CN101446575B - 一种微囊藻毒素-lr多抗免疫亲和柱的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)多抗免疫亲和柱(IAC)的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及微囊藻毒素(MC)检测技术领域。本发明所研制的IAC是将MC-LR多抗固定于柱中，从而吸附样品溶液中的MC-LR，洗脱后起到富集和净化的效果，然后进HPLC进行定性定量分析。作为前处理过程，IAC富集优于现有的固相萃取(SPE)法。在HPLC图中显示MC-LR多抗IAC能将MC-LR的峰与其它杂质峰分开，不至影响测定结果，而SPE净化由于杂质太多，MC-LR峰甚至难以分辨。由于MC-LR多抗与MC-LR能够特异性结合使IAC有很好的特异性，一次净化能除去绝大部分干扰物。而SPE无特异性，不能除去干扰物，会影响最后的测定结果。
Description
技术领域
一种微囊藻毒素-LR多抗免疫亲和柱的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及微囊藻毒素检测技术领域。
背景技术
随着工农业的发展和城市化进程的加快，工业和生活污水进入水环境中，导致水体富营养化程度加剧。水中氮磷等含量增加，引起有毒蓝藻水华的频繁发生。近年来，我国的饮用水源地如太湖、巢湖、滇池等湖泊，一些水库、河流等均受到蓝藻水华的侵袭。2007年4月发布的《长江保护与发展报告》称，2003年三峡库区蓄水至135米之后，12条长江一级支流在回水区不同程度地出现“水华”现象，并且近几年有加剧的趋势。
蓝藻水华腐烂后将毒素释放于水中，其中最主要的是微囊藻毒素(以下简称MC)。MC是一组环状七肽，一般结构为：环(-D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Y-Adda-D-Glu-Mdha)，其中：L为左旋，D为右旋，X、Y为可变氨基酸。由于XY的不同及MeAsp和Adda的甲基化或去甲基化产生的差异，可以形成多种不同的MC异构体。目前已分离、鉴定出70多种MC。
MC引起野生动物和家畜中毒甚至死亡在世界各地都有报道。MC还是潜在的致癌因子。MC中天然存在最常见的一种微囊藻毒素-LR(以下简称MC-LR)已被发现是蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制剂。此抑制作用是因为毒素与酶之间在肝中通过共价键和非共价键产生特异性结合而引起的。在小鼠实验中发现MC-LR是潜在的肿瘤促进因子。1996年巴西发生透析液受MC污染的事故，造成50多人死亡。考虑到饮水安全，WHO和我国GB5749-2006生活饮用水卫生标准规定饮用水中MC-LR的限量为1μg/L。
免疫亲和柱(IAC)是利用免疫亲和层析原理制作的分离分析预装柱。由于抗体与抗原作用具有高度专一性，因此通过IAC净化能够去除绝大部分杂质。IAC技术已日渐成熟，在与藻毒素类似的真菌毒素的检测中已广泛应用，其中黄曲霉毒素的免疫亲和层析已被列入国标中(GB18980-2003和GB18979-2003)。
目前水中MC-LR的检测常用HPLC和LC-MS法，因含量低，在进样前，一般用固相萃取柱(SPE)富集，但是SPE无特异性，水中杂质多，富集后会引入许多杂质，干扰检测结果，特别是HPLC法，有时测定值与实际值相去甚远。LC-MS法虽然检测限低，测定结果较准确，但是价格昂贵，一般实验室没有。
利用本发明所研制的IAC，通过一次净化即可除去绝大部分杂质，直接进HPLC就能获得准确的结果，而一般县市级疾控中心都有HPLC，能够满足MC-LR日常监测的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种MC-LR多抗免疫亲和柱的制备和使用方法，所研制的IAC是将MC-LR的多抗固定于柱中，从而吸附样品溶液中的MC-LR，洗脱后起到富集和净化的效果，然后进HPLC进行定性定量分析。作为前处理过程，IAC富集优于现有的SPE法。
本发明的技术方案：一种MC-LR多抗免疫亲和柱的制备方法：
(1)以MC-LR与牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到的偶联物(以下简称MC-LR-BSA)作为人工抗原，兔疫获得MC-LR抗血清，再采用饱和硫酸铵二步沉淀法纯化获得MC-LR多抗；
(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose 4B，活化过程如下：
(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；
(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；
(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3抽洗；
(3)MC-LR多抗免疫亲和柱的制备：
MC-LR多抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得MC-LR多抗免疫亲和柱，操作步骤如下：
(d)偶联
将上述制备纯化好的MC-LR多抗置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR多抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍MC-LR多抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的MC-LR多抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC-LR多抗的量；
(e)封闭活性基团
将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
(f)洗涤
步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；
(g)防腐处理
步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密闭保存；
(h)装柱
将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR多抗IAC；
(i)保存
琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR多抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；
(j)柱的再生
