JPH0486560A - 気相式蛋白質配列分析装置を用いたジスルフィド結合位置の分析方法 - Google Patents
気相式蛋白質配列分析装置を用いたジスルフィド結合位置の分析方法Info
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- JPH0486560A JPH0486560A JP19912290A JP19912290A JPH0486560A JP H0486560 A JPH0486560 A JP H0486560A JP 19912290 A JP19912290 A JP 19912290A JP 19912290 A JP19912290 A JP 19912290A JP H0486560 A JPH0486560 A JP H0486560A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は気相式蛋白質配列分析装置（以下単に気相式シ
ークエンサーと称する）を用いたジスルフィド結合位置
の分析方法に関するもので、さらに詳しくは糖蛋白質、
蛋白質およびペプチドの構造解析の分野で利用される。
ークエンサーと称する）を用いたジスルフィド結合位置
の分析方法に関するもので、さらに詳しくは糖蛋白質、
蛋白質およびペプチドの構造解析の分野で利用される。
気相式シークエンサーは蛋白質やペプチドのアミノ酸配
列を分析する機器であるが、その高感度性、操作の容易
さにより現在巾広く普及しており蛋白質化学の分野にお
いて大きな技術的革新をもたらした。しかしながら蛋白
質またはペプチドの分子内に複数個のジスルフィド結合
を有する場合、その結合の位置を決めることは通常の方
法ではこの気相式シークエンサーを使用しても不可能で
ある。例えばトランスフォーミング増殖因子のようにア
ミノ酸として６個のシスティンを含み分子内ジスルフィ
ド結合を３個保有するペプチドの場合に、アミノ酸配列
を解析する時はジスルフィド結合を還元剤にて開裂させ
一５Ｈ基をアルキル化し、分子内結合を失くしてから気
相式シークエンサーにより一次構造の解析を行なうがジ
スルフィド結合の位置は決めることはできない。
列を分析する機器であるが、その高感度性、操作の容易
さにより現在巾広く普及しており蛋白質化学の分野にお
いて大きな技術的革新をもたらした。しかしながら蛋白
質またはペプチドの分子内に複数個のジスルフィド結合
を有する場合、その結合の位置を決めることは通常の方
法ではこの気相式シークエンサーを使用しても不可能で
ある。例えばトランスフォーミング増殖因子のようにア
ミノ酸として６個のシスティンを含み分子内ジスルフィ
ド結合を３個保有するペプチドの場合に、アミノ酸配列
を解析する時はジスルフィド結合を還元剤にて開裂させ
一５Ｈ基をアルキル化し、分子内結合を失くしてから気
相式シークエンサーにより一次構造の解析を行なうがジ
スルフィド結合の位置は決めることはできない。
これまで分子内に複数個のジスルフィド結合を有する場
合、その位置の決定のために大量の試料を用い酵素分解
や化学的分解を併用し、その分解物を、分離・精製・分
析など煩雑な操作を行なわねばならなかった。しかし最
近気相式シークエンサーを利用して蛋白質のジスルフィ
ド結合の分析が報告された（文献： Ｔ Ｍａｒｔｉ、
Ｓ、 Ｊ、 Ｒｏｓｓｅｌｅｔ。
合、その位置の決定のために大量の試料を用い酵素分解
や化学的分解を併用し、その分解物を、分離・精製・分
析など煩雑な操作を行なわねばならなかった。しかし最
近気相式シークエンサーを利用して蛋白質のジスルフィ
ド結合の分析が報告された（文献： Ｔ Ｍａｒｔｉ、
Ｓ、 Ｊ、 Ｒｏｓｓｅｌｅｔ。
Ｋ、 Ｔｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｋ、Ａ、Ｗａｌｓｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２６＋８０９９ （１９
８７）、、 Ｓ、Ｂｕｒｍａｎ＋ Ｄ、Ｗｅｌｌｅｒ、
Ｂ、Ｃｈａｉｔ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２６＋８０９９ （１９
８７）、、 Ｓ、Ｂｕｒｍａｎ＋ Ｄ、Ｗｅｌｌｅｒ、
Ｂ、Ｃｈａｉｔ。
Ｔ、 Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ａｎｄ Ｅ、Ｂｒｅ
ｓｌｏｗ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ
。
ｓｌｏｗ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ
