JPH10267844A

JPH10267844A - 時間分解蛍光検出器およびそれを用いた蛍光分析装置、方法

Info

Publication number: JPH10267844A
Application number: JP9145397A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Iwata; 哲郎岩田; Yasuyuki Kurosu; 泰行黒須; Masako Maeda; 昌子前田
Original assignee: Jasco Corp
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 1998-10-09

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の目的は、励起により長寿命蛍光を発
する対象の分析を容易とする蛍光検出器およびそれを用
いた蛍光分析装置を提供することにある。【解決手段】励起光束を所定タイミングで断続的に試
料に照射する励起光断続出射部４０，４２と、前記励起
光断続出射部４０，４２の光束通過タイミングより一定
時間遅延して得られる試料の蛍光のみを通過させる遅延
蛍光取得部４６と、前記遅延蛍光取得部４６により選択
された蛍光強度を測定し電気信号とする光電変換部５０
と、を備えたことを特徴とする時間分解蛍光検出器１８
およびこれを用いた時間分解蛍光分析装置１０。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は蛍光検出装置および
蛍光分析装置、方法、特に蛍光採取タイミングの調整機
構の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】たとえばアミノ化合物などの微量分析に
は従来よりラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッ
セイ、蛍光標識法などが用いられている。しかしなが
ら、ラジオイムノアッセイなどに用いられる放射性同位
体は安全性の点で問題があり、化学発光イムノアッセ
イ、蛍光標識法では検出感度あるいはＳ／Ｎ比の点で改
善の余地が残されている。ラベルとして通常の色素を用
いた場合、たとえばフルオレセインでは、期待されるよ
うな高いＳ／Ｎ比は、高強度励起源を用いた場合にも得
られない。これはバックグラウンド蛍光による強い妨害
光、及び励起ビームの散乱光が対象部位から発する蛍光
信号をぼかすことによる。

【０００３】これに対して、最近、ランタニドイオンを
用いる蛍光標識法が注目されている。ランタニドイオン
の錯体は高い強度の遅延蛍光信号により特徴づけられ
る。これらの中で、ユーロピウム（Ｅｕ³⁺）の錯体は特
異な蛍光特性を有しており、大きなストークシフト、狭
い発光バンド幅、高い量子効率、及び数十マイクロ秒か
らサブミリ秒の長い蛍光生起時間等が特徴的である。こ
れらの性質により、Ｅｕ³⁺錯体は、安全性の点で問題の
ある放射性同位体に代わって免疫アッセイのラベルとし
て用いられてきた。

【０００４】一方で、Ｅｕ³⁺錯体のこれらの性質は、時
間分解蛍光検出に好適である。対象部位の蛍光信号は高
い選択性を有して検出可能であり、またＥｕ³⁺錯体をパ
ルス励起系でラベルとして用いた場合には高い検出感度
が得られることがある。これは多くのバックグラウンド
物質の蛍光生起時間が短い（１０^-7秒以下）のに対し、
Ｅｕ³⁺錯体のそれはきわめて長い（１０^-4秒以上）こと
に起因し、そのことはそれら二つの信号がパルス励起の
後のタイムゲートを用いることにより容易に分離できる
ことを意味する。このような時間分解検出のいくつかの
試みが高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）あるいはキ
ャピラリー電気泳動の分野で、重畳したピークの分離及
びバックグラウンドノイズの除去のために行われてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらこれらの
多くは、ナノ秒あるいはピコ秒のスケールで行われてい
る。このため高価な、高速パルスレーザー光源と高性能
の検出システムが要求される。本発明は前記従来技術の
課題に鑑みなされたものであり、その目的は励起により
長時間蛍光を発する対象の分析を容易とする蛍光検出器
およびそれを用いた蛍光分析装置、方法を提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明にかかる時間分解蛍光検出器は、励起光束を所
定タイミングで断続的に試料に照射する励起光断続出射
部と、前記励起光断続出射部の光束通過タイミングより
一定時間遅延して得られる試料の蛍光のみを通過させる
遅延蛍光取得部と、前記遅延蛍光取得部により選択され
た蛍光強度を測定し電気信号とする光電変換部と、を備
えたことを特徴とする。

