味であるが、それは約0.25μMの感受性限界濃度を伴
なって、囓歯動物に対しては強い有害性である（kusanoなど., Appl. Exptl. Zo
ol. 6: 40-50 (1971); Lush and Holland, Genet. Res. 52: 207-212 (1988)）
。本明細書に記載される細胞に基づくアッセイにおいては、mT2R5の1/2最大の応
答を誘発するのに必要とされるシクロヘキシミドの濃度は0.5μMであり、そして
その限界値は約0.2μMであった（図4c, d）。特に、この用量−応答は、マウス
におけるシクロヘキシミド味覚の感受性範囲に適合する。
【０３５７】 シクロヘキシミド応答の運動学を決定するために、rho−mT2R5によりトランス
フェクトされた細胞を、ミクロ灌流チャンバー上に配置し、そして種々の条件下
で試験溶液を注いだ。細胞は、刺激の適用に続いてμM濃度でのシクロヘキシミ
ドに対する強い過渡的応答を示した（１秒以下の潜伏時間）。測定されるように
、味覚体が除去される場合、[Ca2+]iは基線に戻った。シクロヘキシミドへの延
長された暴露（10秒以上）は、次の適合性をもたらした：[Ca2+]iの早い上昇、
続いて徐々の上昇、但し休止レベルへの不完全な低下（図4a）。同様に、シクロ
ヘキシミド連続的適用は、脱感作の表示である有意に低められた応答を導いた（
Lefkowitzなど., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57: 127-133 (1992)
）。これはたぶん、対照、すなわち同時トランスフェクトされたmGluR1の応答は
シクロヘキシミド脱感作の間、変更されないので、受容体のレベルで生じる。
【０３５８】 他のT2Rが苦味化合物により活性化されるかどうかを決定するために、11種の
ロドプシン−標識されたヒトT2R受容体を、Gα15を含むHEK−293細胞中にそれら
をそれぞれトランスフェクトすることによってアッセイした。個々のトランスフ
ェクトされた系を、一群の苦味及び甘味味覚体、例えばアミノ酸、及び他の天然
及び合成化合物に対して試験した。
【０３５９】 それらの実験は、強い苦味味覚体デナトニウムが、ヒト候補体味覚受容体hT2R
4の１つの受容体によりトランスフェクトされた細胞において[Ca2+]iの有意な過
渡的上昇を誘発したが、しかしトランスフェクトされていない対照細胞（図３）
又は他のhT2Rによりトランスフェクトされた細胞においては、そうではなかった
ことを示した。デナトニウム応答は、約100μMの限界値を伴なって、強い用量依
存性を有した。興味あることには、hT2R4は、それが高濃度の苦味味覚体６−ｎ
−プロピル−２−チオウラシル（PROP）に対しても応答したので、混乱性の限界
範囲を示した（図５）。
【０３６０】 hT2R4の応答がこの受容体のインビボ機能に影響を及ぼす場合、同様に調整さ
れた受容体は他の種において見出され得ることが仮定される。マウス受容体mT2R
8はたぶんhT2R4のオルト体である：それらは約70％の同一性を共有するが、とこ
ろが次の最も近い受容体はわずか40％の同一性を有し；それらの２種の遺伝子は
相同ゲノム期間において得られる。rho−mT2R8キメラ受容体を生成し、そして広
範囲の種類の味覚体に対するその応答について試験した。実際、mT2R8は、その
ヒト相対物のように、デナトニウムにより及び高い濃度のPROPにより活性化され
る（図３及び５）。他の味覚体は、mT2R8を発現する細胞からの有意な応答を誘
発しなかった。それらの２種の受容体はわずか70％の同一性を共有するので、苦
味化合物に対するそれらの応答性における類似性は、オルト性苦味味覚受容体と
してのそれらの役割を証明する。
【０３６１】例VIII：シクロヘキシミド非テスターマウスはmT2R5味覚受容体に突然変異を有
する ： mT2R5がシクロヘキシミドのための高い親和性受容体として機能する証明は、m
T2R5遺伝子がCyx遺伝子座に応答することを示した。組織断片への現場ハイブリ
ダイゼーションは、mT2R5の発現プロフィールが、テスター株と非テスター株と
の間で区別できないことを示した（図６）。mT2R5とCyx遺伝子座との間の連鎖を
決定するために、mT2R5遺伝子における多形現象を同定し、そしてC57BL/6J (非
テスター)×DBA/2J（テスター）交雑からの組換え近交系パネルにおけるそれら
の分布を決定した。
【０３６２】 強い連鎖が、mT2R5とCyx遺伝子座との間で見出された。mT2R5遺伝子における
