CN113189233B - 一种测定蔬菜中硒形态含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，所述方法使用离子对反相高效液相色谱‑紫外‑氢化物发生‑原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒脲、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸、亚硒酸根和硒酸根7种硒形态和含量。本发明的测定方法无机硒提取加入碘乙酰胺，解决了HPLC‑HG‑AFS中分析测试亚硒酸根回收率差的问题；前处理操作快速、简便，蛋白酶所需种类少且用量少，试剂成本低，样品提取率高，大大提高了硒形态HPLC‑HG‑AFS分析方法的灵敏度和分离度；一次可同时分析测定7种硒形态含量，且仪器分析测试时间短。

Description

一种测定蔬菜中硒形态含量的方法
技术领域
本发明属于质量检测技术领域，具体涉及一种测定蔬菜中硒形态含量的方法。
背景技术
硒作为一种人体必需的营养元素，人体内各种活性酶的重要组成成分，被世界卫生组织和中华医学会定为二十一世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素。硒在预防克山病、增强免疫力、抗氧化、防癌抗癌、护肝、保心、促进脑力发育、防治糖尿病、调节内分泌与维生素吸收与利用、保护甲状腺和前列腺等方面均发挥着重要作用。
硒在生物体内的生物利用度、有效性、毒性以及代谢等不仅与硒的总量有关，更与硒赋存形态密切相关。农产品中硒的常见形态主要分为无机硒和有机硒。无机硒，如硒酸盐、亚硒酸盐，毒性较大，在人体中吸收和利用率低，长期摄入易导致人体病变。有机硒，如硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等，经生物转换而得，生物活性强，易被人体所吸收和利用，安全无副作用和营养价值高。可以说，硒的赋存形态真正决定了硒在生物体内的可利用价值和营养价值。硒在不同食物中的结合形式和形态种类均不同，有的以蛋白结合态为主，有的与多糖类结合为主，这样就导致不同样品的硒提取释放方法不一。此外，不同种类的样品需要的酶种类不同，不同酶的提取量、提取温度等条件亦不同，因此很难形成针对所有样品统一的硒形态前处理方法。
食品中硒形态分析方法有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)法、高效液相色谱-串联三重四级杆质谱(HPLC-MS-MS)法、体积排阻色谱(SEC-HPLC)法、气相色谱-电感耦合等离子体质谱(GC-ICP-MS)法、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-HPLC-ICP-MS)法、高效液相色谱-原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)法等。液相色谱硒形态分离多为离子交换(AE)法和离子对(IP)法，离子对试剂多为三氟乙酸、七氟丁酸和己烷磺酸等，罕见以四丁基溴化铵为离子对试剂分离硒形态的报道。目前，关于食品中硒形态HPLC-AFS分析方法的报道不多，样品类型主要集中于富硒酵母、大米、食用菌和水产品等，且主要方法HPLC-ICP-MS法，但是HPLC-ICP-MS法测硒时存在质谱干扰严重，需要较为丰富的分析测试经验，且其运行成本和购置成本显著较高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中对蔬菜中硒的形态和含量检测灵敏度差，分析时间过长的缺陷，从而提供了一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，具体为离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法(IP-RP-HPLC-UV-HG-AFS)。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，所述方法使用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、亚硒酸根(Se(IV))和硒酸根(Se(VI))7种硒形态和含量，根据硒形态保留时间确定形态，峰面积确定含量。
进一步地，包括如下步骤：
S1：取1份待测样品加入碘乙酰胺溶液，使用超声波提取后过滤上机测试，测定亚硒酸根的形态和含量；