【０００７】また、本発明にかかる検出器において、励
起光断続出射部は、励起光束出射部と励起光断続部とよ
りなり、前記励起光束出射部は実質的に連続点灯される
光源よりなり、また励起光断続部は前記光源より出射さ
れる励起光束を所定タイミングで断続することが好適で
ある。

【０００８】また、本発明にかかる時間分解蛍光分析装
置は、流体試料をその含有成分ごとに分離する分離手段
と、前記分離手段よりの溶出流体に、検出対象成分と結
合し高い蛍光強度を有しかつ長寿命な蛍光体とするエン
ハンサーを注入可能なエンハンサー注入手段と、該反応
手段よりの流出流体の蛍光を測定する蛍光検出手段と、
を含み、前記蛍光検出手段は、励起光束を所定タイミン
グで断続的に試料に照射する励起光断続出射部と、前記
励起光断続部の光束通過タイミングより一定時間遅延し
て得られる試料の蛍光のみを通過させる遅延蛍光取得部
と、前記遅延蛍光取得部により選択された蛍光強度を測
定し電気信号とする光電変換部と、を備えたことを特徴
とする。

【０００９】なお、前記分析装置において、検出対象成
分はアミノ化合物と結合したランタノイド錯体であり、
エンハンサーはβ−ジケトンであることが好適である。
ここで、アミノ化合物はアミノ酸あるいは蛋白質を含む
概念である。また、本発明にかかるアミノ化合物の時間
分解蛍光分析方法は、アミノ基と反応する官能基とラン
タノイドイオンとキレートを形成する官能基を分子内に
併せ持つバイファンクショナル試薬を使用してアミノ化
合物を標識し、該標識体をクロマトグラフィーにより分
離後、β−ジケトンを含むエンハンサー試薬を導入し、
前記標識体をミセル化して時間分解蛍光検出することを
特徴とする。

【００１０】また、本発明にかかる間接時間分解蛍光検
出方法は、ランタノイドイオンとβ−ジケトンを含み構
成されるミセル化された長寿命の蛍光体を搬送溶媒中に
含み、短寿命蛍光物質及び非蛍光物質を負のピークとし
て検出することを特徴とする。なお、本発明において、
標識されたアミノ化合物の分離には特に液体クロマトグ
ラフィーが好適であるが、例えばキャピラリー電気泳動
等、アミノ化合物の分離を行うものであれば適用可能で
ある。

【００１１】

【発明の実施形態】以下、図面に基づき本発明の好適な
実施形態について説明する。図１には本発明の一実施形
態にかかる蛍光分析装置が示されている。同図に示す蛍
光分析装置１０は、分離手段１２と、エンハンサー注入
手段１４と、反応手段１６と、蛍光検出手段１８とを含
む。そして、前記分離手段１２は本実施形態において高
速液体クロマトグラフィーよりなり、搬送溶媒を供給す
る溶媒ポンプ２０と、被測定試料を注入するインジェク
タ２２と、分離カラム２４を含む。そして、インジェク
タ２２より注入される被測定試料を搬送溶媒に乗せて分
離カラム２４に導く。

【００１２】前記エンハンサー注入手段１４は、試薬ポ
ンプ２６とＴ字管２８を含み、前記分離カラム２４より
の溶出液にポストカラム試薬としてエンハンサーを導入
する。前記反応手段１６は、一定温度（本実施形態にお
いては４０℃）に制御された湯浴３０中を通過する反応
コイル３２を備え、前記エンハンサーと被測定試料中の
特定成分を反応させ、サブミリ秒オーダーの長寿命且つ
強い蛍光を発する長寿命蛍光体に変換する。前記蛍光検
出手段１８は、励起光束出射手段４０と、励起光断続部
４２と、照射波長選択部４４と、蛍光波長選択部４６
と、遅延蛍光取得部４８と、光電変換部５０および設定
部５１を含む。

