CN105771940A

CN105771940A - 一种亲和层析介质及其制备方法和用途

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Publication number: CN105771940A
Application number: CN201410838581.6A
Authority: CN
Inventors: 黎健荣; 路玲玉; 胡湘丽
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明公开了一种亲和层析介质及其制备方法和用途。本发明提供的亲和层析介质包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白A，所述重组葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点，可用于蛋白质的分离纯化。

Description

一种亲和层析介质及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种亲和层析介质及其制备方法和用途。

背景技术

随着生物技术的发展，用重组技术制备蛋白药物成为可能，目前人们通过克隆编码抗体基因并将该待表达的基因转化到适宜的表达宿主细胞中培养、纯化，最终获得所需的抗体药物。其中，在抗体药物的制备过程中，抗体蛋白的纯化是最为关键的一环，据统计，抗体药物开发中超过60％的资金都花在下游纯化工艺中，因此，纯化工艺的效能和成本将直接影响药物开发的成功与否。

目前最常用的蛋白质纯化技术是亲和层析技术。亲和层析是利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术，具体地，其是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在亲和层析介质中，当要被分离的蛋白混合液通过亲和层析介质时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在亲和层析介质中，那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，从而达到纯化蛋白质的目的。

ProteinA，也称葡萄球菌蛋白A(StaphylococalProteinA，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年，Jensen也发现了类似现象，将其命名为A抗原；1960年Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A，1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别。ProteinA因其能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段，常被用做蛋白纯化的亲和填料。但是，使用天然的ProteinA制备的亲和层析介质，存在亲和力低、纯化效率低等问题。

随着人们对抗体药物生产制造规模和产品纯度的要求越来越高，开发一种更为高效的亲和层析介质仍是目前所急需的。

发明内容

本发明的发明人经过大量的研究，开发了一种新型的亲和层析介质，其包含固相载体以及固定在该载体上的重组ProteinA，与已有的亲和层析介质相比，其动态吸附载量明显提高。具体地，本发明提供了：

1、一种亲和层析介质，其特征在于，其包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白A。

2、上述1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述重组葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

3、上述2所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。

4、上述3所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶。

5、一种制备上述权利要求1-4任一所述的亲和层析介质的方法，包括步骤：

(1)制备重组葡萄球菌蛋白A；

(2)活化固相载体；

(3)将步骤(1)制备的重组葡萄球菌蛋白A与步骤(2)所得的活化的固相载体进行化学偶联反应，获得亲和层析介质。

6、上述5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述重组葡萄球菌蛋白A制备包括以下步骤：

(1)构建重组葡萄球菌蛋白A基因单体；

(2)构建包含上述步骤(1)所得的基因单体的表达载体；

(3)构建包含上述步骤所得的(2)表达载体的大肠杆菌菌株；

(4)培养上述步骤(3)所得的菌株，纯化获得重组葡萄球菌蛋白A。

7、上述5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述固相载体活化，通过以下方法实现：用环氧氯丙烷、氢氧化钠与固相载体在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干,获得固相载体活化凝胶；

8、上述5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述偶联反应是通过以下方法实现：将步骤(1)所得重组葡萄球菌蛋白A与(2)所得的固相载体活化凝胶，在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到亲和层析介质。

9、一种分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，待纯化的蛋白质经上述1-4任一所述的亲和层析介质填充的亲和层析柱进行纯化。

10、上述9所述方法，其特征在于，所述蛋白质是单克隆抗体，优选人源化抗VEGF单克隆抗体。

本发明的亲和层析介质，其包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白A，其中重组葡萄球菌蛋白A的基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，5‘端由Ala-Asp突变成Val-Asp，以形成AccI酶切位点(GTAGAC)，各重组蛋白A基因单体间以AccI酶切位点相连，其中第一个重组蛋白A基因单体前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和EK酶切位点(将His和DDDDK切去)，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入中止密码子TAA和及克隆用BamHI限制性内切酶接头。该基因由507个核苷酸构成。本发明重组葡萄球菌蛋白A基因序列如SEQIDNo.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

