CN106153806B - 三磷酸腺苷的纯度检测方法 - Google Patents

三磷酸腺苷的纯度检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三磷酸腺苷的纯度检测方法。该检测方法包括下述步骤：对ATP标准物质中的水分进行定量检测得到水分含量，对ATP标准物质中的无机杂质进行定量检测得到无机杂质含量，用高效液相色谱检测ATP，并用面积归一化法计算ATP含量，然后通过下述公式计算出ATP标准物质中三磷酸腺苷的纯度：三磷酸腺苷的纯度＝(100％‑水分含量‑无机杂质含量)×ATP含量。本发明的检测方法更为精确可靠，能够精确、稳定地测定ATP标准物质的纯度，应用于细菌快速检测领域，保证相关仪器的校准、检测方法验证和检测结果的质量控制，助推方法标准化工作。

Description

三磷酸腺苷的纯度检测方法
技术领域
本发明涉及物质检测领域，尤其涉及三磷酸腺苷的纯度检测方法。
背景技术
对生物污染的检测是保证食品安全和医疗安全的重要环节。致病性微生物引起的食源性疾病是食品安全的最大隐患，据估计全球每年有数十亿人感染食源性疾病。在医院，医疗器械被人体血液、体液污染重复使用，其生物污染的检测对控制医源性感染至关重要。
传统生物检测方法(直接显微镜计数、平板计数、细胞标记等)适用于普通实验室检测，但检测耗时、操作繁琐，不适宜大量样本的及时观察，国际上现在多使用ATP(三磷酸腺苷)生物发光法对生物细胞总数进行定量分析。
ATP存在于所有活体细胞当中，参与新陈代谢以及各种生化反应，在细胞生命过程中扮演着不可替代角色，生物体的运动、营养和代谢物质的运转生物信号的传递以及生物合成都需要ATP参加，所以活体细胞在一定生理时期内均有较恒定的ATP含量，而在死亡的细胞中不含有ATP，所以ATP含量可以清晰地表明样品中微生物与其他生物残余的多少。
与传统检测方法相比，ATP生物发光检测法具有以下优势：1)检测速度快。传统方法需要2-3天的时间，而ATP生物发光检测法仅需几秒就能得到结果，大大节省了时间成本。2)灵敏度高。比传统方法灵敏度高100倍以上，样品量只要传统方法的百分之一。3)结果准确。台式生物发光检测仪得出的ATP生物发光检测结果准确可靠、值得信赖，可以用于定量检测。4)ATP生物发光检测法可以识别任何活体细胞，在清洁消毒领域的应用不可替代。基于上述优点，ATP生物发光检测法广泛应用于食品安全细菌检测、医疗器械卫生评价、生态环境科学检测及生物医药研究等领域。
近年来，市场上已经出现了多种多样的ATP检测仪和检测试剂盒。
ATP检测仪广泛应用于食品卫生安全领域。铁道行业标准《TB-T 3121-2005铁路食(饮)具洁净度ATP生物发光检测法和分级判定》中明确规定使用ATP生物发光检测法和便携式ATP检测仪来检测铁路食(饮)具洁净度。《卫生监督机构建设指导意见》要求省、市、县三级卫生监督机构配备ATP发光检测仪作为“食品卫生安全现场快速检测设备”和“传染病、各类医疗卫生机构卫生监督现场检测设备”。
ATP检测试剂盒是配合检测仪使用的，市场上已有进口和国产的多个品牌的ATP检测试剂盒，但是由于缺乏有证标准物质的监管，这些试剂盒中ATP标样的量值不统一，影响了检测结果的质量控制。据报道，美国每年有1500万例次由于内镜清洁度问题而引起的医院感染，其中相当一部分是由于检测结果不准确引起的。
近年来，ATP发光检测技术和相关仪器的迅速发展，得到活细胞分析相关各个领域广泛的推广使用，以及国际国内相关领域的普遍应用，但是目前该方法的溯源性差、不同仪器和不同试剂盒的检测结果之间缺乏一致性。而溯源性差的主要原因在于目前国内外尚无ATP标准物质、ATP标准物质的浓度检测不精确，难以进行试剂盒和仪器的质量控制。ATP标准物质的精确检测，能够对统一ATP检测试剂盒的量值提供技术依据，保证相关仪器的校准、检测方法验证和检测结果的质量控制，助推ATP检测方法标准化工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的ATP检测方法不准确、难以进行ATP检测试剂盒和仪器的质量控制的缺陷，提供了一种三磷酸腺苷的纯度检测方法。本发明的检测方法更为精确可靠，能够精确、稳定地测定ATP标准物质的纯度，应用于细菌快速检测领域，保证相关仪器的校准、检测方法验证和检测结果的质量控制，助推方法标准化工作。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种三磷酸腺苷的纯度检测方法，其包括下述步骤：对ATP标准物质中的水分进行定量检测得到水分含量，对ATP标准物质中的无机杂质进行定量检测得到无机杂质含量，用高效液相色谱检测ATP，并用面积归一化法计算ATP含量，然后通过下述公式计算出ATP标准物质中三磷酸腺苷的纯度：
