CN101891798A

CN101891798A - 麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法

Info

Publication number: CN101891798A
Application number: CN 201010115477
Authority: CN
Inventors: 徐莺; 蔡峰; 陈放
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2030-03-02
Also published as: CN101891798B

Abstract

本发明公开的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，是将制备的Curcin粗提液先进行脱盐及缓冲液交换并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，然后将收集的组分进行阴离子交换层析并收集上样后穿透组分，再后将收集的穿透组分用缓冲液进行稀释，最后将稀释后的组分溶液进行阳离子交换层析，并收集最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。由于本发明的分离提纯能力高，因而不仅提高了终产物的纯度和活性，终产物得率有所提高，且工艺周期耗时大大缩短，工艺可放大性好，生产成本低，可为Curcin的各种产品研发以及基于Curcin的深入而精细的基础研究提供强有力的支撑。

Description

麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法

技术领域

本发明属于植物天然蛋白质的分离纯化技术领域，具体涉及一种麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法。

背景技术

麻疯树属于大戟科(Euphorbiaceae)油料植物，广泛分布于我国西南地区，是我国重要的资源植物。麻疯树种子含油量高达40％，是理想的生物柴油生产原料，具有良好的应用前景。同时，麻疯树种仁中蛋白质含量也相当丰富。近年已有文献报道，从麻疯树种仁中分离得到了一种毒蛋白，被命名为Curcin。经实验证明，Curcin属于I型核糖体失活蛋白(林娟等，“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”，高技术通讯，2002，11，36-40，现有技术1)。核糖体失活蛋白是一类细胞毒素蛋白，如将其与单克隆抗体结合，制成免疫毒素(immunotoxic)，可大大提高其作用的专一性，有望开发成专一杀伤癌细胞的药物，在癌症治疗方面具有很大的发展潜能(Lin JY，Tserng KY，Chen CC，Lin LT，Tung TC.Abrin and ricin：new anti-tumour substances.Nature1970；227：292-293.)。

随着Curcin的成功分离，对于Curcin的抗肿瘤、抗真菌活性研究也相继展开。抗肿瘤活性的研究显示，Curcin对胃癌细胞系SGC-7901、骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞系(human hepatoma)等三株细胞的蛋白合成有较强的抑制作用(Lin Juan et al，“Antitumor effects of curcin from seeds of Jatropha curcas”，Acta Pharmacologica Sinica，2003，24(3)，241-246)。抗真菌活性的体外研究显示，Curcin对水稻稻瘟病菌、松赤枯病菌、玉米纹枯病菌、油菜菌核病菌等四种农作物病原菌有明显的抑制作用(魏琴等，“麻疯树毒蛋白(Curcin)的抗真菌活性研究”，中国油料作物学报，2004，26(3)，71-75)。这些研究显示，Curcin作为I型核糖体失活蛋白，在癌症治疗、作物育种、农药开发等方面具有很大的开发潜能及广阔的应用前景。因此，Curcin的提取及分离纯化也就显得十分的重要了。

目前，麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法已有报道(林娟等，“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”，高技术通讯，2002，11，36-40)。该方法披露的分离纯化过程简单叙述如下：

将麻疯树种仁加入磷酸缓冲液中浸泡，之后在植物匀浆机上匀浆。4℃下搅拌后离心取上层清液，用60％、95％两个饱和度依次进行硫酸铵沉淀，收集第二次硫酸铵沉淀的沉淀组分，重新溶解于少量磷酸缓冲液，得到Curcin粗提液。粗提液经过透析，最后进行凝胶过滤分离，得到Curcin纯品。

但综合分析上述Curcin分离纯化方法，尚存在以下一些不足：

第一，由于该方法仅采用了凝胶过滤一种层析方法对Curcin粗提液进行蛋白纯化，因而使得终产品Curcin中还含有相当数量的杂蛋白(见图5中的1号泳道)，其纯度尚不能很好的满足基于Curcin的各种毒理、药理等基础研究。