S2：取另外1份待测样品，加入水后超声破壁，再加入蛋白酶使用超声波提取后过滤上机测试，测定除亚硒酸根以外硒的形态和含量。
进一步地，步骤S1和S2中所述上机测试的仪器分析测试条件为：
液相色谱条件：C18反相色谱柱(250×4.6mm,5μm)，流动相为30mmol/L磷酸氢二铵溶液，其中含有0.5mmmol/L四丁基溴化铵，同时含有2％甲醇，pH为6.0，流速为1.2mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃；
紫外条件：在线紫外消解(紫外灯功率40w，长度28cm)；
氢化物发生条件：0.35％(m/v)氢氧化钾+0.05％(m/v)碘化钾，0.35％(m/v)氢氧化钾+1.5％(m/v)硼氢化钾，10％(v/v)盐酸，泵转速60r/min；
原子荧光光谱条件：负高压300V，灯总电流80mA，载气流量300mL/min，屏蔽气流量500mL/min，原子化器高度9mm。
步骤S1和步骤S2中，所述过滤包括将经超声波提取后的溶液使用滤纸过滤定容，滤液再经超滤离心管离心净化，最后过膜取溶液液体。
优选地，所述定容体积为10-25mL；
所述膜为尼龙滤膜，孔径为0.45μm。
步骤S2中所述蛋白酶为蛋白酶K，其与所述1份待测样品质量比为1：30-1：40；
所述超声破壁的功率为60-90w，时间为60-90s。
步骤S1中碘乙酰胺的浓度为1-5mmol/L。
进一步地，步骤S1和S2中所述超声提取的功率为20kHz，温度为50-60℃，时间为30min，重复2次。
所述待测样品为表面用纯水冲洗干净/擦干、经过匀浆机匀浆1-2min后的蔬菜，所述待测样品每一份的质量为0.5-5g。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明采用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法(IP-RP-HPLC-UV-HG-AFS)来测量蔬菜中的硒的形态和含量，首先利用离子对反相高效液相色谱分离7种硒形态，然后采用紫外灯在线消解将有机硒转化为六价硒，接着采用还原剂将六价硒还原剂为四价硒，最后通过原子荧光光谱法测定硒形态含量。
(2)本发明的测定方法中对无机硒提取加入碘乙酰胺，解决了HPLC-HG-AFS中分析测试亚硒酸根回收率差的问题；前处理操作快速、简便，蛋白酶所需种类少且用量少，试剂成本低，样品提取率高，大大提高了硒形态HPLC-HG-AFS分析方法的灵敏度和分离度；一次可同时分析测定7种硒形态含量，且仪器分析测试时间短。
(3)本发明使用四丁基溴化铵做离子对试剂时，可以改善硒形态分离度。若未加入四丁基溴化铵，采用C18色谱柱分离硒形态时时，亚硒酸和硒代蛋氨酸两峰会有重叠，无法完全分离。本发明使用添加了四丁基溴化铵的流动相，同时加入甲醇，并限定流动相中各物质的浓度，可以提高硒形态的分离度和灵敏度。
(4)本申请使用普通C18色谱柱，其价格远低于阴离子色谱柱，而且采用C18色谱柱的反相液相色谱法对硒代蛋氨酸的灵敏度和分析时间均优于采用阴离子色谱柱的离子交换液相色谱法，前者硒代蛋氨酸的灵敏度可高于后者3～5倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中20μg/L的7种硒形态标准溶液色谱图；
图2为实施例2中富硒蕹菜空心菜色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例1和实施例2中所用仪器为HPLC-UV-HG-AFS(SA-20，北京吉天仪器有限公司)及分析条件如下：
液相色谱：C18反相色谱柱(250×4.6mm,5μm)，流动相为30mmol/L磷酸氢二铵溶液，其中含有0.5mmmol/L四丁基溴化铵，同时含有2％甲醇，pH为6.0，流速为1.2mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃；
紫外：在线紫外消解(紫外灯功率40w，长度28cm)；
氢化物发生：条件：0.35％(m/v)氢氧化钾+0.05％(m/v)碘化钾，0.35％(m/v)氢氧化钾+1.5％(m/v)硼氢化钾，10％(v/v)盐酸，泵转速60r/min；
