CN105158231B - 人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表面增强激光拉曼光谱检测技术领域，具体公开了一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法,本发明首次将表面增强激光拉曼光谱检测方法应用到人体血清中乙酰苯丙氨酸的定性、定量检测，通过提取试剂提取血清样品中乙酰苯丙氨酸，排出其他成分对检测的干扰，制成样品待测液，经激光拉曼光谱仪扫描，记录其1002cm^‑1 ± 3cm^‑1对应峰的强度，能够从标准曲线上查出样品待测液中对应的乙酰苯丙氨酸含量，进而能够计算得到血清中乙酰苯丙氨酸含量。本发明检测方法具有准确、快速、无损、低成本的特点，能够满足大批量样品快速检测的需求，易于普及，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。

Description

人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及乙酰苯丙氨酸的检测技术领域，尤其涉及一种利用表面增强激光拉曼光谱检测乙酰苯丙氨酸的方法。

背景技术

乙酰苯丙氨酸在人体内肝细胞中经过羟化酶的作用，代谢为酪氨酸，在酶的作用下进一步分解为尿黑酸，尿黑酸经过酶的作用转化为乙酰乙酸，最后经过酶的水解作用，最终代谢产物为二氧化碳和水。肝细胞发生病变后，会影响乙酰苯丙氨酸的代谢过程，因此，通过研究人体血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，有助于研究肝细胞病变过程，例如，通过研究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，可以了解肝癌细胞的生长和破坏机理等。

目前乙酰苯丙氨酸的分析技术主要有色谱、质谱、核磁共振及液质联用和气质联用技术等，它们都有各自的优势与适用范围。但这些设备昂贵、操作复杂、分析周期长，无法满足大批量样品快速检测的需求，也难以进行普及。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法,具有准确、快速、无损、低成本的特点，能够满足大批量样品快速检测的需求，易于普及，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，包括如下步骤：

S1、样品前处理：

按体积比量取血清样品0.15～0.25 份,体积为m，溶于0.45～0.75 份的提取试剂中，混匀定容，体积为V，控温0℃～-4℃，经离心机离心沉底，分层；分离得到上清液，于-18℃～-25℃条件下冷冻一段时间，再取出控温0℃～-4℃，用离心机再次离心沉底，分层；将再次分离所得上清液过0.22μm～0.45μm的有机系滤膜，所得滤液即为样品待测液；

所述提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2.5～3.5份、乙腈1.5～2.5份和N,N-二甲基甲酰胺0.5～1.5份，混合置于容器内，-18℃ ～ -25℃密闭保存，用时摇匀；

S2、表面增强激光拉曼光谱检测：

样品待测液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，再用激光拉曼光谱仪扫描，根据1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，从标准曲线上查出对应的乙酰苯丙氨酸含量为c（mg/L），将所述m、V、c按式计算，

得到X（mg/L）,即为血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量。

进一步地，所述步骤S1中，血清样品与提取试剂采用涡旋混匀，-18℃～-25℃条件下冷冻10分钟，离心机10000 转/分钟，每次离心3分钟。

进一步地，所述步骤S1中，所述有机系滤膜为尼龙滤膜。

进一步地，所述提取试剂的制备方法中，混合后液体于-18℃ ～ -25℃保存24小时。

进一步地，所述步骤S2中，表面增强试剂为金纳米溶胶，无机盐凝聚剂为氯化钠溶液。

进一步地，按体积比，0.1 份待测液中依次加入0.3 份金纳米溶胶、0.1 份氯化钠溶液。

所述步骤S2中，标准曲线的绘制方法为：

A、乙酰苯丙氨酸标准溶液配制：准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，根据血清样品中的浓度范围进行适当稀释，制成不同浓度的系列标准溶液；

B、将制得的系列标准溶液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，加入量与样品待测液的加入量相同，再分别用激光拉曼光谱仪扫描，记录1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，将标准溶液的浓度与其对应峰强度制成标准曲线。

本发明上述人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。肝细胞肝癌( HCC) 是最常见的腹内恶性肿瘤之一，占原发性肝癌( PHC) 的91.5%，在世界范围内其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第5位和第3位，同时它的5年生存率还不到7%。目前我国肝癌的发病人数占全球的55%，其死亡率排在恶性肿瘤的第2位，是严重威胁我国人民生命健康的疾病。通过研究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，对了解肝癌细胞的生长和破坏机理具有十分重要的意义，为肝癌细胞的研究提供了一条新的途径。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1）本发明提取试剂可高选择性沉淀大分子蛋白，降低杂质干扰，保留病变肝细胞代谢标志物乙酰苯丙氨酸，有效提高目标物提取率，提高检测的灵敏度。

