CN116990423A - 维生素b12定量检测方法及其快速绘制标准曲线的方法 - Google Patents
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Abstract
一种维生素B12定量检测方法，采用2个浓度的加标回收试验，平行测定2次，检验样品添加回收率与精密度，具体实验步骤如下：S101：标准溶液配制；S102：设定色谱条件；S103:标准曲线绘制；S104：检出限和定量限；S105：精密度与回收率实验；本发明的有益效果为实验所使用提取试剂无毒害，最大限度减少有毒有害试剂的使用，降低对实验人员的危害，样品前处理提取简便快捷，缩短了检测时间，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及维生素检测领域，具体为一种维生素B12定量检测方法及其快速绘制标准曲线的方法。
背景技术
维生素B12广泛应用于医疗、食品行业以及饲料加工。是人体必需的微量营养素，且人体自身不能合成，人体主要通过食用牛乳、肝脏、瘦肉、鱼类和蛋黄等动物性食品获得。人体需要维生素B12的量很少，推荐的日补助量为2.4μg，怀孕和哺乳的妇女日需要量为2.6μg，婴儿为0.4μg。在婴儿配方乳粉中，国家标准要求大于等于1.2μg/100g。
食物中的维生素B12的形态通常为蛋白结合结构，其进入人体消化系统后，经过胃消化和肠消化以及转运过程才能最终被人体吸收消化。当人体缺乏维生素B12时会导致恶性贫血、老年痴呆及精神抑郁等疾病。因此，维生素B12是人体健康的一种至关重要的营养物质。
目前食品中维生素的测定方法较多，包括微生物法、比色法、原子吸收法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法等。其中微生物法(《GB5413.14-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12》)灵敏度高，但培养时间长、操作繁琐等缺点，大部分的检验机构不能较好地开展。原子吸收法受基质钴元素的影响可使结果不准确。
现有技术《GB5009.285-2022食品国家安全标准食品中维生素B12的测定》中第一法液相色谱法与第二法液相色谱-质谱法，均采用维生素B12免疫亲和柱净化，富集后再进行分析检测，该方法利用抗原抗体特异性结合原理，样本净化更纯净，检测灵敏度高，可微量测定等优点，但本方法样品前处理时需要使用氰化钾或氰化钠剧毒化学试剂，并需要酶解，检测时间较长，剧毒试剂对人体的健康存在危害。
张迎周等人发明的专利202011475887《测定婴幼儿食品和乳粉中维生素B12添加量的液相色谱法》中样品检测时5g样品加20ml水溶解，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH值至4.3±0.2后提取，然后定容至100ml，取10ml样品溶液过柱，虽然缩短了过柱时间，但增加了调节pH的步骤，一般免疫亲和柱过柱pH范围的最佳选择在6-8之间，调节pH值4.3仅用水定容到100ml对pH值改变很小，样液通过免疫亲和柱时会影响抗原抗体的结合能力。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种维生素B12定量检测方法，解决维生素B12检测时间长，降低有毒有害危险化学品的使用，简单提取，利用免疫亲和柱净化提高检测效率。
一种维生素B12定量检测方法，采用2个浓度的加标回收试验，平行测定2次，检验样品添加回收率与精密度，具体实验步骤如下：
S101：标准溶液配制；
S102：设定色谱条件；
S103:标准曲线绘制；
S104：检出限和定量限；
S105：精密度与回收率实验；
其特征在于：所述实验中的试剂包括磷酸盐溶液，所述的磷酸盐溶液的配制方法为：0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73gNa2HPO4·12H2O+9gNaCl，将蒸馏水溶解并定容至1000ml，混匀。
进一步，所述步骤S101的方法如下：
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至1、5、10、50、100、500ng/ml。
进一步，所述步骤S102中的条件如下：
色谱柱：Athena C18，120A，柱体参数为4.6×150mm，5μm；
流动相：乙腈：水＝15:85，单位为：v/v；
流速：0.5ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL；
紫外检测器，检测波长：361nm。
进一步，所述步骤S103标准曲线绘制过程如下：
将质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列进行测定，以维生素B12的峰面积为纵坐标，以其相应质量浓度为横坐标绘制标准曲线。
进一步，所述步骤S104检出限和定量限计算过程如下：
以3倍信噪比计算方法得出检出限为0.2μg/kg，10倍信噪比计算方法得出定量限为0.5μg/kg。
进一步，所述步骤S105的精密度与回收率实验方法如下：
选择待测样品为基质，对样品添加两个浓度进行加标回收率实验，平行测定6次，检测出基质加标维生素B12回收率和相对标准偏差。