突然変異がCyx表現型を担当する可能性を試験するために、mT2R5遺伝子を、いく
つかの追加の十分に特徴づけられたシクロヘキシミドテスター（CBA/Ca, BALB/c
, C3H/He）及び非テスター（129/Sv）株から単離し、そしてそれらのヌクレオチ
ド配列を決定した。実際、予測されるように、T2R5がそれらの株においてシクロ
ヘキシミド受容体として機能する場合、すべてのテスターはDBA/2Jと同じmT2R5
対立遺伝子を共有するが、ところが非テスターは、３種の非保存性アミノ酸置換
（T44I, G155D及びL294R）を包含する、ミスセンス突然変異を担持する（図６）
、C57BL/6対立遺伝子を共有する。
【０３６３】 mT2R5 C57BL/6対立遺伝子がCyx変異体の味覚欠損を担当する場合、そのシクロ
ヘキシミド用量−応答性は、Cyx変異体株に見出される感受性シストを再現する
。２−ボルト選択試験は、Cyxテスター株が0.25μMの限界値でシクロヘキシミド
を回避するが、ところが非テスターは感受性の約８倍の低下を有する（例えば、
それらは1μMで非テスターであるが、しかし８μMでシクロヘキシミドを強く回
避する）ことを示した。rho−mT2R5融合体を、非テスター株からのmT2R5により
構成し、そしてその用量応答を、テスター株からの受容体のその応答と比較した
。著しくは、非テスター株からのmT2R5は、苦味味覚体に対するそれらの感受性
に似ている、シクロヘキシミド感受性のシフトを示す（図４ｄ）。一まとめに考
慮すると、それらの結果は、シクロヘキシミド受容体としてのmT2R5を認識し、
そしてmT2R5がCyx遺伝子座に対応することを強く示唆する。
【０３６４】例IX：T2Rはガスデュシンに結合する ： T2Rがガスデュシンにより同時発現される上記証明は、T2Rが苦味味覚体に応答
してこのG−タンパク質を活性化することを示す。T2R−Gタンパク質カップリン
グの選択性を調べるために、mT2R5を、シクロヘキシミドによるその活性化がマ
ウス味覚応答を再現するので、研究のために選択した。Rho−標識されたmT2R5及
びガスデュシンをバキュロウィルス発現システムを用いて調製した。mT2R5−含
有膜を、ガスデュシンを包含する、種々の精製されたG−タンパク質と共にイン
キュベートし、そして味覚体−誘発されたGTP−γS結合性を測定した（Hoonなど
., Biochem. J. 309: 629-636 (1995)）。
【０３６５】 特に、ロドプシン標識されたmT2R5を含む感染性Bocmid（DBA/2−対立遺伝子）
を、Bac−to−Bacシステム（Lifetechnologies, MD）を用いて生成した。昆虫幼
虫細胞を、組換えBacmidにより60時間、そして膜を、Ryba and Tirindelli, J.
Biol. Chem. 270: 6757-6767 (1995) に記載のようにして調製した。周辺タンパ
ク質を、８Mのウレアによる処理により除去し、そして膜を、10mMのHEPES、pH7.
5、1mMのEDTA及び1mMのDTT溶液に再懸濁した。
【０３６６】 rho−mT2R5の発現を、mAb B6-30を用いてウェスターンブロットにより評価し
、そして既知の量のロドプシンと比較して定量化した。約300pモルのrho−mT2R5
を、２×108個の感染された細胞から得た。ガスデュシン及びGβ1γβヘテロダ
イマーを、Hoonなど., Biochem. J. 309: 629-636 (1995); Ryba and Tirindell
i, J. Biol. Chem. 270: 6757-6767 (1995) に記載のようにして単離した。ガス
デュシン及び他のG−タンパク質α−サブユニットに基づいてのGTPγSとGDPとの
受容体−触媒された置換を、10nMのrho−mT2R5, 100μMのGDP、及び20μMのGβ1 γβ の存在下で測定した。すべての測定は、15分の時点で行われ、そしてGTPγS
結合の初期割合に影響を及ぼした。
【０３６７】 それらのGTP−γS結合アッセイは、ガスデュシンへのmT2R5の強いシクロヘキ
シミド−依存性カップリングを示した（図７）。対照的に、カップリングは、G
αs、Gαi、Gαq、又はGαoに関して見出されなかった。有意なGTPγS結合は、
受容体、ガスデュシン又はβγ−ヘテロダイマーの不在下で観察されなかった。
ガスデュシンに対するT2R5の高い選択性、及びガスデュシンを含む味覚受容体細
胞におけるT2Rの独占的な発現は、T2Rがガスデュシン結合味覚受容体として機能
する仮説を支持する。