第二，由于该方法使用的凝胶过滤层析流速慢，工艺耗时较长，因而不利于Curcin活性的保持。

第三，根据该方法的描述，其工艺耗时约58小时(透析耗时48小时，凝胶过滤耗时10小时)，因而工艺周期较长，不利于生产成本的控制及终产物活性的保持。

第四，由于该方法采用的凝胶过滤是穿透性层析，要得到理想的分离效果，上样量须小于柱体积的5％。如果工艺需要放大，则不可避免的造成样品体积增大，要维持原有分离效果，就需要大幅增加柱体积以满足上样量的增加。但凝胶过滤填料十分昂贵，柱体积的增加必然造成成本的大幅上升。同时，由于柱体积大幅上升，层析柱也需同步更换为更粗或更长的层析柱，因而势必带来生产成本的大幅上升，所以该方法的可放大性不够。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种终产物活性和纯度高，纯化工艺周期短，工艺可放大性好的麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法，以便为更深入研究开发Curcin在癌症治疗、作物育种、农药开发等方面的应用价值创造必要的条件。

本发明提供的麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法，该方法是将制备的Curcin粗提液先进行脱盐及缓冲液交换并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，然后将收集的组分进行阴离子交换层析并收集上样后穿透组分，再后将收集的穿透组分用缓冲液进行稀释，最后将稀释后的组分溶液进行阳离子交换层析，并收集最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。

上述方法使用的Curcin粗提液是按照林娟等公开的“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”(高技术通讯，2002，11，36-40)中的方法制备的。该Curcin粗提液的电泳结果见图4第2泳道。

该方法中脱盐及缓冲液交换步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用Sephadex G 25 superfine填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。本步骤耗时1小时。

该方法中阴离子交换层析步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用Q Sepharose FF填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。本步骤耗时0.5小时。

该方法中稀释步骤用缓冲液B对阴离子交换层析步骤收集的组分进行稀释，稀释倍数10-30倍，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液。本步骤耗时很短，可忽略不计。

该方法中阳离子交换层析步骤采用具有二元泵混合系统的液相色谱仪，其中A泵输送缓冲液B，B泵输送缓冲液C，且A、B两泵的液体能以任意比例混合，层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样，上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗2-4个柱体积，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱，阶段洗脱的长度为4-6个柱体积，线性梯度洗脱的长度为18-22个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，填料采用SP Sepharose HP填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。本步骤耗时1.5小时。

以上方法使用的缓冲液A，即Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为20-50mM，pH8.0-8.5。

以上方法使用的缓冲液B，即柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸三钠的浓度为20-50mM，pH 4.8-5.2。

以上方法使用的缓冲液C，即柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液是在缓冲液B中加入0.9-1.1M氯化钠经搅拌溶解均匀而成，pH 4.8-5.2。

以上方法在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为9-11％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为9-11％，结束点的体积百分含量为38-42％。

另外，需要说明的是，上述方法所使用的填料均为通用电器医疗集团生产的产品。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、由于现有技术(林娟等，“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”，高技术通讯，2002，11，36-40，)所涉及的技术方案仅采用了凝胶过滤一种层析方法对Curcin粗提液进行蛋白纯化，因而其所用的蛋白分离原理较为单一，所得的终产物Curcin纯品中还存在一定数量的杂带(见图5中的1号泳道)。而本发明由于采用了阴离子交换、阳离子交换这两种基于不同原理的层析方法对Curcin粗提液进行联合分离提纯，故其工艺分离提纯能力不仅有所提高，且其终产物纯度也有明显提升(对比图5的1号和2号泳道)。从图中可见，经过本发明技术方案制得的Curcin纯品的纯度已达到电泳纯标准，这使得本发明所涉及的新工艺能更好的应用于基于Curcin的各种产品研发以及基于Curcin的深入而精细的基础研究，如Curcin抗肿瘤、抗真菌机理的深入研究以及各种毒理、药理研究。