2）本发明选用纳米增强试剂金纳米溶胶和无机盐凝聚剂氯化钠溶液，并筛选出最优添加量，大大提高了检测灵敏度。

3）本发明确定了乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱特征定性波数，首次将该技术应用到肝癌血清中乙酰苯丙氨酸的定性定量检测，具有准确、快速、无损、低成本的特点，一个样品检测时间小于15分钟，灵敏度高，检出限达到3.0 mg/L，检测成本低至2元/个样品，检测方法简单、易学，读数直观、方便，不需要医学专业人员，易于普及，能够满足大批量样品快速检测的需求，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定，对研究肝癌细胞的生长和破坏机理具有十分重要的意义。

附图说明

图1是肝癌血清中含3.0 mg/L的乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图；

图2是空白血样的激光拉曼光谱图；

图3是实施例1中健康人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图；

图4是实施例2中肝癌早期患者人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图；

图5是实施例3中肝癌晚期患者人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图；

图6是乙酰苯丙氨酸标准曲线图。

具体实施方式

为了解决现有技术人体血清中病变肝细胞代谢产物乙酰苯丙氨酸含量检测成本高、耗时长、准确度低、操作复杂，且不能够适应大批量样品快速检测需求的问题，本发明首次将表面增强激光拉曼光谱检测方法应用到人体血清中乙酰苯丙氨酸的定性、定量检测，通过采用专用提取试剂高效提取血清样品中乙酰苯丙氨酸，排出其他成分对检测的干扰，制成样品待测液，经激光拉曼光谱仪扫描，记录其1002cm^-1 ± 3cm^-1对应峰的强度，能够从标准曲线上查出样品待测液中对应的乙酰苯丙氨酸含量，进而能够计算得到血清中乙酰苯丙氨酸含量。

下面举例对本发明检测方法作进一步说明。

1、乙酰苯丙氨酸标准溶液配制

准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，稀释制成1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L系列浓度标准溶液。

2、样品待测液制备

量取血清样品0.15～0.25 mL于 10 mL离心管中，按三倍体积比加入 0.45～0.75mL专用提取试剂，涡旋混匀1.0min，于0℃ ～ -4℃离心机内离心3.0min（10000 转/分钟）；

转移上清液于2.0mL具塞试管中，置于-18℃ ～ -25℃冰箱冷冻10min，取出于0℃～ -4℃离心机内离心3.0min（10000 转/分钟）；

将所得上清液过0.22μm～0.45μm有机相尼龙滤膜，所得滤液即为待测液。

所用提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2.5～3.5mL、乙腈1.5～2.5mL和N,N-二甲基甲酰胺0.5～1.5mL，混合置于容器内，-18℃ ～ -25℃密闭保存24小时，用时摇匀。

3、设定激光拉曼光谱仪工作条件

激光功率：200mW；

积分时间：10sec；

平均次数：2；

平滑参数：1。

4、定性测定

取前制的样品待测液0.1 mL，依次加入0.3 mL纳米增强试剂（金纳米溶胶），0.1mL无机盐凝聚剂（10%氯化钠溶液），摇匀后用激光拉曼光谱仪扫描，根据其拉曼谱图中1002cm^-1 ± 3cm^-1处有无特征拉曼峰进行评估：

有特征拉曼峰则说明样品中含有乙酰苯丙氨酸；如无明显特征拉曼峰，则说明样品中乙酰苯丙氨酸含量在检测限值（3.0 mg/L）以下。

5、定量测定

取前制的乙酰苯丙氨酸系列浓度标准溶液，分别依次加入0.3 mL纳米增强试剂（金纳米溶胶），0.1 mL无机盐凝聚剂（10%氯化钠溶液），摇匀后用激光拉曼光谱仪扫描；对测定的拉曼谱图进行基线调整；再以1002cm^-1 ± 3cm^-1处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对乙酰苯丙氨酸特征拉曼峰进行归一化处理，归一化后得到对应浓度标准溶液的特征拉曼峰强度，据此绘制乙酰苯丙氨酸标准曲线，适用乙酰苯丙氨酸检测浓度范围是3.0 mg/L ～150 mg/L。标准曲线应当每日重新制定。

将样品待测液的拉曼谱图按上述方法进行基线调整和归一化处理，归一化后得到的特征拉曼峰强度可根据制得的标准曲线读取得到样品待测液中的乙酰苯丙氨酸的含量，再根据式计算，得到血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量。