【０３６８】 本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に
組み込まれる。 前述の発明はより一層の理解のために例示的且つ例によりいくらか詳細に記載
されて来たが、いくらかの変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、
当業者に明らかであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Gα15が、細胞内カルシウムの開放性にμオピオイド受容体及びmGluR
1受容体の活性化を連結することを示す。HEK−293細胞を、Gαi連続されたμオ
ピオイド受容体又はGαq連結されたmGluR1受容体により過渡的にトランスフェク
トした。Gα15を含むトランスフェクトされた細胞を、次のアゴニスト：（ｃ）1
0μMのDAMGO及び（ｄ）20μMのトランス（±）１−アミノ−１，３−シクロペン
タンジカルボン酸（ACPD）の添加の前（a, b）及び後（c, d）、[Ca2+]iの上昇
についてアッセイした。[Ca2+]iのリガンド−及び受容体−依存性上昇は、Gα15
に依存した（パネルe, f）。尺度は、FURA−2放射比から決定された[Ca2+]i（nM
）を示す。
【図２】 図２は、ウシロドプシンの最初の39個のアミノ酸がHEK−293細胞の形質膜にT2
Rを効果的に標的化することを示す。代表的なrho−T2R融合体によりトランスフ
ェクトされた、透過されていない細胞の免疫蛍光染色を、抗−ロドプシンmAb B6
-30を用いて検出した。
【図３】 図３は、T2R受容体が苦味化合物により刺激されることを示す。HEK−293細胞
を、rho−mT2R5 (a, d, g)、rho−hT2R4 (b, e, h)及びrho−mT2R8 (c, f, i)
によりトランスフェクトした。mT2R5を発現する細胞を、1.5μMのシクロヘキシ
ミド（d, g）を用いて刺激し、そしてhT2R4及びmT2R8を発現するそれらの細胞を
、1.5mMのデナトニウム（e, f, h, i）により刺激した。[Ca2+]iの上昇は、Gα1
5の不在下で観察されず（g〜i）；対照においては、強いGα15依存性応答が味覚
体の存在下で観察され（d-f）;尺度はFURA−２放射比から決定された[Ca2+]i(nM
)を示す。線トレース（ｊ−ｌ）は、パネル（ｄ−ｆ）からの代表的な細胞につ
いての[Ca2+]i変化の運動力学を示し；矢印は味覚体の添加を示す。
【図４】 図４は、シクロヘキシミドに対する味覚受容体である。（ａ）Gα15及びrho−
mT2R5を発現するHEK−293細胞を、２μMのシクロヘキシミド（CYX）、3mMの６−
ｎ−プロピルチオウラシル（PROP）又は5mMのデナトニウム（DEN）の複数回のパ
ルスにより攻撃し；トレース上のドット及び水平棒は、味覚体パルスの時間及び
持続期間を示す。シクロへキサミドは、強い受容体活性化を誘発する。この実験
はまた、反復された刺激に対する又は刺激の持続された適用の間の脱感作も示す
。（ｂ）シクロヘキシミドに対する応答は非常に特異的であり、そして緩衝液（
CON）又は高濃度の他の味覚体の添加の後、観察されない。使用される略語及び
濃度は次の通りである：CYX（5μM）；アトロピン、ATR（5mM）；ブルシン、BRU
（5mM）；カフェイン酸、CAFF（2mM）；デナトニウム、DEN（5mM）；エピカテチ
ン、（−）EPI（3mM）；フェニルチオカルバミド、PTC（3mM）；６−ｎ−プロピ
ルチオウラシル、PROP（10mM）；サッカリン、SAC（10mM）；ストリキニン、STR
（5mM）；スクロースオクタアセテート、SOA（3mM）。カラムは、少なくとも６
回の独立した実験での平均±s.e.を表す。（ｃ）テスター（DBA/2−対立遺伝子
）及び非テスター（C57BL/6−対立遺伝子）株からのmT2R5遺伝子は、シクロヘキ
シミドのパルスに対する特異的 [Ca2+]i変化を仲介する。水平の棒は、刺激の時
間及び持続時間を示す。細胞がシクロヘキシミドの連続した適用により脱感作さ
れなかったことを確かめるために、200秒が、刺激間で経過した。（ｄ）mT2R5の
シクロへキサミド用量応答。[Ca2+]iの変化は、30μMのシクロヘキシミドでの応
答に対して標準化されたFURA−2（F340/F380）比として示され；点は、少なくと
も６回の測定の平均±s.e.を表す。非テスター対立遺伝子は、テスター対立遺伝
子に対するシクロヘキシミド感受性において著しい低下を示す（それぞれ、約2.