原子荧光光谱：负高压300V，灯总电流80mA，载气流量300mL/min，屏蔽气流量500mL/min，原子化器高度9mm。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例为得到硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、亚硒酸根(Se(IV))和硒酸根(Se(VI))7种硒的标准曲线，具体步骤如下：
(1)准备硒标准物质:SeCys2(GBW10087，浓度44.2μg/g，以Se计)、MeSeCys(GBW10088，浓度34.8μg/g，以Se计)、SeUr(Sigma-Aldrich，98％)、SeMet(GBW10034，浓度39.4μg/g，以Se计)、SeEt(TRC，98％)、Se(Ⅳ)(GBW10032，浓度42.9μg/g，以Se计)、Se(Ⅵ)(GBW10033，浓度41.5μg/g，以Se计)。
分别准确称取标准物质0.39745gSeUr和0.67889gSeEt，用水溶解，定容至25mL，即SeUr和SeEt标准储备液浓度均为1000mg/L，然后准确吸取100μLSeUr和SeEt标准储备液，用水稀释，定容至100mL，即SeUr和SeEt标准中间液浓度均为1.00mg/L；分别准确吸取1.13mLSeCys2、1.44mL MeSeCys、1.27mLSeMet、1.20mL Se(Ⅳ)、1.17mLSe(Ⅵ)、5mL 1.00mg/LSeUr和SeEt标准中间液，用30mmol/L磷酸氢二铵溶液(pH8.0)定容至50.0mL，即7种硒形态标准中间液浓度均为1.00mg/L。
(2)分别准确吸取1.00mg/L 7种硒形态标准中间液0.05、0.5、1、2.5、5、7.5和10mL，配置一系列硒形态标准工作液浓度：1、10、20、50、100、150和200μg/L，用30mmol/L磷酸氢二铵溶液(pH8.0)定容至50.0mL。液相色谱-原子荧光光谱法测定硒形态标准工作液，浓度由低到高依次进样，以各种硒形态色谱峰面积和浓度绘制标准曲线，具体内容如下表1所示，保留时间定性，外标法峰面积定量。
表1 7种硒形态的标准曲线、检出限和定量限
Figure BDA0003045054080000071
如图1所示为20μg/L的7种硒形态标准溶液色谱图，在上述仪器分析测试条件下SeCys2、MeSeCys、SeUr、Se(IV)、SeMet、Se(VI)和SeEt的出峰时间分别为2.57min、3.29min、3.81min、4.25min、5.02min、8.91min和10.97min。
检出限为添加低浓度7种形态硒浓度至空白样品，经提取、净化后测定7种硒形态含量，根据其3倍标准偏差除以标准曲线的斜率，其对应浓度作为检出限(n＝11)。定量限等于3倍检出限×定容体积/样品称样量。本方法硒形态检出限为0.14-0.43μg/L，定量限为0.7-2.2μg/kg。
实施例2
本实施例提供一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，测试的待测样品为富硒蕹菜空心菜(品种为赣蕹1号)，具体步骤如下：
(1)将富硒蕹菜空心菜用水洗净，晾干，取可食部分约200g，用匀浆机匀浆1min，得到处理好的待测样品；
(2)取步骤(1)中的待测样品2g于50mL离心管中，加入水5.0mL和100mmol/L碘乙酰胺溶液0.1mL，摇匀，于超声仪中20kHz频率超声提取30min，重复2次，提取液经定量滤纸过滤，用水定容至10mL容量瓶中，取5mL滤液于超滤离心管，于离心机5000rpm离心净化20min，取离心后下层净化液过0.45μm尼龙膜后上机测定；同时做空白试验，即未加入样品，其他步骤同上；
(3)取步骤(1)中的待测样品2g于50mL离心管中，加入水5.0mL，摇匀，于细胞破碎仪中90w功率超声破壁60s；再加入50mg蛋白酶K，于超声仪中20kHz频率超声提取30min，重复2次，提取液经定量滤纸过滤，用水定容至10mL容量瓶中，取5mL滤液用超滤离心管，于离心机5000rpm离心净化20min，取离心后下层净化液过0.45μm尼龙膜后上机测定；同时做空白试验，即未加入样品，其他步骤同上；
