JP3016254B2 - アミノ酸配列の分析方法 - Google Patents
アミノ酸配列の分析方法Info
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- JP3016254B2 JP3016254B2 JP2407124A JP40712490A JP3016254B2 JP 3016254 B2 JP3016254 B2 JP 3016254B2 JP 2407124 A JP2407124 A JP 2407124A JP 40712490 A JP40712490 A JP 40712490A JP 3016254 B2 JP3016254 B2 JP 3016254B2
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- amino acid
- rna
- acid sequence
- aminoacyl
- amino acids
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアミノ酸配列の分析方法
に関する。更に詳しくは、カルボキシペプチダーゼによ
りペプチド断片のカルボキシル末端基よりアミノ酸を順
次脱離させ、脱離したアミノ酸を検出することによるア
ミノ酸配列の分析方法に関する。
に関する。更に詳しくは、カルボキシペプチダーゼによ
りペプチド断片のカルボキシル末端基よりアミノ酸を順
次脱離させ、脱離したアミノ酸を検出することによるア
ミノ酸配列の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学、生化学、医学分野等におい
て、タンパク質の一次構造の決定は重要な位置を占めて
いる。タンパク質の一次構造の決定法としては、１９５
０年にエドマンによりエドマン分解が確立されて以来、
このエドマン分解を自動化した装置が開発されてきてい
る。即ち、従来より、アミノ酸配列の分析方法はペプチ
ド断片のＮ（アミノ）末端基より逐次分解したアミノ酸
を検出していくエドマン法が主流であり、この方法は、
アルカリ存在下フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴ
Ｃ）を作用させ、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）処理して
Ｎ末端基をチアゾリノン誘導体とし（ＰＴＺ−アミノ
酸）、ＰＴＺ−アミノ酸を加熱し、安定なフェニルチオ
ヒダントイン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）に転位させ、
ＴＬＣ又は逆相ＨＰＬＣにてＰＴＨ−アミノ酸を検出す
る方法である。一方、カルボキシル末端基のアミノ酸だ
けの決定方法としてはヒドラジン分解法、トリチウム標
識法などが知られているが、カルボキシル末端基からの
アミノ酸配列の分析方法は未だ知られていない。
て、タンパク質の一次構造の決定は重要な位置を占めて
いる。タンパク質の一次構造の決定法としては、１９５
０年にエドマンによりエドマン分解が確立されて以来、
このエドマン分解を自動化した装置が開発されてきてい
る。即ち、従来より、アミノ酸配列の分析方法はペプチ
ド断片のＮ（アミノ）末端基より逐次分解したアミノ酸
を検出していくエドマン法が主流であり、この方法は、
アルカリ存在下フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴ
Ｃ）を作用させ、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）処理して
Ｎ末端基をチアゾリノン誘導体とし（ＰＴＺ−アミノ
酸）、ＰＴＺ−アミノ酸を加熱し、安定なフェニルチオ
ヒダントイン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）に転位させ、
ＴＬＣ又は逆相ＨＰＬＣにてＰＴＨ−アミノ酸を検出す
る方法である。一方、カルボキシル末端基のアミノ酸だ
けの決定方法としてはヒドラジン分解法、トリチウム標
識法などが知られているが、カルボキシル末端基からの
アミノ酸配列の分析方法は未だ知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらのＮ末端基から
の分解法である従来法においては、反応条件が強く、あ
る種のＰＴＨアミノ酸（セリン、トレオニン等）誘導体
が分解しやすいことに加えて、対照となるアミノ酸が必
要となるが、対照アミノ酸を用いて検出する場合、ＴＬ
Ｃではアミノ酸の化学的性質が近似している為、展開溶
媒を多種類用いなければならないという問題があった。
また、逆相ＨＰＬＣにおいても、標準試料との溶出時間
を比較して行なわれるが、ピークが近いと、重ねて分析
しなければならず、大変煩雑であった。
の分解法である従来法においては、反応条件が強く、あ
る種のＰＴＨアミノ酸（セリン、トレオニン等）誘導体
が分解しやすいことに加えて、対照となるアミノ酸が必
要となるが、対照アミノ酸を用いて検出する場合、ＴＬ
Ｃではアミノ酸の化学的性質が近似している為、展開溶
媒を多種類用いなければならないという問題があった。
また、逆相ＨＰＬＣにおいても、標準試料との溶出時間
を比較して行なわれるが、ピークが近いと、重ねて分析
しなければならず、大変煩雑であった。