3μM対0.5μMのEC50）。
【図５】 図５は、hT2R4及びmT2R8がデナトニウムに対して応答することを示す。Gα15
を発現するHEK−293細胞を、hT2R4又はmT2R8受容体により過渡的にトランスフェ
クトし、そして[Ca2+]iを、図３に示されるようにモニターした。（ａ）[Ca2+]i
の上昇は、デナトニウムによる刺激により誘発され得るが、しかし他の苦味化合
物によっては誘発され得ない。55組の異なった苦味及び甘味味覚体のうち９種の
それらに対する、（ｂ）hT2R4及び（ｃ）mT2R8の応答プロフィール（実験方法を
参照のこと）が示される。CONは対照緩衝液添加を言及し、NARは2mMのナリンジ
ン、及びLYSは5mMのリシン添加を言及する。他の略語及び濃度は、図４に報告さ
れる通りである。リガンドの添加の前及び後での平均FURA−２蛍光比（F340／F3
80）を、すべての応答する細胞を含む、100の等しいサイズの領域から得た。値
は、少なくとも６回の実験の平均±s.e.を表す。
【図６】 図６は、シクロヘキシミドテスター及び非テスター株がmT2R5の異なった対立
遺伝子を発現することを示す。（ａ）mT2R5の予測されるトランスメンブラント
ポロジー；非テスター株からの対立遺伝子におけるアミノ酸置換が赤で強調され
ている。この遺伝子座でのわずか２種の対立遺伝子の存在は、同じ多形現象を共
有する株が共通する創始者（Beckなど., Nat. Genet. 24: 23-55 (2000)）に由
来するので、予測されないわけではない。（ｂ）シクロヘキシミドテスター株（
DBA/2）及び（ｃ）非テスター株（C57BL/6）の有郭乳頭細胞においてmT2R5の発
現を示す現場ハイブリダイゼーション；発現パターンにおける株特異的差異は、
口腔の他の領域からの味覚芽においては検出されなかった。
【図７】 図７は、mT2R5がシクロヘキシミドに応答してガスデュシンを活性化するこを
を示す。（ａ）mT2R5を含む昆虫幼虫細胞膜は、300μMのシクロヘキシミドの存
在下でガスデュシンを活性化するが、しかしリガンド（対照）の不在下で又は1m
Mのストロピン、ブルシン、カフェイン、デナトニウム、フェニルチオカルバミ
ド、６−ｎ−プロピルチオウラシル、キニン、サッカリン、ストリオシン、スク
ロースオクタアセテートの存在下でそれを活性化しない。（ｂ）mT2R5によるガ
スデュシン活性化のシクロヘキシミド濃度依存性を、単一部位結合により適合せ
しめた（Kd＝14.8＋0.9μM）。
【図８】 図８は、多くのヒト、ラット及びマウスT2Rファミリーメンバーのための核酸
及びタンパク質配列を包含する表を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｆ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/483 33/566 33/53 33/15 Ｚ 33/566 33/50 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 アメリカ合衆国 アメリカ合衆国 メリーランド 20852− 3804，ロックビル，エグゼキューティブ ブールバード 6011，スイート 325，オ フィス オブ テクノロジー トランスフ ァー，ナショナル インスティチューツ オブ ヘルス (72)発明者 ズッカー，チャールズ エス． アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130， サン ディエゴ，サーストン プレイス 4778 (72)発明者 アドラー，ジョン エリオット アメリカ合衆国，ワシントン ディー．シ ー．20036，ピー．ストリート ノースウ エスト 1730 (72)発明者 ライバ，ニック アメリカ合衆国，メリーランド 20817， ベセスダ，ランディゲン コート 9202 (72)発明者 ミューラー，ケン アメリカ合衆国，カリフォルニア 92121， サン ディエゴ，ジェネシー アベニュ 9585，アパートメント エイチ１ (72)発明者 フーン，マーク アメリカ合衆国，メリーランド 20895， ケンジントン，ワーナー ストリート 4218 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FA19 FB03 FB05 4B024 AA01 AA11 BA63 CA02 FA02 4B063 QA18 QQ63 QQ89 QR77 QX04 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 CA40 DA50 DA75 EA21 EA50

Claims (93)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 味覚細胞における味覚シグナルを調節する化合物を同定する
    ための方法であって、 （ｉ）配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番号169, 配列番号170
    及び配列番号171から成る群から選択された配列に対して50％以上のアミノ酸同
    一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容体ポリペプチドと前記化合物と
    を接触せしめ；そして （ii）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能的効果を決定する段階を含
    んで成る方法。
  2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、G−タンパク質結合受容体活性を有す
    る請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記機能的効果が、化学的効果である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記機能的効果が、物理的効果である請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドの細胞外ドメイン又は
    トランスメンブラン領域への前記化合物の結合性を測定することによって決定さ
    れる請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドへの放射性ラベルされ
    たGTPの結合性を測定することによって決定される請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが、組換え体である請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが、ラット、マウス又はヒトからである請
    求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが、細胞又は細胞膜において発現される請
    求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドを発現する細胞の電
    気活性の変化を決定することによって測定される請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記機能的効果が、細胞内cAMP, cGMP, IP3又はCa2+の変
    化を測定することによって決定される請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 細胞内Ca2+の変化が、細胞におけるFURA-2依存性蛍光の変
    化を検出することによって検出される請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞が、真核細胞である請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞が、HEK−283細胞である請求項13記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ポリペプチドが、ロドプシンタンパク質の少なくとも
    約20個の連続したN−末端アミノ酸を含んで成る融合タンパク質である請求項９
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ロドプシンタンパク質がウシロドプシンである請求項
    15記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が、Gα15を含んで成る請求項９記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、苦味味覚剤の存在下で前記化合物と
    接触せしめられ、そして前記化合物の存在下で細胞に対する前記苦味味覚剤の機
    能的効果及び前記化合物の不在下で細胞に対する前記苦味味覚剤の機能的効果の
    差異が、前記化合物が味覚細胞における味覚シグナルを調節できることを示す請
    求項９記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが、配列番号1, 配列番号3, 配列番号5,
    配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17,
    配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28,
    配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39,
    配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48,
    配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56,
    配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65,
    配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71,
    配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77
    , 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89
    , 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号10
    1, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列
    番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123