本发明还提供一种维生素B12定量检测中快速绘制标准曲线的方法，具体方法如下：
根据实施例1所述的一种维生素B12定量检测方法，通过步骤S103获取历史标准曲线结果，再进行如下实验步骤：
S201：配制单点质量浓度的标准溶液；
S202：设定色谱条件；
S203：根据所述的历史标准曲线结果绘制当前标准曲线；
S204：根据绘制当前标准曲线检测待测样品质量浓度。
进一步，所述步骤S201的方法如下：
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至50ng/ml。
进一步，所述步骤S203标准曲线绘制过程如下：
将质量浓度为50ng/ml的维生素B12标准工作溶液进行测定，获取质量浓度为50的维生素B12标准工作溶液的峰面积，再通过如下公式计算1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12的峰面积：
S当前＝C当前×S历史÷C历史
其中，C当前为当前维生素B12的浓度值，具体分别为1、5、10、50、100、500ng/ml，C历史历史上维生素B12的浓度值，具体为50ng/ml，S当前为质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积，S历史为质量浓度为50ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积；
将质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列为绘制标准曲线的横坐标，以对应维生素B12的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明方法用PBS溶液直接超声提取，具体操作样品称取后加入PBS溶液混匀超声30分钟，离心5分钟后稀释过滤，收集滤液用免疫亲和柱净化；
本发明替代了国标中添加氰化钾溶液，用胃蛋白酶、淀粉酶酶解的方法，国标方法酶解需要在37℃中酶解30分钟(肉及制品需要1小时)，然后再转入100℃水浴30分钟，在放置室温，将样品溶液转入100ml容量瓶定容至刻度摇匀，取40ml于50ml离心管中离心，此过程需要时长总计约2-3小时；
本发明创造的有益效果是：实验所使用提取试剂无毒害，最大限度减少有毒有害试剂的使用，降低对实验人员的危害，样品前处理提取简便快捷，缩短了检测时间，提高了检测效率。
本发明还将标准曲线的检测和绘制进行简化，并且仍能达到相应的检测准确度，缩短了检测时间，提高了检测效率，创造性的用质量浓度的等比关系与标准曲线的绘制结合起来，解决了每次实验都需要重新检测多个点的质量浓度的问题。
附图说明
图1是50μg/L维生素B12标准溶液的色谱图；
图2是婴幼儿配方奶粉中维生素B12的检出色谱图；
图3是婴幼儿配方奶粉中添加维生素B12(20ug/kg)的检出色谱图；
图4是幼儿配方米粉中维生素B12的检出色谱图；
图5是幼儿配方米粉中添加维生素B12(40ug/kg)的检出色谱图；
图6是一种维生素B12定量检测方法的实验步骤图；
图7是一种维生素B12定量检测中快速绘制标准曲线的方法的实验步骤图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明选择幼儿配方奶粉与幼儿配方米粉做样品添加回收实验，具体实验过程如下：
取婴幼儿配方奶粉、幼儿配方米粉样品，进行2个浓度的加标回收试验，平行测定2次，检验样品添加回收率与精密度。
实施中涉及到的仪器与试剂如下：
维生素B12免疫亲和柱(河北伊莱莎生物有限公司)；
岛津LC-20A系列高效液相色谱，配紫外检测器；
涡旋混合器(新宝仪器，XH-T)
多管振荡器(杭州佑宁仪器HD-2500)
氮吹仪(莱普特科学仪器NG150-1)
色谱柱(4.6×150mm，4.5μm)(上海安普公司)；
维生素B12标准品(纯度99％)购自Sigma公司；
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自韩国德山药品工业(株)；
磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯)、氯化钠(分析纯)均购自国药集团；
试验用水：娃哈哈瓶装纯净水。
磷酸盐溶液(PBS)：0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73gNa2HPO4·12H2O+9gNaCl，蒸馏水溶解并定容至1000ml，混匀。
如图6所示，实验步骤如下：
S101：标准溶液配制；
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至1、5、10、50、100、500ng/ml；
S102：色谱条件：
色谱柱：Athena C18，120A，(4.6×150mm，5μm)；
流动相：乙腈：水＝15:85(v/v)
流速：0.5ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL。
紫外检测器，检测波长：361nm，
S103:标准曲线绘制：
将质量浓度分别为1、5、10、、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列进行测定，以维生素B12的峰面积为纵坐标，以其相应质量浓度为横坐标绘制标准曲线。维生素B12在1-100ng/ml范围内与相应峰面积呈线性关系，相关系数(R2)为0.9999。