2、参照赵琦等公开的“一种快速微量的非放射性核糖体失活蛋白活性检测方法”(四川大学学报(自然科学版)，2007，44，168-172)对Curcin的生物学活性进行测定。该方法用抑制蛋白翻译百分率为50％时对应的Curcin浓度(IC₅₀)表示Curcin的活性(IC₅₀越小，样品中Curcin的活性越大)。将现有技术1制得的Curcin纯品(样品1)和本发明实施例3制得的Curcin纯品(样品2)分别进行IC₅₀值测定。根据赵琦等公开的活性检测方法，首先测定加入了不同浓度的Curcin纯品(从10^-12mol/L至10^-6mol/L)时的荧光素酶活性百分率(测定结果见下表)，然后根据测得的数据，以Curcin浓度的常用对数值为横坐标(x轴)，以荧光素酶活性百分率为纵坐标(y轴)作图(如图6)，根据图中数据点，做出一条直线，求得线性回归方程。根据此方程，计算出当荧光素酶活性百分率为50％时，对应的Curcin浓度常用对数值，进而计算出对应的Curcin浓度(即IC₅₀值)。经计算，样品1的回归方程为：y＝-15.918x-103.33，IC₅₀＝0.233nmol/L，样品2的回归方程为y＝-23.44x-186.46，IC₅₀＝0.081nmol/L，故样品1的IC₅₀值是样品2的2.88倍，也即样品2的活性是样品1的2.88倍。即，本发明的分离纯化工艺较之现有技术更能保持Curcin的生物学活性。

Curcin浓度对数值	-12	-11	-10	-9	-8	-7	-6
								样品1荧光素酶活性百分率	92.1	73.7	54.2	36.6	15.1	6.3	1.5

样品2荧光素酶活性百分率

96.5

72.3

45.2

20.5

5.2

--

3、由于本发明方法分离提纯获得的Curcin纯品采用Bradford法(Bradford M M.AnalBiochem，1970，72：248)进行蛋白浓度测定，并根据浓度和Curcin纯品的体积计算出最终的蛋白含量，根据最初所用种仁重量计算出的终产物得率为3.12mg/100g种仁，而据现有技术1所述其Curcin纯品得率为2.91mg/100g种仁，故本发明可在终产物纯度和活性提高的基础上，使终产物的得率有所提高了。

4、如下表所示，现有技术的工艺总共耗时58小时，而本发明所采用的纯化工艺总共耗时3小时，仅为现有技术的5.2％，因而工艺周期可大大缩短，以利于生产成本的控制及终产物活性的保持。

5、由于现有技术采用的是凝胶过滤一步纯化的方法，该方法属于穿透性层析，其要想得到理想的分离效果，上样量须小于柱体积的5％，因而当工艺需要放大时，则需要增加柱体积来满足上样量的增加。柱体积的增加就意味着所使用的凝胶过滤填料的增加，而因凝胶过滤填料十分昂贵，不仅会使成本的大幅上升，且层析柱也需同步更换为更粗或更长的层析柱，这又将带来了生产投入的大幅上升。而本发明不仅采用了两步离子交换代替了凝胶过滤，且阴离子交换层析及阳离子交换层析因均为吸附性层析，故而对样品体积没有限制，所以当工艺需要放大时，既不必大幅度增加柱体积，又不需同步更换为更粗或更长的层析柱，从而避免了成本的大幅上升。加之，本发明所使用的填料均为适合工业化生产的填料，具有成本低，重复使用次数多，便于在位清洗等优点，故更适合大规模生产时采用。

附图说明

图1为本发明实施例3脱盐及缓冲液交换步骤的层析峰型图(或称色谱图)。其中实线曲线表示280nm吸收值(单位为：mAU)，长虚线曲线表示色谱基线，短虚线曲线表示电导值(单位为：mS/cm)，阴影部分表示需要收集的组分。

图2为本发明实施例3阴离子交换层析步骤的层析峰型图(或称色谱图)。其中实线曲线表示280nm吸收值(单位为：mAU)，长虚线曲线表示色谱基线，短虚线曲线表示电导值(单位为：mS/cm)，阴影部分表示需要收集的组分。

图3为本发明实施例3阳离子交换层析步骤的层析峰型图(或称色谱图)。其中实线曲线表示280nm吸收值(单位为：mAU)，长虚线曲线表示色谱基线，短虚线曲线表示电导值(单位为：mS/cm)，阴影部分表示需要收集的组分。

