CN110551233A - 一种广东紫珠多糖及其提取方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广东紫珠多糖及其提取方法和用途，从广东紫珠中提取分离得到的广东紫珠均一多糖，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为1:19.14:1.02:3.28:24.16:4.68:1.62；相对分子质量为42.02KDa；多糖含量85％以上，酸性糖含量在10％以上；糖苷键型包括T‑α‑阿拉伯糖、→4‑β‑半乳糖‑(1→、→2,4‑α‑鼠李糖‑(1→、→4‑α‑半乳糖醛酸‑(1→和→4,6‑α‑葡萄糖‑(1→。本发明所得广东紫珠均一多糖CKP‑1在制备促凝血相关药物中有良好的应用前景。

Description

一种广东紫珠多糖及其提取方法和用途
技术领域
本发明涉及了一种植物多糖及其提取方法和应用，具体为广东紫珠均一多糖CKP-1、提取方法及用途。
背景技术
广东紫珠来源于马鞭草科植物广东紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun的干燥地上部分，为《中华人民共和国药典》(2015年版)收载品种，具有收敛止血、散瘀、清热解毒之功效，用于衄血、咯血、吐血、便血、崩露、外伤出血、肺热咳嗽、咽喉肿痛、热毒疮疡、水火烫伤等。广东紫珠在国内分布范围广，易于栽培，临床用于治疗宫颈炎、盆腔炎与阴道炎等妇科疾病，现被开发的中成药有抗宫炎片、宫复康胶囊和宫炎净片等。广东紫珠药材的药效物质基础研究前期主要集中在已经发现的小分子化学成分上，如以金石蚕苷、连翘酯苷B为代表的苯乙醇苷类成分，以槲皮素为代表的黄酮类成分等，但已有的研究成果尚未全面阐释广东紫珠多种活性作用的科学内涵。目前有学者开始关注广东紫珠中的大分子类物质，如多糖类成分，但是，也仅限于提取分离广东紫珠水溶性粗多糖，且提取分离得到的水溶性粗多糖的组成复杂，多糖含量较低，难以体现广东紫珠多糖的药理作用。
近年来，多种新的提取技术被应用于多糖的提取制备工艺研究中，有效地提高了其提取效率。已有研究表明超声波在多糖提取过程中利用其空化作用和机械效应破坏生物细胞壁，加速浸提物的溶出，能有效提高多糖的得率。
广东紫珠具有很好的止血促凝作用。已有文献报道，紫珠水煎液通过刺激外源性凝血系统以及血浆中凝血因子的活性产生止血作用，能显著缩短大鼠APTT的作用，还能通过影响内源性凝血系统以及血浆中凝血因子的活性而产生止血、凝血作用，同时调高TXB2表达、降低6-keto-PGF1a，刺激血管内皮细胞应激性产生止血活性物质，在各种凝血酶的催化作用下，对血小板和毛细血管产生自我保护作用，如促使血小板聚集和收缩血管等。
促凝血药(coagulants)又称止血药，是指能加速血液凝固或降低毛细血管通透性，促使出血停止的药物，常用于治疗出血性疾病。正常人由于有完整的血液凝固系统和抗凝及纤溶系统，所以血液在血管内既不凝固也不出血，始终自由流动完成其功能，但当机体出现凝血障碍时，凝血系统无法激活，止血环节异常，血浆中存在着的凝血因子无法发生了一系列的生化过程，最后无法形成纤维蛋白凝块，造成大量出血，形成出血性疾病。急性出血性疾病严重时，可并发休克、甚至死亡。因此迫切需要安全、有效的促凝血药物。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种广东紫珠多糖，是从广东紫珠中提取得到的均一多糖。本发明另一目的是提供该多糖的提取方法。本发明还有一目的是指出该多糖具有显著的抗凝血活性，可以制备成促凝血药物。
技术方案：本发明所述的一种广东紫珠均一多糖CKP-1，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为1:19.14:1.02:3.28:24.16:4.68:1.62；相对分子质量为42.02KDa；糖苷键型包括T-α-阿拉伯糖、→4-β-半乳糖-(1→、→2,4-α-鼠李糖-(1→、→4-α-半乳糖醛酸-(1→和→4,6-α-葡萄糖-(1→；比旋光度为+16.3°。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，85％≤多糖含量≤95％，10％≤酸性糖含量≤17％。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1元素组成比C/H/N/O为29.70％/4.19％/1.05％/65.06％。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1包含有α-D-吡喃糖苷和β-D-吡喃糖苷。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，参照中国药典2015版附录VII G pH测定法操作规程进行操作，广东紫珠均一多糖CKP-1pH为6.4±0.1。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，通过以下方法制备：