【００１３】前記励起光束出射部４０は、本実施形態に
おいて、直流駆動されるキセノンランプを用いている。
また、励起光断続部４２は機械的チョッパーを用いてお
り、出射部４０からの光束はレンズ５２，５４および前
置アパーチャ５６を介して入射し、チョッパー４２によ
り透過・遮蔽される。前記励起光断続部４２を通過した
断続励起光は後置アパーチャ５８、コリメータレンズ６
０を介して照射波長選択部４４に入射する。照射波長選
択部４４は紫外域バンドパスフィルターより構成され、
前記キセノンランプ４０よりの励起光束より、被測定対
象となる蛍光体を励起し得る所定波長の励起波長光束を
選択する。本実施形態においてはランタニド錯体を前提
とし、その通過波長を２８０〜３７０ｎｍ（−３dB
点）、最大波長３４０nmとする。

【００１４】該照射波長選択部４４により波長制御され
た励起光は集光レンズ６２およびスリット６４を介し
て、前記反応手段３０より供給される反応液が流れるフ
ローセル６６に照射される。該フローセル６６の入光面
と略直角方向より得られる蛍光はスリット６８、コリメ
ータレンズ７０を介して蛍光波長選択部４６に入射され
る。前記蛍光波長選択部４６はローパスフィルターより
なり、被測定対象となる蛍光体の蛍光波長光束を選択す
る。本実施形態ではランタニド錯体を前提とし、−３db
となる波長が５８０nmである。そして、前記紫外域バン
ドパスフィルター４４およびローパスフィルター４６の
波長特性はＥｕ³⁺錯体の蛍光特性と略一致させている。

【００１５】該蛍光波長選択部４６を通過した蛍光は、
集光レンズ７２および前置アパーチャ７４を介して遅延
蛍光取得部４８に入射する。該遅延蛍光取得部４８も、
前記励起光断続部４２と同様に機械的チョッパーより構
成されており、前記励起光断続部４２の光束通過タイミ
ングより一定時間遅延して得られる蛍光を通過させるよ
うに制御されている。該遅延蛍光取得部４８を通過した
蛍光は、後置アパーチャ７６、集光レンズ７８、及びア
パーチャ８０を介して光電変換部５０に入射する。前記
光電変換部５０は本実施形態においてフォトマルチプラ
イヤーよりなり、入射した蛍光を光電変換する。この電
気信号は増幅アンプ８２及びゲート型積分器８４を介し
てチャートレコーダー８６に出力される。

【００１６】なお、前記励起光断続部４２、遅延蛍光取
得部４６及びゲート型積分器８４の動作タイミングは一
の位相同期ループ回路８８により同期制御されている。
本実施形態にかかる蛍光分析装置１０は概略以上のよう
に構成され、次にその作用について説明する。本実施形
態において、被測定試料は、検出対象成分であるアミノ
化合物をバイファンクショナル反応試薬（アミノ基と反
応する官能基（たとえばイソチオシアノ基）とＥｕ³⁺等
のランタノイドイオンと錯体を形成する官能基（例えば
ＥＤＴＡ）を分子内に併せ持つ反応試薬）を用いて標識
し、アミノ化合物−イソチオシアノ−ベンジル−ＥＤＴ
Ａ−ランタノイド錯体を形成して用いる（図２（ａ）参
照）。この錯体は比較的安定であり、またアミノ化合物
の性質を強く有するため、カラム処理などにより適正な
分離を行うことができるが、蛍光強度自体はさほど高く
ない。

【００１７】この試料（アミノ化合物−イソチオシアノ
−ベンジル−ＥＤＴＡ−ランタノイド錯体）をインジェ
クタ１２より注入すると、該試料は溶媒ポンプ２０より
送給される搬送溶媒と共に、分離カラム２４により成分
ごとに分離される。この溶出液にエンハンサー注入手段
１４よりポストカラム試薬（β−ジケトン）を添加し、
反応手段１６により反応させると、β−ジケトン−ラン
タノイド錯体が形成される（図２（ｂ）参照）。このβ
−ジケトン−ランタノイド錯体はサブミリ秒オーダーの
長寿命且つ強い蛍光を発する。そして、この反応溶出液
はフローセル６６を経由して排出される。