    , 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列
    番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145
    , 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列
    番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択され
    たアミノ酸配列を含んで成る請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 味覚細胞における味覚シグナルを調節する化合物を同定す
    るための方法であって、 （ｉ）配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番
    号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番
    号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番
    号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番
    号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番
    号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番
    号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番
    号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番
    号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列に対して60％以上のアミ
    ノ酸配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容体ポリペプチドと前
    記化合物とを接触せしめ；そして （ii）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能的効果を決定する段階を含
    んで成る方法。
  21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドが、G−タンパク質結合受容体活性を有
    する請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記機能的効果が、化学的効果である請求項20記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 前記機能的効果が、物理的効果である請求項20記載の方法
    。
  24. 【請求項２４】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドの細胞外ドメイン又
    はトランスメンブラン領域への前記化合物の結合性を測定することによって決定
    される請求項20記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドへの放射性ラベルさ
    れたGTPの結合性を測定することによって決定される請求項20記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドが、組換え体である請求項20記載の方法
    。
  27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドが、ラット、マウス又はヒトからである
    請求項20記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ポリペプチドが、細胞又は細胞膜において発現される
    請求項20記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記機能的効果が、前記ポリペプチドを発現する細胞の電
    気活性の変化を決定することによって測定される請求項28記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記機能的効果が、細胞内cAMP, cGMP, IP3又はCa2+の変
    化を測定することによって決定される請求項28記載の方法。
  31. 【請求項３１】 細胞内Ca2+の変化が、細胞におけるFURA-2依存性蛍光の変
    化を検出することによって検出される請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記細胞が、真核細胞である請求項28記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記細胞が、HEK−283細胞である請求項32記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記ポリペプチドが、ロドプシンタンパク質の少なくとも
    約20個の連続したN−末端アミノ酸を含んで成る融合タンパク質である請求項20
    記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ロドプシンタンパク質がウシロドプシンである請求項
    34記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記細胞が、Gα15を含んで成る請求項28記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記ポリペプチドが、苦味味覚剤の存在下で前記化合物と
    接触せしめられ、そして前記化合物の存在下で細胞に対する前記苦味味覚剤の機
    能的効果及び前記化合物の不在下で細胞に対する前記苦味味覚剤の機能的効果の
    差異が、前記化合物が味覚細胞における味覚シグナルを調節できることを示す請
    求項28記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ポリペプチドが、配列番号1, 配列番号3, 配列番号5,
    配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17,
    配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28,
    配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39,
    配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48,
    配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56,
    配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65,
    配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71,
    配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77
    , 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89
    , 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号10
    1, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列
    番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123
    , 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列
    番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145
    , 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列
    番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配列番号164から成る群から選択され
    たアミノ酸配列を含んで成る請求項20記載の方法。
  39. 【請求項３９】 味覚細胞における味覚シグナルを調節する化合物を同定す
    るための方法であって、 （ｉ）配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番
    号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番
    号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番
    号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番
    号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番
    号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番
    号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番
    号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番
    号74, 配列番号75, 配列番号 76, 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を含んで成るポリペプチ
    ドの細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域に対して60％以上のアミノ酸配
    列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容体の細胞外ドメイン又はト
    ランスメンブラン領域を含んで成るポリペプチドと前記化合物とを接触せしめ；
    そして （ii）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能的効果を決定する段階を含
    んで成る方法。
  40. 【請求項４０】 前記ポリペプチドが、キメラポリペプチドを形成する異種
    ポリペプチドに共有結合される細胞外ドメイン又はトランスメンブラン領域を含