。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、８６４２９ （１９８９）、）。
分子内ジスルフィド結合を７個有するノイロフィジンと
いう蛋白の構造を解析したニス・バーマンらの文献は気
相シークエンサー操作中、還元剤との接触を意識的に避
けている。また彼らの報告にあるように通常、ペプチド
の場合１００〜５００ピコモルの試料を使用すれば充分
であるが、ジスルフィド結合を有するペプチドの場合最
大 １０ナノモルもの大量の試料を使用したと報告して
いる。
いう蛋白の構造を解析したニス・バーマンらの文献は気
相シークエンサー操作中、還元剤との接触を意識的に避
けている。また彼らの報告にあるように通常、ペプチド
の場合１００〜５００ピコモルの試料を使用すれば充分
であるが、ジスルフィド結合を有するペプチドの場合最
大 １０ナノモルもの大量の試料を使用したと報告して
いる。
レベルの試料を構造解析に使用することは非常に困難で
ある。なぜなら必要量を得るためには膨大な原料と多大
な時間を要するからである。したがってこれら天然物化
学の分野では微量でジスルフィド結合の位置を解析する
方法の開発が望まれている。
ある。なぜなら必要量を得るためには膨大な原料と多大
な時間を要するからである。したがってこれら天然物化
学の分野では微量でジスルフィド結合の位置を解析する
方法の開発が望まれている。
〔課題を解決するための手段および効果〕気相式シーク
エンサーの解析原理はエドマンの報告（Ｐ、Ｅｄｍａｎ
＋ Ａｃｔａ ｃｈｅｗ、 ５ｃａｎｄ、＋ ４＋
２８３（１９５０）、 ）に基づ（もので、以下の反応
を自動的に行なわせるものである。
エンサーの解析原理はエドマンの報告（Ｐ、Ｅｄｍａｎ
＋ Ａｃｔａ ｃｈｅｗ、 ５ｃａｎｄ、＋ ４＋
２８３（１９５０）、 ）に基づ（もので、以下の反応
を自動的に行なわせるものである。
すなわちポリブレン処理したガラスファイバーディスク
に、溶解した試料例えばペプチドを添加吸着させた後、
気体トリメチルアミン条件下でフェニルイソチオシアネ
ートを反応させＮ末端にアミノ酸と結合したフェニルチ
オカルバミルペプチド（ＰＴＣ−ペプチド）とする（カ
ップリング反応）。
に、溶解した試料例えばペプチドを添加吸着させた後、
気体トリメチルアミン条件下でフェニルイソチオシアネ
ートを反応させＮ末端にアミノ酸と結合したフェニルチ
オカルバミルペプチド（ＰＴＣ−ペプチド）とする（カ
ップリング反応）。
次いで気体あるいは液体のトリフルオロ酢酸（以下ＴＦ
Ａと略す）で処理し、ペプチドのＮ末端アミノ酸−つだ
けを切断し抽出操作により２−アニリノ−５−チアゾリ
ノンアミノ酸（ＡＴＺ−アミノ酸）を得る（切断反応）
。
Ａと略す）で処理し、ペプチドのＮ末端アミノ酸−つだ
けを切断し抽出操作により２−アニリノ−５−チアゾリ
ノンアミノ酸（ＡＴＺ−アミノ酸）を得る（切断反応）
。
このＡＴＺ−アミノ酸をＴＦＡ溶液で処理することによ
り安定な３−フェニル−２−チオヒダントインアミノ酸
（ＰＴＨ−アミノ酸）に変換させる（変換反応）。さら
にこのＰＴＨ−アミノ酸をアセトニトリル溶液にて溶出
し直接高速液体クロマトグラフに注入しＰＴＨ−アミノ
酸を分離・検出する。溶出位置とピーク面積によりアミ
ノ酸の同定と定量を行なうものである。順次同じ操作を
繰り返すことにより逐次Ｎ末端より構成アミノ酸が一残
基ずつ切断されその配列を決定するものである。
り安定な３−フェニル−２−チオヒダントインアミノ酸
（ＰＴＨ−アミノ酸）に変換させる（変換反応）。さら
にこのＰＴＨ−アミノ酸をアセトニトリル溶液にて溶出
し直接高速液体クロマトグラフに注入しＰＴＨ−アミノ
酸を分離・検出する。溶出位置とピーク面積によりアミ
ノ酸の同定と定量を行なうものである。順次同じ操作を
繰り返すことにより逐次Ｎ末端より構成アミノ酸が一残
基ずつ切断されその配列を決定するものである。
市販の機器としては例えば高滓製作新製ＰＳＱＩ型、米
国アプライドバイオシステム社製４７７Ａ型。
国アプライドバイオシステム社製４７７Ａ型。
４７３八型などがある。
前述の如く分子内に複数個のジスルフィド結合を有する
蛋白質またはペプチドを分析し、ジスルフィド結合の位
置を決定することは気相式シークエンサーを用いても通
常の方法では不可能である。
蛋白質またはペプチドを分析し、ジスルフィド結合の位
置を決定することは気相式シークエンサーを用いても通
常の方法では不可能である。
本発明者らはＰＴＨ−シスチンの検出を改善しより微量
の蛋白質およびペプチドに適用できる方法を見い出すべ
く長年にわたって鋭意検討を重ねた結果、気相式シーク
エンサーを用いて分析する工程において使用する試薬中
に還元剤例えばジチオスレイトール（以下ＤＴＴと称す
る）を使用することによってジスルフィド結合の位置を
決定することが可能であることを見い出し本発明を完成