实验结果表明，本发明的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点，与市售的MabSelectSure(美国GE公司)相比，其动态吸附载量明显提高。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，下述实施例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais,T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual,2^ndedition,ColdspringHarborLaboratoryPress.实施例1重组葡萄球菌蛋白A的制备

1、构建重组葡萄球菌蛋白A基因单体

通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段(重复片段序列如SEQIDNO:2所示的第46-192位核苷酸所示)的序列单体，其包括长度为153bp的重复片段，以及前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点、6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)、EK酶切位点(用于将His和DDDDK切去，形成正确的ProteinA)和AccI酶切位点(gtagac，用于连入多个重复片段)。另外，还包括终止密码子TAA，及克隆用BamHI限制性内切酶接头共9bp。标记为“单体1”。

另外，通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段(重复片段序列如SEQIDNO:2的第46-192位核苷酸所示)的序列单体，其序列包括长度为153bp重复片段，以及两端AccI酶切位点。标记为“单体2”。

2、构建重组葡萄球菌蛋白A基因的表达载体

用限制型内切酶NcoI和BamHI酶切实施例1所获得的单体1，然后与经NcoI及BamHI酶切的载体pET32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明葡萄球菌蛋白A基因单体已克隆至pET32a中，从而成功构建含一个葡萄球菌蛋白A基因单体的载体，标记为“pET32a-1”。

将上述步骤1所获得的单体2以AccI酶切，回收相应片段，然后与上述步骤2所构建的pET32a-1载体连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有3个蛋白A基因单体的葡萄球菌蛋白A的表达载体，标记为“pET32a-P”，经检测，pET32a-P表达载体包含如SEQIDNo：2所示基因序列。

3、构建表达重组葡萄球菌蛋白A的大肠杆菌菌株

用CaCl2法将上述步骤2所获得的pET32a-P转化BL21DE3，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET32a-P的重组转化子，标志为“BL21DE3-pET32a-P”。

4、重组葡萄球菌蛋白A的生产与纯化

(1)菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌BL21DE3-pET32a-P，接种于LB培养基中，接种量1～2％V/V，于30℃培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按l:10-1:5接种于发酵培养基上，30℃发酵至O.D600达到0.4～0.8，升温至42℃诱导，3～5小时后离心收菌。

取少量细胞加2×上样缓冲液，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示葡萄球菌蛋白A已诱导可溶表达。

(2)重组葡萄球菌蛋白A的纯化

将步骤(1)收集的菌体用磷酸盐缓冲液(0.2M，pH7.0-8.0，含有0.1MNaCl)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。

将粗提液使用SDS-PAGE电泳检测，结果显示大部分葡萄球菌蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微：将粗提液进行Sephacryl5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组葡萄球菌蛋白A(命名为“ProteinA1”)，其纯度可达90％以上，经检测，ProteinA1氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。

实施例2ELISA法检测重组葡萄球菌蛋白A与抗体结合活性

采用ELISA法检测上述实施例1制备的ProteinA1与抗体结合活性，具体过程如下：

1)包被：在96孔板中每孔包被ProteinA1样品100u1，37℃，1h；

2)封闭：每孔以100u1的1％的BSA封闭，37℃，1h；

3)加一抗：每孔加入约100ug人IgG抗体(购自Mlbio公司)，37℃，1h；

4)加二抗：每孔加入约100u1，1:1000辣根过氧化物酶标记抗体(购自Mlbio公司)，37℃，1h；

5)显色。

同样的方法检测市售ProteinA(购自古朵生物)与抗体结合活性。

ELISA检测结果：本发明的ProteinA1与人IgG抗体结合，每孔包被1.5-3.3ng葡萄球菌蛋白A即可获得明显的检测信号，而市售的ProteinA需每孔包被7.5-10.5ng葡萄球菌蛋白A时才获得明显的检测信号。可见本发明的ProteinA1具有更强的抗体结合活性。

实施例3亲和层析介质的制备

利用实施例1的ProteinA1制备琼脂糖凝胶亲和层析介质，包括以下步骤：

1、琼脂糖凝胶的活化：用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(5％的交联琼脂糖凝胶)在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的琼脂糖凝胶；

