CN104458976A

CN104458976A - 一种维生素b12在线免疫亲和净化柱及其使用方法

Info

Publication number: CN104458976A
Application number: CN201410758483.1A
Authority: CN
Inventors: 赵孔祥; 何佳; 宓捷波; 陈旭艳; 郑文杰
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明涉及一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法。本发明属于维生素检测技术领域。维生素B12在线免疫亲和净化柱，装填偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。使用方法：（1）上样：净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和净化柱；分析柱处于初始流动相平衡阶段；（2）转移：净化泵提供乙腈/水，免疫亲和净化柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；（3）分析与平衡：免疫亲和净化柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入检测仪。本发明具有多次使用，自动净化，检测时间短，检测效率高等优点。

Description

一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法

技术领域

本发明属于维生素检测技术领域，特别是涉及一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法。

背景技术

目前，免疫亲和层析是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的SPE技术,根据抗原抗体的高选择性,从复杂的待测样品中提取目标化合物。它具有高选择性及高亲和性，目前，在真菌毒素、兽药残留、微量维生素分析中作为前处理净化手段应用越来越广泛。但是由于商品化的免疫亲和净化柱只能使用一次，且价格较高，阻碍了其在实际检测工作的使用。现有的检测方法存在检测成本高，手工操作，检测时间长，检测效率低等技术问题。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法。

本发明提供一种B12在线免疫亲和净化柱，该净化色谱柱不仅能重复使用，而且通过与液相色谱或液相色谱-串联质谱的联用，实现样品的净化、分析的自动化。

本发明能在线、重复使用，可净化维生素B12。将该免疫亲和净化柱通过阀切换连接到具有双泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪上，通过上样、转移和分析与平衡等步骤实现维生素B12的在线免疫亲和净化测定。

本发明的目的之一是提供一种具有免疫亲和净化柱可以多次使用，降低检测费用，缩短了检测时间，简化了检测步骤等特点的B12在线免疫亲和柱。

本发明B12在线免疫亲和净化柱所采取的技术方案是：

一种B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：免疫亲和柱中装填偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。

本发明B12在线免疫亲和净化柱还可以采用如下技术方案：

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：免疫亲和柱为圆柱形不锈钢填充柱，圆柱形不锈钢填充柱直径为2－6mm，长度为20－30mm。

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：圆柱形不锈钢填充柱装有双液相泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪及连接阀。

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：双液相泵为净化泵和洗脱泵，净化泵为免疫亲和柱输送液体，洗脱泵为分析柱输送液体。

本发明的目的之二是提供一种具有操作方便，降低检测费用，手动净化方式改为自动净化，节省了人力，缩短了检测时间，简化了检测步骤，检测效率高等特点的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法。

本发明B12在线免疫亲和净化柱的使用方法所采取的技术方案是：

一种B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：B12在线免疫亲和净化柱一端连接净化泵，另一端连接六通阀，洗脱泵与六通阀连通，六通阀连通分析柱，分析柱连接检测仪，切换六通阀实现免疫亲和净化柱与分析柱的串联或并联；其使用过程包括以下步骤：

(1)上样：六通阀使免疫亲和净化柱与分析柱独立，净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和，B12被吸附，杂质被吸附而随上样液进入废液；分析柱处于初始流动相平衡阶段；

(2)转移：通过六通阀切换，免疫亲和净化柱与分析柱串联使用，净化泵提供乙腈/水，免疫亲和柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；

(3)分析与平衡：免疫亲和净化柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入检测仪，实现B12的检测。

本发明B12在线免疫亲和净化柱的使用方法还可以采用如下技术方案：

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：检测仪为液相色谱检测仪或串联质谱检测仪。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：上样及平衡溶液为pH 7.2至pH 7.6的磷酸盐缓冲液，流速1.8－2.2mL/min。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：转移溶剂为体积比为1：1的乙腈/水，转移流速0.4－0.8mL/min，转移时间3－5min。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：分析柱为4.6mm*100mm粒径为3μm的C18填料的色谱柱，操作条件采用甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.5－0.7mL/min。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明B12在线免疫亲和净化柱及净化方法，它是净化柱通过阀切换连接到具有双泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪上。双泵分别为净化色谱柱和分析柱输送液体。它通过液相泵不同阶段提供不同的流动相，完成上样、转移和分析与平衡步骤，实现B12的在线免疫亲和净化检测。本发明的免疫亲和净化柱可重复使用，在线免疫亲和净化方法实现了样品纯化及分析的自动化。

附图说明

图1是维生素B12在线免疫亲和净化柱结构示意图；

图2是本发明上样、分析与平衡步骤的管路连接示意图；

图3是本发明转移步骤的管路连接示意图。

图中，1－柱接头，2－螺母，3－柱管，4－琼脂糖凝胶，5－垫圈，6－筛板，1’－净化泵，2’－色谱柱，3’－六通阀，4’－废液，5’－洗脱泵，6’－分析柱，7’－检测器。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：