S104：检出限和定量限：
以3倍信噪比计算方法得出检出限为0.2μg/kg，10倍信噪比计算方法得出定量限为0.5μg/kg。
S105：精密度与回收率实验：
选择幼儿配方奶粉与配方米粉样品为基质，分别添加两个浓度进行加标回收率实验，平行测定6次，结果见表1。由表1可见两种基质加标维生素B12回收率为91.3％-94.4％，相对标准偏差(RSD)在0.5％-2.2％范围内。该方法具有良好的准确度与精密度，满足样品添加回收的质量要求，方法可应用。
表1：样品加标回收率与精密度
实施例2
为了更好的说明一种维生素B12定量检测方法的方法的优越性，采用样品检测与比对实验进行说明，具体如下：
对比案例：将实施例中样品，按照《GB5009.285-2022食品安全国家标准食品中维生素B12的测定》中的高效液相测定法测定方法进行测定。
S201：提取：
称取样品3g于50ml离心管中，加入30ml上述PBS溶液；振摇充分溶解，超声20分钟，高速震荡5分钟；4000转速离心5分钟；配方奶粉取中间清液15ml加入15ml PBS混匀，米粉取中间清液加入30ml PBS混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，滤液待净化。
S202净化：
将维生素B12免疫亲和柱与10ml注射器连接；将处理好待净化的样液20ml分别加入注射器，缓慢通过免疫亲和柱；样液全部通过后，用10ml纯水淋洗免疫亲和柱；液体全部流完后，让空气通过柱管，吹干水分；取3ml甲醇缓慢洗脱亲和柱，收集全部洗脱液，50℃下氮气吹干；1ml流动相复溶样品，涡旋1分钟，过0.45um针式滤膜上液相检测，测定结果见表2。
表2：实施例1与高效液相测定法测定的结果对比：
由表2可知，以上方法比对的测定结果，本发明方法测定的结果更加稳定(RSD值＜3％)，《GB5009.285-2022》中第一法的液相色谱法的检测结果偏差较大(RSD＞5％)，并且实验过程需加入氰化钾试剂，有中毒风险，需格外谨慎，酶解过程需加热，更容易释放氰化氢气体，100℃水浴时，如样品封闭太紧很容易让样品产生气体，使瓶塞爆开，造成有害气体散发及安全隐患。
本发明方法前处理只用加入PBS溶液提取，仅超声震荡即可满足提取率，最多需要30分钟，而背景技术中的方法需经过酶解、水浴、冷却至少需要2小时，本发明方法操作更简单快捷，非常适用与实验室对食品中维生素B12的检测。
实施例3：
具体检测步骤实施例1相同，如图7所示，但与实施1的区别点在于步骤S101：标准溶液配制过程，本实施采用如下方式：
通过步骤S103获取历史标准曲线结果，再进行如下实验步骤：
S201：配制单点质量浓度的标准溶液；
S202：设定色谱条件；
S203：根据所述的历史标准曲线结果绘制当前标准曲线；
S204：根据绘制当前标准曲线检测待测样品质量浓度。
步骤S201的方法如下：
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至50ng/ml；
只需测出标准工作液检测点50ng/ml的峰面积，再结合实施1中标准曲线中50ng/ml的值来计算其他点的值，两者之间的差值比，确定当前的标准曲线。
S当前＝C当前×S历史÷C历史
其中，C当前为当前维生素B12的浓度值，具体分别为1、5、10、50、100、500ng/ml，C历史历史上维生素B12的浓度值，具体为50ng/ml，S当前为质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积，S历史为质量浓度为50ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积。
采用上述公式可以快速的将质量浓度分别为1、5、10、、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列的峰面积求出，绘制出标准曲线。
例如计算100ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列的峰面积，可将以下已知条件代入：C当前＝100ng/ml，C历史＝50ng/ml，S历史为50ng/ml的维生素B12的峰面积，通过上面的公式即可求出S当前，即100ng/ml的维生素B12的峰面积。
通过上述方式，可以快速的将标准曲线建立，而无须对多个维生素B12标准工作溶液系列进行测定，缩短检测时间，提高检测效率，减少工作溶液浪费。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种维生素B12定量检测方法，采用2个浓度的加标回收试验，平行测定2次，检验样品添加回收率与精密度，具体实验步骤如下：
S101：标准溶液配制；
S102：设定色谱条件；
S103:标准曲线绘制；
S104：检出限和定量限；
S105：精密度与回收率实验；
其特征在于：所述实验中的试剂包括磷酸盐溶液，所述的磷酸盐溶液的配制方法为：0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73gNa2HPO4·12H2O+9gNaCl，将蒸馏水溶解并定容至1000ml，混匀。
