CN103344592B

CN103344592B - 一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法

Info

Publication number: CN103344592B
Application number: CN201310302492.5A
Authority: CN
Inventors: 董永胜
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: CN103344592A

Abstract

本发明涉及一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，步骤如下：（1）根据甲基橙标准溶液与不同浓度的GHK标准溶液进行反应，经分光光度计检测吸光度值，绘制甲基橙溶液标准曲线；（2）取待测GHK样品配制待测GHK样品溶液，然后与甲基橙标准溶液反应，经分光光度计检测吸光度值后，计算甘氨酰组氨酰赖氨酸含量。本发明与传统检测方法相比，具有测定试剂易购，检测仪器价格相对于液相色谱仪价格低；且具有操作简便、测定快速、分析成本低、灵敏度高的特点。

Description

一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸（Glycyl-L-Histidyl-L-Lysine，GHK）是1973年Pickart等人首先从人血浆中分离得到的一种三肽，其分子式为C₁₄H₂₄N₆O₄、分子量为340.38，GHK的结构式如下：

甘氨酰组氨酰赖氨酸能增加正常肝细胞的存活率及促进肝癌细胞的生长，并刺激这些细胞的DNA和RNA的合成，因此被称为肝细胞生长因子。GHK以及GHK与二价铜离子形成的络合物（GHK-Cu）还可促使神经细胞、免疫相关细胞和肾小球细胞的生长、分裂和分化。GHK-Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成。GHK和GHK-Cu具有的多种生物活性使它们在包括皮肤移植、烧伤等治疗上有着广泛的应用前景，GHK含量的高低在其发挥生理功能时具有重要的作用。

甘氨酰组氨酰赖氨酸是含有两个肽键的寡肽，其含量的测定可依据多肽及蛋白质含量的测定方法，如双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法等。但双缩脲法灵敏度差，Folin-酚试剂法受到酚类物质、柠檬酸及硫酸铵的干扰，紫外吸收法受到多种有机物（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等）的干扰。上述方法都是将多肽分子作为一个单元参与反应，对于不同结构的多肽，其测定结果会有较大的差别。

甘氨酰组氨酰赖氨酸的纯度检测有采用高效液相色谱法（HPLC）的报道，如彭小三（南京大学硕士论文，2003）在进行甘氨酰组氨酰赖氨酸的液相合成及其酶促降解研究时，用液相合成法合成了GHK，并用HPLC检验其纯度，得到1个单峰，证明合成物中只含有GHK，但没有测定其含量。HPLC法虽然具有速度快、分辨率高、灵敏度高等优点，但也具有分析成本高、容量小、流动相消耗大、仪器设备价格昂贵及日常维护费用高等缺点。在实际工作中，大批量GHK样品的含量测定会受时间、经费或仪器设备条件的限制，因而需要采用操作简便、测定快速、成本低、灵敏度高的GHK含量测定方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种操作简便、测定快速、成本低、灵敏度高的甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法。

经研究发现，常用的酸碱指示剂甲基橙可与GHK反应形成一种复合物，该复合物的形成会使溶液的颜色发生变化，因而推断可以通过测定甲基橙的含量来确定GHK的含量。甲基橙又名对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，是一种阴离子染料，其分子式为C₁₄H₁₄N₃SO₃Na，其结构式如下：

甲基橙水溶液的变色范围为：pH小于3.1时，甲基橙呈红色；pH为3.1～4.4时，则呈橙色；pH大于4.4时，甲基橙呈黄色。据测定甲基橙的最大吸收峰对应波长为465nm。

本发明的技术方案如下：

一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，步骤如下：

（1）取甲基橙标准溶液，分别与不同浓度的GHK标准溶液进行反应，反应后的标准反应液经分光光度计检测吸光度值，以吸光度值为纵坐标、标准反应液中剩余的甲基橙浓度值为横坐标，制作甲基橙溶液标准曲线；

