CN114137134A - 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效液相色谱‑电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，按如下步骤：S1、配制流动相,调节pH值7.0～7.6；S2、配制标准溶液，包括：S2.1、配制单一标准储备液：分别称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解；分别吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释；S2.2、配制混合标准储备液：分别吸取步骤S2.1的7种单一标准储备液，用水稀释成混合标准储备液；S2.3、采用步骤S1的流动相将步骤S2.2的混合标准储备液稀释。采用本发明技术方案，硒形态检出限低，能满足一些低硒样品中各硒形态的分离检测，从而扩大了检测样品类型的范围。
Description
技术领域
本发明属于硒元素分离技术领域，具体涉及一种7种硒形态的离子对高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离检测方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等显著的生理功能，所以维持机体中适量的硒水平能预防多种疾病，如癌症、克山病、大骨节病等。通过食物补硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法。硒元素在食品中的形态主要分为无机硒和有机硒，无机硒主要包括硒酸盐、亚硒酸盐、硒化氢等，有较大毒性。有机硒以硒蛋白、硒多糖、硒代氨基酸等形式存在，有机硒毒性小，生物利用率高，更有利于人体吸收。但目前食品的国家标准中只规定了总硒的测定方法，不能区分有机硒和无机硒，更不能区分各种硒的形态，难以准确评价富硒产品的补硒功效。建立快速、灵敏、准确的方法检测食品、药品及保健品等产品中的硒含量以及对硒元素形态进行分析对人类的健康和经济发展有着重要意义。
外源无机硒被农作物根吸收，在芽和树叶中转化为有机硒，然后在叶绿体作用下进一步代谢合成硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)等有机硒。因此，在评估富硒产品时，主要考虑这三种有机硒的含量与组成。
而要实现富硒产品中不同硒元素形态的分析，首先必须建立富硒产品中硒化物的提取、分离和检测方法。目前硒化物分离检测的主流方法包括液相色谱-原子荧光联用法(HPLC-HG-AFS)、液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)。用液相色谱分离时主要使用离子交换柱(如阴离子交换柱Hamilton PRP-X100)和C8、C18柱(离子对色谱法)。有研究表明采用C18柱的分离效果要强于使用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱。
全国供销行业标准《GH/T 1135-2017富硒农产品》、湖北地标《DBS42/002-2021富有机硒食品硒含量要求》中推荐的检测方法为HPLC-HG-AFS，但该系统中的检测器AFS相比ICP-MS具有较高仪器检测限，因此一些低硒样品中各硒形态由于含量低于检测限而无法进行检测，进而限制了检测样品类型的范围。ICP-MS具有灵敏度高、检出限低、元素专一性、选择范围宽等优点，故该HPLC-ICP-MS分离检测方法可满足大部分样品的硒形态检测，甚至可检出一些痕量硒化合物。
现有专利文献大部分是利用阴离子交换柱(Hamilton PRP-X100)分离富硒产品中的4～5种硒形态，再利用AFS或ICP-MS检测不同硒形态的含量。如专利文献CN 107727758 A利用HPLC-HG-AFS分离并测定富硒饲料中5种形态硒物质的含量。专利文献CN 112964803 A利用HPLC-HG-AFS分离测定富硒茶树组织样品中2种无机硒和3种有机硒形态。专利文献CN111610263 B利用HPLC-HG-AFS分离测定富硒木耳中5种硒形态。以上各专利文献存在分离检测的硒形态种类少，检出限低的问题。专利文献CN 113391016 A利用HPLC-ICP-MS分离测定玉米中4种硒形态。专利文献CN 111289674 A利用HPLC-ICP-MS分离测定富硒水果中5种硒形态。以上两专利文件也存在分离检测的硒形态种类少的问题。
利用C8、C18柱离子对色谱法分离硒形态的研究较少，如专利文献CN 106290626 A利用C8柱分离，ICP-MS测定富硒花生或其制备的产品种3种硒形态。专利文献CN 112630316A利用C18柱分离，ICP-MS测定富硒蛋白多糖4种硒形态。但，以上专利还是存在分离检测的硒形态种类少的问题。专利文献CN 113189233 A利用C18柱分离，AFS测定蔬菜中7种硒形态，但其存在检出限低的问题，且未涉及很重要的一种有机硒形态SeCys的分离检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供了一种7种硒形态的离子对高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离检测方法。