【００１８】一方、前記キセノンランプ４０よりの励起
光がチョッパー４２により断続され、さらに紫外域バン
ドパスフィルター４４により所定波長の励起光が抽出さ
れて、前記フローセル６６に照射される。そうすると、
β−ジケトン−ランタノイド錯体からは長寿命且つ強い
蛍光が発せられ、一方他の共存する蛍光物質からは短寿
命の蛍光が発せられる。この状態は図３に示されてい
る。同図（ａ）に示されるように、前記チョッパー４２
により１msec間隔で７５μsecの励起光照射が行われて
いる。なお、このサイクルは第一チョッパー４２のアパ
ーチャー幅（１mm）とキセノンランプ４０の発光の空間
距離（約１mm）に基づく波形の畳み込み積分により決定
される。

【００１９】そして、フローセル６６中のβ−ジケトン
−ランタノイド錯体からは、図３（ｂ）に示されるよう
な蛍光が発せられる。該蛍光はローパスフィルタ４６に
より、所定波長領域の蛍光のみが抽出され、チョッパー
４８により遅延蛍光が採取される。すなわち、チョッパ
ー４８は前記チョッパー４２と同期して、励起光照射よ
り一定時間（２００μsec）遅延して開となり（図３
（ｃ））、その後５００μsecの期間蛍光を通過させ
る。同図（ｃ）より明らかなように、第二チョッパー４
８のデューティー比は５０％である。図（ｃ）の点線は
サンプリング信号（ＦＷＨＭ：５００μ秒）の仮想波形
を示しており、これはチョッパー４８のアパーチャー幅
（２mm）とサンプルセル６６の側面幅（１mm）に依存す
る波形の畳み込みにより決定される。

【００２０】以上のようにして、フォトマルチプライヤ
ー５０は実質上同図（ｄ）に示すような蛍光を検出す
る。なお、他の蛍光物質は励起光照射後２００μsecの
期間中にほぼ蛍光を終了しており、検出対象とはならな
い。さらに、ゲート型積分器８４は同図（ｅ）に示すよ
うに励起光照射開始後２２０μsecより積分を開始し、
１９０μsec継続する。この結果、フォトマルチプライ
ヤー５０の立ち上がり時あるいは蛍光強度が弱くＳ／Ｎ
比が悪化した裾部分のカットを行うことができる。な
お、２２０μ秒及び１９０μ秒は、実験的に最適化され
た時間位置及び時間幅である。Ｅｕ³⁺錯体の濃度と比例
関係にある出力直流信号は、チャートレコーダー８６に
送られる。

【００２１】本実施形態において、機械的チョッパー４
２と直流駆動キセノンランプ４０の組み合わせが時間分
解計測の目的に用いられている。キセノンフラッシュラ
ンプの使用に対比して、前記組み合わせは試料の励起周
波数の繰り返し再現性が高く、ランプの高安定性、長寿
命の点で好ましい。フラッシュランプと比較して比較的
長いパルス幅および弱い放射強度は、Ｅｕ³⁺錯体の高い
強度および長い遅延時間という蛍光特性にとって大きな
欠点とはならない。

【００２２】また、本実施形態においては、サンプルか
ら出射された蛍光信号のサンプリングは出射側に挿入さ
れた第二の機械的チョッパー４８により光学的に行われ
る。第二チョッパー４８の回転は位相同期ループ（ＰＬ
Ｌ）回路８８により第一チョッパー４２と同期してい
る。前記位相同期ループ回路８８の位相角を設定部５１
の設定により変更することで、遅延蛍光信号の最適時間
位置にサンプリングゲートを移動することができる。第
二チョッパー４２を通過した蛍光はフォトマルチプライ
ヤー５０に入射し、電圧信号に変換される。この光学的
サンプリング方法は、従来の検出器出力サンプリング方
法と比較しＳＮ比の点で優れている。この理由は検出器
の飽和が回避でき、検出器の後に続く電気回路の周波数
帯域の狭域化ができるからである。他方、チョッパー４
８を通過した微少な迷光により、フォトマルチプライヤ
ー５０から直流バイアス信号が発生することがあり、Ｓ
Ｎ比を低下させる。この問題を回避するため、アパーチ
ャー５６，５８，７４，７６およびスリット６４，６８
を、サンプルセル６６とチョッパー４２，４８の両側に
配置する。加えて、ゲート型積分器８４（実効時定数
０．４秒）を用い、第二チョッパー４８のタンミング信
号によりトリガーをかける。ゲート幅および位置は最大
ＳＮ比を与える地点に最適化される。