三磷酸腺苷的纯度＝(100％-水分含量-无机杂质含量)×ATP含量。
本发明中，所述的ATP标准物质可为本领域中ATP检测试剂盒和仪器中常用的三磷酸腺苷标准物质，较佳地是由市售ATP原料经纯化步骤得到，具体纯化步骤包括：使用中压制备色谱分离收集ATP成分；钠平衡和脱盐；样品干燥。
本发明中，所述ATP原料可为本领域常规市售原料，较佳地为购于湖北武汉巨顺宏生物化工股份有限公司生产的三磷酸腺苷二钠粗品。
所述的纯化步骤较佳地包括如下：
(1)中压制备色谱条件：使用自制中压制备色谱柱(YMC C18，10μ，30*250mm)，柱温为3～8℃(优选为5℃)，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.6g，磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000ml，摇匀)(15∶85)，流速40～50ml/min；进样为5ml 40～50mg/ml(优选为40mg/ml)的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；
(2)样品纯化
打开中压制备分离系统，调节柱温为3～8℃(优选为5℃)，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)的洗脱溶剂(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)平衡制备柱，取ATP原料(三磷酸腺苷二钠粗品，加氮气除氧后纯水适量，制成40～50mg/ml(优选为40mg/ml)的溶液即得)5ml注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存，重复进样，至所有供试溶液分离完成；
(3)Na+平衡和脱盐
用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用2000ml体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，此时色谱柱吸附样品为ATP二钠(2010年版药典二部规定，ATP二钠的pH为4.5-7.0)，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)洗涤去除缓冲盐离子，去除缓冲盐，再用甲醇洗脱ATP二钠，收集峰高1500mV以上洗脱液；
(4)样品干燥
迅速低温蒸馏去除甲醇(避光，常温，浓缩时间少于15min)，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。
本发明中，在对水分进行定量检测前，较佳地还对ATP标准物质进行定性鉴定，所述的定性鉴定采用下述步骤：使用核磁共振波谱仪对ATP标准物质中的碳谱和氢谱进行扫描，得到主成分的结构；使用有机元素分析仪对ATP标准物质中的碳、氢、氮元素含量进行测定，与理论值进行比对。
本发明中，所述的水分进行定量检测较佳地采用卡尔费休法进行检测，一般ATP标准物质中的水分含量＜1％(较佳地为0.2％～0.5％)，该水分含量不计结晶水。
本发明中，所述的无机杂质一般包括阳离子杂质和阴离子杂质，其中对阳离子杂质进行定量检测较佳地使用ICP法(电感耦合等离子体发射光谱)进行检测，检测结果各阳离子杂质含量总和小于0.01％；其中对阴离子杂质进行定量检测较佳地使用离子色谱进行检测，检测结果各阴离子杂质含量总和小于0.001％。
本发明中，所述的高效液相色谱中，较佳地在波长259nm处进行紫外检测，然后使用面积归一化法进行计算ATP含量，一般ATP含量＞99％。
其中，所述的高效液相色谱中，检测条件如下：C18反相色谱柱(250mm×4.6mm)，柱温35℃，流动相为甲醇：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.6g，磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000ml，摇匀)(5∶95，体积比)，检测波长259nm。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的检测方法更为精确可靠，能够精确、稳定地测定ATP标准物质的纯度，应用于细菌快速检测领域，保证相关仪器的校准、检测方法验证和检测结果的质量控制，助推方法标准化工作。