柱使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。
用所述方法制备的MC-LR多抗IAC，应用于实际水样中MC-LR的测定。取0.2L受蓝藻污染的水样先通过0.45μm微孔滤膜过滤；IAC先依次用5mL甲醇，5mL蒸馏水，5mL PBS预处理；滤液过预处理后的MC-LR多抗IAC；再依次用5mL PBS、5mL蒸馏水、5mL 10％甲醇淋洗杂质；最后用5mL纯甲醇洗脱；洗脱液减压蒸干，残留物用0.2mL PBS溶解后进HPLC分析；同时用固相萃取柱做对照实验；
HPLC的测定条件：仪器为Waters 600高效液相色谱仪配合Waters 996二极管阵列检测器；色谱柱为Kromasil 100-5C18，150×4.6mm，5μm；流动相为含0.05％甲酸的去离子水∶乙腈体积比为60∶40，流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量20μL；检测波长为240nm。
本发明的有益效果：MC-LR多抗免疫亲和柱能将MC-LR与其它杂质分离。在HPLC图中显示MC-LR的峰与其它杂质峰分开，不至影响测定结果，而一般SPE净化由于杂质太多，在HPLC图中MC-LR峰甚至难以分辨。由于MC-LR多抗与MC-LR能够特异性结合使IAC有很好的特异性，一次净化能除去绝大部分干扰物。而SPE无特异性，不能除去干扰物，会影响最后的测定结果。
附图说明
图1MC-LR标样HPLC谱图。
图2MC-LR多抗免疫亲和柱净化水样HPLC谱图。
图3固相萃取柱净化水样HPLC谱图。
具体实施方式
MC-LR与牛血清白蛋白(BSA)偶联物，以下简称MC-LR-BSA；MC-LR与卵清蛋白(OVA)偶联物，以下简称MC-LR-OVA。
实施例1：MC-LR多抗的制备
1、完全抗原的合成
(1)MC-LR-BSA免疫原的合成
完全抗原MC-LR-BSA的合成采用水溶性碳二亚胺法，利用1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)作为“桥联剂”，使MC-LR的羧基(-COOH)与EDC反应生成中间产物，再与BSA蛋白分子上的氨基反应，制成完全抗原MC-LR-BSA偶联物作为免疫原。合成方法如下：
0.5mg MC-LR溶于0.5mL甲醇，分为0.25mL的两等份，通氮气，在35℃下挥发至干。一份含有0.25mg MC-LR的残余物溶于1mL PBS(pH7.4)缓冲液中，加入5mg EDC，振荡至完全溶解，用0.1M盐酸溶液将pH值调至5，室温下缓慢搅拌5min。将1.4mg BSA溶于3mL PBS缓冲液中，振荡至完全溶解，然后逐滴加入上述MC-LR溶液中，在室温下保持1h。然后4℃下过夜。将混合物于4℃下在0.1mol/L pH7.4的PBS中透析72h，每隔6h换透析液1次。冷冻干燥后于-20℃保存。
(2)MC-LR-OVA检测抗原的合成
用混合酸酐法完成MC-LR与载体蛋白OVA的交联，合成MC-LR-OVA完全抗原作为检测抗原。合成方法如下：
一份含有0.25mg MC-LR的残余物加入0.5mL 1，4-dioxane，振荡使其溶解，再加入7μL氯甲酸异丁酯和12μL三丁胺，将此混合物轻微振荡然后在4℃下保持30min。0.9mg OVA溶于3mL碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0)中。将上述MC-LR溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0。然后，将混合物于4℃下在0.1mol/L pH7.4的PBS中透析72h，每隔6h换透析液1次。冷冻干燥后于-20℃保存。
2、MC-LR多抗的制备与纯化
用合成的MC-LR-BSA作为免疫原，免疫得到MC-LR抗血清。
采用饱和硫酸铵二步沉淀法纯化得到的抗血清，操作如下：
(1)取10mL抗血清与等体积的PBS(pH7.4)混合，搅拌下逐滴加入10mL饱和硫酸铵，4℃过夜，使免疫球蛋白充分沉淀。
(2)4000g离心20min，弃去上清。用10mL PBS溶解沉淀，再逐滴加入5mL饱和硫酸铵溶液，4℃过夜。
重复第二步过程一次。用10mL PBS溶解末次离心所得沉淀物装入透析袋。4℃透析三天充分除盐(每天换液4次)。透析纯化的蛋白质冷冻干燥后即为MC-LR多抗，将其保存在-20℃下。
实施例2：琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化
用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose 4B。溴化氰法活化效果好、偶联率高、对抗体影响小，活化过程如下：
(1)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌。
(2)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批倒入琼脂糖中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5左右。待溴化氰完全反应完全，pH基本保持不变，即可停止搅拌。
(3)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3抽洗。
实施例3：MC-LR多抗IAC的制备
MC-LR多抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得MC-LR多抗免疫亲和柱，操作步骤如下：
(1)偶联
将上述制备纯化好的MC-LR多抗置于pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3缓冲液的偶联缓冲液中透析12h。将上述活化好的Sepharose 4B凝胶置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR多抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程。用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的抗MC-LR多抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物。收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC-LR多抗的量。
(2)封闭活性基团
将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团。
(3)洗涤