2.根据权利要求1所述的一种维生素B12定量检测方法，其特征在于：所述步骤S104检出限和定量限计算过程如下：
以3倍信噪比计算方法得出检出限为0.2μg/kg，10倍信噪比计算方法得出定量限为0.5μg/kg。
3.根据权利要求1所述的一种维生素B12定量检测方法，其特征在于：所述步骤S105的精密度与回收率实验方法如下：
选择待测样品为基质，对样品添加两个浓度进行加标回收率实验，平行测定6次，检测出基质加标维生素B12回收率和相对标准偏差。
4.根据权利要求1所述的一种维生素B12定量检测方法，其特征在于：所述步骤S103标准曲线绘制过程如下：
将质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列进行测定，以维生素B12的峰面积为纵坐标，以其相应质量浓度为横坐标绘制标准曲线。
5.根据权利要求4所述的一种维生素B12定量检测方法，其特征在于：所述步骤S101的方法如下：
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至1、5、10、50、100、500ng/ml。
6.根据权利要求4所述的一种维生素B12定量检测方法，其特征在于：所述步骤S102中的条件如下：
色谱柱：Athena C18，120A，柱体参数为4.6×150mm，5μm；
流动相：乙腈：水＝15:85，单位为：v/v；
流速：0.5ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL；
紫外检测器，检测波长：361nm。
7.一种维生素B12定量检测中快速绘制标准曲线的方法，其特征在于：根据权利要求4-6任一所述的一种维生素B12定量检测方法，通过步骤S103获取历史标准曲线结果，再进行如下实验步骤：
S201：配制单点质量浓度的标准溶液；
S202：设定色谱条件；
S203：根据所述的历史标准曲线结果绘制当前标准曲线；
S204：根据绘制当前标准曲线检测待测样品质量浓度。
8.根据权利要求7所述的一种维生素B12定量检测中快速绘制标准曲线的方法，其特征在于：所述步骤S201的方法如下：
维生素B12标准储备液(1mg/ml)：准确称取1mg纯度折算为100％质量维生素B12标准品，加入1ml甲醇溶解，摇匀，避光冷藏保存；
维生素B12标准中间液(10mg/L)：准确移取标准储备液100μL至100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，避光保存；
维生素B12标准工作液：将标准中间液用流动相纯水与乙腈体积比15:85梯度稀释至50ng/ml。
9.根据权利要求7所述的一种维生素B12定量检测中快速绘制标准曲线的方法，其特征在于：所述步骤S203标准曲线绘制过程如下：
将质量浓度为50ng/ml的维生素B12标准工作溶液进行测定，获取质量浓度为50的维生素B12标准工作溶液的峰面积，再通过如下公式计算1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12的峰面积：
S当前＝C当前×S历史÷C历史
其中，C当前为当前维生素B12的浓度值，具体分别为1、5、10、50、100、500ng/ml，C历史历史上维生素B12的浓度值，具体为50ng/ml，S当前为质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积，S历史为质量浓度为50ng/ml的维生素B12标准工作溶液的峰面积；
将质量浓度分别为1、5、10、50、100、500ng/ml的维生素B12标准工作溶液系列为绘制标准曲线的横坐标，以对应维生素B12的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5310656A (en) * | 1989-06-26 | 1994-05-10 | Tritech Partners | Vitamin B12 assay |
| US5506109A (en) * | 1989-06-26 | 1996-04-09 | Bayer Corporation | Vitamin B12 assay |
| CN104458976A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种维生素b12在线免疫亲和净化柱及其使用方法 |
| CN106693443A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-24 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种维生素b12适配体亲和柱及其制备方法和用途 |
| CN109709253A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-03 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 |
| CN112697911A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-23 | 普研（上海）标准技术服务股份有限公司 | 测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12添加量的液相色谱法 |