附图说明
图1为离子色谱法对ATP标准物质中的阴离子进行检测的谱图。
图2为ATP标准物质中的阴离子色谱图。
图3为氯离子的检测标准曲线图。
图4为ATP标准物质的高效液相色谱图。
图5为各方法检测ATP标准物质纯度的结果比对示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的实施例中ATP标准物质由下述方法制得：
(1)中压制备色谱条件：使用自制中压制备色谱柱(YMC C18，10μ，30*250mm)，柱温为5℃，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.6g，磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000ml，摇匀)(体积比为15∶85)，流速40～50ml/min；进样为5ml 40mg/ml的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；
(2)样品纯化
打开中压制备分离系统，调节柱温为5℃，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)的洗脱溶剂(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)平衡制备柱，取ATP原料(ATP二钠粗品，加氮气除氧后纯水适量，制成40mg/ml的溶液即得)5ml注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存，重复进样，至所有供试溶液分离完成；
(3)Na+平衡和脱盐
用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用2000ml体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，此时色谱柱吸附样品为ATP二钠盐(2010年版药典二部规定，ATP二钠的pH为4.5-7.0)，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液(氮气除氧，低温冷却液循环泵平衡温度至5℃)洗涤去除缓冲盐离子，去除缓冲盐，再用甲醇洗脱ATP二钠，收集峰高1500mV以上洗脱液；
(4)样品干燥
迅速低温蒸馏去除甲醇(避光，常温，浓缩时间少于15min)，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。
实施例1用核磁共振法对ATP标准物质定性
ATP(三磷酸腺苷)通常以二钠盐的形式存在，并含有3份结晶水。结构式见下式所示：
下面通过核磁共振波谱法和有机元素分析法对ATP标准物质进行定性验证。
(1)仪器与试剂
Bruker AVANCE III 500M核磁共振波谱仪。
二甲亚砜、氘代水。
(2)检测结果
将10mgATP标准物质溶解在0.3mL D2O中，采样1024次测C13谱。
将5mg ATP标准物质溶解在0.6mL二甲亚砜中，采样8次测H1谱。
根据核磁共振结果可以看出，ATP标准物质中的碳、氢原子个数和结构与ATP理论结构式吻合，且氢谱中存在水峰，说明ATP含有结晶水。
实施例2用元素分析仪定性
三磷酸腺苷二钠盐合三结晶水的分子式为：C10H14O13N5P3Na2·3H2O。为了判断ATP标准物质中除了少量降解产物外，是否含有其他有机物，我们使用2台有机元素分析仪对ATP标准物质中的C、H、N元素含量进行检测，其检测结果见表1所示：
表1 2台元素分析仪对ATP标准物质中的C、H、N含量检测结果
根据有机元素分析仪检测结果，样品中的C、H、O含量与ATP理论值非常接近，证实ATP样品的ATP存在形式为三磷酸腺苷二钠盐带3份结晶水。根据碳、氢、氮含量，未发现样品中含有其他有机杂质。
实施例3水分测定
将ATP标准物质置于干燥器中，经过24小时的真空干燥后做卡尔费休法测定。
根据《中国药典》，用卡尔费休法测定ATP标准物质中的水分含量。先用无水甲醇预滴定到终点，再精密秤取纯水3份，分别滴定至终点，算出卡尔费休试剂的平均F值(每毫升费休氏液相当于水的重量，mg)，存入滴定仪中。