将广东紫珠粉碎后，加入有机试剂脱脂，超声水提取，过滤并将提取液浓缩，醇沉并洗涤沉淀，干燥得广东紫珠多糖粗品；多糖粗品加水配制成溶液，经脱脂，脱蛋白，醇沉并洗涤沉淀，干燥得到广东紫珠粗多糖初步纯化样品后，再采用大孔树脂、离子交换柱、分子筛柱纯化后冷冻干燥得广东紫珠均一多糖CKP-1。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1的提取方法，将广东紫珠粉碎后，加入有机试剂脱脂，超声水提取，过滤并将提取液浓缩，醇沉并洗涤沉淀，干燥得广东紫珠多糖粗品；多糖粗品加水配制成溶液，经脱脂，脱蛋白，醇沉并洗涤沉淀，干燥得到广东紫珠粗多糖初步纯化样品后，再采用大孔树脂、离子交换柱、分子筛柱纯化后冷冻干燥得广东紫珠均一多糖CKP-1。
所述的提取方法，具体由下列步骤组成：
(1)称取粉碎后过筛的广东紫珠全草药材于提取容器中，加入4-5倍体积乙醇，回流脱脂3-4小时，纱布除去上清后将样品烘干；将烘干后样品至于反应容器中，按料液比20～70mL/g加入去离子水，辅以超声波法提取，提取时间为20～70min，提取温度为20～70℃，超声功率为125～250W，提取结束后过滤得提取液，将提取液浓缩，加入乙醇沉淀，静置24-28小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得到广东紫珠多糖粗品。
(2)广东紫珠多糖粗品加去离子水配制成广东紫珠多糖粗品溶液，用无水石油醚脱脂；接着用Sevage试剂脱蛋白；加入乙醇沉淀，静置24～28小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得广东紫珠粗多糖初步纯化样品；取广东紫珠粗多糖初步纯化样品，用去离子水充分溶解，加入大孔树脂脱色和除蛋白质，溶液过滤后浓缩，加入无水乙醇沉淀，静置，离心除去上清；以无水乙醇洗涤，真空干燥；
(3)取步骤(2)所得样品，充分溶解于去离子水，上已平衡好的离子交换柱，平衡液为去离子水，先以去离子水洗脱，再以0～2mol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；
(4)离子交换柱分离所得广东紫珠多糖水洗组分上分子筛柱层析，以去离子水洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；冷冻干燥，得到广东紫珠均一多糖CKP-1。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1在制备治疗凝血障碍药物中的用途。
所述的广东紫珠均一多糖CKP-1在制备促凝血剂中的用途。
有益效果：本发明采用超声波辅助提取法和多种柱层析分离、纯化方法，从广东紫珠药材中获得了纯度较高的均一多糖CKP-1，采用色谱学，光谱学，波谱学等技术和方法，全面解析了CKP-1的结构特征，在此基础上，进一步探讨了CKP-1的凝血活性，揭示了CKP-1是广东紫珠药材发挥止血作用的有效成分之一，因此可以将广东紫珠均一多糖CKP-1应用于制备促凝血的药物，拥有广阔的应用前景，具有良好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为本发明中广东紫珠多糖粗品(CKP)提取条件单因素分析；
图2为本发明中广东紫珠多糖粗品(CKP)提取条件响应面分析；
图3为本发明中广东紫珠均一多糖(CKP-1)高效分子排阻色谱；
图4为本发明中广东紫珠均一多糖(CKP-1)的单糖组成图谱；
图5为本发明中广东紫珠均一多糖(CKP-1)的紫外-可见扫描光谱；
图6为本发明中广东紫珠均一多糖(CKP-1)的红外光谱；
图7为本发明中广东紫珠均一多糖(CKP-1)的核磁共振谱图。
具体实施方式
实施例1：广东紫珠多糖粗品(CKP)的制备方法
称取粉碎后过80目筛的广东紫珠全草药材10g于提取容器中，加入5倍体积乙醇，回流脱脂3小时，6层纱布除去上清后将样品烘干。将烘干后样品至于反应容器中，加入去离子水200～700ml，辅以超声波法提取。所述超声波法提取具体为：按料液比20～70mL/g加入去离子水，提取时间为20～70min，提取温度为20～70℃，超声功率为125～250W；提取结束后过滤得提取液，将提取液浓缩，加入4倍乙醇沉淀，4℃放置24小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤3次，真空干燥得到广东紫珠多糖粗品(CKP)。
本发明的工艺参数由单因素实验(表1、图1)及响应面实验(表2、图2、图3)确定，结果见表2、表3。根据上述结果分析得出，影响广东紫珠多糖粗品(CKP)提取产率的因素，主次顺序为料液比＞超声功率＞提取时间＞提取温度。即料液比为65mL/g，超声功率为250W，提取温度为70℃，提取时间为55min时，广东紫珠粗多糖粗品(CKP)产率最高。响应面预测产率为9.06％，验证试验中广东紫珠粗多糖粗品(CKP)产率为8.98±0.21％。
表1响应面实验因素水平
表2广东紫珠多糖粗品(CKP)的响应面优化产率分析
表3响应面法实验因素及结果分析
a表明差异具有显著性(P＜0.01)
b表明差异具有显著性(P＜0.05).