    んで成る請求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記ポリペプチドが、G−タンパク質結合受容体活性を有
    する請求項39記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記ポリペプチドが、固相に連結される請求項39記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】 前記ポリペプチドが、固相に共有結合される請求項42記載
    の方法。
  44. 【請求項４４】 前記機能的効果が、前記細胞外ドメイン又はトランスメン
    ブラン領域への前記化合物の結合性を測定することによって決定される請求項39
    記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記ポリペプチドが、組換え体である請求項39記載の方法
    。
  46. 【請求項４６】 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番号169,
    配列番号170及び配列番号171から成る群から選択された配列に対して50％以上の
    アミノ酸配列同一性を有する、味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする
    単離された核酸。
  47. 【請求項４７】 前記受容体が、配列番号166, 配列番号167, 配列番号168,
    配列番号169, 配列番号 170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成る請求項46記載の核酸。
  48. 【請求項４８】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに
    対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合するが、しかし配列
    番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番
    号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番
    号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番
    号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番
    号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番
    号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番
    号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番
    号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番
    号75及び 配列番号 76から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに対
    して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結合しない受容体をコー
    ドする請求項46記載の核酸。
  49. 【請求項４９】 前記核酸が、G−タンパク質結合受容体活性を有する受容
    体をコードする請求項46記載の核酸。
  50. 【請求項５０】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る受
    容体をコードする請求項46記載の核酸。
  51. 【請求項５１】 前記核酸が、配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列
    番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列
    番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106,
    配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番
    号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128,
    配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番
    号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150,
    配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番
    号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群から選択されたヌクレオチド配
    列を含んで成る請求項46記載の核酸。
  52. 【請求項５２】 前記核酸が、ラット又はマウスからである請求項46記載の
    核酸。
  53. 【請求項５３】 前記核酸が、異種ポリペプチドに連結される細胞外ドメイ
    ン又はトランスブラン領域を含んで成るキメラポリペプチドをコードする請求項
    46記載の核酸。
  54. 【請求項５４】 請求項46記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
  55. 【請求項５５】 請求項54記載のベクターを含んで成る単離された細胞。
  56. 【請求項５６】 味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする単離され
    た核酸であって、前記核酸が、 （１）E(F/A)(I/V/L)(V/L)G(I/V)(L/V)GN(G/T)FI(V/A)LVNC(I/M)DW（配列番号
    166）； （２）(D/G)(F/L)(I/L)L(T/I)(G/A/S)LAISRI(C/G/F)L（配列番号167）； （３）NH(L/F)(S/T/N)(L/I/V)W(F/L)(A/T)T(C/S/N)L(S/N/G)(I/V)（配列番号1
    68）； （４）FY(F/C)LKIA(N/S)FS(H/N)(P/S)(L/I/V)FL(W/Y)LK（配列番号169）； （５）LLI(I/F/V)SLW(K/R)H(S/T)(K/R)(Q/K)(M/I)(Q/K)（配列番号170）；及
    び （６）HS(F/L)(I/V)LI(L/M)(G/S/T)N(P/S/N)KL(K/R)(Q/R)（配列番号171）か
    ら成る群から選択されたアミノ酸配列をコードする変性プライマー組と同じ配列
    に対して、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズするプ
    ライマーにより増幅されることを特徴とする核酸。
  57. 【請求項５７】 前記受容体が、配列番号166, 配列番号167, 配列番号168,
    配列番号169, 配列番号 170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成る請求項56記載の核酸。
  58. 【請求項５８】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに
    対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合するが、しかし配列
    番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番
    号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番
    号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番
    号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番
    号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番
    号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番
    号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番
    号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番
    号75及び 配列番号 76から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに対
    して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結合しない受容体をコー
    ドする請求項56記載の核酸。
  59. 【請求項５９】 前記核酸が、G−タンパク質結合受容体活性を有する受容
    体をコードする請求項56記載の核酸。
  60. 【請求項６０】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る受
    容体をコードする請求項56記載の核酸。
  61. 【請求項６１】 前記核酸が、配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列
    番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列
    番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106,
    配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番
    号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128,
    配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番
    号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150,
    配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番
    号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群から選択されたヌクレオチド配
    列を含んで成る請求項56記載の核酸。