(4)将步骤(2)、(3)净化后得到的样品溶液用IP-RP-HPLC-UV-HG-AFS法测定样品中硒形态含量，液相色谱条件为离子对反相高效液相色谱法，以C18为反相色谱柱，流动相为30mmol/L磷酸氢二铵溶液(含0.5mmmol/L四丁基溴化铵，pH6.0)和2％(v/v)甲醇，流速为1.2mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃；紫外灯在线消解将有机硒转化为六价硒，还原剂为0.05％(m/v)碘化钾(含0.35％(m/v)氢氧化钾)将六价硒转化为四价硒；原子荧光光谱条件为载液为10％(v/v)盐酸溶液，还原剂为2.0％(m/v)硼氢化钾(含0.35％(m/v)氢氧化钾)。根据硒形态保留时间定性，峰面积定量。
对富硒蔬菜样品中硒形态含量进行测定时，同时进行加标回收试验，重复次数n＝6。添加回收率(％)＝100*(测定总值-样品值)/加标浓度，回收率：变异系数(％)＝100*标准差/平均值，其结果如下表2所示：
表2本申请实施例2中待测样品硒形态测定结果、加标回收率和变异系数
Figure BDA0003045054080000091
由上表可知，待测样品中的硒形态为硒代胱氨酸(SeCys2)和硒代蛋氨酸(SeMet)，其中硒代胱氨酸为0.058mg/kg，硒代蛋氨酸为0.163mg/kg。
试验例1
本试验例为对比试验。
(1)对比试验1：与实施例2相比，对比例中原步骤(2)中未加入碘乙酰胺溶液，其它条件不变。结果表明，在加标回收试验中，其亚硒酸根回收率为14％，远低于实施例2。
(2)对比试验2：与实施例2相比，对比例中原步骤(3)中蛋白酶K用量比与样品质量比为1:100，其它条件不变。结果表明，其有机硒形态提取率为43％，远低于实施例2。
(3)对比试验3：与实施例2相比，对比例中原步骤(3)中未经细胞破碎仪超声破壁，其它条件不变。结果表明，其有机硒形态提取率为56％，远低于实施例2。
(4)对比试验4：与实施例2相比，对比例中原步骤(2)中超声提取温度为37℃，其它条件不变。结果表明，其有机硒形态提取率为67％，远低于实施例2。
(5)对比试验5：与实施例2相比，对比例中原步骤(2)中蛋白酶种类为蛋白酶XIV(链霉蛋白酶)，其它条件不变。结果表明，其有机硒形态提取率为82％，远低于实施例2。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，其特征在于，所述方法使用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒脲、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸、亚硒酸根和硒酸根7种硒形态和含量；
包括如下步骤：
S1：取1份待测样品加入碘乙酰胺溶液，使用超声波提取后过滤上机测试，测定亚硒酸根的形态和含量；
S2：取另外1份待测样品，加入水后超声破壁，再加入蛋白酶使用超声波提取后过滤上机测试，测定除亚硒酸根以外硒的形态和含量；
步骤S1和S2中所述上机测试的仪器分析测试条件为：
液相色谱条件： C18 反相色谱柱，250×4.6 mm，5µm，流动相为30 mmol/L磷酸氢二铵溶液，其中含有0.5 mmol/L四丁基溴化铵，同时含有2%甲醇，pH为6.0，流速为1.2 mL/min，进样量为100 µL，柱温为35℃；
紫外条件：紫外灯功率40 w，长度28 cm，在线紫外消解；
氢化物发生条件：0.35％氢氧化钾+0.05％碘化钾，0.35％氢氧化钾+1.5％硼氢化钾，10％盐酸，泵转速60 r/min；
原子荧光光谱条件：负高压300 V，灯总电流80 mA，载气流量300 mL/min，屏蔽气流量500 mL/min，原子化器高度9 mm；
步骤S2中所述蛋白酶为蛋白酶K，其与所述待测样品质量比为1：30-1：40；
所述超声破壁的功率为60-90 w，时间为60-90s；
步骤S1中碘乙酰胺的浓度为1-5mmol/L；
步骤S1和S2中所述超声提取的频率为20 kHz频率超声，温度为50-60℃，时间为30min，重复2次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中，所述过滤包括将经超声波提取后的溶液使用滤纸过滤定容，滤液再经超滤离心管离心净化，最后过膜取溶液液体。
3.根据权利要求2所述的方法，所述定容体积为10-25 mL；
所述膜为尼龙滤膜，孔径为0.45 µm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中，所述待测样品为表面用纯水冲洗干净/擦干、经过匀浆机匀浆1-2min后的蔬菜，所述待测样品每一份的质量为0.5-5 g。
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