CN110658286B - 利用rp-hplc法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法 - Google Patents

利用rp-hplc法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用反相高效液相色谱(RP‑HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4‑羟基苯乳酸含量的方法，包括以下步骤：步骤a：配置流动相；步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量‑峰面积标准曲线和4‑羟基苯乳酸含量‑峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；步骤c：将含有苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用内标法计算出苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的含量。

Description

利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的 方法
技术领域
本发明属于高效液相色谱分析技术领域，涉及食品和发酵液中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的快速检测，具体涉及一种利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法。
背景技术
苯乳酸和4-羟基苯乳酸是近年来微生物源生物防腐剂研究的热点之一，可以有效抑制革兰氏阴性、阳性细菌和真菌的生长，不仅用于控制食源性致病菌和腐败菌的生长，而且在调节肠道菌群方面有巨大的潜力；同时它们溶解性好，对酸碱和温度的稳定性高，故在食品行业和健康保健等领域的应用前景被人们广泛看好。
目前，苯乳酸和4-羟基苯乳酸的检测主要有薄层层析法和高效液相检测法，相关报道均以单个物质的测定较多。高效液相色谱法测定苯乳酸代表性的方法是以0.05％的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05％的三氟乙酸/水(B)的混合液为流动相，梯度洗脱程序为：0～20min由10％A线性变化至100％，20～23min保持100％A，23～25min100％A线性变化至10％；流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃。4-羟基苯乳酸的检测的方法为：0.05%三氟乙酸/水(A) 和0.05% 三氟乙酸/甲醇溶液(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0～20min 为10%～100% B，20～23min保持 100% B；流速: 1mL/min；检测波长: 210nm；柱温: 30℃。这两种方法中均要求梯度洗脱，对仪器配制要求高，流动相比例发生变化时，基线易发生漂移，对结果产生影响。同时流动相中三氟乙酸酸性强，对柱子的损伤大，柱子寿命严重缩短。
发明内容
针对目前苯乳酸和4-羟基苯乳酸检测时对仪器要求高、柱子损伤大、不能同时检测中两种物质等问题，本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，本发明的方法对柱子损伤小、准确度高，稳定性好，操作简单，节约成本，缩短生产过程中的检测时间，且检测结果准确可靠。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：
利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，包括以下步骤：
步骤a：配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，确定出峰时间，采用外标法，以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；
步骤c：将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用外标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量。
其中，步骤b中，所述色谱柱为 C18 (4.6×250mm，5μm)色谱柱，色谱条件包括：
流动相：流动相A为质量分数0.1%甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A和B的体积比为80：20；
流动相流速：0.5mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱温：20～30℃；
进样量：10μL。
本发明流动相的选择，利用质量分数0.1％的甲酸/水溶液来改善分离物质的吸附性能，C18色谱柱是亲水性色谱柱，亲水性强的先被分离出来，乙腈洗脱能力强，可使低波长下有吸收的杂质被检测，由于不使用梯度洗脱，检测结果稳定，基线不会发生漂移。两者结合使检测结果更准确，且保留能力强，对苯乳酸和4-羟基苯乳酸两个水溶性的物质分离效果好，出峰时间合适。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明流动相和流速不发生变化，压力稳定，2个水溶性物质同时被检出，操作简单，结果准确可靠，能够大规模检测样品中苯乳酸和4-羟基本速算的含量。
2、本发明利用质量分数0.1%甲酸/水溶液和乙腈为流动相，相较三氟乙酸为流动相时对柱子的损伤小。
3、本发明利用反相高效液相色谱法快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量，准确度高，稳定性好，操作简单，且检测结果准确可靠，检测样品和杂质之间分离较好，有利于食品样品和乳酸菌发酵液中的苯乳酸和4-羟基苯乳酸的定量检测。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的苯乳酸标准溶液的液相色谱图(0.8mg/mL)；
图2是本发明实施例1提供的4-羟基苯乳酸标准溶液的液相色谱图（400ug/mL）；
图3是本发明实施例提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸混标的液相色谱图（1为4-羟基苯乳酸，2为苯乳酸）；
图4 是本发明实施例1提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液的液相色谱图（1为4-羟基苯乳酸，2为苯乳酸）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步说明。
以下实施例中采用的高效液相色谱仪为依利特P230ll，色谱柱为POSITISIL C18(3) (4.6×250mm，5μm)色谱柱色谱柱。其中，色谱条件为：
流动相：流动相A为质量分数0.1%甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A和B的体积比为80：20；
流动相流速：0.5mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱温：20～30℃；
进样量：10μL。
实施例1
利用反相高效液相色谱法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，具体步骤为：
步骤a、配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
步骤b、采用Aldrich纯度大于98%色谱纯苯乳酸标准品配制苯乳酸标准溶液，依次稀释得到浓度为0.2 mg/mL、0.4mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸标准溶液进行高效液相分析，每个浓度的标准溶液分别进样三次，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，色谱图如图1所示，图中保留时间为30.5800min处为苯乳酸的峰，其余为杂质峰，峰面积如表1所示，并采用外标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程：y＝33969x+2525.4，R2 ＝0.9976；
步骤c、采用Aldrich的纯度大于97%的色谱纯4-羟基苯乳酸标准品配制4-羟基苯乳酸标准溶液，依次稀释得到浓度为0.15 mg/mL、0.20mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL、0.35 mg/mL和 0.40 mg/mL的标准溶液，采用高效液相色谱仪对4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相分析，每个浓度的标准溶液分别进样三次，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，色谱图如图2所示，图中保留时间为10.0475min处为4-羟基苯乳酸的峰，其余为杂质峰，峰面积如表2所示，并采用外标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程：y＝30623x+384.2，R 2＝0.9986；
步骤d、将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品进行前处理，8000r/min离心4min，0.22μm微滤，利用高效液相色谱仪分析，采用与上述标准溶液完全相同的色谱条件，记录峰面积，利用大连依利特离线数据处理软件计算峰面积，代入标准曲线，得到样品中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量。从图3可以看出，保留时间9.7983min为4-羟基苯乳酸的峰，保留时间30.7658min为苯乳酸的峰，其余的为杂峰，2个主峰的出峰时间适宜，且与杂峰分离度良好。
表1 苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
Figure 779080DEST_PATH_IMAGE002
表2 4-羟基苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
Figure 289695DEST_PATH_IMAGE004
实施例2
为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行回收率试验，取已知含 0.25 ug/mL的 4-羟基苯乳酸浓度的发酵液样品 5 份，分别添加 4-羟基苯乳酸标准品溶液试验，进行样品处理和色谱分离检测，测定加样回收率。测定结果显示表3所示。
表3 4-羟基苯乳酸加样回收率实验数据
Figure 194066DEST_PATH_IMAGE006
实施例3
为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行回收率试验，取已知含 0.42 mg/mL的苯乳酸浓度的发酵液样品 5 份，分别添加苯乳酸标准品溶液试验，进行样品处理和色谱分离检测，测定加样回收率。测定结果显示表4所示。
表4 苯乳酸加样回收率实验数据
Figure 526959DEST_PATH_IMAGE008
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：配制流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，利用离线数据处理软件进行数据处理，确定出峰时间，采用外标法，以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；
步骤c：将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用外标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量；
步骤b中，所述色谱柱为规格为4.6×250mm，5μm的C18色谱柱，色谱条件如下：
流动相：流动相A为质量分数0.1％甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A和B的体积比为80：20；
流动相流速：0.5mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱温：20～30℃；进样量：10μL。
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