  62. 【請求項６２】 前記核酸が、ラット又はマウスからである請求項56記載の
    核酸。
  63. 【請求項６３】 前記核酸が、異種ポリペプチドに連結される細胞外ドメイ
    ン又はトランスブラン領域を含んで成るキメラポリペプチドをコードする請求項
    56記載の核酸。
  64. 【請求項６４】 請求項56記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
  65. 【請求項６５】 請求項64記載のベクターを含んで成る単離された細胞。
  66. 【請求項６６】 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列
    番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列
    番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107,
    配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番
    号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129,
    配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番
    号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151,
    配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配
    列番号164から成る群から選択された配列に対して60％以上のアミノ配列同一性
    を含んで成る、味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする単離された核酸
    。
  67. 【請求項６７】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに
    対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合するが、しかし配列
    番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番
    号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番
    号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番
    号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番
    号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番
    号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番
    号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番
    号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番
    号75及び 配列番号 76から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに対
    して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結合しない受容体をコー
    ドする請求項66記載の核酸。
  68. 【請求項６８】 前記核酸が、G−タンパク質結合受容体活性を有する受容
    体をコードする請求項66記載の核酸。
  69. 【請求項６９】 前記核酸が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列
    番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列
    番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る受
    容体をコードする請求項66記載の核酸。
  70. 【請求項７０】 前記核酸が、配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列
    番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列
    番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106,
    配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番
    号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128,
    配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番
    号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150,
    配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番
    号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群から選択されたヌクレオチド配
    列を含んで成る請求項66記載の核酸。
  71. 【請求項７１】 前記核酸が、ラット又はマウスからである請求項66記載の
    核酸。
  72. 【請求項７２】 前記核酸が、異種ポリペプチドに連結される細胞外ドメイ
    ン又はトランスブラン領域を含んで成るキメラポリペプチドをコードする請求項
    66記載の核酸。
  73. 【請求項７３】 請求項66記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
  74. 【請求項７４】 請求項73記載のベクターを含んで成る単離された細胞。
  75. 【請求項７５】 味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする単離され
    た核酸であって、配列番号78, 配列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番号
    86, 配列番号88, 配列番号90, 配列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号
    98, 配列番号100, 配列番号102, 配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配
    列番号110, 配列番号112, 配列番号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号1
    20, 配列番号122, 配列番号124, 配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配
    列番号132, 配列番号134, 配列番号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号1
    42, 配列番号144, 配列番号146, 配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配
    列番号154, 配列番号156, 配列番号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号1
    63及び配列番号165から成る群から選択された配列を有する核酸に対して、高い
    緊縮条件下で特異的にハイブリダイズするが、しかし配列番号2, 配列番号4, 配
    列番号6, 配列番号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番号16, 配列
    番号18, 配列番号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番号29, 配列
    番号31, 配列番号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番号43, 配列
    番号45, 配列番号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61 及び配列番号63か
    ら成る群から選択された配列を有する核酸に対しては特異的にハイブリダイズし
    ない核酸。
  76. 【請求項７６】 味覚伝達G−タンパク質結合受容体をコードする単離され
    た核酸であって、前記受容体が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番
    号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番
    号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配
    列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番号1
    17, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127, 配
    列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番号1
    39, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149, 配
    列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番号1
    62, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに対
    して60％以上のアミノ酸配列同一性を有し、ここで前記核酸が、配列番号78, 配
    列番号80, 配列番号82, 配列番号84, 配列番号86, 配列番号88, 配列番号90, 配
    列番号92, 配列番号94, 配列番号96, 配列番号98, 配列番号100, 配列番号102,
    配列番号104, 配列番号106, 配列番号108, 配列番号110, 配列番号112, 配列番
    号114, 配列番号116, 配列番号118, 配列番号120, 配列番号122, 配列番号124,
    配列番号126, 配列番号128, 配列番号130, 配列番号132, 配列番号134, 配列番