【００２３】また、本実施形態において、分光計測を行
うため、紫外域バンドパスフィルター４４を励起光の光
路上に配置し、この通過波長を２８０〜３７０ｎｍ（−
３dB地点）、最大波長３４０nmとする。出光側にはロー
パスフィルター４６が挿入され、これは−３dbとなる波
長が５８０nmである。この二つのフィルターの波長特性
はＥｕ³⁺錯体の蛍光特性と略一致させている。通常の回
折格子型のモノクロメーターを用いる場合と比較して、
フィルター分光法はＳＮ比の点で有利であり、これによ
り高い光学的なスループットが得られ、励起及び蛍光波
長の２つの波長軸方向で蛍光信号を効果的に集めること
ができる。

【００２４】なお、上記実施形態において、ゲート型積
分器を用いているが、これに限られるものではなく、例
えばボックスカー積分器などを用いることも可能であ
る。また、本実施形態においては、継続点灯される励起
光束出射部を用いた例について説明したが、パルス光源
を用いることも可能である。また、蛍光信号収集手段と
して光子計数法を採用することも可能である。また、本
実施形態においては、アミノ化合物を検出対象とした
が、これに限られるものではなく、例えばバイファンク
ショナル反応試薬のイソチオシアノ基を他の官能基に置
き換えることにより、チオ化合物、カルボキシル化合物
などの検出も可能である。

【００２５】また、分離手段としてキャピラリー電気泳
動装置などを用いることも可能である。さらに、適当量
のエンハンサー溶液とランタノイドイオンを混入した移
動相を用いれば、非蛍光物質のみならず、一般的な短寿
命蛍光物質（例えばダンシル化合物、フルオレセインな
ど）を同時に分析することができる。すなわち、移動相
自身に長寿命の強い蛍光をもたせることで、非蛍光物質
のみならず、一般的な短寿命蛍光物質も、負のピークと
してシグナルを与える。

【００２６】

【実施例】以下、本発明のより具体的な実施例を示す。
なお、以下の時間分解蛍光検出器および蛍光検出器に用
いられるフローセルの容量は１６μlである。

【００２７】試薬ＨＰＬＣにおいては、イソチオシアノベンジル−ＥＤＴ
ＡとＥｕ³⁺錯体より誘導体化した試料溶液をポストカラ
ム法によりエンハンサー溶液と混合される。一方、時間
分解蛍光検出器の性能確認実施のためのフローインジェ
クション分析（ＦＩＡ）においては、ユーロピウム（II
I）アセテートテトラハイドレート（Ｅｕ（ＣＨ₃ＣＯ
Ｏ）₃・４Ｈ₂０，９９．９％）の試料溶液がエンハンサ
ー溶液と混合される。エンハンサー溶液はβ−ジケト
ン、トリｎ−オクチルフォスフィンオキサイド（ＴＯＰ
Ｏ）及び界面活性剤（TritonX-100）よりなる。β−ジ
ケトンに関しては、ピバロイトリフルオロアセトン（Ｐ
ＴＡ）、ベンゾイルトリフルオロアセトン（ＢＦＡ）、
あるいはセオニルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）を用
いた。TritonX-100及びユーロピウムアセテートは和光
純薬工業（株）（大阪）より購入し、ＰＴＡ，ＢＦＡ，
ＴＴＡ，ＴＯＰＯおよびＩＴＣＢ−ＥＤＴＡは同人
（株）（熊本）より購入した。すべての他の試薬は分析
グレードである。

【００２８】エンハンサー溶液の調製エンハンサー溶液は上記の混合リガンド（β−ジケトン
及びＴＯＰＯ）をTritonX-100を含む酢酸ナトリウム緩
衝液に溶解することにより調製した。つまり、２００ml
の５％TritonX-100に２．０Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）を加え、１０mlの５０mM ＴＯＰＯ，３
２mlの２．５mM β−ジケトン（ＰＴＡ，ＢＦＡ，ある
いはＴＴＡ）及び十分な蒸留水を加えて１ｌとする。

