CN104280498A - 一种乳制品中乳铁蛋白的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：先将样品溶解于水，离心去除脂肪，再加入酸试剂调节PH再离心，最后加入硫酸铵盐析，离心，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；再将乳清即样品乳铁蛋白粗提物过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；最后进行高效液相色谱测定，选用外标法或内标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。本发明在样品常规预处理的基础上进行改进，可以对乳制品中乳铁蛋白进行快速富集，样品预处理简单，费时短，且检测费用低，受外界环境变化及操作人员的影响小，在对乳铁蛋白进行预处理后进行高效液相色谱法检测，可将乳铁蛋白与其他杂质很好的分开，保证了乳铁蛋白检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
乳铁蛋白又称为乳转铁蛋白或红蛋白，于1939年被外国学者发现。它是一种红色糖蛋白，在泪液、汗液、精液、胆汁、乳汁及血液中性粒细胞中广泛存在，尤其在初乳中含量最高，可达7g/L。乳铁蛋白结构与血清转转蛋白相似，牛和人乳铁蛋白分别由689、691个氨基酸组成，其中谷氨酸、天冬氨酸及丙氨酸含量较高，半胱氨酸含量较少，基本不含硫氨酸。乳铁蛋白与铁的亲和力明显高于血清转铁蛋白，每个乳铁蛋白可结合两分子三价铁及两分子HCO3-或CO32-。
近年来，随着生物工程技术的不断进步与成熟，科学家们已经完成了乳铁蛋白生物学功能的有关研究，确定了其对人体的9大重要功能，具体包括：提高肠道对铁离子的吸收、广谱抗菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、调节免疫等。由于乳铁蛋白具有上述多种生理功能，因此，其在贫血及骨质疏松等疾病的诊治中均有着重要的作用。目前，乳铁蛋白被公认是一种天然、安全的功能性蛋白，因此，它在保健食品及药品中均有着广泛的应用前景，同时，也受到有关生厂商的格外重视。GB2760文件中明确将乳铁蛋白作为乳制品添加剂，可将其应用于婴儿配方奶粉、幼儿奶粉及学生奶焰中，使用量为30-100mg/100g。因此，对乳铁蛋白灵敏快速的检测，对于市售乳制品的质量监督具有重大意义。
目前测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法包括酶联免疫法、凝胶色谱法及紫外分光光度法等，酶联免疫法具有灵敏度高，样品无需纯化及最小检测限低等优点，但易受环境及操作者的影响，多次检测结果差异较大。紫外分光光度法操作简便，但易受其他物质的干扰，不易准确定量。凝胶色谱法操作简便，但仅适用于高纯度样品中乳铁蛋白的测定。因此，急需寻求一种操作简便、检测准确、适用样本广泛的检测方法。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种检测灵敏度高、准确性高、样品预处理简单的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）分离纯化：取样品5-10g溶解于50-100ml去离子水中，离心20-30min，去除脂肪，加入酸试剂，调节PH至4-5，再次离心20-30min ，加入硫酸铵盐析，离心，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；
（2）精提：将步骤（1）中制得的乳铁蛋白粗提物过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；
（3）将步骤（2）中制得的样品乳铁蛋白精提物进行高效液相色谱测定，选用外标法或内标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。
优选的，所述的酸试剂为盐酸，所述的盐酸浓度为1-3mol/L。
优选的，步骤（1）中所述的硫酸胺为质量浓度为60%-90%的硫酸铵溶液。
优选的，步骤（1）中所述的离心速度均为4500-5000r/min。
优选的，步骤（2）中所述的过滤采用的是纤维素滤膜，所述的纤维素滤膜的直径为0.35-0.45um。
优选的，步骤（3）中所述的高效液相色谱测定的参数为：色谱柱采用弱阳离子交换色谱柱，流动相为含有氯化物的磷酸盐缓冲液或含有硼酸盐的磷酸盐缓冲液，流动量流速为0.5-1.0ml/min，进样量为10-15ul，检测波长为265-285nm，柱温为28-35℃。
优选的，所述的弱阳离子交换色谱柱选自碘丙基阳离子交换色谱柱、碘酸基阳离子交换色谱柱或羧甲基阳离子交换色谱柱中的一种。
优选的，所述的氯化物选自氯化钠或氯化钾中的一种或多种，所述的硼酸盐选自硼酸钠或硼酸钾中的一种或多种。
优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.03-0.08mol/L,所述的磷酸盐缓冲液的共轭碱为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时的洗脱程序具体为：
氯化物或硼酸盐的浓度变化范围 被洗脱物质
0~0.1 mol/L -0.9~1.0mol/L 与阳离子不结合或结合弱的蛋白，0.9~1.0mol/L-1.1~1.2 mol/L 乳铁蛋白，
1.1~1.2 mol/L-1.4~1.5 mol/L 其他杂质。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明根据乳铁蛋白的理性特性，在样品常规预处理的基础上进行改进，采用脱脂、酸法去除酪蛋白及硫酸铵沉淀的方法，先进行粗提、再进行精提，可以对乳制品中乳铁蛋白进行快速富集，与传统的酶联免疫法相比，样品预处理简单，费时短，且检测费用低，受外界环境变化及操作人员的影响小。
（2）本发明将乳制品预处理后进行高效液相色谱测定，可将其他蛋白及有关杂质最大限度洗脱，而不会使乳铁蛋白变性，在适宜的流动相及一定色谱条件下进行高效液相色谱检测，可使乳铁蛋白与其他杂质很好的分开，分离度及灵敏度均很高，保证了乳铁蛋白检测结果的准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）分离纯化：取婴儿奶粉5g溶解于50ml去离子水中，以4500r/min离心20min，去除脂肪，加入浓度为1mol/L的盐酸，调节PH至4，再次离心20min，加入质量浓度为60%的硫酸铵溶液盐析，离心10min，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；
（2）精提：将步骤（1）中制得的乳铁蛋白粗提物采用直径为0.35um的纤维素滤膜过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；
（3）将步骤（2）中制得的样品乳铁蛋白精提物进行高效液相色谱测定，色谱条件：色谱柱采用碘丙基阳离子交换色谱柱，流动相为含有氯化钠的磷酸盐缓冲液，流动量流速为0.5ml/min，进样量为10ul，检测波长为265nm，柱温为28℃；选用外标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。