取ATP标准物质样品6份，每份约0.15g，精密称定，用乙二醇-无水甲醇(60∶40，体积比)溶解，用标定过的卡尔费休试剂滴定到终点，得出样品的含水量，并算出平均值。检测结果见表2。由于三磷酸腺苷二钠盐合三结晶水中本身含有结晶水，其结晶水含量理论值为8.93％，计算ATP纯度标准物质中的水分时，将结晶水扣除，只计算吸附水。
表2 ATP标准物质中含水量检测结果
由上表可知，不计结晶水，ATP标准物质样品的含水率为0.30％。
实施例4无机离子杂质含量测定
(1)阳离子杂质
将ATP标准物质配制成10g/L的水溶液，用ICP法检测ATP标准物质中的可能存在的阳离子杂质K、Ca、Mg、Al、Fe、Cu、Hg、Cd、As、Pb、Ni、Co，检测结果各阳离子杂质总和为0.0018％，对定值结果影响不大，可以忽略不计。
(2)阴离子杂质
使用离子色谱法对ATP标准物质中的阴离子进行检测。图1是使用阴离子混标对各种阴离子的出峰时间进行定性，图2是ATP标准物质的阴离子色谱图，由图可知，ATP标准物质中含有磷酸根离子和少量的氯离子。ATP纯度标准物质中除磷酸根离子外，各阴离子含量均小于检出限。磷酸根离子是ATP降解形成的，与ATP降解产物含量相关，ATP降解产物的含量在HPLC检测部分已计入杂质，在此不重复计算。
氯离子的检测标准曲线如图3所示。将氯离子标准物质稀释成5个浓度(0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L)，每个浓度重复检测3次，制作标准曲线并计算检出限(空白的3倍标准偏差)，Cl-的检出限为0.04mg/L，纯化后的10g/L ATP标准物质中Cl-的含量低于检出限，即Cl-杂质含量低于0.0004％，可以忽略不计。
因此，检测结果表明，ATP标准物质中无机离子的含量非常小(一般小于0.1％就可以忽略)，可以忽略不计。
实施例5 HPLC检测结果
(1)仪器与试剂
液相色谱仪(安捷伦1100，DAD检测器)、C18反相色谱柱(250mm×4.6mm，Kromasil100-5C18)；
甲醇为色谱纯、水为超纯水、其他试剂均为分析纯。
(2)色谱条件
采用C18反相色谱柱，柱温35℃，流动相为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.6g，磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000ml，摇匀)(5∶95，体积比)，检测波长259nm。
(3)检测结果
用面积归一化法检测ATP在总核苷酸(包括ATP、ADP、AMP及其他可能存在的核苷酸)中的含量，其中ATP是指三磷酸腺苷，ADP是指二磷酸腺苷，AMP是指一磷酸腺苷。色谱图见图4，检测结果见表3。发明人研究发现在259nm处有紫外吸收，从液相色谱图中可以看出，样品中除ATP及其降解产物ADP、AMP外，不存在其他核苷酸。
表3 ATP在总核苷酸中的比例
实施例6ATP标准物质纯度计算
根据下述公式(1)，ATP标准物质中，三磷酸腺苷的纯度的计算结果见表4。
三磷酸腺苷纯度(％)＝(100％-水分含量-无机离子杂质含量)×HPLC检测的ATP含量。 (1)
表4 ATP标准物质中三磷酸腺苷的纯度
实施例7多种方法对ATP纯度标物中总核苷酸量的验证
7.1 ICP法对总核苷酸含量的验证
ATP标物中主成分为三磷酸腺苷二钠，其降解失去一个磷酸根后，形成二磷酸腺苷二钠，二磷酸腺苷二钠再失去一个磷酸根，形成单磷酸腺苷二钠。也就是说每1分子ATP+ADP+AMP的总和对应2分子的Na。下面通过ICP法测Na，对ATP纯度标物中总核苷酸的含量进行验证。
1)仪器与试剂
ICP(Perkin Elmer)；Na空心阴极灯；移液器(Effendorf)。
GBW(E)080631水中钠标准物质；超纯水。
2)检测方法
使用GBW(E)080631水中钠标准物质0.100g/L配制成五个浓度的钠标准溶液，分别为0.0g/L、0.025g/L、0.050g/L、0.075g/L、0.010g/L。检测波长为589.592nm。每个浓度检测2次，取平均值，作出标准曲线。配制0.5g/L的ATP溶液，在上述三个波长下重复测定6次，计算平均值和相对标准偏差。
3)检测结果
在波长为589.592nm处检测0.5g/L ATP溶液中的Na含量，重复测量6次，并将Na含量换算成ATP溶液中的总核苷酸含量。换算公式为
式中CNa为检测到的Na含量，g/L；MATP为ATP的分子量；MNa为Na的分子量；CATP为ATP溶液的浓度，g/L。
检测结果见表5。
表5 ICP法测ATP标物中总核苷酸含量
7.2电解质分析法对总核苷酸含量的验证