图4为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(考马斯亮蓝R-250染色)。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：Curcin粗提液；泳道3：本发明实施例3脱盐及缓冲液交换步骤中收集的组分；泳道4：本发明实施例3阴离子交换层析步骤中收集的组分；泳道5：本发明实施例3阳离子交换层析步骤中收集的组分(也即采用本发明涉及的新纯化工艺得到的Curcin纯品)。图中箭头所指位置即为Curcin的对应电泳条带(根据现有技术1所述，Curcin理论分子量为28.2kD)。

图5为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(考马斯亮蓝R-250染色)，其目的是对不同工艺制备的Curcin纯品的纯度进行分析和比较。泳道1：经过现有技术1制得的Curcin纯品；泳道2：本发明实施例3阳离子交换层析中收集的组分(也即经过本发明涉及的新纯化工艺制得的Curcin纯品)。泳道3：蛋白质分子量标准。图中箭头所指位置即Curcin的对应电泳条带。

图6为Curcin抑制蛋白翻译活性测定图，其目的是为了对不同工艺制得的Curcin纯品的生物学活性进行计算和比较。横坐标为Curcin浓度的常用对数值(Curcin的浓度单位为：mol/L)；纵坐标为荧光素酶活性百分率(％)。图中■表示样品1的数据点(样品1为采用现有技术1制得的Curcin纯品)，▲表示样品2的数据点(样品2为采用本发明实施例3制得的Curcin纯品)。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。

实施例1

第一步：制备Curcin粗提液。按照现有技术1公开的方法制备Curcin粗提液。

第二步：脱盐及缓冲液交换。先用缓冲液A，即Tris浓度为35mM，pH为8.2的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分。其中仪器采用AKTA purifier UPC 10(通用电器医疗集团产品)，填料采用Sephadex G 25 superfine填料，流速为200cm/h，检测器波长选择280nm。

第三步：阴离子交换层析。先用缓冲液A(配比、浓度和pH同前一步骤)进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分(未与填料结合的组分)。其中仪器采用AKTA purifier UPC 10(通用电器医疗集团产品)，填料选用Q Sepharose FF填料，流速为200cm/h，检测器波长选择280nm。

第四步：稀释。用缓冲液B，即柠檬酸三钠浓度为35mM，pH为5.0的柠檬酸三钠缓冲液，对第三步收集的组分进行稀释，稀释倍数20倍。稀释后的溶液作为下一步层析的样品。

第五步：阳离子交换层析。本步骤采用通用电器医疗集团生产的具有二元泵混合系统的AKTA purifier UPC 10液相色谱仪，其中A泵输送缓冲液B，B泵输送缓冲液C，且A、B两泵的液体能以任意比例混合。层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样。上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗3个柱体积，以去除未结合蛋白，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱。在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为10％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为10％，结束点的体积百分含量为40％。阶段洗脱的长度为5个柱体积，线性梯度洗脱的长度为20个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液(配比、浓度和pH同前一步骤)，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，其中柠檬酸三钠浓度为35mM，氯化钠0.9M，溶液pH为5.0，填料采用SP Sepharose HP填料，流速为200cm/h，检测器波长选择280nm。

实施例2

第二步：脱盐及缓冲液交换。先用缓冲液A，即Tris浓度为20mM，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分。其中流速为150cm/h。

第三步：阴离子交换层析。先用缓冲液A(配比、浓度和pH同前一步骤)进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分(未与填料结合的组分)。其中流速为150cm/h。

第四步：稀释。用缓冲液B，即柠檬酸三钠浓度为20mM，pH为4.8的柠檬酸三钠缓冲液，对第三步收集的组分进行稀释，稀释倍数10倍。稀释后的溶液作为下一步层析的样品。

第五步：阳离子交换层析。层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样。上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗2个柱体积，以去除未结合蛋白，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱。在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为9％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为9％，结束点的体积百分含量为38％。阶段洗脱的长度为4个柱体积，线性梯度洗脱的长度为18个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液(配比、浓度和pH同前一步骤)，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，其中柠檬酸三钠浓度为20mM，氯化钠1M，溶液pH为4.8，流速为150cm/h。