实施例1

参阅附图1。

一种维生素B12在线免疫亲和净化柱，为圆柱形不锈钢填充柱，圆柱形不锈钢填充柱直径为2－6mm，长度为20－30mm。免疫亲和净化柱中装填偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。圆柱形不锈钢填充柱装有双液相泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪的连接阀。

制作过程：将偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶装填于2.1-4.6mm×20-30mm的不锈钢填充柱中，填充柱两端用筛板密封，制成在线免疫亲和净化柱。

实施例2。

参阅附图1至图3。

一种B12在线免疫亲和净化色谱柱的使用方法：B12在线免疫亲和净化色谱柱一端连接净化泵，另一端连接六通阀，洗脱泵与六通阀连通，六通阀连通分析柱，分析柱连接检测仪，切换六通阀实现免疫亲和净化柱与分析柱的串联或并联；其使用过程包括以下步骤：

(1)上样：六通阀使免疫亲和净化柱与分析柱独立，净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和净化柱，B12被吸附，杂质被吸附而随上样液进入废液；分析柱处于初始流动相平衡阶段；

(2)转移：通过六通阀切换，免疫亲和净化柱与分析柱串联使用，净化泵提供乙腈/水，免疫亲和净化柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；

(3)分析与平衡：免疫亲和净化色谱柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入液相色谱检测仪或串联质谱检测仪，实现B12的检测。

完成在线净化的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪需要配备两个液相泵(净化泵、洗脱泵)以及一套切换阀，净化泵负责为净化柱输送液体，洗脱泵负责为分析柱输送液体，切换阀实现净化柱与分析柱的串联-并联切换。在线净化操作需要上样、转移和分析与平衡三步。B12免疫亲和净化柱净化泵操作条件为：上样及平衡溶液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，流速2.0mL/min，转移溶剂为乙腈/水(v/v,1+1),转移流速0.6mL/min，转移时间4min。B12分析柱采用4.6mm*100mm粒径为3μm的C18填料的色谱柱，操作条件采用甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.6mL/min。切换阀控制上样及分析与平衡过程中B12净化柱与分析柱互相独立，并联运行，转移过程中二者串联，使得B12净化柱上洗脱下来的B12进入分析柱。之后被净化泵提供的流动相带入液相检测器或串联质谱检测器中，实现B12的在线免疫亲和净化检测。

本实施例的具体结构及其操作过程：

B12在线免疫亲和净化柱制作：将偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶4手工装填于2.1-4.6mm×20-30mm的不锈钢填充柱管3中，两端用筛板6、柱接头1及螺母2密封，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗平衡1小时，制成B12在线净化柱2’。将该净化柱2’连接到附图中相应的位置。由净化泵1’提供在线净化柱的流动相，通过流动相的变化，实现上样、转移、分析与平衡步骤。上样步骤：净化柱2’与分析柱6’并联，净化泵1’提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入净化柱2’，B12被吸附，杂质为被吸附而随上样液进入废液4’。分析柱处于初始流动相平衡阶段。转移步骤：通过六通阀3’切换，使净化色谱柱2’与分析柱6’串联使用，净化泵1’提供乙腈/水，净化色谱柱2’上富集的B12随洗脱液进入分析柱6’。分析与平衡步骤：六通阀3’切换，净化色谱柱2’与分析柱6’并联，净化色谱柱2’通过净化泵1’依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备。分析柱6’通过洗脱泵5’提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入液相色谱检测器或串联质谱检测器7’，实现B12的检测。

Claims

1.一种维生素B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：免疫亲和净化柱中装填偶联有 B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。

2. 根据权利要求1所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：免疫亲和净化柱为圆柱形不锈钢填充柱，圆柱形不锈钢填充柱直径为2－6mm,长度为20－30mm。

3.根据权利要求2所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：圆柱形不锈钢填充柱装有双液相泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪及连接阀。

4.根据权利要求3所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：双液相泵为净化泵和洗脱泵，净化泵为免疫亲和柱输送液体，洗脱泵为分析柱输送液体。

5.根据权利要求1所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：B12在线免疫亲和净化柱一端连接净化泵，另一端连接六通阀，洗脱泵与六通阀连通，六通阀连通分析柱，分析柱连接检测仪，切换六通阀实现免疫亲和净化柱与分析柱的串联或并联；其使用过程包括以下步骤：

上样：六通阀使免疫亲和净化柱与分析柱独立，净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和净化柱，B12被吸附，杂质被吸附而随上样液进入废液；分析柱处于初始流动相平衡阶段；

转移：通过六通阀切换，免疫亲和净化柱与分析柱串联使用，净化泵提供乙腈/水，免疫亲和谱柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；

分析与平衡：免疫亲和净化柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入检测仪，实现B12的检测。

6.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：检测仪为液相色谱检测仪或串联质谱检测仪。

7.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：上样及平衡溶液为pH 7.2至pH 7.6的磷酸盐缓冲液，流速1.8－2.2 mL/min。

8.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：转移溶剂为体积比为1：1的乙腈/水，转移流速0.4－0.8mL/min，转移时间3－5 min。

9.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：分析柱为4.6mm*100mm粒径为3μm的C18填料的色谱柱，操作条件采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.5－0.7 mL/min。