c表明差异不具有显著性
实施例2：广东紫珠均一多糖(CKP-1)的制备方法
向广东紫珠多糖粗品(CKP)溶液(约10mg/mL)中加入无水石油醚搅拌震荡使之成乳状，静置使溶液上下分层为止，去除石油醚层；重复以上操作3-4次，直到石油醚层无油状小液滴出现，表明脱脂完成。加入Sevage试剂于脱脂后的多糖溶液，充分溶解放置于摇床内振荡后离心，去除变性蛋白层，取上清液；将上清液重复上述步骤重复处理3-5次，直到没有白色的胶状物质产生，即无变性的蛋白质产生，得到脱蛋白的多糖溶液；加入4倍乙醇沉淀，4℃放置24小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤3次，真空干燥得本发明产物广东紫珠粗多糖初步纯化样品。取广东紫珠粗多糖初步纯化样品2g于容器中，充分溶解于40ml去离子水，加入D101大孔树脂脱色和除蛋白质，间或搅拌1小时，溶液过滤后浓缩至10ml，加入10ml无水乙醇沉淀，4℃放置24小时。离心除去上清。以无水乙醇洗涤3次，真空干燥。取上述真空干燥后的样品200mg，充分溶解于去离子水，上已平衡好的DEAE-52离子交换柱，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，上样体积为10ml，先以300ml去离子水洗脱，再以0～2mol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得广东紫珠多糖水洗组分上Sephadex G-200分子筛柱层析，以去离子水洗脱。柱规格为(1.0×100cm)，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。冷冻干燥，得到均一广东紫珠均一多糖(CKP-1)。
实施例3：广东紫珠均一多糖(CKP-1)的理化性质测定
1.多糖含量测定
精确称取干燥至恒重待测样品适量，配制成0.1mg/mL多糖溶液，采用硫酸苯酚法和间羟联苯法，在490nm和525nm处，分光光度法测定总糖和酸性糖含量，以葡萄糖计算广东紫珠多糖粗品(CKP)总糖含量为52.82±3.78％，酸性糖含量为10.66±1.29％，广东紫珠均一多糖(CKP-1)总糖含量为89.93±3.87％，酸性糖含量为12.63±2.45％。
2.蛋白含量测定
精密称取干燥至恒重待测样品10mg，配制成1mg/mL多糖溶液后进行测定，采用考马斯亮蓝法，在595nm处，分光光度法测定总蛋白含量，以牛血清白蛋白计算广东紫珠多糖粗品(CKP)总蛋白含量为5.23±0.95％，广东紫珠均一多糖(CKP-1)未检测到蛋白。
3.pH测定
参照中国药典2015版附录VII G pH测定法操作规程进行操作，广东紫珠均一多糖(CKP-1)pH为6.4±0.1。
4.元素分析
取广东紫珠均一多糖(CKP-1)适量，于有机元素分析仪上进行C、H、N元素分析，其元素组成比为29.70％/4.19％/1.05％/65.06％(C/H/N/O)。
5.旋光度分析
将待测样品干燥至恒重后，配制成1mg/mL溶液，用旋光仪测定旋光度，由公式[α]Dt＝100α/L c计算比旋度。其中c：溶液浓度(g/100mL)；α：旋光度；L：玻管长度(dm)。广东紫珠均一多糖(CKP-1)比旋光度为+16.3°。
6.纯度及相对分子质量分析
高效液相色谱法：以Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器。色谱条件为：H2O为流动相，流速1ml/min，样品浓度为1mg/ml每次进样35μl，检测时间30min。依次以标准分子量多糖DextranT-5、T-10、T-20、T40、T70绘制保留时间与各分子量对数关系标准曲线，再测样品的保留时间，根据GPC曲线求得样品的分子量。结果见图3，CKP-1的分子量为42.02KDa且为对称的均一峰。
7.单糖组成分析
