JPS61233371A - アミノ酸配列分析方法 - Google Patents
アミノ酸配列分析方法Info
- Publication number
- JPS61233371A JPS61233371A JP20182784A JP20182784A JPS61233371A JP S61233371 A JPS61233371 A JP S61233371A JP 20182784 A JP20182784 A JP 20182784A JP 20182784 A JP20182784 A JP 20182784A JP S61233371 A JPS61233371 A JP S61233371A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dimethylamino
- laser
- signal
- amino acid
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ジメチルアミノ）−１−ナフチルイソチオシアネートあ
るいはフルオレセインイソチオシアネートを用いたエド
マン分解反応で生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘
導体、すなわちチオヒダントインの高感度測定によるア
ミノ酸配列分析法に関する。
るいはフルオレセインイソチオシアネートを用いたエド
マン分解反応で生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘
導体、すなわちチオヒダントインの高感度測定によるア
ミノ酸配列分析法に関する。
アミノ酸配列分析法において現在、最も多く使用されて
いる方法はフェニルイソチオシアネートをエドマン分解
試薬として用い、生成した７工二ルチオヒダントインア
ミノ酸（ＰＴＨアミノ醸）を紫外吸収検出器を検出器と
する高速液体りｐマトグラフイーで分離，同定するもの
である。しかし、この方法ではＰ？Ｈアミノ酸の吸収極
大における分子吸光係数がちいさいため（ｇ＝１４００
０エ２６９ｎｍ）、ビフモル以下の微量たん白質，ペプ
チドのアミノ酸配列分析への適用は困難である。
いる方法はフェニルイソチオシアネートをエドマン分解
試薬として用い、生成した７工二ルチオヒダントインア
ミノ酸（ＰＴＨアミノ醸）を紫外吸収検出器を検出器と
する高速液体りｐマトグラフイーで分離，同定するもの
である。しかし、この方法ではＰ？Ｈアミノ酸の吸収極
大における分子吸光係数がちいさいため（ｇ＝１４００
０エ２６９ｎｍ）、ビフモル以下の微量たん白質，ペプ
チドのアミノ酸配列分析への適用は困難である。
４−（ｘ，ｘ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルイソチ
オリアネートあるいはフルオレセインイソチオシアネー
トを用いたエドマン分解反応で生じるアミノ酸のイソチ
オシアネート誘導体は完壁光物質であり、ＰＴＨアミノ
酸に比較すると高感度に測定できる。しかし、近年遺伝
子工学や生物化学ではさらに高感度のアミノ酸配列分析
法が要求されている。
オリアネートあるいはフルオレセインイソチオシアネー
トを用いたエドマン分解反応で生じるアミノ酸のイソチ
オシアネート誘導体は完壁光物質であり、ＰＴＨアミノ
酸に比較すると高感度に測定できる。しかし、近年遺伝
子工学や生物化学ではさらに高感度のアミノ酸配列分析
法が要求されている。
この発明の発明者らは４−（Ｎ、ｙｉ−ジメチルアミノ
）−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフルオレ
セインイソチオシアネートを用イタエドマン分解反応で
生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体の螢光ｍｊ
ｌにおいて、パルスレーザを光源とする時間分解螢光法
で、螢光分析におけるバックグラウンド光であるレイリ
散乱、ラマン散乱、セル壁での散乱、溶媒の不純物によ
るバックグラウンド螢光が光パルス照射後ナノ秒以下の
半減期しか有しないのに対し、４−（Ｎ、Ｍ−ジメチル
アミノ）−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフ
ルオレセインイソチオシアネートを用いたエドマン分解
反応で生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体の螢
光は２〜１０ナノ秒まで延びていることを見出した。さ
らに、この光パルス照射後２〜１０ナノ秒の螢光を測定
するパルスレーザを光源とする時間分解螢光法を検出器
とするアミノ酸配列分析法で極めて微量のたん白質。
）−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフルオレ
セインイソチオシアネートを用イタエドマン分解反応で
生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体の螢光ｍｊ
ｌにおいて、パルスレーザを光源とする時間分解螢光法
で、螢光分析におけるバックグラウンド光であるレイリ
散乱、ラマン散乱、セル壁での散乱、溶媒の不純物によ
るバックグラウンド螢光が光パルス照射後ナノ秒以下の
半減期しか有しないのに対し、４−（Ｎ、Ｍ−ジメチル
アミノ）−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフ
ルオレセインイソチオシアネートを用いたエドマン分解
反応で生じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体の螢
光は２〜１０ナノ秒まで延びていることを見出した。さ