【００２９】アミノ化合物の錯体化１μＭ〜１ｍＭのアミン溶液（１０μl）に５〜５００
μＭのＥｕ³⁺のＩＴＣＢ−ＥＤＴＡ錯体（ＩＴＣＢ−Ｅ
ＤＴＡ−Ｅｕ；４５μl）及び１００ｍＭ炭酸ナトリウ
ム（ｐＨ９．８；４５μl）を加えた。この溶液は４０
℃で８時間インキュベートされ、５〜２０μlの反応混
合物が前記図１のＨＰＬＣシステムに導入される。ＩＴ
ＣＢ−ＥＤＴＡ−Ｅｕ溶液は、ＩＴＣＢ−ＥＤＴＡ（１
mg）を０．５mMＥｕアセテート溶液５mlに加えて調製す
る。

【００３０】バックグラウンドの除去時間分解蛍光検出器のバックグラウンド除去能力を測定
するため、強い妨害蛍光バックグラウンドの存在下でフ
ローインジェクション分析（ＦＩＡ）（分離カラムを有
しないＨＰＬＣシステム）を行った。試料溶液は一定濃
度（０．１μM）のＥｕ³⁺のＰＴＡ錯体を、各種濃度
（０〜９００μM）のフルオレセイン（５n秒以下の寿
命）と混合したものである。サンプルの注入量は１０μ
lで、搬送溶媒としては８％アセトニトリルを含む２０m
MＮａ−ＰＯ₄（ｐＨ７．０）を０．２ml/min（ポンプ２
０）の流量で用いた。エンハンサー溶液（８μMＰＴ
Ａ；ｐＨ６．５）の流量は０．２ml/min（ポンプ２６）
である。比較のため、従来の蛍光検出器１００を前記時
間分解蛍光検出器１８に直列接続し、励起及び出射波長
をそれぞれ２９０nm及び６１５nmとした。図４は（ａ）
蛍光検出器および（ｂ）時間分解蛍光検出器により得ら
れた信号を示す。同図より明らかなように、時間分解蛍
光検出器から得られた信号はＥｕ³⁺錯体の一定濃度に対
応して一定であるが、蛍光検出器から得られた信号はフ
ルオレセインの濃度に依存したバックグラウンド蛍光信
号の影響を受けている。

【００３１】ダイナミックレンジと検出限界図５は時間分解蛍光検出器のダイナミックレンジを示
す。時間分解蛍光検出器はフローを停止させて行った。
用いたサンプル溶液は、エンハンサー溶液（８μMＰＴ
Ａ；ｐＨ６．５）に溶解された酢酸ユーロピウムであ
り、ポンプ２０によりフローセル６６に導入される。図
５の直線範囲は検出強度で４オーダーをカバーしてお
り、検出限界は２．１×１０^-10Ｍ（３．３×１０^-15モ
ル）である。ここではＳＮ比＝３を与えるサンプル濃度
を検出限界とした。時間分解蛍光検出器をＦＩＡモード
（サンプルの注入容量；１０μｌ，溶媒（２０mMＮａ−
ＰＯ₄）及びエンハンサー溶液の流量０．１ml/min）で
用いた場合には、検出限界は９．９×１０^-9Ｍ（１．６
×１０^-13モル）であった。

【００３２】時間分解蛍光検出器は従来の蛍光検出器と
比較して、特に高いバックグラウンドを有する試料に対
して高感度を得ることが可能である。これは信号に重畳
されるショットノイズが信号強度の平方根に比例するこ
とによる。これを確かめるため、各種濃度（１０^-7〜１
０^-4Ｍ）のフルオレセインとＰＴＡエンハンサー溶液の
混合物について時間分解蛍光検出器（ＴＲＦＬ）および
蛍光検出器（ＦＬ）からの２つの信号のノイズの標準偏
差を測定した。この結果を表１に示す。なお、標準偏差
は０Ｍのフルオレセインの標準偏差で規格化してある。

【００３３】

【表１】 ──────────────────── 濃度ＴＲＦＬＦＬ ──────────────────── ０Ｍ１．００１．００１０^-7Ｍ１．０１１．２４１０^-6Ｍ０．９９１．８１１０^-5Ｍ１．０７５．００１０^-4Ｍ１．９４２１．９４ ──────────────────── 流量０．２ml/min 蛍光検出Ｅｘ．２９０nm Ｅｍ．６
１５nm