本实施例各步骤所用仪器、填料和检测器波长选择同实施例1，略。

实施例3

第二步：脱盐及缓冲液交换。先用缓冲液A，即Tris浓度为40mM，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分。其中流速为150cm/h。

此步对应的层析峰型图(或称色谱图)见图1。具体收集位置见图1中阴影部分，收集组分的电泳结果见图4第3泳道。

此步对应的层析峰型图(或叫色谱图)见图2，具体收集位置见图2中阴影部分，收集组分的电泳结果见图4第4泳道。

第四步：稀释。用缓冲液B，即柠檬酸三钠浓度为40mM，pH为5.0的柠檬酸三钠缓冲液，对第三步收集的组分进行稀释，稀释倍数10倍。稀释后的溶液作为下一步层析的样品。

第五步：阳离子交换层析。层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样。上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗3个柱体积，以去除未结合蛋白，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱。在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为10％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为10％，结束点的体积百分含量为40％。阶段洗脱的长度为4个柱体积，线性梯度洗脱的长度为20个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液(配比、浓度和pH同前一步骤)，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，其中柠檬酸三钠浓度为40mM，氯化钠1.0M，溶液pH为5.0，流速为150cm/h。

此步对应的层析峰型图(或叫色谱图)见图3。具体收集位置见图3中阴影部分，收集组分的电泳结果见图4第5泳道。

实施例4

第二步：脱盐及缓冲液交换。先用缓冲液A，即Tris浓度为50mM，pH为8.5的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分。其中流速为100cm/h。

第三步：阴离子交换层析。先用缓冲液A(配比、浓度和pH同前一步骤)进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分(未与填料结合的组分)。其中流速为100cm/h。

第四步：稀释。用缓冲液B，即柠檬酸三钠浓度为50mM，pH为5.2的柠檬酸三钠缓冲液，对第三步收集的组分进行稀释，稀释倍数30倍。稀释后的溶液作为下一步层析的样品。

第五步：阳离子交换层析。层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，平衡5个柱体积，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样。上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗4个柱体积，以去除未结合蛋白，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱。在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为11％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为11％，结束点的体积百分含量为42％。阶段洗脱的长度为6个柱体积，线性梯度洗脱的长度为22个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液(配比、浓度和pH同前一步骤)，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，其中柠檬酸三钠浓度为50mM，氯化钠1.1M，溶液pH为5.2，流速为100cm/h。

Claims

1.一种麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法是将制备的Curcin粗提液先进行脱盐及缓冲液交换并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，然后将收集的组分进行阴离子交换层析并收集上样后穿透组分，再后将收集的穿透组分用缓冲液进行稀释，最后将稀释后的组分溶液进行阳离子交换层析，并收集最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。

2.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中脱盐及缓冲液交换步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用Sephadex G 25superfine填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

3.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中阴离子交换层析步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用QSepharose FF填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

4.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中稀释步骤用缓冲液B对阴离子交换层析步骤收集的组分进行稀释，稀释倍数10-30倍，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液。

5.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中阳离子交换层析步骤采用具有二元泵混合系统的液相色谱仪，其中A泵输送缓冲液B，B泵输送缓冲液C，且A、B两泵的液体能以任意比例混合，层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样，上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗2-4个柱体积，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱，阶段洗脱的长度为4-6个柱体积，线性梯度洗脱的长度为18-22个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，填料采用SP Sepharose HP填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

6.根据权利要求2或3所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的缓冲液A，即Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为20-50mM，pH 8.0-8.5。

7.根据权利要求4或5所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的缓冲液B，即柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸三钠的浓度为20-50mM，pH 4.8-5.2。

8.根据权利要求5所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的缓冲液C，即柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液是在缓冲液B中加入0.9-1.1M的氯化钠经搅拌溶解均匀而成，pH 4.8-5.2。

9.根据权利要求5或8所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为9-11％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为9-11％，结束点的体积百分含量为38-42％。