为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，按如下步骤：
S1、配制流动相,调节pH值7.0～7.6；
S2、配制标准溶液，包括：
S2.1、配制单一标准储备液：分别称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解；分别吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释；
S2.2、配制混合标准储备液：分别吸取步骤S2.1的7种单一标准储备液，用水稀释成混合标准储备液；
S2.3、采用步骤S1的流动相将步骤S2.2的混合标准储备液稀释。
优选的，步骤S1，以10.0～40.0mmol·L-1磷酸氢二铵、0.5～3.0mmol·L-1四丁基溴化铵、不高于2.0％甲醇配制成流动相，并采用甲酸或氨水调节pH值为7.4。
优选的，步骤S1具体如下：称取3.96g磷酸氢二铵、0.64g四丁基溴化铵，溶于980mL水中，混匀，采用甲酸调pH至7.4，再加入20mL甲醇，混匀后过0.22μm滤膜，于水浴中超声脱气。
优选的，步骤S1，以30.0mmol·L-1磷酸氢二铵、2.0mmol·L-1四丁基溴化铵、1.0％甲醇配制成流动相。
优选的，步骤S2.1、分别准确称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解，溶液浓度为50.0mg·L-1(以硒计)；分别准确吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释，溶液浓度为10.0mg·L-1(以硒计)。
优选的，步骤S2.2、分别吸取步骤S2.1的7种单一标准储备液，用水稀释成浓度为1.0mg·L-1的混合标准储备液。
优选的，步骤S2.3、采用步骤S1的流动相将步骤S2.2的混合标准储备液稀释成浓度为1.0～200.0μg·L-1的混合标准工作溶液。
采用本发明技术方案，硒形态检出限低，能满足一些低硒样品中各硒形态的分离检测，从而扩大了检测样品类型的范围。
附图说明
图1是Hamilton PRP-X100柱6种硒形态分离色谱图。
图2是流动相pH值对7种硒形态保留时间的影响图
图3是离子对浓度对7种硒形态保留时间的影响图。
图4是磷酸氢二铵浓度为10.0mmol L-1时不同硒形态色谱图。
图5是磷酸氢二铵浓度为20.0mmol L-1时不同硒形态色谱图。
图6是磷酸氢二铵浓度为30.0mmol L-1时不同硒形态色谱图。
图7是磷酸氢二铵浓度为40.0mmol L-1时不同硒形态色谱图。
图8是不同甲醇浓度条件下7种硒形态色谱叠加图。
图9是7种硒形态各浓度混合标准溶液色谱叠加图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明优选实施例做详细说明。
本实施例准备工作如下：
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：硝酸(微电子化学级，选用赛默飞世尔科技公司产品)；甲醇(色谱纯，选用赛默飞世尔科技公司产品)；磷酸氢二铵(分析纯，选用阿拉丁公司产品)；四丁基溴化铵(分析纯，选用CNW公司产品)；甲酸(色谱纯，选用赛默飞世尔科技公司产品)；氨水(优级纯，选用国药集团产品)；超纯水(电阻率＞18.2MΩ·cm)。
标准品和标准溶液：
硒代半胱氨酸(SeCys)(纯度≥98％，选用湖北万得化工有限公司产品)。
硒代乙硫氨酸(SeEt)(纯度≥98％，选用加拿大TRC公司产品)。
硒代胱氨酸标准溶液(SeCys2)(44.2μg·g-1，以硒计，选用中国计量科学研究院产品)。
甲基硒代半胱氨酸标准溶液(MeSeCys()(34.8μg·g-1，以硒计，选用中国计量科学研究院产品)。
硒代蛋氨酸标准溶液(SeMet)(39.4μg·g-1，以硒计，选用中国计量科学研究院产品)。
硒酸根标准溶液[Se(VI)](41.5μg·g-1，以硒计，选用中国计量科学研究院产品)。
亚硒酸根标准溶液[Se(IV)](42.9μg·g-1，以硒计，选用中国计量科学研究院产品)。
1.1.2 仪器：电感耦合等离子体质谱仪(Xseries2，选用美国热电公司产品)；高效液相色谱(U3000，选用戴安公司产品)；电子天平(PL602-L，选用梅特勒-托利多仪器有限公司产品)；pH计(PHS-2F，选用上海仪电科学仪器股份有限公司产品)；C18柱(Athena，4.6×250mm，5μm)；保护柱(Athena，4.0×20mm，5μm)；无机微孔滤膜(0.22μm)；超声波仪(KQ-500E，选用昆山市超声仪器有限公司产品)。所有玻璃仪器均用硝酸溶液(20％)浸泡24h以上，用超纯水冲洗干净，烘干备用。
1.2 方法
1.2.1 仪器工作条件
仪器工作条件见表1。
表1 HPLC及ICP-MS的主要工作参数
1.2.2 流动相的配制
准确称取3.96g磷酸氢二铵、0.64g四丁基溴化铵，溶于980mL水中，混匀，用甲酸调pH至7.4，再加入20mL甲醇，混匀后过0.22μm滤膜，于水浴中超声脱气15min，备用。
1.2.3 标准溶液的配制