称取5mg CKP-1于安瓿瓶中，加入1mL 2M三氟乙酸溶解，用酒精喷灯封口，于100℃沸水浴中水解8h。水解产物转移至蒸发皿中，在80℃条件下蒸干，用1mL甲醇洗涤3次，去除多余TFA，冷却后加入1mL双蒸水溶解水解样品。将上述水解液8000rpm离心5min后取100μL加入100μL 0.6M氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入200μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，混匀后置于70℃烘箱中反应100min。反应结束后取出，冷却至室温，再加入200μL 0.3M盐酸中和氢氧化钠，并用双蒸水补足至1mL。用1mL氯仿萃取去除过量的PMP，涡旋后静置15min，吸取上清再加入1mL氯仿，如此重复3次。最后吸取200μL水相，8000rpm离心5min，上清则作为样品溶液。结果如图4所示，CKP-1由甘露糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，摩尔比为1:19.14:1.02:3.28:24.16:4.68:1.62。
9.紫外光谱分析
取适量CKP-1，配制成浓度为1mg/mL的溶液，在200-700nm范围内扫描。如图5所示，CKP-1在260nm、280nm处无吸收，说明其不含蛋白质和核酸。
10.红外光谱分析
称取5mg CKP-1，溴化钾压片后置于红外光谱仪上在400-4000cm-1区间扫描。如图6所示，3406.7cm-1附近的强宽峰，2932.2cm-1附近的弱峰为多糖中OH伸缩振动，CH伸缩振动和CH变形振动的特征峰。1624.1cm-1处的特征吸收则来自于C＝O的强对称吸收和羰基中C-H的变形振动。1100.8cm-1附近的吸收峰与C-O-C的伸缩振动相关。此外，862.6cm-1和957.6cm-1处的特征峰证明CKP-1中存在着α-D-吡喃糖苷和β-D-吡喃糖苷。
11.核磁波谱分析
精密称取适量CKP-1溶于D2O中，检测温度为30℃，使用Varian-500核磁波谱仪进行分析。结果如图7所示，CKP-1主要由T-α-Ara(f)，→4-β-Gal(p)-(1→，→2,4-α-Rha(p)-(1→，→4-α-GalA(p)-(1→和→4,6-α-Glc(p)-(1→组成，具体谱图对应解析如表4所示。
表4广东紫珠多糖的核磁共振氢谱和碳谱的化学位移归属
实施例4：体外促凝血活性研究
活化部分凝血活酶(APTT)通过影响内源性系统来延长凝血时间，其基本原理是在体外模仿人体内环境，待测血浆与活化部分凝血活酶通过涡旋混匀器混合均匀，通过滴加氯化钙，激活内源性凝血系统，血液凝固所需时间即为APTT值。凝血酶时间(TT)用来检测血浆的凝血酶时间，适量的凝血酶将血浆样品中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，血液凝固所需时间即为凝血酶时间(TT)。凝血酶原时间(PT)用于血液外源性凝血途径的检测。PT的原理是血液一旦接触到含钙离子物质，即刻激发凝血效应，凝血酶原转化为凝血酶，继而引发连锁反应，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，血液便会凝固。取新鲜健康人体血液，在低速下下离心10min，取上清液为富血小板血浆(PRP)，将PRP在高速下离心10min，上清液为贫血小板血浆(PPP)。取不同浓度的广东紫珠精品多糖(CKP-1)50μL与贫血小板血浆200μL，通过涡旋混匀器混合均匀，取混合后的样品25μL，加入同体积的APTT试剂、PT试剂或TT试剂，混匀，在血凝仪上37℃孵育3分钟，滴加25μL同温度下预热的氯化钙溶液，记录血液凝固时间即为广东紫珠粗糖和广东紫珠精品多糖的APTT值。以生理盐水和维生素K1分别作为阴性对照和阳性对照，按上述方法同样操作，每个多糖组分样品测量6次。结果如表5所示，与空白组相比，阳性药物维生素K1、CKP-1均可以显著缩短APTT，PT和TT。4mg/mL的CKP-1对APTT，PT和TT的缩短作用最强，分别能达到19.05±0.61s，13.60±0.45s，10.08±0.68s。综合上述数据分析可以得出，广东紫珠均一多糖CKP-1在体外具有一定促凝血作用，可开发为促凝血药物，并进一步应用于凝血相关疾病的治疗。
表5CKP与CKP-1的体外凝血试验结果
注：与空白组比较，*表明P<0.05；**表明P<0.01

Claims (10)