した。
の蛋白質およびペプチドに適用できる方法を見い出すべ
く長年にわたって鋭意検討を重ねた結果、気相式シーク
エンサーを用いて分析する工程において使用する試薬中
に還元剤例えばジチオスレイトール（以下ＤＴＴと称す
る）を使用することによってジスルフィド結合の位置を
決定することが可能であることを見い出し本発明を完成
した。
使用する試薬とは気相式シークエンサーを用いて分析す
る工程において、ＡＴＺ−アミノ酸をＰＴ）Ｉアミノ酸
に転換させる際に用いるトリフルオロ酢酸溶液あるいは
ＰＴＨ−アミノ酸を溶解させ高速液体クロマトグラフに
輸送するアセトニトリル溶液のことである。
る工程において、ＡＴＺ−アミノ酸をＰＴ）Ｉアミノ酸
に転換させる際に用いるトリフルオロ酢酸溶液あるいは
ＰＴＨ−アミノ酸を溶解させ高速液体クロマトグラフに
輸送するアセトニトリル溶液のことである。
ニス・バーマンらの報告にもあるように還元剤を使用す
ることは、シスチンのジスルフィド結合の切断をもたら
すものと考えられており意識的に識とは逆に還元剤を添
加した試薬を使用することによって意外にももとの試料
のジスルフィド結合には何ら悪い影響を与えずＰＴＨ化
後のＰＴＨ−システィンを収率よ（検出できる。さらに
これまでは高速液体クロマトグラフでの検出ピークの物
質はＰＴＨ−シスチンと考えられていたがそれはＰＴＨ
システィンであることを確認し、この確認により還元剤
の利用が可能であることが判明したものである。すなわ
ちシスチンとシスティンを気相式シークエンサーで各々
解析した時、いずれも高速液体クロマトグラムで同一ピ
ークが検出されること、さらに上述の気相式シークエン
サーで調製したＰＴＨ−シスチンにＤＴＴを加えて加熱
し還元処理しても同一ピークが検出されることから、こ
れまで文献ではＰＴＨ−シスチンと考えられていたが本
当はＰＴＨ−システィンであることが判明した。この事
実から適当量の還元剤を加えることによってＰＴＨ−シ
スティンの収率を向上させたものである。
ることは、シスチンのジスルフィド結合の切断をもたら
すものと考えられており意識的に識とは逆に還元剤を添
加した試薬を使用することによって意外にももとの試料
のジスルフィド結合には何ら悪い影響を与えずＰＴＨ化
後のＰＴＨ−システィンを収率よ（検出できる。さらに
これまでは高速液体クロマトグラフでの検出ピークの物
質はＰＴＨ−シスチンと考えられていたがそれはＰＴＨ
システィンであることを確認し、この確認により還元剤
の利用が可能であることが判明したものである。すなわ
ちシスチンとシスティンを気相式シークエンサーで各々
解析した時、いずれも高速液体クロマトグラムで同一ピ
ークが検出されること、さらに上述の気相式シークエン
サーで調製したＰＴＨ−シスチンにＤＴＴを加えて加熱
し還元処理しても同一ピークが検出されることから、こ
れまで文献ではＰＴＨ−シスチンと考えられていたが本
当はＰＴＨ−システィンであることが判明した。この事
実から適当量の還元剤を加えることによってＰＴＨ−シ
スティンの収率を向上させたものである。
また本発明において還元剤としてはメルカプトエタノー
ル、ＤＴＴなどのチオール化合物、またはトリブチルホ
スフィンなどが使用できるが、臭気性、取り扱い易さか
ら考慮するとＤＴＴが好ましい。
ル、ＤＴＴなどのチオール化合物、またはトリブチルホ
スフィンなどが使用できるが、臭気性、取り扱い易さか
ら考慮するとＤＴＴが好ましい。
添加する濃度は好ましくは０．０１〜１■／ｄの範囲で
あり、更に好ましくは０．１■／ｄ前後が適当である。
あり、更に好ましくは０．１■／ｄ前後が適当である。
（実施例〕
以下に本発明の詳細な説明する。しかし本発明はこれら
実施例のみに限定されるものではない。
実施例のみに限定されるものではない。
なお、実施例に先立って、従来方法による分析方法を比
較例として記載した。
較例として記載した。
比較例
試料としてウシインシュリン３００ピコモルを用いて、
高滓ＰＳＱ−１型気相式シークエンサーにて解析した。
高滓ＰＳＱ−１型気相式シークエンサーにて解析した。
使用した試薬・溶媒は以下の通りである。
（１） カップリング試薬
（２）切断試薬
トリフルオロ酢酸
（４）溶媒
ｎ−へブタン、酢酸エチル、塩化ｎ−ブチル４０％アセ
トニトリル水溶液 通常の方法、すなわちＤＴＴを加えない標準解析を実施
した。
トニトリル水溶液 通常の方法、すなわちＤＴＴを加えない標準解析を実施
した。
ウシインシュリンのアミノ酸配列から１１サイクル目に
ＰＴＨ−システィンが検出されることになるので１１サ
イクル目の高速液体クロマトグラムを図ＩＡに示した。
ＰＴＨ−システィンが検出されることになるので１１サ
イクル目の高速液体クロマトグラムを図ＩＡに示した。
実施例
高滓ＰＳＣＩ−１型気相式シークエンサーを用いて、Ｐ