1.2.3.1 单一标准储备液：准确称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解，定容至10mL,溶液浓度为50.0mg·L-1(以硒计)。准确吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释至10mL，溶液浓度为10.0mg·L-1(以硒计)。上述溶液均于-20℃避光保存。
1.2.3.2 混合标准储备液：分别吸取适量的7种单一标准储备液(1.2.3.1)，用水稀释成浓度为1.0mg·L-1的混合标准储备液，-20℃避光保存。
1.2.3.3 混合标准工作溶液：用流动相(1.2.2)将混合标准储备液(1.2.3.2)稀释成浓度为1.0～200.0μg·L-1的混合标准工作溶液，临用新配。
1.2.4 分离条件的优化
下面分别考察流动相的pH值、离子对(四丁基溴化铵)浓度、缓冲盐浓度、甲醇浓度变化对7种硒形态分离的影响，获得最佳分离条件。
1.2.5 标准曲线绘制和检出限
在最佳分离条件下用C18柱分离7种硒形态，用ICP-MS检测各硒形态。以硒形态的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。采用逐级稀释法，三倍的信噪比(S/N＝3)确定各硒形态的检出限。
2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择
本实施例对Hamilton PRP-X100阴离子交换柱的分离效果进行了研究，发现以5mmol·L-1的柠檬酸铵-1％甲醇(pH4.3)为流动相，能实现6种硒形态的分离，但是SeCys和SeCys2未能实现分离，且SeEt峰形较差。分离效果参见图1。故本实施例采用C18柱进行硒形态分离研究。
2.2 色谱峰的定性和定量
硒在自然界存在74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se等6种同位素，各同位素的自然丰度分别为0.89％、9.37％、7.63％、23.77％、49.61％和8.73％。相对而言，80Se的自然丰度最高，但在质谱中40Ar40Ar+的干扰也最大。鉴于此，采用H2-He碰撞池模式采集78Se信号，并调节碰撞气H2-He的流量，以消除40Ar38Ar+与38Ar40Ca+等对78Se的质谱干扰，根据单个硒形态标准溶液的保留时间，判断各物质的出峰顺序依次为SeCys、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)和SeEt，以78Se色谱峰的峰面积作为定量依据。
2.3 分离条件优化
2.3.1 流动相pH对不同硒形态分离的影响
流动相的pH值是影响具有不同pKa值元素形态分离的主要因素。在不同的酸度条件下，硒的不同形态会以阳离子、阴离子或者两性离子的形式存在，因此流动相pH变化对各硒形态的分离效果和保留时间影响很大。以30.0mmol·L-1磷酸氢二铵、2.0mmol·L-1四丁基溴化铵、1.0％甲醇为流动相，流动相用甲酸或氨水调节pH值，不同的流动相pH值下各种硒形态的保留现象参见图2。SeEt的保留时间随着pH值升高而增加。而Se(VI)的保留时间随着pH值升高而减小。pH变化对SeCys、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)的分离影响较大。pH在7.0～7.3时，SeCys、SeCys2未完全分离。pH为7.5时，SeCys2、MeSeCys分离较差。pH为7.6时，SeCys2、MeSeCys、Se(IV)分离较差。pH为7.4时，7种硒形态能实现较好的完全分离。
2.3.2 离子对浓度对不同硒形态分离的影响
以30.0mmol·L-1磷酸氢二铵、1％甲醇为流动相，采用甲酸或氨水调节流动相的pH＝7.4，在流动相中添加离子对试剂四丁基溴化铵浓度为0.5～3.0mmol·L-1范围内，考察了四丁基溴化铵浓度对7种硒形态保留时间的影响，结果如图3所示。SeEt的保留时间随着流动相中离子对浓度升高而略微降低。Se(VI)的保留时间与离子对浓度正相关，随着离子对浓度的增加而增大。离子对浓度为0.5mmol·L-1和1.0mmol·L-1时，MeSeCys和Se(IV)不能完全分离。离子对浓度为3.0mmol·L-1时，SeCys2、MeSeCys不能完全分离。当离子对浓度为2.0mmol·L-1时，7种硒形态能实现完全分离。
2.3.3 缓冲盐浓度对不同硒形态分离的影响
流动相中添加四丁基溴化铵浓度为2.0mmol·L-1、甲醇为1％，采用甲酸调节流动相的pH＝7.4，在缓冲盐磷酸氢二铵浓度为10.0～40.0mmol·L-1范围内，考察了磷酸氢二铵浓度对7种硒形态保留时间的影响，结果如图4～图7所示。磷酸氢二铵浓度为10.0mmol·L-1时，分离效果很差。浓度为20.0mmol·L-1时，SeCys2、MeSeCys不能完全分离。浓度为40.0mmol·L-1时，MeSeCys和Se(IV)分离效果较差。当磷酸氢二铵浓度为30.0mmol·L-1时，7种硒形态实现完全分离。
2.3.4 甲醇浓度对不同硒形态分离的影响
本实施例考察了流动相中加入甲醇(浓度范围为0～2.0％)对7种硒化合物的增敏作用及分离效果的影响。结果参见图8，结果表明流动相中加入甲醇对7种硒化合物具有明显的增敏作用，信号强度随甲醇浓度升高而增大。甲醇浓度升高还能缩短SeEt的出峰时间。但是甲醇浓度过高会在采样锥上产生碳富集堵塞锥孔，需时常清洗。因此，本实施例选择甲醇浓度为2.0％，既可以增加硒的灵敏度，又可以减少采样锥上的碳富集。