（2）取待测GHK样品称重后，获得待测GHK样品质量，将待测GHK样品配制待测GHK样品溶液，然后将待测GHK样品溶液与甲基橙标准溶液进行反应，反应后的待测反应液经分光光度计检测吸光度值，根据步骤（1）制得的甲基橙溶液标准曲线，获得反应后剩余的甲基橙摩尔浓度，然后根据如下公式计算GHK的摩尔浓度：

反应消耗的甲基橙摩尔浓度（mmol/L）=反应前甲基橙标准溶液的摩尔浓度（mmol/L）－反应后剩余的甲基橙摩尔浓度（mmol/L）

GHK摩尔浓度（mmol/L）=反应消耗的甲基橙摩尔浓度（mmol/L）÷2

再根据如下公式计算GHK质量：

GHK质量（mg）=340.38×GHK摩尔浓度值

最后，根据如下公式计算甘氨酰组氨酰赖氨酸含量：

甘氨酰组氨酰赖氨酸含量（%）=（GHK质量÷待测GHK样品质量）×100%。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的具体操作步骤如下：

取同一浓度的甲基橙标准溶液8份，每份各1.0～5.0mL，分别加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液1.0～5.0mL，再分别加入不同浓度的GHK标准溶液各1.0～5.0mL，充分混合，加热到30℃，恒温反应30min；离心，取上清液，在465nm波长处测定每个标准反应液的吸光度值，以吸光度值为纵坐标、标准反应液中剩余的甲基橙浓度值为横坐标，制作甲基橙溶液标准曲线。

根据本发明进一步优选的，所述的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的配制方法如下：

称取磷酸二氢钠溶于去离子水中，摇均，制得浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液；称取一水柠檬酸溶于去离子水中，摇均，制得浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液；将磷酸二氢钠溶液加入到柠檬酸溶液中，柠檬酸溶液与磷酸二氢钠溶液的体积比为1：（1.0～1.8），混合均匀，制得pH5.0～6.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液。

根据本发明进一步优选的，所述的甲基橙标准溶液的配制方法如下：

称取甲基橙标准品溶于去离子水中，摇匀，制得0.08～0.12mmol/L的甲基橙标准溶液。

根据本发明进一步优选的，所述的GHK标准溶液的配制方法如下：

称取甘氨酰组氨酰赖氨酸标准品溶于去离子水中，制得浓度为0.01～0.05mmol/L的GHK标准溶液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中待测反应液的吸光度值的获得，具体步骤如下：

i、取待测GHK样品称重后，获得待测GHK样品质量，将待测GHK样品溶于去离子水中，制得浓度为0.01～0.02mmol/L的待测GHK样品溶液；

ii、取甲基橙标准溶液1.0～5.0mL，加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液1.0～5.0mL，制得甲基橙标准反应液；

iii、取步骤i的待测GHK样品溶液1.0～5.0mL加入到步骤ii配制的甲基橙标准反应液中，充分混合，加热到30℃，恒温反应30min；离心，取上清液，在465nm波长处测定待测反应液的吸光度值。

根据本发明优选的，上述步骤（1）和步骤（2）中的离心条件为3500～4500r/min、离心10～20min。

本发明的基本原理：

在酸性条件下，甘氨酰组氨酰赖氨酸呈阳性、甲基橙呈阴性，在一定条件下，GHK与甲基橙混合时，两者发生反应形成复合物。当甲基橙过量时，反应液中的颜色会发生变化，用分光光度计在465nm波长处测定反应液的吸光度值A₄₆₅就可以确定反应液中剩余甲基橙的含量，再由甲基橙的含量换算出GHK的含量，GHK含量的测定是以反应液中甲基橙含量的减少值来换算的。

GHK与甲基橙的反应式：

2C₁₄H₁₄N₃SO₃Na+C₁₄H₂₄N₆O₄→C₁₄H₁₃N₃SO₃-C₁₄H₂₄N₆O₄-C₁₄H₁₃N₃SO₃

由上述反应式，1mol的GHK可与2mol的甲基橙发生反应生成1mol的复合物。

有益效果

本发明采用甲基橙与甘氨酰组氨酰赖氨酸进行反应，通过反应后测定甲基橙在465nm波长处的吸光度值来检测甘氨酰组氨酰赖氨酸的含量，与传统检测方法相比，具有测定试剂易购，检测仪器价格相对于液相色谱仪价格低；且具有操作简便、测定快速、分析成本低、灵敏度高的特点。