【０００４】近年では、タンパク質あるいはペプチドの
一次構造の決定において、迅速かつ簡便になされること
が要請されているが、このように従来法では分析操作が
煩雑であり分析にも時間を要している等の問題点が指摘
されていた。従って、本発明の目的は対照となるアミノ
酸標準サンプルとの比較等を行う必要のない、簡易なア
ミノ酸配列の分析方法を提供することにある。
一次構造の決定において、迅速かつ簡便になされること
が要請されているが、このように従来法では分析操作が
煩雑であり分析にも時間を要している等の問題点が指摘
されていた。従って、本発明の目的は対照となるアミノ
酸標準サンプルとの比較等を行う必要のない、簡易なア
ミノ酸配列の分析方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は前記課題を解
決すべく鋭意検討した結果、ペプチド断片のカルボキシ
ル末端基よりアミノ酸を順次脱離させ、次いでアミノア
シル結合をｔ−ＲＮＡと脱離した該アミノ酸との間に形
成させ、得られた反応生成物であるアミノアシルｔ−Ｒ
ＮＡを検出すれば、前記課題を解決することができるこ
とを見い出し本発明を完成するに至った。
決すべく鋭意検討した結果、ペプチド断片のカルボキシ
ル末端基よりアミノ酸を順次脱離させ、次いでアミノア
シル結合をｔ−ＲＮＡと脱離した該アミノ酸との間に形
成させ、得られた反応生成物であるアミノアシルｔ−Ｒ
ＮＡを検出すれば、前記課題を解決することができるこ
とを見い出し本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の要旨はペプチド断片のカル
ボキシル末端基より、カルボキシペプチダーゼ処理によ
りアミノ酸を順次脱離せしめ、次いで脱離したアミノ酸
と該アミノ酸に特異的なｔ−ＲＮＡ及びアミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素とを反応せしめ、得られた反応生成物
を検出することを特徴とするアミノ酸配列の分析方法に
関する。
ボキシル末端基より、カルボキシペプチダーゼ処理によ
りアミノ酸を順次脱離せしめ、次いで脱離したアミノ酸
と該アミノ酸に特異的なｔ−ＲＮＡ及びアミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素とを反応せしめ、得られた反応生成物
を検出することを特徴とするアミノ酸配列の分析方法に
関する。
【０００７】本発明において用いられるカルボキシペプ
チダーゼは、ペプチドのカルボキシル末端からペプチド
結合を加水分解する酵素であり、通常カルボキシペプチ
ダーゼＹ又はＰ（例えばベーリンガーマンハイム社製の
製造番号２３８１３９）が用いられる。カルボキシペプ
チダーゼによる酵素処理は、試量としてのペプチド断片
の量にもよるが、通常ペプチド断片５ｎｍolに対し０．
５〜１Ｕを加え、３７℃で３０分行う。酵素処理により
カルボキシル末端基より順次アミノ酸が脱離され遊離さ
れてくるため、適当な時間（通常例えば２分おきに１０
回程度）毎にサンプリングを行う。
チダーゼは、ペプチドのカルボキシル末端からペプチド
結合を加水分解する酵素であり、通常カルボキシペプチ
ダーゼＹ又はＰ（例えばベーリンガーマンハイム社製の
製造番号２３８１３９）が用いられる。カルボキシペプ
チダーゼによる酵素処理は、試量としてのペプチド断片
の量にもよるが、通常ペプチド断片５ｎｍolに対し０．
５〜１Ｕを加え、３７℃で３０分行う。酵素処理により
カルボキシル末端基より順次アミノ酸が脱離され遊離さ
れてくるため、適当な時間（通常例えば２分おきに１０
回程度）毎にサンプリングを行う。
【０００８】サンプリングされた各酵素処理液にアミノ
アシルｔ−ＲＮＡ合成酵素と１種類づつのｔ−ＲＮＡを
加えて、通常３７℃で約２０分間反応させて特異的アミ
ノ酸とｔ−ＲＮＡとの間にアミノアシル結合を形成させ
る。添加するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素はアミノ
酸をそれに対応するｔ−ＲＮＡに結合させる機能をもっ
た公知の酵素であり、例えばMethod in EnzymologyVol.
29 p547 (1974)に記載されたアラニル−ｔ−ＲＮＡ−
シンセターゼを用いることができる。添加量は通常基質
の２倍量である。また添加するｔ−ＲＮＡは２０種のア
ミノ酸それぞれに対応するｔ−ＲＮＡが知られており、
「核酸の化学ＩＩＩ（生化学実験講座２）」日本生化学
会編、東京化学同人p485〜488(1977) に記載されたもの
など容易に入手し得るものである。ｔ−ＲＮＡは各酵素
処理液に１種類づつが添加され添加量は通常０．５μＭ
である。従って通常、１回のサンプリングにより得られ
た酵素処理液を２０本に分注し、それぞれに各ｔ−ＲＮ
Ａとアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を添加し反応させ
る。
アシルｔ−ＲＮＡ合成酵素と１種類づつのｔ−ＲＮＡを
加えて、通常３７℃で約２０分間反応させて特異的アミ
ノ酸とｔ−ＲＮＡとの間にアミノアシル結合を形成させ
る。添加するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素はアミノ
酸をそれに対応するｔ−ＲＮＡに結合させる機能をもっ
た公知の酵素であり、例えばMethod in EnzymologyVol.