X 为血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量，单位为毫克每升（mg/L）；

c 为从标准曲线得到的样品待测液中乙酰苯丙氨酸含量，单位为毫克每升（mg/L）；

V为血清样品与提取试剂混合后的定容体积，单位为毫升（mL）；

m为血清样品量取体积，即样品待测液体积，单位为毫升（mL）。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均数的15%。

下面分别就三个不同血清样品实施例，按表1中条件，制得样品待测液，并用激光拉曼光谱仪进行测量，未给出的条件、步骤按前述说明执行。

表1

其中，提取试剂的组分按体积配比均为：甲醇:乙腈:N,N-二甲基甲酰胺=3:2:1。

将得到的三个谱图根据前述制得的标准曲线读取得到样品待测液中的乙酰苯丙氨酸的含量，再根据式计算，得到血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量，采用高效液相色谱（HPLC）法进行确证，结果见表2。

表2

实施例1-3中，单个样品检测时间小于15分钟，检测成本低至2元/个样品。

以实施例3血清样品，选用不同配比的提取试剂进行提取，其余方法同实施例3，测量结果见表3。

表3

上述实施例中，实施例1血清样品来自健康人体，实施例2血清样品来自肝癌早期患者，实施例3血清样品来自肝癌晚期患者，肝细胞发生病变成为肝癌细胞后，会影响或破坏人体内乙酰苯丙氨酸的代谢过程，导致人体血清内乙酰苯丙氨酸不能被肝细胞正常代谢分解，含量增多。实施例1-3中，应用本发明检测方法测得血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量X符合上述机理说明，随人体内肝癌细胞的增多（肝癌症状加重），人体对乙酰苯丙氨酸的代谢分解降低或减少，导致人体血清中乙酰苯丙氨酸的含量增大。

本发明人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法,具有准确、快速、无损、低成本的特点，能够满足大批量样品快速检测的需求，易于普及，适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定，对研究肝癌细胞的生长和破坏机理具有十分重要的意义，具有较高的临床实用价值，市场潜力巨大。

Claims (8)

1.一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样品前处理：

按体积比量取血清样品0.15～0.25份,体积为m，溶于0.45～0.75份的提取试剂中，混匀定容，体积为V，控温0℃～-4℃，经离心机离心沉底，分层；分离得到上清液，于-18℃～-25℃条件下冷冻一段时间，再取出控温0℃～-4℃，用离心机再次离心沉底，分层；再次分离所得上清液过0.22μm～0.45μm的有机系滤膜，所得滤液即为样品待测液；

所述提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2.5～3.5份、乙腈1.5～2.5份和N,N-二甲基甲酰胺0.5～1.5份，混合置于容器内，-18℃～-25℃密闭保存，用时摇匀；

S2、表面增强激光拉曼光谱检测：

样品待测液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，再用激光拉曼光谱仪扫描，根据1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，从标准曲线上查出对应的乙酰苯丙氨酸含量为c，所述c的单位为mg/L，将所述m、V、c按式(I)计算，

<mrow> <mi>X</mi> <mo>=</mo> <mi>c</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mfrac> <mi>V</mi> <mi>m</mi> </mfrac> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mi>I</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>

得到X，所述X的单位为mg/L,即为血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于所述步骤S1中，血清样品与提取试剂采用涡旋混匀，-18℃～-25℃条件下冷冻10分钟，离心机10000转/分钟，每次离心3分钟。

3.根据权利要求1所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于所述步骤S1中，所述有机系滤膜为尼龙滤膜。

4.根据权利要求1所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于所述提取试剂的制备方法中，混合后液体于-18℃～-25℃保存24小时。

5.根据权利要求1所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于所述步骤S2中，表面增强试剂为金纳米溶胶，无机盐凝聚剂为氯化钠溶液。

6.根据权利要求5所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于，按体积比，0.1份样品待测液中依次加入0.3份金纳米溶胶、0.1份氯化钠溶液。

7.根据权利要求1所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，标准曲线的绘制方法为：

A、乙酰苯丙氨酸标准溶液配制：准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10mg于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液，根据血清样品中的浓度范围进行适当稀释，制成不同浓度的系列标准溶液；

B、将制得的系列标准溶液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，加入量与样品待测液的加入量相同，再分别用激光拉曼光谱仪扫描，记录1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，将标准溶液的浓度与其对应峰强度制成标准曲线。

8.如权利要求1-7中任意一项所述的人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法的应用，其特征在于，用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。