1.一种广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为1:19.14:1.02:3.28:24.16:4.68:1.62；相对分子质量为42.02KDa；糖苷键型包括T-α-阿拉伯糖、→4-β-半乳糖-(1→、→2,4-α-鼠李糖-(1→、→4-α-半乳糖醛酸-(1→和→4,6-α-葡萄糖-(1→；比旋光度为+16.3о。
2.根据权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：85％≤多糖含量≤95％，10％≤酸性糖含量≤17％。
3.根据权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：元素组成比C/H/N/O为29.70％/4.19％/1.05％/65.06％。
4.根据权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：包含有α-D-吡喃糖苷和β-D-吡喃糖苷。
5.根据权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：参照中国药典2015版附录VII G pH测定法操作规程进行操作，广东紫珠均一多糖CKP-1 pH为6.4±0.1。
6.根据权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1，其特征在于：该多糖通过以下方法制备：
将广东紫珠粉碎后，加入有机试剂脱脂，超声水提取，过滤并将提取液浓缩，醇沉并洗涤沉淀，干燥得广东紫珠多糖粗品；多糖粗品加水配制成溶液，经脱脂，脱蛋白，醇沉并洗涤沉淀，干燥得到广东紫珠粗多糖初步纯化样品后，再采用大孔树脂、离子交换柱、分子筛柱纯化后冷冻干燥得广东紫珠均一多糖CKP-1。
7.一种如权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1的提取方法，其特征在于：将广东紫珠粉碎后，加入有机试剂脱脂，超声水提取，过滤并将提取液浓缩，醇沉并洗涤沉淀，干燥得广东紫珠多糖粗品；多糖粗品加水配制成溶液，经脱脂，脱蛋白，醇沉并洗涤沉淀，干燥得到广东紫珠粗多糖初步纯化样品后，再采用大孔树脂、离子交换柱、分子筛柱纯化后冷冻干燥得广东紫珠均一多糖CKP-1。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：具体由下列步骤组成：
(1)称取粉碎后过筛的广东紫珠全草药材于提取容器中，加入4-5倍体积乙醇，回流脱脂3-4小时，纱布除去上清后将样品烘干；将烘干后样品至于反应容器中，按料液比20～70mL/g加入去离子水，辅以超声波法提取，提取时间为20～70min，提取温度为20～70℃，超声功率为125～250W，提取结束后过滤得提取液，将提取液浓缩，加入乙醇沉淀，静置24-28小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得到广东紫珠多糖粗品。
(2)广东紫珠多糖粗品加去离子水配制成广东紫珠多糖粗品溶液，用无水石油醚脱脂；接着用Sevage试剂脱蛋白；加入乙醇沉淀，静置24-28小时，离心除去上清液，以无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得广东紫珠粗多糖初步纯化样品；取广东紫珠粗多糖初步纯化样品，用去离子水充分溶解，加入大孔树脂脱色和除蛋白质，溶液过滤后浓缩，加入无水乙醇沉淀，静置，离心除去上清；以无水乙醇洗涤，真空干燥；
(3)取步骤(2)所得样品，充分溶解于去离子水，上已平衡好的离子交换柱，平衡液为去离子水，先以去离子水洗脱，再以0-2mol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；
(4)离子交换柱分离所得广东紫珠多糖水洗组分上分子筛柱层析，以去离子水洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；冷冻干燥，得到广东紫珠均一多糖CKP-1。
9.如权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1在制备治疗凝血障碍药物中的用途。
10.如权利要求1所述的广东紫珠均一多糖CKP-1在制备促凝血剂中的用途。
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