    号136, 配列番号138, 配列番号140, 配列番号142, 配列番号144, 配列番号146,
    配列番号148, 配列番号150, 配列番号152, 配列番号154, 配列番号156, 配列番
    号157, 配列番号159, 配列番号161, 配列番号163及び配列番号165から成る群か
    ら選択されたヌクレオチド配列を有する核酸に対して、中位の緊縮条件下で選択
    的にハイブリダイズするが、しかし配列番号2, 配列番号4, 配列番号6, 配列番
    号8, 配列番号10, 配列番号12, 配列番号14, 配列番号16, 配列番号18, 配列番
    号20, 配列番号23, 配列番号25, 配列番号27, 配列番号29, 配列番号31, 配列番
    号34, 配列番号36, 配列番号38, 配列番号41, 配列番号43, 配列番号45, 配列番
    号52, 配列番号54, 配列番号57, 配列番号61 及び配列番号63から成る群から選
    択された配列を有する核酸に対しては特異的にハイブリダイズしないことを特徴
    とする核酸。
  77. 【請求項７７】 配列番号166, 配列番号167, 配列番号168, 配列番号169,
    配列番号170及び配列番号171から成る群から選択された配列に対して50％以上の
    アミノ酸配列同一性を有する、単離された味覚伝達G−タンパク質結合受容体。
  78. 【請求項７８】 前記受容体が、配列番号166, 配列番号167, 配列番号168,
    配列番号169, 配列番号 170及び配列番号171から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成る請求項77記載の単離された受容体。
  79. 【請求項７９】 前記受容体が、G−タンパク質結合受容体活性を有する請
    求項77記載の単離された受容体。
  80. 【請求項８０】 前記ポリペプチドが、キメラポリペプチドを形成する異種
    ポリペプチドに共有結合される請求項77記載の単離された受容体。
  81. 【請求項８１】 前記キメラポリペプチドが、G−タンパク質結合受容体活
    性を有する請求項80記載の単離された受容体。
  82. 【請求項８２】 請求項77記載の受容体に選択的に結合する抗体。
  83. 【請求項８３】 配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配列番号83, 配列
    番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配列番号95, 配列
    番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105, 配列番号107,
    配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番号117, 配列番
    号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127, 配列番号129,
    配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番号139, 配列番
    号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149, 配列番号151,
    配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番号162, 及び配
    列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するに対して60％以上の
    アミノ配列同一性を含んで成る、単離された味覚伝達G−タンパク質結合受容体
    。
  84. 【請求項８４】 前記受容体が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配
    列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配
    列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに
    対して生成されたポリクローナル抗体に対して特異的に結合するが、しかし配列
    番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番
    号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番
    号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番
    号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番
    号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番
    号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番
    号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番
    号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番
    号75及び 配列番号 76から成る群から選択された配列を有するポリペプチドに対
    して生成されたポリクローナル抗体に対しては特異的に結合しない請求項83記載
    の単離された受容体。
  85. 【請求項８５】 前記受容体が、G−タンパク質結合受容体活性を有する請
    求項83記載の単離された受容体。
  86. 【請求項８６】 前記受容体が、配列番号77, 配列番号79, 配列番号81, 配
    列番号83, 配列番号85, 配列番号87, 配列番号89, 配列番号91, 配列番号93, 配
    列番号95, 配列番号97, 配列番号99, 配列番号101, 配列番号103, 配列番号105,
    配列番号107, 配列番号109, 配列番号111, 配列番号113, 配列番号115, 配列番
    号117, 配列番号119, 配列番号121, 配列番号123, 配列番号125, 配列番号127,
    配列番号129, 配列番号131, 配列番号133, 配列番号135, 配列番号137, 配列番
    号139, 配列番号141, 配列番号143, 配列番号145, 配列番号147, 配列番号149,
    配列番号151, 配列番号153, 配列番号155, 配列番号158, 配列番号160, 配列番
    号162, 及び配列番号164から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項
    83記載の単離された受容体。
  87. 【請求項８７】 前記受容体が、ラット又はマウスからである請求項83記載
    の単離された受容体。
  88. 【請求項８８】 前記ポリペプチドが、キメラポリペプチドを形成する異種
    ポリペプチドに共有結合される請求項83記載の単離された受容体。
  89. 【請求項８９】 前記キメラポリペプチドが、G−タンパク質結合受容体活
    性を有する請求項88記載の単離された受容体。
  90. 【請求項９０】 請求項83記載の受容体に選択的に結合する抗体。
  91. 【請求項９１】 異種プロモーターに操作可能的に結合される、ヒト味覚伝
    達Gタンパク質結合受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る発現
    カセットであって、前記受容体が、配列番号1, 配列番号3, 配列番号5, 配列番
    号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番号17, 配列番
    号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番号28, 配列番
    号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番号39, 配列番
    号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番号48, 配列番
    号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番号56, 配列番
    号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番号65, 配列番
    号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番号71, 配列番
    号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75及び 配列番号 76から成る群から選
    択された配列に対して60％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んで
    成る発現カセット。
  92. 【請求項９２】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1, 配列番号3, 配列番
    号5, 配列番号 7, 配列番号 9, 配列番号11, 配列番号13, 配列番号15, 配列番
    号17, 配列番号19, 配列番号21, 配列番号22, 配列番号24, 配列番号26, 配列番
    号28, 配列番号30, 配列番号32, 配列番号33, 配列番号35, 配列番号37, 配列番
    号39, 配列番号40, 配列番号42, 配列番号44, 配列番号46, 配列番号47, 配列番
    号48, 配列番号49, 配列番号50, 配列番号51, 配列番号53, 配列番号55, 配列番
    号56, 配列番号58, 配列番号59, 配列番号60, 配列番号62, 配列番号64, 配列番
    号65, 配列番号66, 配列番号67, 配列番号68, 配列番号69, 配列番号70, 配列番
    号71, 配列番号72, 配列番号73, 配列番号74, 配列番号75及び 配列番号 76から
    成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る受容体をコードする請求項91記
    載の発現カセット。
  93. 【請求項９３】 請求項91記載の発現カセットを含んで成る単離された真核
    細胞。
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