优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L,所述的磷酸盐缓冲液的共轭碱为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时的洗脱程序具体为：
氯化物或硼酸盐的浓度变化范围 被洗脱物质
0 mol/L -0.9mol/L 与阳离子不结合或结合弱的蛋白，1.0mol/L-1.2 mol/L 乳铁蛋白，
1.2 mol/L-1.5 mol/L 其他杂质。
实施例2
一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）分离纯化：取幼儿奶粉10g溶解于100ml去离子水中，以5000r/min离心30min，去除脂肪，加入浓度为3mol/L的盐酸，调节PH至5，再次离心30min，加入质量浓度为90%的硫酸铵溶液盐析，离心20min，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；
（2）精提：将步骤（1）中制得的乳铁蛋白粗提物采用直径为0.45um的纤维素滤膜过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；
（3）将步骤（2）中制得的样品乳铁蛋白精提物进行高效液相色谱测定，色谱条件：色谱柱采用碘酸基阳离子交换色谱柱，流动相为含有氯化钾的磷酸盐缓冲液，流速为1.0ml/min，进样量为15ul，检测波长为285nm，柱温为35℃；选用外标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。
所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.08mol/L,所述的磷酸盐缓冲液的共轭碱为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时的洗脱程序具体为：
氯化物或硼酸盐的浓度变化范围 被洗脱物质
0.1 mol/L -0.9mol/L 与阳离子不结合或结合弱的蛋白，0.9mol/L-1.1mol/L 乳铁蛋白，
1.1 mol/L-1.4 mol/L 其他杂质。
实施例3
一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）分离纯化：取女士奶粉8g溶解于80ml去离子水中，以4800r/min离心25min，去除脂肪，加入浓度为2mol/L的盐酸，调节PH至4.5，再次离心25min，加入质量浓度为75%的硫酸铵溶液盐析，离心15min，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；
（2）精提：将步骤（1）中制得的乳铁蛋白粗提物采用直径为0.4um的纤维素滤膜过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；
（3）将步骤（2）中制得的样品乳铁蛋白精提物进行高效液相色谱测定，色谱条件：色谱柱采用羧甲基阳离子交换色谱柱，流动相为含有硼酸钠的磷酸盐缓冲液，流速为0.8ml/min，进样量为12ul，检测波长为280nm，柱温为30℃；选用内标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。
优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.06mol/L,所述的磷酸盐缓冲液的共轭碱为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时的洗脱程序具体为：
氯化物或硼酸盐的浓度变化范围 被洗脱物质
0mol/L -0.9mol/L 与阳离子不结合或结合弱的蛋白，0.9mol/L-1.1 mol/L 乳铁蛋白，
1.1mol/L-1.4mol/L 其他杂质。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分离纯化：取样品5-10g溶解于50-100ml去离子水中，离心20-30min，去除脂肪，加入酸试剂，调节PH至4-5，再次离心20-30min ，加入硫酸铵盐析，离心10-20min，制得乳清即样品乳铁蛋白粗提物；
（2）精提：将步骤（1）中制得的乳铁蛋白粗提物过滤，制得样品乳铁蛋白精提物；
（3）将步骤（2）中制得的样品乳铁蛋白精提物进行高效液相色谱测定，选用外标法或内标法计算峰面积，确定样品中乳铁蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述的酸试剂为盐酸，所述的盐酸浓度为1-3mol/L。
3.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的硫酸胺为质量浓度为60%-90%的硫酸铵溶液。
4.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的离心速度均为4500-5000r/min。
5.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的过滤采用的是纤维素滤膜，所述的纤维素滤膜的直径为0.35-0.45um。
6.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的高效液相色谱测定的参数为：色谱柱采用弱阳离子交换色谱柱，流动相为含有氯化物的磷酸盐缓冲液或含有硼酸盐的磷酸盐缓冲液，流动量流速为0.5-1.0ml/min，进样量为10-15ul，检测波长为265-285nm，柱温为28-35℃。
7.根据权利要求6所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述的弱阳离子交换色谱柱选自碘丙基阳离子交换色谱柱、碘酸基阳离子交换色谱柱或羧甲基阳离子交换色谱柱中的一种。
8.根据权利要求6所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述的氯化物选自氯化钠或氯化钾中的一种或多种，所述的硼酸盐选自硼酸钠或硼酸钾中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.03-0.08mol/L,所述的磷酸盐缓冲液的共轭碱为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
10.根据权利要求1所述的乳制品中乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时的洗脱程序具体为：
氯化物或硼酸盐的浓度变化范围 被洗脱物质，
0~0.1 mol/L -0.9~1.0mol/L 与阳离子不结合或结合弱的蛋白，0.9~1.0mol/L-1.1~1.2 mol/L 乳铁蛋白，
1.1~1.2 mol/L-1.4~1.5 mol/L 其他杂质。
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