步骤(2)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用5倍偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次。然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次。
(4)防腐处理
步骤(3)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密闭保存。
(5)装柱
将步骤(3)或(4)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在一定负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR多抗IAC。
(6)保存
琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内。
(7)柱的再生
柱使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。
实施例4：湖水水样中MC-LR的检测
1、HPLC的测定条件
高效液相色谱仪为Waters 600配合Waters 996二极管阵列检测器，色谱柱为Kromasil 100-5C18(150×4.6mm，5μm)，流动相为含0.05％甲酸的去离子水∶乙腈＝60∶40(v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量20μL，检测波长为240nm。
2、实际水样中MC-LR的测定
水样2007年5月份取自太湖水域。0.2L受蓝藻污染的太湖水样先通过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液过制备的MC-LR的多抗和单抗IAC(柱子分别用5mL甲醇，5mL蒸馏水，5mL PBS预处理)。分别用5mL PBS、5mL蒸馏水、5mL10％甲醇淋洗杂质，最后用5mL纯甲醇洗脱。洗脱液减压蒸干，残留物用0.2mLPBS溶解后进HPLC分析。同时用固相萃取柱做对照实验。
图1～3分别为MC-LR标样、MC-LR多抗免疫亲和柱净化水样、固相萃取柱净化水样的HPLC谱图。由图2和图3可知，一次净化的效果，IAC明显优于固相萃取柱(图3杂质峰多于图2)。MC-LR多抗免疫亲和柱能将MC-LR的峰与其它杂质峰分开，不至影响测定结果，而SPE净化由于杂质太多，MC-LR峰甚至难以分辨。由于MC-LR多抗与MC-LR能够特异性结合使IAC有很好的特异性，一次净化能除去绝大部分干扰物。而固相萃取柱无特异性，不能除去干扰物，而影响最后的测定结果。
一份湖水水样，HPLC法检测其中MC-LR的含量。IAC净化，两次平行测定结果为0.209μg/L和0.224μg/L，固相萃取柱净化测定结果为0.032μg/L，测定结果偏差较大。
Claims (2)
1.一种微囊藻毒素-LR多抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是：
(1)以微囊藻毒素-LR，以下简称MC-LR，与牛血清白蛋白BSA偶联，偶联物以下简称MC-LR-BSA，作为人工抗原，免疫获得MC-LR抗血清，再采用饱和硫酸铵二步沉淀法纯化获得MC-LR多抗；
(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化Sepharose 4B，活化过程如下：
(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1MpH 8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；
(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2M NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；
(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1M pH 8.3的NaHCO3抽洗；
(3)微囊藻毒素-LR多抗免疫亲和柱的制备：
MC-LR多抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得MC-LR多抗免疫亲和柱，操作步骤如下：
(d)偶联
将上述制备纯化好的MC-LR多抗置于pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR多抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍MC-LR多抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的MC-LR多抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC-LR多抗的量；
(e)封闭活性基团
将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；
(f)洗涤
步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；
(g)防腐处理
步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存；
(h)装柱
将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成MC-LR多抗免疫亲和柱，即MC-LR多抗IAC；
(i)保存
琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR多抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；
(j)柱的再生
柱使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。
2.权利要求1所述方法制备的MC-LR多抗免疫亲和柱的使用方法，其特征是实际水样中MC-LR的测定，取0.2L受蓝藻污染的水样先通过0.45μm微孔滤膜过滤；IAC先依次用5mL甲醇，5mL蒸馏水，5mL PBS预处理；滤液过预处理后的MC-LR多抗IAC；再依次用5mL PBS、5mL蒸馏水、5mL 10％甲醇淋洗杂质；最后用5mL纯甲醇洗脱；洗脱液减压蒸干，残留物用0.2mLPBS溶解后进HPLC分析；同时用固相萃取柱做对照实验。
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