2.4 标准曲线与检出限
分别配制1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μg·L-1的SeCys、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)和SeEt混合标准工作溶液系列，以各浓度色谱峰面积(y)对应质量浓度(x)绘制标准曲线,如图9所示。在最佳实验条件下，1.0～200.0μg·L-1范围内，相关系数(r)均大于0.998，线性关系良好。采用逐级稀释法，当待测物的信噪比(S/N＝3)时确定此时的浓度为该化合物的检出限。结果见表2。
表2 7种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限
综上，本实施例发现C18柱的分离效果优于Hamilton PRP-X100阴离子交换柱。利用C18柱进行离子对色谱法分离，优化流动相pH值、离子对浓度、缓冲盐浓度和甲醇浓度条件。经C18反相色谱柱分离，以30.0mmol·L-1磷酸氢二铵、2.0mmol·L-1四丁基溴化铵、2.0％甲醇为流动相，流动相的pH用甲酸或氨水调节至7.4，7种硒形态能实现完全分离且峰形良好。根据单个硒形态标准溶液的保留时间，判断各物质的出峰顺序依次为SeCys、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)、SeEt。运用ICP-MS的H2-He碰撞池技术进行检测，获得了7种硒形态的标准曲线，各硒形态在1.0～200.0μg·L-1浓度范围内线性关系良好，7种硒形态的检出限分别为：0.20、0.11、0.14、0.11、0.17、0.12、0.20μg·L-1。本实施例分离检测了一种重要有机硒形态SeCys，且与专利文献CN 113189233 A相比，本实施例的硒形态检出限更低，能满足一些低硒样品中各硒形态的分离检测，从而扩大了检测样品类型的范围。
上述内容描述了本发明的使用原理、特征和部分有益效果，本领域的相关人员根据上述内容可以了解，上述内容并未限制本发明，上述的实施例和说明书描述的是本发明的基本原理和特征，在符合本发明构思的前提之下，本发明还可进行各种变化改进，这些改进都应落入本发明要求保护的范围之内。
Claims (7)
1.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是按如下步骤：
S1、配制流动相,调节pH值7.0～7.6；
S2、配制标准溶液，包括：
S2.1、配制单一标准储备液：分别称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解；分别吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释；
S2.2、配制混合标准储备液：分别吸取步骤S2.1的7种单一标准储备液，用水稀释成混合标准储备液；
S2.3、采用步骤S1的流动相将步骤S2.2的混合标准储备液稀释。
2.如权利要求1所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S1，以10.0～40.0mmol·L-1磷酸氢二铵、0.5～3.0mmol·L-1四丁基溴化铵、不高于2.0％甲醇配制成流动相，并采用甲酸或氨水调节pH值为7.4。
3.如权利要求1或2所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S1具体如下：称取3.96g磷酸氢二铵、0.64g四丁基溴化铵，溶于980mL水中，混匀，采用甲酸调pH至7.4，再加入20mL甲醇，混匀后过0.22μm滤膜，于水浴中超声脱气。
4.如权利要求2所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S1，以30.0mmol·L-1磷酸氢二铵、2.0mmol·L-1四丁基溴化铵、1.0％甲醇配制成流动相。
5.如权利要求1或2或4所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S2.1、分别准确称取适量硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸标准品，分别用水溶解，溶液浓度为50.0mg·L-1；分别准确吸取适量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根标准溶液，分别用水稀释，溶液浓度为10.0mg·L-1。
6.如权利要求5所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S2.2、分别吸取步骤S2.1的7种单一标准储备液，用水稀释成浓度为1.0mg·L-1的混合标准储备液。
7.如权利要求6所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分离硒形态的方法，其特征是：步骤S2.3、采用步骤S1的流动相将步骤S2.2的混合标准储备液稀释成浓度为1.0～200.0μg·L-1的混合标准工作溶液。
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