如前所述，每1分子ATP+ADP+AMP的总和对应2分子的Na。下面通过电解质法测Na对ATP纯度标物中总核苷酸的含量进行验证。
1)仪器与试剂
电解质分析仪(迅达)；氯化钠纯度标准物质；Tris；盐酸；水为超纯水。
2)检测方法
使用氯化钠纯度标准物质配制成五个浓度的氯化钠标准溶液，分别为80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、160mmol/L。每个浓度检测2次，取平均值，作出标准曲线。由于电解质分析仪直接以Na的浓度(mmol/L)为信号值给出，因此我们以氯化钠纯度标准物质配制的Na标准溶液的浓度为横坐标，以电解质分析仪显示的Na检测浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
秤取一定量的ATP标物，配制在0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，制得浓度为60mmol/L的ATP溶液。重复检测6次，根据标准曲线计算Na含量和总核苷酸含量。
3)检测结果
用电解质分析仪检测60mmol/LATP溶液中的Na含量，重复测量6次，并将Na含量换算成ATP溶液中的总核苷酸含量。换算公式为
式中CNa为检测到的Na含量，mmol/L；
CATP为ATP溶液的浓度，mmol/L
检测结果见表6。
表6电解质分析法测ATP标物中总核苷酸含量
7.3离子色谱法测ATP标物中磷酸根离子
1)仪器与试剂
离子色谱仪(热电)；水中磷酸根分析标准物质；水为超纯水。
2)检测方法
使用水中磷酸根分析标准物质配制成五个浓度的磷酸根标准溶液，分别为0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L。每个浓度检测2次，取平均值，作出标准曲线。
用ATP纯度标物配制浓度为5g/L的ATP溶液。重复检测6次，根据标准曲线计算磷酸根含量。
3)检测结果
ATP纯度标物中含有磷酸根离子(见图2)，磷酸根离子是ATP的降解产物(ATP→ADP+PO4 3-，ADP→AMP+PO4 3-)，因此可以通过ATP标物中磷酸根离子的量计算ATP标物中ADP和AMP的量，结合HPLC(见图4)中ATP、ADP、AMP三者的比值(列于表7)，可以推算出ATP标物中总核苷酸的量。
表7 HPLC检测核苷酸中ATP、ADP、AMP含量
根据表7，1mol ATP纯度标物对应的磷酸根离子为
0.45％+2×0.09％＝0.63％
因此通过离子色谱法测磷酸根检测测定ATP中总核苷酸含量的计算公式为：
式中为离子色谱检测得到的磷酸根离子浓度，mg/LCATP溶液为配制的ATP样品溶度，5000mg/L。
计算结果见表8
表8 ATP中阴离子含量检测结果
7.4总核苷酸含量验证结果
我们通过3种方法来验证ATP标物中的总核苷酸含量，分别是ICP法测Na、电解质分析法测Na、离子色谱法测PO4 3-。通过公式(5)将测得的总核苷酸含量换算成ATP含量。并评定了各方法的不确定度(U(k＝2))，结果见表9和图5。
CATP＝C总核苷酸×CHPLC (5)
式中，CHPLC为ATP纯度标物的HPLC检测纯度，99.46％。
表9各方法检测结果比对
从图5中可以看出，本发明所述方法结果准确，不确定度较小，仅为0.24％。
对于本发明的上述结果，采用了三种方法验证纯度：1.电解质分析法检测ATP中的Na含量，换算成ATP纯度；2.ICP法检测ATP中的Na含量，换算成ATP纯度；3.离子色谱法检测ATP中的磷酸根含量，换算成ATP纯度。本发明的方法计算出的ATP纯度都在这三种方法的检测值范围内，表明本发明的检测方法是准确可靠的。

Claims (9)

1.一种三磷酸腺苷的纯度检测方法，其特征在于，包括下述步骤：对ATP标准物质中的水分进行定量检测得到水分含量，对ATP标准物质中的无机杂质进行定量检测得到无机杂质含量，用高效液相色谱检测ATP，并用面积归一化法计算ATP含量，然后通过下述公式计算出ATP标准物质中三磷酸腺苷的纯度：
三磷酸腺苷的纯度＝(100％-水分含量-无机杂质含量)×ATP含量；
所述的ATP标准物质由ATP原料经纯化步骤得到，
所述的纯化步骤包括如下：
(1)中压制备色谱条件：中压制备色谱柱的规格为10μm，30*250mm，柱温为3～8℃，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，体积比为15:85，流速40～50ml/min；进样为40～50mg/ml的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；所述中压制备色谱柱为YMCC18柱；