附图说明

图1是实施例1制得的甲基橙溶液标准曲线；

其中：纵坐标为465nm波长处测定的吸光度值，横坐标为甲基橙浓度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

试剂来源：甲基橙标准品购自天津市凯通化学试剂有限公司；甘氨酰组氨酰赖氨酸标准品购自上海抚生生物技术有限公司；GHK样品购自吉尔生化（上海）有限公司，标注纯度为98%。

设备来源：分光光度计为购自上海光学仪器一厂的752型紫外光栅分光光度计。

实施例1

一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）测定试剂的制备

a、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的配制

称取28.40g磷酸二氢钠溶于1000mL去离子水中，摇均，制得0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液；称取21.01g一水柠檬酸溶于1000mL去离子水中，摇均，制得0.1mol/L的柠檬酸溶液。取磷酸二氢钠溶液10.3mL和柠檬酸溶液9.7mL，混合均匀，制得pH5.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液。

b、甲基橙标准溶液的配制

准确称取32.733mg的甲基橙标准品溶于1000mL去离子水中，摇匀，制得浓度为0.1mmol/L甲基橙标准溶液。

c、GHK标准溶液的配制

准确称取34.04mg、51.06mg、68.08mg、85.10mg、102.12mg、119.14mg、136.16mg、153.18mg的甘氨酰组氨酰赖氨酸标准品分别溶于1000mL去离子水中，摇均，制得GHK溶液，将上述GHK溶液分别稀释10倍，制得0.01mmol/L、0.015mmol/L、0.02mmol/L、0.025mmol/L、0.03mmol/L、0.035mmol/L、0.04mmol/L、0.045mmol/L的GHK标准溶液。

d、待测GHK样品溶液的配制

称取待测GHK样品34.04mg溶于1000mL去离子水中，制得待测GHK样品溶液，再将该溶液稀释10倍，制得浓度为0.01mmol/L的待测GHK样品溶液。

（2）测定操作过程

a、甲基橙溶液标准曲线的制作

取甲基橙标准溶液8份，每份各2.0mL，分别加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液2.0mL，再分别加入不同浓度的GHK标准溶液2.0mL，充分混合，加热到30℃，剧烈震荡，恒温反应30min；4000r/min、离心15min，分别取上清液1.0mL，摇匀。反应完全结束后，通过化学反应方程式可以得到标准反应液中剩余的甲基橙摩尔浓度值。用分光光度计在465nm波长处测定每个标准反应液的吸光度值，以吸光度值（A）为纵坐标、标准反应液中剩余的甲基橙摩尔浓度值（C）为横坐标，制作甲基橙溶液标准曲线，结果见图1。

甲基橙摩尔浓度标准曲线的回归方程为：A=8.978C-0.021（R²=0.999），其中：A为吸光度值，C为甲基橙摩尔浓度（mmol/L），R²为相关系数。吸光度值A的变化与甲基橙摩尔浓度成线性关系，其拟合度达0.999。

b、待测GHK样品的质量测定

取甲基橙标准溶液2.0mL，加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液2.0mL，再加入待测GHK样品溶液2.0mL，按步骤（2）中的步骤a方法操作，测得反应液在465nm波长处的吸光度值为0.755，根据标准曲线得出甲基橙的摩尔浓度为0.0804mmol/L，通过计算得到GHK摩尔浓度为0.0098mmol/L。

GHK质量（mg）=340.38×GHK摩尔浓度值=340.38×0.0098=3.335mg。

（3）GHK含量计算

甘氨酰组氨酰赖氨酸含量（%）=（GHK质量÷待测GHK样品质量）×100%=（3.335÷3.404）×100%=97.97%。

由此可见，用分光光度法测定GHK的实验结果与样品标注的纯度基本相同。

实施例2

如实施例1所述的甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，不同之处在于：

步骤（1）的d步骤中，取GHK标准品50.0mg、90.0mg、130.0mg分别加入到1000mL的去离子水中，摇匀，制得GHK样品溶液I、GHK样品溶液II、GHK样品溶液III。