29 p547 (1974)に記載されたアラニル−ｔ−ＲＮＡ−
シンセターゼを用いることができる。添加量は通常基質
の２倍量である。また添加するｔ−ＲＮＡは２０種のア
ミノ酸それぞれに対応するｔ−ＲＮＡが知られており、
「核酸の化学ＩＩＩ（生化学実験講座２）」日本生化学
会編、東京化学同人p485〜488(1977) に記載されたもの
など容易に入手し得るものである。ｔ−ＲＮＡは各酵素
処理液に１種類づつが添加され添加量は通常０．５μＭ
である。従って通常、１回のサンプリングにより得られ
た酵素処理液を２０本に分注し、それぞれに各ｔ−ＲＮ
Ａとアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を添加し反応させ
る。
【０００９】各ｔ−ＲＮＡはアミノ酸各々について特異
的であるため、カルボキシル末端基より脱離したアミノ
酸に対して特異的なｔ−ＲＮＡが添加された反応液にお
いては、アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素により該アミ
ノ酸とｔ−ＲＮＡとの間にアミノアシル結合が形成さ
れ、特異的なアミノアシルｔ−ＲＮＡを得ることができ
る。
的であるため、カルボキシル末端基より脱離したアミノ
酸に対して特異的なｔ−ＲＮＡが添加された反応液にお
いては、アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素により該アミ
ノ酸とｔ−ＲＮＡとの間にアミノアシル結合が形成さ
れ、特異的なアミノアシルｔ−ＲＮＡを得ることができ
る。
【００１０】次に、ＨＰＬＣ等によりこれらの各反応生
成物を分離し、２６０ｎｍのｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピー
クを検出することにより、常法により脱離した遊離のア
ミノ酸を検出することができる。これらの操作を経時的
に行ない、カルボキシル末端基より順次脱離されるアミ
ノ酸を分析することによりアミノ酸配列を分析すること
ができる。
成物を分離し、２６０ｎｍのｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピー
クを検出することにより、常法により脱離した遊離のア
ミノ酸を検出することができる。これらの操作を経時的
に行ない、カルボキシル末端基より順次脱離されるアミ
ノ酸を分析することによりアミノ酸配列を分析すること
ができる。
【００１１】本発明の方法は、マニュアル操作により、
あるいは本発明の方法を用いてアミノ酸配列を自動分析
する装置によっても行うことができる。自動分析装置と
して応用する場合の一態様としては、図１に示すフロー
チャートが挙げられる。まず、カルボキシペプチダーゼ
によりカルボキシル末端基よりアミノ酸を順次脱離させ
るペプチド断片化反応部１、脱離されたアミノ酸にアミ
ノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素およびｔ−ＲＮＡを抽入し
て反応させるアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成部２、合成さ
れたアミノアシルｔ−ＲＮＡを検出する検出部３そして
データ処理部４から構成される。
あるいは本発明の方法を用いてアミノ酸配列を自動分析
する装置によっても行うことができる。自動分析装置と
して応用する場合の一態様としては、図１に示すフロー
チャートが挙げられる。まず、カルボキシペプチダーゼ
によりカルボキシル末端基よりアミノ酸を順次脱離させ
るペプチド断片化反応部１、脱離されたアミノ酸にアミ
ノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素およびｔ−ＲＮＡを抽入し
て反応させるアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成部２、合成さ
れたアミノアシルｔ−ＲＮＡを検出する検出部３そして
データ処理部４から構成される。
【００１２】
【実施例】以下、実施例をあげて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定される
ものではない。 実施例１ １．５ｍｌエッペンドルフチューブ２１本にペプチド断
片１ｎｍｏｌ／ｍｌを各々０．５ｍｌ、バッファーとし
て０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．７）
０．４ｍｌ、カルボキシペプチダーゼＰ（ベーリンガー
マンハイム社製）０．０５Ｕ／ｍｌを０．１ｍｌ添加
し、３０℃で２分おきに１０回、０．１ｍｌづつサンプ
リングを行ない、６５℃で約１分間処理して酵素を失活
させる。次にサンプリングした各溶液にアミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素（Method in Enzymology Vol. 29 p54
7 (1974)に記載されたアラニル−ｔ−ＲＮＡ−シンセタ
ーゼ）０．０５Ｕ／ｍｌを０．１ｍｌ添加し、ＡＴＰを
終濃度１０ｎｍｏｌとなるように加え、さらに２０種の
ｔ−ＲＮＡを１種づつ１０ｎｍｏｌ各チューブに加え、
３７℃で１０分間反応させる（残り１本はｔ−ＲＮＡ無
添加）。得られた反応生成物をＨＰＬＣにより分離し、
２６０ｎｍのｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピークより、その溶
出時間を各ｔ−ＲＮＡについてＰＣにて計算し、アミノ
酸配列の順序を決定する。この場合、カルボキシル末端
基より脱離されるアミノ酸とアミノアシル結合を形成し
たｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピーク（２６０ｎｍ）が検出さ
れ、残りの２０本のチューブからは検出されない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定される