【００３４】従来の蛍光検出器に比較すると、時間分解
蛍光検出器からの信号のノイズの標準偏差は一桁小さ
く、これはＳＮ比で１０程度改善されることを意味して
いる。他の実験から、ＦＩＡモードの検出限界は、ＢＴ
Ａエンハンサー溶液を用いた場合には１．９×１０^-9Ｍ
（３．０×１０^-14モル）、ＴＴＡエンハンサー溶液を
用いた場合には１．４×１０^-9Ｍ（２．３×１０^-14モ
ル）であることが判明した。また、金属材料、たとえば
パイプ、Ｔ字管、反応コイル、インジェクター、ポンプ
ユニット、マイクロシリンジなどがＥｕ³⁺と反応し、大
きな信号テーリング及び信号再現性の低下を引き起こす
ことも判明した。このような問題を改善するため、流路
から金属材料をできる限り除外した。

【００３５】最適実験条件次にＨＰＬＣ実験の最適条件について検討を行った。決
定されるべきパラメータは緩衝液のｐＨ、エンハンサー
溶液の濃度、β−ジケトンの濃度、ＨＰＬＣに対するア
セトニトリルの濃度、混合コイルの温度及びその他であ
る。実験的に得られた条件は次の通りである。エンハンサー溶液：８０μM β−ジケトン，５００μM
ＴＯＰＯ，１．０％ TritonX-100，２００mM 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）混合コイル：長さ４ｍ，内径０．２５mm，tefzel，４０
℃ 溶媒：２０％以下のアセトニトリルを含む２０mM Ｎａ
−ＰＯ₄，流量０．１〜０．２ml/min エンハンサー溶液：０．０２〜０．２ml/min このエンハンサー溶液は、水で２０倍に希釈しても、増
強能力は減少しない。ＴＴＡ溶液の増強能力はＰＴＡ溶
液の約７倍であるが、数日の間に約１／１０に低下す
る。他方、ＰＴＡ溶液は安定である。ＢＦＡ溶液の安定
性はアセトニトリルの濃度に強く依存する。

【００３６】時間分解蛍光検出器によるアミノ化合物分
析時間分解蛍光検出器の全体の性能を調べるため、ダンシ
ル（Ｄｎｓ）−Ｇｌｎ（１．１mM）及びＤｎｓ−Ａｌａ
（１．９mM）の存在下で、６６．７μM ３−フェニル
−１−プロピルアミンＩＴＣＢ−ＥＤＴＡ−Ｅｕの分析
を行った。蛍光検出器により得られたクロマトグラムが
図６（ａ）に示され、時間分解蛍光検出器によるクロマ
トグラムが図６（ｂ）に示されている。溶媒は２０％ア
セトニトリルを含む２０mM Ｎａ−ＰＯ₄（ｐＨ７．
０）を０．１ml/minの流量で用いた。ポストカラム試薬
はＴＴＡ溶液を用い、その流量は０．０２ml/minとし
た。ＨＰＬＣに用いられる分離カラムはCrest C18T-5
（ステンレススチールカラム内径０．１５mm 長さ５０
mm）である。サンプルの注入量は１０μlである。クロ
マトグラフのピークは、Ｄｎｓ−Ｇｌｎ，Ｄｎｓ−Ａｌ
ａ，及び３−フェニル−１−プロピルアミンＩＴＣＢ−
ＥＤＴＡ−Ｅｕに対応して、Ａ，ＢおよびＣとマークさ
れている。ここで、「＊」は副生成物を意味する。蛍光
検出器がすべてのピークを示すのに対し、時間分解蛍光
検出器はサンプルとその副生成物のみを示すことが解
る。さらに、蛍光検出器で分離が不十分なクロマトグラ
フピークは時間分解蛍光検出器により明瞭に分離され、
時間分解蛍光検出器の有効性を示している。

【００３７】間接時間分解蛍光分析装置への適用図７には前記図１に示す装置を間接時間分解蛍光分析装
置として用いた場合の検出結果が示されている。同図よ
り明らかなように、搬送溶媒自体に強い蛍光を持たせて
いるため、蛍光物質１および非蛍光物質２が同一位相に
ピークを生じていることが理解される。