2、重组葡萄球菌蛋白A与活化的琼脂糖凝胶的化学偶联：将上述步骤1获得的活化琼脂糖凝胶与实施例1制备的ProteinA1在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗抽干，获得葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析介质。

利用同样的方法制备葡聚糖凝胶亲和层析介质：

1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与葡聚糖凝胶在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的葡聚糖凝胶；

2、将上述步骤1获得的活化葡聚糖凝胶与实施例1制备的ProteinA1在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到葡萄球菌蛋白A葡聚糖凝胶亲和层析介质。

经检测，制备的亲和层析介质特性如表2所示：

表2、亲和层析介质特性

实施例4亲和层析介质分离纯化抗体

使用上述实施例3制备的重组葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析介质从抗体培养液中分离纯化抗体(按照CN02111093.X所述的方法制备人源化抗VEGF单克隆抗体)，具体过程如下：

1、上述实施例3制备的重组葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为l0ml；

2、用缓冲液A(pH7.4的PBS溶液，以下同)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；

3、将2m1人源化抗VEGF单克隆抗体培养液用缓冲液A稀释到20m1，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为lml/min；

4、用缓冲液A再洗5-10个床体积，流速为lml/min；

5、用缓冲液B(pH4.0的20mM柠檬酸缓冲液，其配制方法如下：柠檬酸2.1g加水950m1，用5MNaOH调至pH4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰；

6、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；

7、将分离纯化的人源化抗VEGF单克隆抗体与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析。

(备注：柱子每使用几次后应该用以缓冲液C(pH3.0的0.5M醋酸缓冲液，其配制方法如下：0.5M醋酸溶液用固体NaOH调至pH3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)

另外，使用相同的方法，利用市售MabSelectSure(购自美国GE公司)从培养液中分离纯化抗体(按照CN02111093.X所述的方法制备人源化抗VEGF单克隆抗体)。

SDS-PAGE电泳结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析介质一次纯化获得的人源化抗VEGF单克隆抗体纯度约97.2％，MabSelectSure亲和层析介质一次纯化获得的人源化抗VEGF单克隆抗体纯度约94.5％。实验结果表明，本发明的重组葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析介质纯化效果优于市售产品。

实施例5亲和层析介质对抗体的动态吸附载量的检测

本发明的亲和层析介质与市售MabSelectSure(购自美国GE公司)对抗体动态吸附载量比较(按照CN02111093.X所述的方法制备人源化抗VEGF单克隆抗体)，步骤如下：

1、用缓冲液A(pH7.4的PBS溶液)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；

2、2mg/ml浓度人源化抗VEGF单克隆抗体上样，流速为lml/min，至10％穿透时停止；

3、根据样品浓度、上样体积及柱体积计算出10％穿透时各凝胶的动态吸附载量。

实验结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶对抗体的动态吸附载量为约39.4mg/ml，市售MabSelectSure的动态吸附载量约25mg/ml。

实验结果表明，本发明的亲和层析介质对抗体的动态吸附载量明显高于市售的MabSelectSure亲和层析介质的动态吸附载量，具有更好的纯化效果。

。

Claims

1.一种亲和层析介质，其特征在于，其包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白A。

2.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述重组葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

3.根据权利要求2所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。

4.根据权利要求3所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶。

5.一种制备上述权利要求1-4任一所述的亲和层析介质的方法，包括步骤：

(1)制备重组葡萄球菌蛋白A；

(2)活化固相载体；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述重组葡萄球菌蛋白A制备包括以下步骤：

(1)构建重组葡萄球菌蛋白A基因单体；

(2)构建包含上述步骤(1)所得的基因单体的表达载体；

(3)构建包含上述步骤所得的(2)表达载体的大肠杆菌菌株；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述固相载体活化，通过以下方法实现：用环氧氯丙烷、氢氧化钠与固相载体在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得固相载体活化凝胶。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述偶联反应是通过以下方法实现：将步骤(1)所得重组葡萄球菌蛋白A与(2)所得的固相载体活化凝胶，在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到亲和层析介质。

9.一种分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，待纯化的蛋白质经上述1-4任一所述的亲和层析介质填充的亲和层析柱进行纯化。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述蛋白质是单克隆抗体。