ものではない。 実施例１ １．５ｍｌエッペンドルフチューブ２１本にペプチド断
片１ｎｍｏｌ／ｍｌを各々０．５ｍｌ、バッファーとし
て０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．７）
０．４ｍｌ、カルボキシペプチダーゼＰ（ベーリンガー
マンハイム社製）０．０５Ｕ／ｍｌを０．１ｍｌ添加
し、３０℃で２分おきに１０回、０．１ｍｌづつサンプ
リングを行ない、６５℃で約１分間処理して酵素を失活
させる。次にサンプリングした各溶液にアミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素（Method in Enzymology Vol. 29 p54
7 (1974)に記載されたアラニル−ｔ−ＲＮＡ−シンセタ
ーゼ）０．０５Ｕ／ｍｌを０．１ｍｌ添加し、ＡＴＰを
終濃度１０ｎｍｏｌとなるように加え、さらに２０種の
ｔ−ＲＮＡを１種づつ１０ｎｍｏｌ各チューブに加え、
３７℃で１０分間反応させる（残り１本はｔ−ＲＮＡ無
添加）。得られた反応生成物をＨＰＬＣにより分離し、
２６０ｎｍのｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピークより、その溶
出時間を各ｔ−ＲＮＡについてＰＣにて計算し、アミノ
酸配列の順序を決定する。この場合、カルボキシル末端
基より脱離されるアミノ酸とアミノアシル結合を形成し
たｔ−ＲＮＡ由来の吸収ピーク（２６０ｎｍ）が検出さ
れ、残りの２０本のチューブからは検出されない。
【００１３】
【発明の効果】従来のＮ末端基からの化学分解法に比
べ、本発明の方法は酵素を用いた分解なので、反応条件
がマイルドで、副反応を伴なわない。また、ｔ−ＲＮＡ
はアミノ酸各々について特異的であり、本発明の方法に
より予め加えるｔ−ＲＮＡを限定していれば、アミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素によりｔ−ＲＮＡに結合するア
ミノ酸は１種類である。従って、ｔ−ＲＮＡに結合した
アミノ酸を２６０ｎｍにおける吸収を検出することによ
り分析することができる。このように本発明の方法では
ＴＬＣのような各種の展開溶媒にて分離する事もなく、
また、ＨＰＬＣに用いられるアミノ酸標準サンプルも必
要なくなるので操作が簡単であり、簡便に分析を行うこ
とができる。
べ、本発明の方法は酵素を用いた分解なので、反応条件
がマイルドで、副反応を伴なわない。また、ｔ−ＲＮＡ
はアミノ酸各々について特異的であり、本発明の方法に
より予め加えるｔ−ＲＮＡを限定していれば、アミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素によりｔ−ＲＮＡに結合するア
ミノ酸は１種類である。従って、ｔ−ＲＮＡに結合した
アミノ酸を２６０ｎｍにおける吸収を検出することによ
り分析することができる。このように本発明の方法では
ＴＬＣのような各種の展開溶媒にて分離する事もなく、
また、ＨＰＬＣに用いられるアミノ酸標準サンプルも必
要なくなるので操作が簡単であり、簡便に分析を行うこ
とができる。
【図１】本発明の方法を用いたアミノ酸配列自動分析装
置のフローチャートを示した図である。
置のフローチャートを示した図である。
１ ペプチド断片化反応部 ２ アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成部 ３ 検出部 ４ データ処理部
Claims (1)
- 【請求項１】 ペプチド断片のカルボキシル末端基よ
り、カルボキシペプチダーゼ処理によりアミノ酸を順次
脱離せしめ、次いで脱離したアミノ酸と該アミノ酸に特
異的なｔ−ＲＮＡ及びアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素
とを反応せしめ、得られた反応生成物を検出することを
特徴とするアミノ酸配列の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2407124A JP3016254B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | アミノ酸配列の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2407124A JP3016254B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | アミノ酸配列の分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04229195A JPH04229195A (ja) | 1992-08-18 |
| JP3016254B2 true JP3016254B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=18516744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2407124A Expired - Lifetime JP3016254B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | アミノ酸配列の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3016254B2 (ja) |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP2407124A patent/JP3016254B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04229195A (ja) | 1992-08-18 |
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