【００３８】

【発明の効果】以上説明したように本発明にかかる蛍光
検出器によれば、励起光を断続して試料に照射し、その
試料より発する蛍光を前記励起光の照射タイミングより
一定の遅延時間を有して採取することとしたので、蛍光
期間の長い成分について散乱光ないし他成分の蛍光の影
響の少ない検出を行うことができる。また、本発明にか
かる蛍光分析装置及び方法によれば、前記蛍光検出器を
用いることにより、特定成分の定性、定量分析を正確に
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態にかかる蛍光分析装置の概
略構成の説明図である。

【図２】本発明において用いられる長時間蛍光化反応の
一例の説明図である。

【図３】前記図１に示す蛍光検出手段におけるタイミン
グダイアグラムである。

【図４】本発明にかかる時間分解蛍光検出器と一般的な
蛍光検出器の検出結果の比較図である。

【図５】時間分解検出器による検出強度と検出対象濃度
の関係図である。

【図６】長時間蛍光物質のクロマトグラムを通常の蛍光
検出器でとった場合と、本発明にかかる時間分解蛍光検
出器でとった場合の比較図である。

【図７】図１に示した装置を間接時間分解蛍光分析装置
として用いた場合の検出結果の説明図である。

【符号の説明】

１０時間分解蛍光分析装置１２分離手段１４エンハンサー注入手段１６反応手段１８時間分解蛍光検出手段４０励起光束出射部４２励起光断続部４４照射波長選択部４６蛍光波長選択部４８遅延蛍光取得部５０光電変換部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】励起光束を所定タイミングで断続的に試
料に照射するする励起光断続出射部と、前記励起光断続出射部の光束通過タイミングより一定時
間遅延して得られる試料の蛍光のみを通過させる遅延蛍
光取得部と、前記遅延蛍光取得部により選択された蛍光強度を測定し
電気信号とする光電変換部と、を備えたことを特徴とす
る時間分解蛍光検出器。
【請求項２】請求項１記載の検出器において、励起光
断続出射部は、励起光束出射部と励起光断続部とよりな
り、前記励起光束出射部は実質的に連続点灯される光源より
なり、また励起光断続部は前記光源より出射される励起光束を
所定タイミングで断続することを特徴とする時間分解蛍
光検出器。
【請求項３】流体試料をその含有成分ごとに分離する
分離手段と、前記分離手段よりの溶出流体に、検出対象成分と結合し
高い蛍光強度を有しかつ長寿命な蛍光体とするエンハン
サーを注入可能なエンハンサー注入手段と、前記長寿命蛍光体を含有する流出流体の蛍光を測定する
蛍光検出手段と、を含み、前記蛍光検出手段は、励起光束を所定タイミングで断続的に試料に照射する励
起光断続出射部と、前記励起光断続出射部の光束通過タイミングより一定時
間遅延して得られる試料の蛍光のみを通過させる遅延蛍
光取得部と、前記遅延蛍光取得部により選択された蛍光強度を測定し
電気信号とする光電変換部と、を備えたことを特徴とす
る時間分解蛍光分析装置。
【請求項４】請求項３記載の装置において、検出対象
成分はアミノ化合物と結合したランタノイド錯体であ
り、エンハンサーはβ−ジケトンであることを特徴とす
る時間分解蛍光分析装置。
【請求項５】アミノ基と反応する官能基とランタノイ
ドイオンとキレートを形成する官能基を分子内に併せ持
つバイファンクショナル試薬を使用してアミノ化合物を
標識し、該標識体をクロマトグラフィーにより分離後、
β−ジケトンを含むエンハンサー試薬を導入し、前記標
識体をミセル化して時間分解蛍光検出することを特徴と
するアミノ化合物の時間分解蛍光分析方法。
【請求項６】ランタノイドイオン及びβ−ジケトンを
含み構成されるミセル化された長寿命の蛍光体を搬送溶
媒中に含み、短寿命蛍光物質及び非蛍光物質を負のピー
クとして検出する間接時間分解蛍光分析方法。