らに、この光パルス照射後２〜１０ナノ秒の螢光を測定
するパルスレーザを光源とする時間分解螢光法を検出器
とするアミノ酸配列分析法で極めて微量のたん白質。
ペプチドでアミノ醸配列を決定できることを発見した。
すなわち、この発明は４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）
−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフルオレセ
インイソチオシアネートを用いたエドマン分解反応で生
じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体をパルスレー
ザを光源とする時間分解螢光法で測定する高感度のアミ
ノ酸配列分析法および装置を提供することにある。
−１−ナフチルイソチオリアネートあるいはフルオレセ
インイソチオシアネートを用いたエドマン分解反応で生
じるアミノ酸のイソチオシアネート誘導体をパルスレー
ザを光源とする時間分解螢光法で測定する高感度のアミ
ノ酸配列分析法および装置を提供することにある。
以下実施例、比較例に基すいて、この発明の詳細な説明
する。
する。
実施例１
第１図にａ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチ
ルイソチオリアネートあるいはフルオレセインインチオ
シアネートを用いたエドマン分解反応で生じるアミノ酸
のイソチオシアネート誘導体（チオヒダントイン）の分
析装置の一実施例を示す。この装置はチオヒダントイン
を分離する液体クロマトグラフ部（１）とパルスレーザ
を光源とする時間分解螢光検出部（ＩＱから成りている
。液体クリマドグラ７部（１）は溶離液貯槽（１）、１
２）、グラジェント溶離装置（３）、溶離液送液ポンプ
（４）、試料導入装置（５）、および分離カラムから構
成されている。
ルイソチオリアネートあるいはフルオレセインインチオ
シアネートを用いたエドマン分解反応で生じるアミノ酸
のイソチオシアネート誘導体（チオヒダントイン）の分
析装置の一実施例を示す。この装置はチオヒダントイン
を分離する液体クロマトグラフ部（１）とパルスレーザ
を光源とする時間分解螢光検出部（ＩＱから成りている
。液体クリマドグラ７部（１）は溶離液貯槽（１）、１
２）、グラジェント溶離装置（３）、溶離液送液ポンプ
（４）、試料導入装置（５）、および分離カラムから構
成されている。
第２図に螢光検出部（１０の構成図を示す。４−（Ｎ、
・Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルヒダントインの
分析の場合は窒素レーザー（１）、フルオレセインイン
チオヒダントインの場合は窒素レーザー（１）をボンピ
ング源とする色素レーザー（２）を光源として使用する
。窒素レーザ光の１部をビームスプリッタ（３）で取り
出し、ピンフォトダイオド（４）で検出し、サンプルホ
ールドＱ１のトリガ信号および螢光強度補正用の参照信
号とした。励起光の六Ｓ分はビームスプリッタ（３）を
通過した後フローセル（５）に集光される。螢光は励起
光に対して直角方向で集光され、さらに分光器（６）で
分光した後、マイクロチャンネルプレート内蔵型高速光
電子増倍管（７）で検出する。その信号はプリアンプ（
８）で増幅され、遅延回路（９）で設定された遅延時間
でサンプルホールドされ、演算回路（ロ）に導かれる。
・Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルヒダントインの
分析の場合は窒素レーザー（１）、フルオレセインイン
チオヒダントインの場合は窒素レーザー（１）をボンピ
ング源とする色素レーザー（２）を光源として使用する
。窒素レーザ光の１部をビームスプリッタ（３）で取り
出し、ピンフォトダイオド（４）で検出し、サンプルホ
ールドＱ１のトリガ信号および螢光強度補正用の参照信
号とした。励起光の六Ｓ分はビームスプリッタ（３）を
通過した後フローセル（５）に集光される。螢光は励起
光に対して直角方向で集光され、さらに分光器（６）で
分光した後、マイクロチャンネルプレート内蔵型高速光
電子増倍管（７）で検出する。その信号はプリアンプ（
８）で増幅され、遅延回路（９）で設定された遅延時間
でサンプルホールドされ、演算回路（ロ）に導かれる。
実験例１
第３図、第４図にそれぞれ０ナノ秒、５ナノ秒の遅延時
間を設定して測定した１０フェムトモルのフルオレセイ
ンチオヒダントインのクロマトグラムを示す。溶離液は
α１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）を用い５％かジ５０
％までのアセトニトリルによるリニアグラジェント溶離
法で分離している。使用したカラムはＴＳＫｇｅｌ Ｏ
ＤＳ １２０Ｔ、流速は１ ｔｎｌＡ／ ｗｉｎで測定
している。螢光測定は５１５ｎｍの螢光強度を測定して
いる。遅延時間が０ナノ秒の場合、ベースラインの雑音
が大きいが、遅延時間を５ナノ秒とすると散乱光および
短寿命の螢光が除失されるため、明瞭なりロマトグラム
が得られる。第３図、第４図に示されたピークは次のア
ミノ酸に対応する。
間を設定して測定した１０フェムトモルのフルオレセイ
ンチオヒダントインのクロマトグラムを示す。溶離液は
α１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）を用い５％かジ５０
％までのアセトニトリルによるリニアグラジェント溶離
法で分離している。使用したカラムはＴＳＫｇｅｌ Ｏ
ＤＳ １２０Ｔ、流速は１ ｔｎｌＡ／ ｗｉｎで測定
している。螢光測定は５１５ｎｍの螢光強度を測定して
いる。遅延時間が０ナノ秒の場合、ベースラインの雑音