-
2023
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5310656A (en) * | 1989-06-26 | 1994-05-10 | Tritech Partners | Vitamin B12 assay |
| US5506109A (en) * | 1989-06-26 | 1996-04-09 | Bayer Corporation | Vitamin B12 assay |
| CN104458976A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种维生素b12在线免疫亲和净化柱及其使用方法 |
| CN106693443A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-24 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种维生素b12适配体亲和柱及其制备方法和用途 |
| CN109709253A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-03 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 |
| CN112697911A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-23 | 普研（上海）标准技术服务股份有限公司 | 测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12添加量的液相色谱法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| HEUDI, O等: "Determination of vitamin B12> in food products and in premixes by reversed-phase high performance liquid chromatography and immunoaffinity extraction", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 1101, 6 January 2006 (2006-01-06), pages 63 - 68, XP024968405, DOI: 10.1016/j.chroma.2005.09.059 * |
| PARK, JM等: "Development of Pretreatment Method for Analysis of Vitamin B12> in Cereal Infant Formula using Immunoaffinity Chromatography and High-Performance Liquid Chromatography", FOOD SCIENCE OF ANIMAL RESOURCES, vol. 41, no. 02, 1 March 2021 (2021-03-01), pages 335 - 342 * |
| 励炯;林伟杰;曹青文;金朦娜;: "免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中的维生素B_(12)总量", 营养学报, no. 01, 29 February 2020 (2020-02-29), pages 72 - 77 * |
| 吴楠;姜金斗;陶大利;张永胜;: "免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定乳粉中维生素B_(12)含量", 分析测试学报, no. 03, 25 March 2013 (2013-03-25), pages 389 - 392 * |
| 周黎;余以刚;徐红;黄焯枝;郭文婷;郭伟鹏;: "免疫亲和柱―超高效液相色谱法测定维生素饮料中维生素B_(12)", 中国食物与营养, no. 03, 28 March 2018 (2018-03-28), pages 27 - 29 * |
| 李贻等: "高效液相色谱法检测婴幼儿配方食品中维生素B12的含量", 食品安全质量检测学报, vol. 12, no. 08, 25 April 2021 (2021-04-25), pages 3306 - 3312 * |
| 许秀敏;高燕红;龙朝阳;黄湘东;鲁琳;李晖;: "免疫亲和柱-高效液相色谱法测定营养型固体饮品中维生素B_(12)", 中国职业医学, no. 1, 20 August 2011 (2011-08-20), pages 62 - 63 * |
| 黄娟等: "免疫亲和-HPLC法测定婴幼儿配方乳粉中维生素B12", 中国食物与营养, vol. 21, no. 11, 28 November 2015 (2015-11-28), pages 71 - 73 * |
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