经计算GHK的质量，结果见表1。

表1GHK质量测定结果

由此可见，本发明所采用的方法能够较准确地测定样品中GHK的含量，可以用于GHK含量的测定。

对比例

如实施例1所述的甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，按实施例2的GHK标准品溶液的配制，采用高效液相色谱法（HPLC）测定GHK样品溶液I、GHK样品溶液II、GHK样品溶液III中的GHK质量，结果见表2。

表2分光光度法与高效液相色谱法测定GHK质量的结果

本发明所采用的分光光度法测定GHK的含量与高效液相色谱法的测定结果几乎相当，但其测定成本以及仪器价格比液相色谱仪低许多，因此，分光光度法是一种操作简便、测定快速、成本低、灵敏度高的GHK含量测定方法。

Claims

1.一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，步骤如下：

（2）取待测GHK样品称重后，获得待测GHK样品质量，将待测GHK样品配制成待测GHK样品溶液，然后将待测GHK样品溶液与甲基橙标准溶液进行反应，反应后的待测反应液经分光光度计检测吸光度值，根据步骤（1）制得的甲基橙溶液标准曲线，获得反应后剩余的甲基橙摩尔浓度，然后根据如下公式计算GHK的摩尔浓度：

反应消耗的甲基橙摩尔浓度=反应前甲基橙标准溶液的摩尔浓度－反应后剩余的甲基橙摩尔浓度

GHK摩尔浓度=反应消耗的甲基橙摩尔浓度÷2

再计算GHK质量，最后，根据如下公式计算甘氨酰组氨酰赖氨酸含量：

甘氨酰组氨酰赖氨酸含量=（GHK质量÷待测GHK样品质量）×100%。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中的具体操作步骤如下：

取同一浓度的甲基橙标准溶液8份，每份各1.0~5.0mL，分别加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液1.0~5.0mL，再分别加入不同浓度的GHK标准溶液各1.0~5.0mL，充分混合，加热到30℃，恒温反应30min；离心，取上清液，在465nm波长处测定每个标准反应液的吸光度值，以吸光度值为纵坐标、标准反应液中剩余的甲基橙浓度值为横坐标，制作甲基橙溶液标准曲线。

3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的配制方法如下：

称取磷酸二氢钠溶于去离子水中，摇均，制得浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液；称取一水柠檬酸溶于去离子水中，摇匀，制得浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液；将磷酸二氢钠溶液加入到柠檬酸溶液中，柠檬酸溶液与磷酸二氢钠溶液的体积比为1：（1.0~1.8），混合均匀，制得pH 5.0~6.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液。

4.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的甲基橙标准溶液的配制方法如下：

称取甲基橙标准品溶于去离子水中，摇匀，制得0.08~0.12mmol/L的甲基橙标准溶液。

5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中的GHK标准溶液的配制方法如下：

称取甘氨酰组氨酰赖氨酸标准品溶于去离子水中，制得浓度为0.01~0.05mmol/L的GHK标准溶液。

6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（2）中待测反应液的吸光度值的获得，具体步骤如下：

i、取待测GHK样品称重后，获得待测GHK样品质量，将待测GHK样品溶于去离子水中，制得待测GHK样品溶液；

ii、取甲基橙标准溶液1.0~5.0mL，加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液1.0~5.0mL，制得甲基橙标准反应液；

iii、取步骤i的待测GHK样品溶液1.0~5.0mL加入到步骤ii配制的甲基橙标准反应液中，充分混合，加热到30℃，恒温反应30min；离心，取上清液，在465nm波长处测定待测反应液的吸光度值。

7.如权利要求2或6所述的测定方法，其特征在于，离心条件为3500~4500r/min、离心时间为10~20min。