が大きいが、遅延時間を５ナノ秒とすると散乱光および
短寿命の螢光が除失されるため、明瞭なりロマトグラム
が得られる。第３図、第４図に示されたピークは次のア
ミノ酸に対応する。
１；アスパラギン酸 ２Ｘグルタミン酸 ３ｚアスパラ
ギン ４ｚ七リン ５ｚカルボキシメチルシステイン
６；グリシン ７３グルタミン８；ヒスチジン ９；ア
ルギニン １０３アラニン １１．セリンの分解物 １
２；チロシン１３；スレオニン １４ｇプロリン １５
；メチオニン １６：バリン １７：トリプトフアン１
８；フェニルアラニン １９：イソレイシン２０；ロイ
シン ２１；リジン 実験例２ 第５図、第６図にそれぞれ０ナノ秒、１０ナノ秒の遅延
時間を設定して測定した２０フ工ムトモルの４−（ｌｉ
、Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルチオヒダントイ
ンのクロマトグラムを示す。
ギン ４ｚ七リン ５ｚカルボキシメチルシステイン
６；グリシン ７３グルタミン８；ヒスチジン ９；ア
ルギニン １０３アラニン １１．セリンの分解物 １
２；チロシン１３；スレオニン １４ｇプロリン １５
；メチオニン １６：バリン １７：トリプトフアン１
８；フェニルアラニン １９：イソレイシン２０；ロイ
シン ２１；リジン 実験例２ 第５図、第６図にそれぞれ０ナノ秒、１０ナノ秒の遅延
時間を設定して測定した２０フ工ムトモルの４−（ｌｉ
、Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルチオヒダントイ
ンのクロマトグラムを示す。
分離条件は第３図の条件と同様である。窒素レーザ光（
３３７ｎｍ）で励起し４５０ ｎｍの螢光強度を測定し
ている。フルオレセインチオヒダントインの場合と同様
、遅延時間１０ナノ秒のクロマトグラムでは短寿命の雑
音螢光が除去され、大きな信号／雑音比が得られる。第
３図、第４図に示されたピークは次のアミノ酸に対応す
る。
３３７ｎｍ）で励起し４５０ ｎｍの螢光強度を測定し
ている。フルオレセインチオヒダントインの場合と同様
、遅延時間１０ナノ秒のクロマトグラムでは短寿命の雑
音螢光が除去され、大きな信号／雑音比が得られる。第
３図、第４図に示されたピークは次のアミノ酸に対応す
る。
１；アスパラギン酸 ２：力ルボキシメチルシスティン
３：グルタミン酸 ４：アスパラギン５；セリン ６
：スレオニン ７；グリシン８；グルタミン ９；ヒス
チジン ＩＪアラニン １１；チロシン １２３アルギ
ニン １３ニブロリン １４：メチオニン １５：バリ
ン１６！トリプトフアン １７３リジン １８：７エエ
ルアラニン １９ｚイソロイシン ２０１０イシン 以上述べたようにパルスレーザ−を光源とする時間分解
螢光器を用いた高速液体りｐマドグラフィがフルオレセ
インチオヒダントインや４−（Ｎ。
３：グルタミン酸 ４：アスパラギン５；セリン ６
：スレオニン ７；グリシン８；グルタミン ９；ヒス
チジン ＩＪアラニン １１；チロシン １２３アルギ
ニン １３ニブロリン １４：メチオニン １５：バリ
ン１６！トリプトフアン １７３リジン １８：７エエ
ルアラニン １９ｚイソロイシン ２０１０イシン 以上述べたようにパルスレーザ−を光源とする時間分解
螢光器を用いた高速液体りｐマドグラフィがフルオレセ
インチオヒダントインや４−（Ｎ。
Ｎ−デメチルアミノ）−１−す７チルヂオヒダントイン
を分析する高感度アミノ酸配列分析法に有効であること
が明らかになった。
を分析する高感度アミノ酸配列分析法に有効であること
が明らかになった。
第１図はこの発明の装置の一実施例の構成図を示してい
る。 ｔ２；溶離液貯槽 ３ｓグラジエント溶離装置４工試料
注入パルプ ５；送液ポンプ ６：分離カラム ７ｚ７０−セル 第２図はパルスレーザを光源とする時間分解螢光器（Ｉ
Ｉ）の構成図を示している。 １ｇ窒ＩＥレーザ ２；色素レーザ ５：ビームスブリ
ツタ ４；ビンホトダイオド ５：フ四−セル ６：分
光器 ７３高速光電子増倍管 ８ニブ’）７＞プ ９ｓ
遅延回路 １０；ピークホールド１１；サンプルホール
ド １２；演算回路１３：記録計 １４１高速液体クロ
マトグラフ第３図、第４図はフルオレセインチオヒダン
トイン（１０フ工ムトモルのアミノ酸）の螢光遅延時間
Ｄナノ秒、５ナノ秒で検出したクロマトグラム、第５図
、第６図は４−（Ｎ、Ｎ−デメチルアミノ）−１−ナフ
チルチオヒダントイン（２０フ工ムトモルのアミノ酸）
の螢光遅延時間０ナノ秒、１０ナノ秒で検出したクロマ
トグラムを示している。 特許出願人 東洋曹達工業株式会社 図面の浄釘（内容に変更なし） 第５図 第６図 手続ンｒｌｌ ｉ−Ｅ書（方式） 昭和６０年２月８日
る。 ｔ２；溶離液貯槽 ３ｓグラジエント溶離装置４工試料
注入パルプ ５；送液ポンプ ６：分離カラム ７ｚ７０−セル 第２図はパルスレーザを光源とする時間分解螢光器（Ｉ
Ｉ）の構成図を示している。 １ｇ窒ＩＥレーザ ２；色素レーザ ５：ビームスブリ
ツタ ４；ビンホトダイオド ５：フ四−セル ６：分
光器 ７３高速光電子増倍管 ８ニブ’）７＞プ ９ｓ
遅延回路 １０；ピークホールド１１；サンプルホール
ド １２；演算回路１３：記録計 １４１高速液体クロ
マトグラフ第３図、第４図はフルオレセインチオヒダン
トイン（１０フ工ムトモルのアミノ酸）の螢光遅延時間
Ｄナノ秒、５ナノ秒で検出したクロマトグラム、第５図
、第６図は４−（Ｎ、Ｎ−デメチルアミノ）−１−ナフ
チルチオヒダントイン（２０フ工ムトモルのアミノ酸）
の螢光遅延時間０ナノ秒、１０ナノ秒で検出したクロマ
トグラムを示している。 特許出願人 東洋曹達工業株式会社 図面の浄釘（内容に変更なし） 第５図 第６図 手続ンｒｌｌ ｉ−Ｅ書（方式） 昭和６０年２月８日
Claims (1)