(2)样品纯化
调节柱温为3～8℃，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)中的洗脱溶剂平衡制备柱，将ATP原料形成的40～50mg/ml水溶液注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存；
(3)Na+平衡和脱盐
用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液洗涤去除缓冲盐离子，再用甲醇洗脱，收集峰高1500mV以上洗脱液；
(4)样品干燥
蒸馏去除甲醇，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。
2.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的纯化步骤 包括如下：
(1)中压制备色谱条件：中压制备色谱柱的规格为10μm，30*250mm，柱温为5℃，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，体积比为15:85，流速40～50ml/min；进样为40mg/ml的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；
(2)样品纯化
调节柱温为5℃，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)的洗脱溶剂平衡制备柱，将ATP原料形成的40mg/ml水溶液注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存；
(3)Na+平衡和脱盐
用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液洗涤去除缓冲盐离子，再用甲醇洗脱，收集峰高1500mV以上洗脱液；
(4)样品干燥
蒸馏去除甲醇，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。
3.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，在对水分进行定量检测前，还对ATP标准物质进行定性鉴定，所述的定性鉴定采用下述步骤：使用核磁共振波谱仪对ATP标准物质中的碳谱和氢谱进行扫描，得到主成分的结构；使用有机元素分析仪对ATP标准物质中的碳、氢、氮元素含量进行测定，与理论值进行比对。
4.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的水分进行定量检测采用卡尔费休法进行检测，所述的ATP标准物质中的水分含量<1％，该水分含量不计结晶水。
5.权利要求4所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的ATP标准物质中的水分含量为0.2％～0.5％。
6.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的无机杂质包括阳离子杂质和阴离子杂质，其中对阳离子杂质进行定量检测使用电感耦合等离子体发射光谱进行检测；其中对阴离子杂质进行定量检测使用离子色谱进行检测。
7.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱中，在波长259nm处进行紫外检测，然后使用面积归一化法进行计算ATP含量。
8.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱中，检测条件如下：C18反相色谱柱，柱温35℃，流动相为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，检测波长259nm。
9.如权利要求8所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的C18反相色谱柱的规格为250mm×4.6mm，所述的磷酸盐为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾，所述的甲醇：磷酸盐缓冲液按体积比为5:95。
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