ＴＨ−アミノ酸を溶解させる４０％アセトニトリル溶液
に０．１■／ｄ ＤＴＴを添加した以外は、比較例と同
一の試薬、同一の試料を用い、同一の条件で解析した。
ＴＨ−アミノ酸を溶解させる４０％アセトニトリル溶液
に０．１■／ｄ ＤＴＴを添加した以外は、比較例と同
一の試薬、同一の試料を用い、同一の条件で解析した。
１１サイクル目の高速液体クロマトグラムを図ＩＢに示
した。図ＩＡ、ＢともＰＴＨ−システィンのピークは矢
印で示した。
した。図ＩＡ、ＢともＰＴＨ−システィンのピークは矢
印で示した。
図１から明らかのように、Ａの場合はＰＴＨ−システィ
ンのピークは小さく、他のピークと区別するのは難かし
いがＢに示すごと＜、ＤＴＴ添加によって、ＰＴＨ−シ
スティンのピークは、はっきりと確認できＡに比較して
Ｂの場合約５０％のピーク面積の増加が認められＰＴｔ
ｌ−システィンの同定が容易になる。
ンのピークは小さく、他のピークと区別するのは難かし
いがＢに示すごと＜、ＤＴＴ添加によって、ＰＴＨ−シ
スティンのピークは、はっきりと確認できＡに比較して
Ｂの場合約５０％のピーク面積の増加が認められＰＴｔ
ｌ−システィンの同定が容易になる。
さらに各サイクルにおけるシスティン以外の他のアミノ
酸の回収率を、ＤＴＴ添加、非添加時について表１に示
したが、両者全く差がなく、他のアミノ酸に対し、全く
悪い影響を及ぼさないことも確認された。
酸の回収率を、ＤＴＴ添加、非添加時について表１に示
したが、両者全く差がなく、他のアミノ酸に対し、全く
悪い影響を及ぼさないことも確認された。
以上、本発明は気相式シークエンサーに使用る試薬中に
単にＤＴＴを添加するだけで、ＰＴＨスティンの回収率
を上げ、微量の試料で蛋白質ペプチドのジスルフィド結
合の位置を確認でき有用な方法であり本発明の価値は高
い。
単にＤＴＴを添加するだけで、ＰＴＨスティンの回収率
を上げ、微量の試料で蛋白質ペプチドのジスルフィド結
合の位置を確認でき有用な方法であり本発明の価値は高
い。
図１は、１１サイクル目の高速液体クロマトラムでＡは
通常の方法、ＢはＤＴＴを添加した時矢印はＰＴＨ−シ
スティンのピークを示す。
通常の方法、ＢはＤＴＴを添加した時矢印はＰＴＨ−シ
スティンのピークを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）気相式蛋白質配列分析装置を用い蛋白質あるいはペ
プチドの一次構造を分析するにあたり、ＰＴＨ−アミノ
酸への転換反応に用いるトリフルオロ酢酸溶液中に還元
剤を添加しておくことを特徴とするジスルフィド結合位
置の分析方法。 ２）気相式蛋白質配列分析装置を用い蛋白質あるいはペ
プチドの一次構造を分析するにあたり、ＰＴＨ−アミノ
酸の溶解、並びに高速液体クロマトグラフへの輸送に用
いるアセトニトリル溶液中に還元剤を添加しておくこと
を特徴とするジスルフィド結合位置の分析方法。 ３）還元剤がジチオスレイトールである請求項１または
２記載の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19912290A JPH0486560A (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 気相式蛋白質配列分析装置を用いたジスルフィド結合位置の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19912290A JPH0486560A (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 気相式蛋白質配列分析装置を用いたジスルフィド結合位置の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0486560A true JPH0486560A (ja) | 1992-03-19 |
Family
ID=16402507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19912290A Pending JPH0486560A (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 気相式蛋白質配列分析装置を用いたジスルフィド結合位置の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0486560A (ja) |
-
1990
- 1990-07-30 JP JP19912290A patent/JPH0486560A/ja active Pending
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