- １、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフチルイ
ソチオリアネートあるいはフルオレセインイソチオシア
ネートを用いたエドマン分解反応で生じる４−（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノ）−１−ナフチルチオヒダントインあ
るいはフルオレセインチオヒダントインを液体クロマト
グラフィで分離し、パルスレーザを光源とする時間分解
螢光検出法で検出することを特徴とするアミノ酸配列分
析法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20182784A JPS61233371A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | アミノ酸配列分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20182784A JPS61233371A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | アミノ酸配列分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61233371A true JPS61233371A (ja) | 1986-10-17 |
| JPH0511266B2 JPH0511266B2 (ja) | 1993-02-15 |
Family
ID=16447550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20182784A Granted JPS61233371A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | アミノ酸配列分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61233371A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01212357A (ja) * | 1987-06-19 | 1989-08-25 | Applied Biosystems Inc | クロマトグラフ情報の量化 |
| EP0501307A2 (en) * | 1991-02-28 | 1992-09-02 | Shimadzu Corporation | Method for amino acid sequence analysis |
| WO1994002854A1 (en) * | 1992-07-27 | 1994-02-03 | Seiko Instruments Inc. | Method for high-sensitivity detection of amino acid derivative |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5847239A (ja) * | 1981-09-14 | 1983-03-18 | Nisshin Denki Seisakusho:Kk | 液体クロマトグラフ装置 |
-
1984
- 1984-09-28 JP JP20182784A patent/JPS61233371A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5847239A (ja) * | 1981-09-14 | 1983-03-18 | Nisshin Denki Seisakusho:Kk | 液体クロマトグラフ装置 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01212357A (ja) * | 1987-06-19 | 1989-08-25 | Applied Biosystems Inc | クロマトグラフ情報の量化 |
| EP0501307A2 (en) * | 1991-02-28 | 1992-09-02 | Shimadzu Corporation | Method for amino acid sequence analysis |
| US5234836A (en) * | 1991-02-28 | 1993-08-10 | Shimadzu Corporation | Method for amino acid sequence analysis |
| WO1994002854A1 (en) * | 1992-07-27 | 1994-02-03 | Seiko Instruments Inc. | Method for high-sensitivity detection of amino acid derivative |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0511266B2 (ja) | 1993-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roach et al. | Determination of amino acids at subfemtomole levels by high-performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection | |
| Yu et al. | Attomole amino acid determination by capillary zone electrophoresis with thermooptical absorbance detection | |
| Grau et al. | Recent methodological advances in the analysis of nitrite in the human circulation: nitrite as a biochemical parameter of the L-arginine/NO pathway | |
| Negri et al. | Online SERS detection of the 20 proteinogenic L-amino acids separated by capillary zone electrophoresis | |
| Lau et al. | Nanomolar derivatizations with 5-carboxyfluorescein succinimidyl ester for fluorescence detection in capillary electrophoresis | |
| JPH0154668B2 (ja) | ||
| Ogunkunle et al. | Small molecules released from islets of Langerhans determined by liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Amankwa et al. | Fluorescence detection in capillary electrophoresis | |
| CA2114371A1 (en) | Method of spectrometry and apparatus therefor | |
| CN1053128A (zh) | 十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定方法 | |
| JPS61233371A (ja) | アミノ酸配列分析方法 | |
| Zhao et al. | Quantitation of agmatine by liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection | |
| Murray et al. | HPLC laser fluorometric determination of amines in beer | |
| Van Den Beld et al. | Laser-induced fluorescence detection in liquid chromatography after preliminary derivatization of carboxylic acid and primary amino groups | |
| Vrábel et al. | Sensitive detection and separation of fluorescent derivatives using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection with 532 nm Nd: YAG laser | |
| Imasaka et al. | Determination of anthracene derivatives by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography combined with helium—cadmium laser fluorimetry | |
| JP3823473B2 (ja) | カテコールアミン分析装置 | |
| Szabo et al. | Direct Injection Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI‐MS) Analysis of Proteins with High Matrix Content: Utilizing Taylor–Aris Dispersion | |
| JPH10267844A (ja) | 時間分解蛍光検出器およびそれを用いた蛍光分析装置、方法 | |
| Peters et al. | Multi-analyte calibration curve for high-performance liquid chromatography with an inductively coupled plasma carbon emission detector | |
| US9080995B2 (en) | Method for quantitatively analyzing cysteine and cystine and reagent kit for quantitatively analyzing cysteine and cystine | |
| Martin et al. | The free-falling drop detector--a nover fluorescence detector for high-performance liquid chromatography. | |
| JPH071265B2 (ja) | アミノ基を有する光学異性体の分析方法 | |
| Wang et al. | N-hydroxysuccinimidyl-fluorescein-O-acetate for precolumn fluorescence derivatization of amino acids and oligopeptides in liquid chromatography | |
| Assenza | Detection Systems |